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Die
Erfindung betrifft einen Bioreaktor, die Verwendung des Bioreaktors
zur Kultivierung von Mikroorganismen oder Zellkulturen sowie ein
Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen oder Zellkulturen.
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Bei
der Kultivierung von Mikroorganismen und Zellkulturen, insbesondere
von tierischen, pflanzlichen und humanen Zellen, kommen verschiedene
Typen von Bioreaktoren zum Einsatz. Neben dem gerührten
Bioreaktor hat sich vor allem der Air-Lift-Bioreaktor etablieren
können. In einem Air-Lift-Bioreaktor wird Gas wie zum Beispiel
Luft in einen aufwärts gerichteten Teil des Bioreaktors,
in der Fachwelt auch als Riser bekannt, eingeleitet. Vorzugsweise
findet eine feinblasige Begasung statt. Der Riser steht an dessen
oberen und unteren Ende mit dem oberen und unteren Ende eines weiteren,
aufwärts gerichteten Teils des Bioreaktors in Verbindung,
in der Fachwelt als Downcomer bekannt. Eine weit verbreitete Variante
des im Wesentlichen zylindrischen Air-Lift-Bioreaktors beinhaltet
ein zentral angeordnetes zylindrisches Leitrohr, welches den Air-Lift-Bioreaktor
in einen Auftriebsteil (Riser) innerhalb des Leitrohres und einen
Abtriebsteil (Downcomer) im Ringraum zwischen dem Leitrohr und der
Behälteraußenwand des Air-Lift-Bioreaktors teilt.
Genauso gut kann sich der Auftriebsteil im Ringraum zwischen dem
Leitrohr und der Behälteraußenwand und der Abtriebsteil
innerhalb des Leitrohrs befinden. Die Zufuhr von beispielsweise
mit Sauerstoff angereichertem Gas am unteren Ende des Risers vermindert
die mittlere Dichte der Suspensionskultur im Riser, was zu einer
aufwärts gerichteten Flüssigkeitsströmung
im Riser führt, welche in der Folge den Flüssigkeitsinhalt
des Downcomers ersetzt, der wiederum zum unteren Ende des Risers
strömt. Auf diese Art und Weise wird eine Flüssigkeitszirkulation erzeugt,
welche die Suspensionskultur ausreichend vermischt und die Zellen
in Schwebe, d. h. in freier Suspension hält. Bei Zellen
mit Sauerstoffbedarf z. B. löst sich gasförmiger
Sauerstoff im Nährmedium und wird von den in der Suspensionskultur
vorhandenen Zellen zu Kohlendioxid veratmet. Der Vorteil eines solchermaßen „gerührten” Bioreaktors
liegt darin, dass bei ausreichender Versorgung der Zellen mit im
Nährmedium gelöstem Sauerstoff und ausreichender
Entsorgung des bei der Veratmung entstehenden Kohlendioxids keine bewegten
Teile wie ein mechanischer Rührer notwendig sind.
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Die
nach dem Stand der Technik bekannten Air-Lift-Bioreaktoren sind
in schlanker Bauform ausgeführt, d. h. das Verhältnis
H/D von Höhe H zu Durchmesser D liegt bei den in der Zellkultur
bekannten Air-Lift-Bioreaktoren zwischen 6 und 14:
- [1] Varley
J., Birch J., Reactor design for large scale suspension animal cell
culture, Cytotechnology, 29, (1999): 177–205.
- [2] Petrossian A., Cortessis G. P., Large-scale production
of monoclonal antibodies in defined serum-free media in airlift
bioreactors, BioTechniques, 8, (1990): 414–422.
- [3] Hesse F., Ebel M., Konisch N., Sterlinski R., Kessler
W., and Wagner R., Comparison of a production process in a membrane-aerated
stirred tank and up to 1000-L airlift bioreactors using BHK-21 cells
and chemically defined Protein-free medium, Biotechnol. Prog., 19,
3 (2003): 833–843.
- [4] Chisti, Y., Animal-cell damage in sparged bioreactors,
Trends Biotechnol., 18, 10 (2000): 420–432.
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Im
Produktionsmaßstab führt diese schlanke Bauform
dazu, dass die Air-Lift-Bioreaktoren bei üblichen Arbeitsvolumina
von mehreren Hundert Litern bis zu mehreren Kubikmetern Bauhöhen
von mehreren Meter erreichen. Zum Beispiel entsprechen 12 m3 Arbeitsvolumen einer Bauhöhe von
14,4 m bei einen H/D-Verhältnis von 14. Solche Air-Lift-Bioreaktoren
müssen somit in Räumen mit großen Deckenhöhen
oder mit Durchbrüchen über mehrere Stockwerke
aufgestellt werden. Dies erfordert eine aufwändige Stahlgerüst-Konstruktion.
Darüber hinaus müssen die Air-Lift-Bioreaktoren
in situ dampfsterilisiert werden und können nicht mehr
als Ganzes mitsamt der für die Zellkultur notwendigen Peripherie
in einem Autoklaven dampfsterilisiert werden. Konventionelle Bioreaktoren
mit gängigen H/D-Verhältnissen um 2 können
hingegen in Autoklaven transportiert und dort dampfsterilisiert
werden.
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Generell
sind hohe Reaktoren schwer zu handhaben.
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Es
stellt sich damit ausgehend vom Stand der Technik die Aufgabe, Bioreaktoren
bereitzustellen, die auch bei Arbeitsvolumina von mehreren hundert
Litern bis zu mehreren Kubikmetern Baugrößen einhalten,
die üblichen Raumhöhen entsprechen, sodass Umbaumaßnahmen
zur Installation nicht erforderlich sind. Dabei sollen die geforderten
Bioreaktoren wie die nach dem Stand der Technik bekannten Air-Lift-Bioreaktoren über eine
ausreichende Versorgung von Zellen mit Gas, z. B. Sauerstoff und
eine ausreichende Entsorgung von Gas, z. B. des bei der Veratmung
entstehenden Kohlendioxids verfügen, ohne dass bewegte
Teile wie ein mechanischer Rührer erforderlich sind.
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Überraschenderweise
wurde gefunden, dass Air-Lift-Bioreaktoren in der Zellkultur eingesetzt
werden können, selbst wenn das Verhältnis von
Höhe zu Durchmesser deutlich unter 6 liegt.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist damit ein Air-Lift-Bioreaktor mit
einem Verhältnis H/D von Höhe H zu Durchmesser
D, das kleiner als 6 ist.
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Bevorzugt
liegt das Verhältnis H/D zwischen 1 und 6, besonders bevorzugt
zwischen 2 und 6.
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Unter
Air-Lift-Bioreaktor werden Reaktoren verstanden, die über
einen Riser, einen Downcomer und eine Begasungseinheit verfügen.
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Riser
und Downcomer werden bevorzugt über ein zylinderförmiges
Gefäß, in das ein zylinderförmiges Rohr
angeordnet ist, gebildet (siehe z. B. 1). In einer
bevorzugten Ausführungsform unterscheiden sich die Querschnittsflächen
des Risers und des Downcomers um maximal 10%, besonders bevorzugt
sind sie gleich groß (siehe z. B. 2).
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Das
zylinderförmige Gefäß und das zylinderförmige
Rohr weisen bevorzugt dieselbe Querschnittsgeometrie auf. Sie sind
bevorzugt elliptisch oder rund ausgeführt.
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Die
Begasungseinheit wird entweder innerhalb des zylinderförmigen
Leitrohres angeordnet oder zwischen Außenwand des Leitrohres
und Innenwand des Gefäßes. Im ersten Fall liegt
der Riser innerhalb des Leitrohres und der Downcomer zwischen Außenwand
des Leitrohres und Innenwand des Gefäßes; im zweiten Fall
liegt der Downcomer innerhalb des Leitrohres und der Riser zwischen
Außenwand des Leitrohres und Innenwand des Gefäßes.
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Neben
der Versorgung der Zellen oder Organismen mit Gas, z. B. Sauerstoff,
und dem Abtransport von gasförmigen Stoffwechselprodukten
wie z. B. Kohlendioxid sorgt die Begasungseinheit für eine
Umlaufströmung zwischen Riser und Downcomer.
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Bevorzugt
wird eine Begasungseinheit eingesetzt, die Blasen mit einem Durchmesser
von weniger als 2 mm erzeugt.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Begasungseinheit
als Mikroblasenbegaser ausgeführt. Unter Mikroblasenbegaser
werden Körper verstanden, die Gas, insbesondere Sauerstoff
in Form von feinen Bläschen in eine Flüssigkeit
einbringen können. Unter „feinen Gasblasen” werden
Gasblasen verstanden, die in dem eingesetzten Kulturmedium eine
geringe Neigung zur Koaleszenz aufweisen. Als Mikroblasenbegaser
eignen sich beispielsweise spezielle Sinterkörper aus metallischen
oder keramischen Werkstoffen, Filterplatten oder laserperforierten
Platten, die Poren oder Löcher mit einem Durchmesser von
in der Regel kleiner als 100 μm, bevorzugt 15 μm,
aufweisen. Die Begasungseinheit ist bevorzugt als hohler Körper, z.
B. als Rohr ausgeführt, durch den Gas strömen
kann. Bei kleinen Gasleerrohrgeschwindigkeiten von weniger als 0,5
m h–1 werden sehr feine Gasblasen
erzeugt, die in den in der Zellkultur normalerweise eingesetzten Medien
eine geringe Neigung zur Koaleszenz aufweisen.
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Als
Mikroblasenbegaser eignen sich weiterhin Membranschläuche.
Unter Membranschläuchen werden flexible rohrförmige
Gebilde verstanden, die für Gase wie Sauerstoff und Kohlendioxid
durchlässig sind. Als Beispiel seien Membranhohlfäden
aus mikroporösem Polypropylen genannt, wie sie beispielhaft
in Chem.-Ing.-rech. 62 (1990), Nr. 5, S. 393–395
von H. Büntemeyer et al. beschrieben werden.
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Die
Begasungseinheit ist bevorzugt nahe der Unterkante des Leitrohres
angeordnet. Die Begasungseinheit ist bevorzugt ringförmig
oder spiralförmig ausgeführt, damit sie den Strömungsquerschnitt
nur unwesentlich verringert. Plattenförmige Begasungseinheiten
(ihren zu einem erhöhten Strömungswiderstand.
Der hierdurch auftretende Druckverlust muss über einen
höheren Gasvolumenstrom ausgeglichen werden, um die Umlaufströmung
zwischen Riser und Downcomer aufrecht zu erhalten. Ein höherer
Gasvolumenstrom führt jedoch zu einer erhöhten
Scherrate, die für empfindliche Zellen zerstörerisch
sein kann und somit vermieden werden sollte. Ferner sollte der Durchmesser
der bevorzugt ring- oder spiralförmigen Begasungseinheit
so passend für den Querschnitt des Risers gestaltet sein,
dass der Querschnitt möglichst gleichmäßig
mit Gasblasen beaufschlagt wird. Zu vermeiden wäre demnach
eine Begasungseinheit, welche mit kleinem ringförmigen
Durchmesser in der Mitte des Risers angeordnet ist, wobei der restliche
(äußere) Riserquerschnitt unzureichend mit den
entstehenden Gasblasen versorgt wird. Es ist auch denkbar, die Begasungseinheit
mäanderförmig auszubilden. Weitere Formen sind
denkbar.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform sind alle Ecken und Kanten
innerhalb des erfindungsgemäßen Bioreaktors abgerundet,
insbesondere die Kanten des Leitrohres, um Wirbel zu vermeiden,
welche ebenfalls zu einem Druckverlust und zu erhöhter
Scherung führen.
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Der
erfindungsgemäße Bioreaktor weist bevorzugt Mittel
zur Shrömungsführung auf, welche eine Schlaufenströmung
zwischen Riser und Downcomer begünstigen sowie Druckverluste
und Scherungen gering halten. In einer bevorzugten Ausführungsform
weist der Boden des Bioreaktors eine Erhöhung auf, welche
die zum Reaktorboden strömende Flüssigkeit nach
oben umlenkt. Bevorzugt sind die Strömungsquerschnitte
im unteren und oberen Bereich des Bioreaktors, in denen die Umkehrung
der Strömungsrichtung stattfindet und das Medium vom Riser
in den Downcomer übergeht bzw. vom Downcomer in den Riser übergeht,
gleich groß und entsprechen in ihrer Größe
dem Strömungsquerschnitten des Risers und Downcomers.
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Als
Material für das Leitrohr und das Gefäß eignen
sich die in der Biotechnologie üblicherweise eingesetzten
Materialien zur Kultivierung von Mikroorganismen und Zellen, wie
z. B. VA-Stahl oder Glas.
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Das
Leitrohr wird innerhalb des Gefäßes über
Stützen gehalten. Diese können am Boden des Gefäßes,
am Deckel des Gefäßes oder an der Innenwand des
Gefäßes angebracht sein. In einer bevorzugten
Ausführungsform hängt das Leitrohr an Stützen,
die am Deckel des Gefäßes angebracht sind. Über
den Deckel wird der Bioreaktor üblicherweise mit Medium,
Nährstoffen, Zusätzen (wie z. B. Antischaummittel
und Puffer) und Gasen versorgt.
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Der
erfindungsgemäße Bioreaktor eignet sich zur Kultivierung
von Mikroorganismen und Zellen (pflanzlich, tierisch, menschlich)
aller Art. Die Verwendung des erfindungsgemäßen
Bioreaktors zur Kultivierung von Mikroorganismen oder pflanzlichen,
tierischen oder menschlichen Zellen ist Gegenstand der vorliegenden
Erfindung.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Kultivierung
von Mikroorganismen oder Zellkulturen. Das Verfahren ist dadurch
gekennzeichnet, dass in einem Bioreaktor mit einem Verhältnis
H/D von Höhe H zu Durchmesser D kleiner als 6, bevorzugt
zwischen 2 und 6, eine Schlaufenströmung (Umlaufströmung)
zwischen einem inneren Leitrohr und dem Bereich zwischen der Außenwand
des Leitrohres und der Innenwand des Bioreaktors mittels einer Begasungseinheit
erzeugt wird. Die Begasungseinheit ist bevorzugt eine Einheit, die
Blasen mit einem Durchmesser von weniger als 2 mm erzeugt, besonders
bevorzugt ist die Einheit ein Mikroblasenbegaser.
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Der
Gasvolumenstrom ist dabei so gewählt, dass die Schlaufenströmung
aufrechterhalten bleibt und die Zellen adäquat mit Gas,
z. B. Sauerstoff, versorgt und von unerwünschtem Gas, z.
B. Kohlendioxid, befreit werden, die Scherrate jedoch minimal gehalten
wird, um eine Zerstörung empfindlicher Zellen zu vermeiden. Weiterhin
ist der Gasvolumenstrom so gewählt, dass eine Suspendierung
der Zellen gewährleistet ist, eine Sedimentation also verhindert
wird. Weitere (nebenrangige) Kriterien sind eine ausreichend kurze
Mischzeit und eine möglichst geringe Schaumbildung.
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Die
Gasblasen können zur Bildung von Schaum führen.
Eine Schaumbildung ist jedoch zu vermeiden, da Zellen dazu neigen,
mit dem Schaum zu flotieren. In der Schaumschicht finden sie nicht
adäquate Kultivierungsbedingungen vor. Der Einsatz von
Antischaummitteln kann hier bekanntermaßen Abhilfe schaffen.
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Bevorzugt
wird das erfindungsgemäße Verfahren so betrieben,
dass sich die Mantelflächen oberhalb und unterhalb des
Leitrohres um maximal 10% unterscheiden; bevorzugt sind sie gleich
groß. Ferner unterscheidet sich in einer bevorzugten Ausführungsform
die Größe der Mantelfläche zwischen Leitrohr
und Flüssigkeitsoberfläche und/oder die Mantelfläche
zwischen Leitrohr und Boden des Bioreaktors um maximal 10% von der
Größe der Querschnittsfläche von Riser
und/oder Downcomer. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Strömungsquerschnitt
für die umlaufende Strömung in allen Bereichen
des Reaktors nahezu gleich groß oder gleich groß,
um Druckverluste zu vermindern.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Mantelfläche
zwischen Leitrohr und Boden des Bioreaktors kleiner als die Querschnittsflächen
von Riser und Downcomer.
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Hierdurch
wird im Bodenbereich eine erhöhte Strömungsgeschwindigkeit
erzeugt, die eine Sedimentation von Zellen oder Mikroorganismen
wirkungsvoll verhindert. Bevorzugt ist die Mantelfläche
zwischen Leitrohr und Boden des Bioreaktors um mindestens 5% und
um maximal 50% kleiner, besonders bevorzugt um mindestens 5% kleiner
und um maximal 30% kleiner.
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Als
Kulturen können in dem erfindungsgemäßen
Verfahren Mikroorganismen sowie tierische, pflanzliche und humane
Zellen eingesetzt werden.
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Die
Vorteile der Erfindung sind:
- – Bereits
existierende Bioreaktoren mit einem Verhältnis von Höhe
zu Durchmesser von beispielsweise 2 können in einfacher
Weise auf den Betrieb als Air-Lift-Bioreaktor umgerüstet
werden. Kostspielige Neuinvestitionen entfallen.
- – Air-Lift-Bioreaktoren mit geringem Verhältnis
von Höhe zu Durchmesser weisen nicht zuletzt in Folge eines
weniger ausgeprägten hydrostatischen Druckprofils eine
höhere Homogenität hinsichtlich Gelöstsauerstoff,
Gelöstkohlendioxid und pH-Wert auf. (So sind hohe schlanke
Bioreaktoren anfällig für örtlich (von der
Höhe abhängige) Kohlendioxidpartialdrücke,
die sich jeweils auf den pH-Wert auswirken.) Die Wahrscheinlichkeit
einer Unterversorgung der Zellen mit Gelöstsauerstoff im
Downcomer des Air-Lift-Bioreaktors sinkt. Die generell bessere axiale
Vermischung führt auch zu besserer Homogenität
bei den Substratkonzentrationen.
- – Häufig werden Air-Lift-Bioreaktoren mit
Makroblasen begast. Die Begasung mit Mikroblasen führt
zu hohen volumenspezifischen Phasengrenzflächen und ermöglicht
so eine deutliche Reduzierung des zum Antrieb der Flüssigkeitsströmung
benötigten Gasvolumenstroms. Damit einher geht eine deutliche
Reduzierung der Scherbeanspruchung von Zellen gegenüber
der grobblasigen Begasung.
- – Die bei den nach dem Stand der Technik bekannten
Air-Lift-Bioreaktoren genannten Nachteile entfallen.
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Die
Erfindung wird nachstehend anhand von Figuren und Beispielen näher
erläutert, ohne sie jedoch hierauf zu beschränken.
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1 zeigt
schematisch einen erfindungsgemäßen Bioreaktor
(a) im Querschnitt von der Seite und (b) im Querschnitt von oben.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor umfasst ein zylinderförmiges
Gefäß (1), in dem bevorzugt mittig zentriert
ein ebenfalls zylinderförmiges Leitrohr (2) eingebracht
ist. Im vorliegenden Beispiel ist in dem Leitrohr nahe der Unterkante
des Leitrohres eine ringförmige Begasungseinheit (3)
eingebracht. Das Verhältnis H/D von Höhe H zu
Durchmesser D beträgt zwischen 1 und 6, bevorzugt zwischen
2 und 6.
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2 zeigt
schematisch eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Bioreaktors im Querschnitt von oben, bei dem die Querschnittsfläche
A innerhalb des Leitrohres und die Fläche B zwischen der
Außenseite des Leitrohres (2) und der Innenwand
des Gefäßes (1) gleich groß sind,
d. h. Riser und Downcomer verfügen bevorzugt über
dieselbe Größe des Strömungsquerschnitts.
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3 zeigt
schematisch eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Bioreaktors im Querschnitt von der Seite. Das Gefäß (1)
verfügt bevorzugt über Umlenkeinrichtungen (9)
am Reaktorboden. Das Leitrohr (2) ist an Stützen
(5) am Deckel (4) des Bioreaktors befestigt. Es
verfügt über abgerundete Kanten, um Druckverluste
infolge von Wirbel und Scherwirkungen zu vermeiden. Die bevorzugt
ringförmige Begasungseinheit ist im vorliegenden Beispiel
der 3 innerhalb des Leitrohres nahe der Unterkante
des Leitrohres angebracht, so dass sich der Riser innerhalb des
Leitrohres und der Downcomer zwischen Leitrohr und Gefäß befindet.
Weiterhin sind am Deckel des Reaktors Durchführungen für
die Gasversorgung (6) sowie Zufuhr von Medium und/oder
Puffer und/oder Zusätzen (wie z. B. Antischaummittel) angebracht
(7). Üblicherweise verfügt der Bioreaktor über
Mittel zur Beheizung und/oder Kühlung sowie Sensoren zur
Messung von z. B. Temperatur, pH-Wert, Gelöstsauerstoffkonzentration,
Gelöstkohlendioxidkonzentration etc., die im vorliegenden
Fall nicht eingezeichnet sind. Bevorzugt liegt der Flüssigkeitslevel
(8) im Reaktor so hoch, dass die Strömungsquerschnitte
in den Umlenkbereichen und im Riser und Downcomer gleich groß sind.
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4 zeigt
eine fotografische Aufnahme einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Bioreaktors. Der gezeigte
Bioreaktor umfasst einen Glasbehälter mit Doppelmantel,
einen Deckel, ein Bodenventil und ein Leitrohr, welches am Deckel
befestigt werden kann.
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5 zeigt
schematisch das Prinzip der Flächenäquivalenz:
die Querschnittsflächen von Riser und Downcomer sowie die
Mantelflächen oberhalb und unterhalb des Leitrohres sind
bevorzugt gleich groß.
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6 zeigt
beispielhaft eine Begasungseinheit für den erfindungsgemäßen
Bioreaktor in Form eines ringförmigen Mikrospargers.
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7 zeigt
in einer grafischen Darstellung die Ergebnisse der Fermentation
von BHK-21-Zellen aus Beispiel 2 in dem Bioreaktor aus Beispiel
1.
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Aufgetragen
sind jeweils die Lebendzelldichte XV (linke
Ordinate, Kästchen) in der Einheit [105 Zellen mL–1] und die Vitalität V
(rechte Ordinate, Kreise) in Prozent gegen die Zeit t (Abszisse)
in Stunden. Der Zeitpunkt t = 0 stellt den Zeitpunkt der Inokulation
dar. Weiterhin ist in der Grafik die Begasungsrate dargestellt. Zunächst
wurde mit einer Begasungsrate von F1 = 15 L/h begonnen; am zweiten
Tag wurde die Begasungsrate auf F2 = 17,5 L/h erhöht.
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- 1
- Gefäß
- 2
- Leitrohr
- 3
- Begasungseinheit
- 4
- Deckel
- 5
- Stützen
- 6
- Durchführung
zur Gasversorgung
- 7
- Durchführungen
- 8
- Flüssigkeitsoberfläche
- 9
- Mittel
zur Strömungsführung: Umlenkeinrichtungen
- A
- Querschnittsfläche
des Risers/Downcomers
- B
- Querschnittsfläche
des Downcomers/Risers
- C
- Mantelfläche
oberhalb des Leitrohres
- D
- Mantelfläche
unterhalb des Leitrohres
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Beispiele
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Beispiel 1: Bioreaktor
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In 4 ist
eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen
Bioreaktors gezeigt. Der gezeigte Bioreaktor umfasst einen Glasbehälter
mit Doppelmantel, einen Deckel, ein Bodenventil und ein Leitrohr,
welches am Deckel befestigt werden kann.
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Die
Deckelbohrungen sind für Standardzubehör geeignet.
Alle für die spätere Fermentation wichtigen Bestandteile
können so angebracht werden. Das Rohr, welches als Zuluftleitung
für die Begasungseinheit ((Mikro-)Sparger) dient, kann
höhenverstellbar ebenfalls am Deckel befestigt werden.
Der Einbau des Spargers erfolgt mittig im unteren Teil des Leitrohrs.
Dadurch findet innen der Aufstieg, außen der Abstieg der
Flüssigkeitsströmung statt. Das Leitrohr besteht
aus einem hohlen Doppelmantelzylinder. Dieser dient nicht nur der Strömungsführung;
das Leitrohr ist so ausgelegt, das der Einbau eines internen Zellabscheiders
möglich ist. Dadurch verringert sich das Arbeitsvolumen
von 15 L auf 10 L.
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Zur
Temperierung des Bioreaktors im späteren Fermentationsbetrieb
dient ein Doppelmantel. Das Ablassen der Flüssigkeit wird über
ein Bodenventil ermöglicht. Die wesentlichen Daten sind
in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle
1: Auslegung einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen
Bioreaktors.
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Es
besteht Flächenäquivalenz zwischen den Querschnittsflächen
von Riser und Downcomer sowie zwischen den Mantelflächen
oberhalb und unterhalb des Risers. Die Differenz zwischen maximalem
und tatsächlichem Arbeitsvolumen entsteht durch das Leitrohr,
dessen Abmessungen als Platzhalter für einen möglichen
internen Zellabscheider dienen. Die Zeichnung zeigt den Glasbehälter
mit Leitrohr.
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Der
Bioreaktor wurde mit einem H/D-Verhältnis von 2 ausgelegt.
In der Regel sind die Bauformen von Airlift-Fermentern schlanker – also
mit höheren H/D-Verhältnissen. Unter anderem um
eine Sauerstofflimitierung im Downcomer zu vermeiden und H/D-Verhältnisse
gängiger Reaktoren beizubehalten, fiel die Entscheidung
auf H/D = 2. Der Tabelle 1 sind ebenfalls die Flächenäquivalenz
zwischen den Querschnittsflächen von Riser und Downcomer
sowie zwischen den Mantelflächen oberhalb und unterhalb
des Risers zu entnehmen. Daraus resultiert eine gleiche Strömungsgeschwindigkeit
in allen Teilen des Reaktors. Druckverluste und das Beschleunigen
oder Abbremsen der Flüssigkeit können so vermieden
werden. Das Prinzip der Flächenäquivalenz ist
in 5 schematisch dargestellt.
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Für
die Begasung wurde ein ringförmiger Mikrosparger (Mikroblasenbegaser)
der Firma Mott, Farmington, CT, USA verwendet, der in
6 gezeigt
ist. In Tabelle 2 ist eine Übersicht über die
Eigenschaften des Spargers gegeben.
| | Ringförmiger
Sparger |
| Porengröße | 2 μm |
| Material | 316L
SS |
| Beschreibung | 10,5''
Sparger-Rohr mit D = 0,25'' zum Ring mit D = 3,5'' geformt |
| Anschluss | Swagelok |
Tabelle
2: Eigenschaften des Mikrospargers der Firma Mott, Farmington, CT,
USA
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Beispiel 2: Fermentation zur biologischen
Charakterisierung
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Es
wurde eine Kultivierung einer BHK-Zelllinie in dem erfindungsgemäßen
Bioreaktor aus Beispiel 1 durchgeführt. BHK-Zellen (Baby-Hamster-Kidney-Zellen)
sind immortalisierte Zellen, die aus den Nieren einen Tag alter
Goldhamster abgeleitet wurden. Es sind Fibroblasten, die ursprünglich
adhärent gewachsen sind. Allerdings existiert eine Vielzahl
verschiedener BHK-Zelllinien, die meist an Suspensionskultur adaptiert
wurden.
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Wegen
ihrer unbegrenzten Wachstumsfähigkeit in Kultur sind etablierte
BHK-Zelllinien hervorragend für die Kultivierung in Fermentern
geeignet.
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Bei
der Zellkultivierung ergab sich eine Startzelldichte von 4·105 Zellen mL–1 mit
einer Vitalität von 92%. Die Sparger-Begasungsrate von
15 L/h wurde zunächst beibehalten, nach einem Tag aber
auf 17,5 L/h erhöht.
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Bei
der Kultivierung stieg, wie in 7 zu erkennen
ist, die Zelldichte sofort leicht an. Innerhalb eines Tages fand
eine Verdopplung der Zelldichte statt.
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In
der exponentiellen Wachstumsphase ergab sich eine Wachstumsrate
von μ = 0,055 h–1. Diese
ist, verglichen mit den Wachstumsraten in der Literatur, sehr hoch.
Dort werden Werte zwischen 0,02 und 0,04 h–1 genannt.
In der Kultivierung, aus der angeimpft worden war, wurde eine Wachstumsrate
von 0,02 h–1 bestimmt. Diese Abweichung
lässt sich nur zum Teil mit der Unsicherheit erklären,
die durch die durchgeführten Einzelmessungen entsteht.
Die hohe Wachstumsrate zeigt, dass durch die Fermentationsbedingungen optimales Wachstum
der Zellen gewährleistet werden kann. Die Batch-Fermentation
war unter diesen Bedingungen erfolgreich.
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Ferner
lässt sich feststellen, dass die Entstehung von Schaum
kein nennenswertes Problem darstellte. Der Schaum erreichte unter
gelegentlicher Antifoam C-Zugabe eine maximale Höhe von
ca. 30 mm. Die Konzentration des Antischaummittels betrug am Ende
der Fermentation ca. 40 ppm, was eine akzeptable Menge ist. Für
diese Zelllinie wurden bisher Konzentrationen bis 500 ppm untersucht
und als unkritisch erachtet. Durch die erhöhte Begasungsrate
entstehen also keine Schaumprobleme. Die Begasungsrate sollte hauptsächlich
aus diesem Grund so niedrig wie möglich gewählt
werden. Da die Ergebnisse darauf hinweisen, dass die Schaumbildung
ein tolerierbares Maß nicht überschreitet, kann
mit 17,5 L/h begast werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Varley J.,
Birch J., Reactor design for large scale suspension animal cell
culture, Cytotechnology, 29, (1999): 177–205 [0003]
- - Petrossian A., Cortessis G. P., Large-scale production of
monoclonal antibodies in defined serum-free media in airlift bioreactors,
BioTechniques, 8, (1990): 414–422 [0003]
- - Hesse F., Ebel M., Konisch N., Sterlinski R., Kessler W.,
and Wagner R., Comparison of a production process in a membrane-aerated
stirred tank and up to 1000-L airlift bioreactors using BHK-21 cells
and chemically defined Protein-free medium, Biotechnol. Prog., 19,
3 (2003): 833–843 [0003]
- - Chisti, Y., Animal-cell damage in sparged bioreactors, Trends
Biotechnol., 18, 10 (2000): 420–432 [0003]
- - Chem.-Ing.-rech. 62 (1990), Nr. 5, S. 393–395 von
H. Büntemeyer et al. [0017]
