DE3809163C2 - Belüftungsvorrichtung für die Zucht von Säugetierzellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Belüftungsvorrichtung für die Zucht von Säugetierzellen. Insbesondere befaßt sich die Erfindung mit einer Belüftungsvorrichtung, die eine Luft­ zufuhr ermöglicht, die notwendig und ausreichend für das Wachstum der Zellen ist, wenn eine Zucht der Säugetierzel­ len im Großmaßstab durchgeführt wird, so daß die Zellen un­ ter geeigneten Umgebungsbedingungen gezüchtet werden kön­ nen.

Die übliche Zucht von Säugetierzellen erfolgt beispielsweise in einer Zuchtvorrichtung 1, die in Fig. 2 gezeigt ist. Die­ se Zuchtvorrichtung 1 hat einen Zuchtbehälter 6 mit einer Rühreinrichtung 3. Der Zuchtbehälter 6 ist mit einem Luftzu­ fuhreinlaß 4 und einem Ableitungsauslaß 5 versehen. Wenn Säugetierzellen unter der Verwendung dieser Vorrichtung ge­ züchtet werden sollen, wird ein Kulturnährmedium 2, das Säu­ getierzellen enthält, in das Innere des Zuchtbehälters 6 ein­ gebracht, und Luft, Luft angereichert mit Sauerstoff oder sehr reiner Sauerstoff (dies wird nachstehend insgesamt mit "Luft" bezeichnet) wird zugeführt, und die Rühreinrichtung 3 bewirkt zugleich eine Agitation. Die zugeführte Luft wird über die Oberfläche des Kulturnährmediums 2 aufgenommen, das in Bewegung gehalten wird, wobei Luft den Säugetierzellen zugeführt wird, die sich in dem Kulturnährmedium 2 befinden.

Wenn bei einer solchen Vorrichtung das Volumen des Zuchtbe­ hälters 6 relativ klein (etwa 100-1000 ml) ist, ist die Luftzufuhr adäquat. Wenn aber das Volumen des Zuchtbehälters 6 groß ist (beispielsweise 500-1000 Liter), wird nicht aus­ reichend Luft den Kulturzellen zugeführt. Wenn daher die Züchtung im Industriemaßstab vorgenommen werden soll, wird das Verhältnis des Oberflächenbereichs zu Fluidvolumen im Zuchtbehälter 6 klein und ein Belüftungssystem mittels der Diffusion von Luft liefert nicht die notwendige und ausrei­ chende Luftmenge für das Wachstum der Zellen.

Eine Anzahl von Einrichtungen wurden verwendet, um die not­ wendige und ausreichende Luftmenge für das Wachstum der Säugetierzellen zu führen, die im Großmaßstab gezüchtet wer­ den sollen (d. h. zum Zwecke der Vergrößerung des volumetri­ schen Sauerstoffübertragungskoeffizienten).

Das Verfahren zur Belüftung von Zuchtbehältern im industriel­ len Maßstab, das heutzutage weit verbreitet Anwendung findet, ist eine direkte Methode für die Luftzufuhr mittels der Blasen­ belüftung und Agitation mit einer Luftblasdüse, die in das Kulturnährmedium eingeführt wird. Bei diesem Verfahren ist die Spitze der Öffnung in der Luftblasdüse mit einer Veren­ gung oder einem gesinterten Filter o. dgl. versehen, und der Durchmesser der Luftblasen wird so klein wie möglich gemacht, so daß der allgemeine Aufnahmefähigkeitskoeffizient für Sau­ erstoff in dem Kulturnährmedium so groß als möglich wird.

Beim Verfahren zur Luftzufuhr mit Hilfe der Blasenbelüftung und Agitation wird die Blasenbildung bei dem Kulturnähr­ medium verstärkt. Der Grund hierfür ist darin zu sehen, daß, wenn Säugetierzellen zu züchten sind, Proteine, wie Serum usw. in dem Kulturnährmedium vorhanden sind und diese Prote­ ine als grenzflächen-aktive Stoffe wirken. Die Blasenbil­ dung bei dem Kulturnährmedium behindert das Wachstum der Zellen und die Erzeugung von durch die Zellen produzierten Produkten nimmt ab, wenn der Behälter mit vielen Blasen ge­ füllt ist. Bei einer weiteren Methode zur effektiven Luft­ zufuhr zu den Kulturzellen läßt sich der Partialdruck von Sauerstoff innerhalb der oberen Grenzen anheben, oberhalb der eine Zytotoxität auftreten würde, wodurch eine Vergröße­ rung der volumetrischen Sauerstoffübertragungsrate verursacht wird. Jedoch ist es relativ schwierig, den Partialdruck von Sauerstoff zu steuern und die hierbei erhaltenen Resultate sind nicht so gut wie man erwartet hatte.

Bei einer weiteren Methode, wird nicht die direkte Luftzu­ fuhr zu den Kulturzellen verwirklicht wie dies bei den vorstehend beschriebenen Verfahrensweisen der Fall ist, sondern wird Luft indirekt unter Verwendung einer semi-permeablen Membran oder einer Silikonmembran zugeführt.

So sind aus der DE-A1-31 22 186 Silikonkautschukmem­ branen bekannt, die zum Be- und Entgasen von Flüssigkei­ ten verwendet werden können. Die Membranen weisen ein integriertes Stützgewebe, vorzugsweise aus Metall, auf und können als Schläuche ausgebildet sein. Durch die Membranen kann mittels Diffusion der Transport eines Gases in eine Flüssigkeit erfolgen.

In der JP-A-60-234580 ist beispielsweise ein Verfahren angegeben, bei dem Sauer­ stoff dem Kulturmedium über eine semi-permeable Membran zuge­ führt wird. Bei diesem Verfahren jedoch ist der Widerstand der vorstehend genannten Membrane groß, wenn Luft durch die­ se permeiert. Um in diesem Zusammenhang die für das Wachs­ tum der Zellen notwendige Luftmenge sicherzustellen, ist es erforderlich, daß der Oberflächenbereich der Membran äußerst groß gewählt werden muß, und es wird ein großer Zuchtbehälter benötigt. Darüber hinaus wird die Anordnung der Membranen in dem Zuchtbehälter äußerst kompliziert. Insbesondere wenn die Kultur die Verwendung eines Mikroträgers erforderlich macht, wird der die Zellen tragende Mikroträger auf eine sehr un­ gleichmäßige Weise in dem Zuchtbehälter verteilt, so daß die Zellen in den relativ ungestörten Bereichen sterben. Die Konstruktion des Zuchtbehälters ist kompliziert, woraus sich der Nachteil ergibt, daß dieser teuer wird. Daher ist die indirekte Belüftungsmethode, die eine Membrane verwendet, nicht zur Verwendung bei großen Zuchtbehältern im industriel­ len Maßstab geeignet.

Wie bereits vorstehend angegeben worden ist, gibt es bisher keine wirksamen Mittel für die Belüftung von Säugetierzellen, die in Zuchtvorrichtungen im Großmaßstab gezüchtet werden sol­ len.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Belüf­ tungsvorrichtung für die Zucht von Säugetierzellen zur Verfügung zu stellen, die einen einfachen und raumspa­ renden Aufbau aufweist, eine für eine optimale Zucht mit geringer Zellsterblichkeitsrate ausreichende Belüftung ermöglicht und sowohl für große als auch für kleine Zuchtbehälter verwendbar ist.

Bei der Lösung dieser Aufgabe geht die Erfindung von dem Grundgedanken aus, dünnwandige, schmale und schlauchför­ mige Hohlkörper aus einem gasdurchlässigen Material an ihren Enden mit einem Kopf zu bündeln und so anzuordnen, daß sie sich geringfügig krümmen können, wenn in die Hohlkörper Luft eingeleitet wird. Während Luft durch die Wände der Hohlkörper in den Zuchtbehälter dringt und sich die Hohlkörper gegeneinander verbiegen, wird die Luft im Zuchtbehälter nach allen Seiten gleichmäßig verteilt.

Gemäß einer bevorzugten Ausbildungsform sind die dünnwandigen, engen Hohlkörper aus Silikonharz hergestellt.

Somit ermöglicht die beschriebene Erfindung folgende Vorteile:
(1) Bereitstellen einer Belüftungsvorrichtung, die den in ei­ nem Zuchtbehälter zu züchtenden Säugetierzellen ausreichend Luft zuführt, wodurch man eine effiziente Zucht von Säugetier­ zellen erhält; (2) Bereitstellen einer Belüftungsvorrichtung zur Verwendung bei der Zucht von Säugetierzellen, die sowohl bei großen Zuchtbehältern für die Züchtung im industriellen Maßstab als auch für kleine Zuchtbehälter verwendbar ist, wobei bei der Vorrichtung verhindert wird, daß sowohl das Wachstum der Zellen behindert wird als auch eine Abnahme der Erzeugung von durch die Zellen produzierten Produkten; (3) Bereitstellen einer Belüftungsvorrichtung mit einem einfachen Aufbau für die Züchtung von Säugetierzellen unter Verwendung eines Mikro­ trägers, die ein Zellsterben verhindert, das dadurch verur­ sacht werden könnte, daß der Mikroträger auf sehr ungleich­ mäßige Weise verteilt wird.

Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung von bevor­ zugten Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beige­ fügte Zeichnung. Darin zeigt:

Fig. 1 eine perspektivische Ansicht zur Verdeutlichung einer Belüftungsvorrichtung für die Zucht von Säugetierzellen nach der Erfindung,

Fig. 2 eine schematische Ansicht zur Verdeutlichung einer üblichen Zuchtvorrichtung für die Zucht von Säugetierzellen,

Fig. 3 eine Schnittansicht zur Verdeutlichung eines Teils der Vorrichtung nach der Erfindung, die in Fig. 1 gezeigt ist,

Fig. 4 eine Schnittansicht zur Verdeutlichung der Be­ festigung der Belüftungsvorrichtung nach der Erfindung an einem Zuchtbehälter,

Fig. 5 eine Schnittansicht längs der Linie V-V in Fig. 4, und

Fig. 6 eine perspektivische Ansicht zur Verdeutlichung einer weiteren Ausbildungsform einer Belüftungs­ vorrichtung für die Zucht von Säugetierzellen nach der Erfindung.

Fig. 1 zeigt eine Belüftungsvorrichtung 10 nach der Erfindung, die eine Anzahl von Belüftungseinrichtungen 15 hat, die eine Anzahl von Bündeln aus dünnwandigen, schmalen, rohrförmigen Hohlkörpern 21 aufweist, die aus einem gasdurchlässigen Ma­ terial bestehen. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, ist ein Ende jeder Belüftungseinrichtung 15 mit Verbindungseinrichtungen 22 eines Kopfes 20 mit dem Ziel verbunden, hierüber Luft einzuleiten. Die anderen Enden sind mit den Verbindungseinrichtungen 23 eines Kopfes 24 verbunden, der zur Luftabfuhr genutzt wird. Bei diesem Beispiel sind zehn Belüftungseinrichtungen 15 ge­ zeigt und jede ist an den Köpfen 20 und 24 angebracht, so daß sie nahezu senkrecht sind. Der Kopf 20 für die Luftzufuhr und der Kopf 24 für die Luftabfuhr sind so gekrümmt, daß sie an die Innenform des Zuchtbehälters 1a (siehe Fig. 4 und 5) ange­ paßt sind. Die Köpfe 20 und 24 sind miteinander mit Hilfe einer Befestigungseinrichtung 27 und 28 verbunden, mittels der die Köpfe 20 und 24 am Zuchtbehälter 1a festgelegt werden.

In den Kopf 20 für die Luftzufuhr strömt Luft über einen Luft­ zufuhreinlaß 25 ein. Die in den Kopf 20 einströmende Luft ver­ teilt sich in die dünnwandigen, schmalen Hohlkörper 21 der je­ weiligen Belüftungseinrichtung 50, und Luft geht durch die dünnwandigen, schmalen Hohlkörper 21. Ein Teil der Luft, die im Innern der dünnwandigen, schmalen Hohlkörper 21 strömt, permeiert durch die Hohlkörperwand der dünnwandigen, schmalen Hohlkörper 21 und strömt in den Zuchtbehälter 1a aus. Die Luft, die durch die dünnwandigen, schmalen Hohlkörper 21 strömt, wird mit Hilfe des Kopfes 24 für den Luftaustritt gesammelt und von einem Luftauslaß 26 des Kopfes 24 für den Luftaus­ tritt ausgegeben.

Nachstehend werden nähere Angaben bezüglich der tatsächlichen Verwendung der Belüftungsvorrichtung 10 gemacht. Fig. 4 zeigt die Anbringung der Belüftungsvorrichtung 10 an dem Zuchtbe­ hälter 1a. Die Köpfe 20 und 24 sind an Befestigungseinrich­ tungen 27 und 28 der vorstehend beschriebenen Art befestigt, und diese Befestigungseinrichtungen 27 und 28 sind an der In­ nenwand des Zuchtbehälters 1a angebracht. Auf diese Weise ist die Belüftungsvorrichtung 10 an der Innenseite des Zucht­ behälters 1a fixiert. Zu diesem Moment ist der Luftzufuhr­ einlaß 25 nur eine Verbindungsleitung 21 mit einem Steuer­ ventil 42 auf der Luftzufuhrseite verbunden, und der Auslaß 26 ist über eine Verbindungsleitung 43 mit einem Steuerven­ til 44 auf der Luftauslaßseite verbunden. Die dünnwandigen, schmalen Hohlkörper 21 der Belüftungseinrichtungen 15, die sich zwischen den Köpfen 20 und 24 befinden, sind nicht so gespannt, daß sie vollständig geradlinig sind, sondern sie können sich geringfügig krümmen.

Der Zuchtbehälter 1a enthält Kulturnährmedium 2, das entweder Säugetierzellen oder Mikroträger 40 enthält, die Säugetier­ zellen mitführen. Ein Heißwassermantel 30 ist um die Außen­ fläche des Zuchtbehälters 1a vorgesehen und er wird ver­ wendet, um die Zuchttemperatur zu regulieren.

Der Zuchtbehälter 1a ist mit weiteren Einrichtungen versehen, um Kulturnährmedium zuzuführen und abzuleiten, mit Einrich­ tungen zur Steuerung der Atmosphäre, sowie Einrichtungen, die verwendet werden, um eine kontinuierliche Zucht zu erzielen. Beispielsweise ist in dem Zuchtbehälter 1a eine Welle 32 nahezu vertikal angeordnet und an ihrem unteren Ende ist ein Flügel bzw. ein Rührwerk 33 vorgesehen. Die Welle 32 wird mittels eines Motorantriebs 31 angetrieben, der außerhalb des Zuchtbehälters 1a vorgesehen ist. Ferner ist in dem Zucht­ behälter 1a ein Kulturnährmedium-Ableitungsauslaß 34 für die Ableitung des Kulturnährmediums aus dem Zuchtbehälter 1a vor­ gesehen. Ferner ist ein Kulturnährmedium-Zufuhreinlaß 35 zum Zwecke des Zuführens von Kulturnährmedium zu dem Zuchtbehäl­ ter 1a vorgesehen. Es ist eine Probesammelöffnung 36 vorge­ sehen, von der aus das Kulturnährmedium im Zuchtbehälter 1a als Probe entnommen werden kann. Ferner ist ein Gasaustritts­ auslaß 28 für das Ableiten von Luft, usw. aus dem Innenraum des Zuchtbehälters 1a vorgesehen. Ferner können auch weitere Einrichtungen vorhanden sein.

Bei der Anwendung der Belüftungsvorrichtung, wie dies in den Fig. 4 und 5 gezeigt ist, wird zuerst eine entsprechende Menge an Kulturnährmedium 2 verwendet, um dies in den Zuchtbehälter einzufüllen, so daß die Belüftungsvorrichtung 10 vollständig untergetaucht ist. Dann wird das Steuerventil 42 für die Luftzufuhr in die "Offen"-Stellung gebracht. Dann kann Luft in die Belüftungsvorrichtung 10 eintreten. Zu diesem Zeit­ punkt kann Luft den Innenraum der dünnwandigen, schmalen Hohlkörper 21 auffüllen, indem das Steuerventil 24 für die Luftabfuhr und der Druck eingestellt werden, der auf die Luft wirkt. Somit geht die Luft in den dünnwandigen, schmalen Hohlkörpern 21 durch die Wände der dünnwandigen, schmalen Hohlkörper 21 durch und wird in dem Kulturnährmedium gelöst. Die dünnwandigen, schmalen Hohlkörper 21 nehmen eine gering­ fügig gebogene Position ein, so daß, wenn Luft in dem Kultur­ nährmedium 2 von den dünnwandigen, schmalen Hohlkörpern 21 aufgelöst wird, die dünnwandigen, schmalen Hohlkörper ungleich­ mäßig angeordnet sind, wobei sie ähnlich Seegras im Wasser gekrümmt sind. Somit wird die durch die dünnwandigen, schmalen Hohlkörper 21 permeierte Luft in entsprechender Weise durch das Kulturnährmedium hindurch verteilt. Da die Belüftungs­ einrichtung 15 der Belüftungsvorrichtung 10 Bündel von dünn­ wandigen, schmalen Hohlkörpern 21 umfassen, ist ihr Volumen relativ klein und sie nehmen nicht viel Raum im Innern des Zuchtbehälters 1a ein.

Für die Belüftungsvorrichtung 10 ist es zur Luftzufuhr in die Zuchtzellen 2 erforderlich, die Luft unter einen festen Druck zu setzen, die sich im Innern der dünnwandigen, schma­ len Hohlkörper 21 befindet, wie dies voranstehend angegeben ist. Bei dem vorstehend genannten Beispiel ermöglicht die Einstellung des Steuerventils 44 auf der Luftauslaßseite, daß der Druck verändert werden kann, der auf die Luft in den dünnwandigen, schmalen Hohlkörpern 21 einwirkt.

Das Material, aus dem die dünnwandigen Hohlkörper 21 hergestellt sind, sollte ein solches sein, das in zufriedenstellender Weise für Luft durchlässig ist. Wenn man berücksichtigt, daß die dünnwandigen, schmalen Hohlkörper 21 bei der Belüftungs­ vorrichtung 10 verwendet werden, die an dem Zuchtbehälter 21a angebracht ist, so wird bevorzugt, daß diese mittels un­ ter Druck stehendem Dampf sterilisierbar sind. Als dünnwan­ dige, schmale Hohlkörper 21, die diese Erfordernisse erfüllen, sind Silikonharzhohlkörper (z. B. Silikonschläuche) äußerst geeignet. Bei der in der Beschreibungseinleitung zum Stand der Technik genannten Vorrichtung werden auch semi-permeable Membranen und Silikonmembranen verwendet, die für Luft durch­ lässig sind, jedoch werden diese in flachen Konfigurationen verwendet, so daß der Widerstand im Hinblick auf die Luftbe­ wegung groß ist und Luft nicht effektiv durch diese permeiert. Im Vergleich zur Erfindung werden dünnwandige schlauchförmige Körper verwendet, die für Gase durchlässig sind, so daß der Gasdruck der Luft gleich jenem der Umgebung der dünnwandigen schlauchförmigen Körper und hierin ist der Grund dafür zu sehen, daß Luft relativ einfach durch diese permeiert.

Die Länge der dünnwandigen Hohlkörper 21 ändert sich in Ab­ hängigkeit von der Größe, Form und dem Fassungsvermögen des Zuchtbehälters 1a. Die Länge wird so gewählt, daß die gesamte Belüftungsvorrichtung 10 in das Kulturnährmedium 2 einge­ taucht ist, das in den Zuchtbehälter 1a einzubringen ist. Die Anzahl der dünnwandigen, schmalen, schlauchförmigen Hohlkörper 21, die zur Bildung der Belüftungseinrichtung 15 verwendet wer­ den, und die Anzahl der Belüftungseinrichtungen 15, die zur Bildung der Belüftungsvorrichtung 10 verwendet werden, sind nicht auf die im Beispiel gezeigten Größen beschränkt.

Die Anzahl der schlauchförmigen Körper wird so gewählt, daß sie, basierend auf dem volumetrischen Sauerstoffübertragungskoeffi­ zienten, der für die gesamte Belüftungsvorrichtung 10 erforder­ lich ist, und basierend auf der Form und dem Fassungsvermögen des Zuchtbehälters 1a geeignet ist. Die dünnwandigen, schmalen, schlauchförmigen Hohlkörper mit einer geeigneten Länge sind gebündelt, um eine Anzahl von Belüftungseinrichtungen zu bilden. Auf diese Weise erhält man die zuvor angegebene Belüftungsvor­ richtung mit einem einfachen Aufbau, welche die für das Wachs­ tum der Säugetierzellen erforderliche und ausreichende Luft zuführen kann, ohne daß Blasen gebildet werden.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Widerstands­ fähigkeit der Belüftungsvorrichtung 10 gegenüber der Dampf­ sterilisation unter Druck untersucht, sowie die Druckbeständig­ keit, die Beständigkeit gegen Beschädigungen, die durch das Arbeiten auftraten u. dgl., und sie haben den volumetrischen Sauerstoffübertragungskoeffizienten für die Belüftungsvor­ richtung 10 sowie verschiedene Tests im Industriemaßstab (etwa mit 500 Litern) durchgeführt, wobei die Belüftungseinrichtun­ gen 15 für den Zuchtbehälter 1a hinsichtlich der Auslegung ent­ sprechend gewählt wurden. Die Ergebnisse zeigten, daß, wenn die dünnwandigen, schmalen, schlauchförmigen Körper 21, die aus Silikonharz bestehen und 60-150 cm lang sind, bei der Zucht verwendet werden, jede der Belüftungseinrichtungen 15 300-600 dünnwandige, schmale, schlauchförmige Hohlkörper 21 haben sollte und der Innendurchmesser der dünnwandigen, schmalen, schlauchförmigen Hohlkörper in der Größenordnung von 0,1 bis 1,0 mm und der Außendurchmesser in der Größen­ ordnung von 0,2 bis 2,0 mm liegen sollte, um optimale Ergeb­ nisse zu erzielen.

Das vor stehend genannte Beispiel beschreibt die Belüftungsvor­ richtung 10 mit dünnwandigen, schmalen, schlauchförmigen Hohl­ körpern 21, die nach oben und unten gestreckt verlaufen. Die Erfindung ist jedoch hierauf nicht beschränkt. Wie beispiels­ weise in Fig. 6 gezeigt ist, kann die Belüftungsvorrichtung 10 von Belüftungseinrichtungen 15 gebildet werden, die dünnwandige, schmale, schlauchförmige Hohlkörper 21 aufweisen, die etwa ho­ rizontal ausgerichtet sind. In diesem Fall erhält man ähnliche Resultate wie die vorangehend erwähnten.

Bei der Anwendung der Vorrichtung (mit einem Fassungsvermögen von 500 Liter), die in Fig. 4 gezeigt ist, werden Mouse C127 Zellen auf einen Mikroträger gebracht und gezüchtet. Als Me­ dium wurde DMEM ("Dulbecco′s minimum essential medium") mit der Zugabe von 10% fötalem Kälberserum verwendet. Als Mikro­ träger wurde Cytodex 3 (Pharmacia, Inc.,) verwendet, der dem Medium mit einer Konzentration von 6 g/l zugegeben wurde. Die Zellen wurden 4 Tage lang bei 37°C gezüchtet. Die maximal er­ reichte Zellkonzentration belief sich auf 5 × 10⁶ Zellen/ml.

Claims (2)

1. Belüftungsvorrichtung für die Zucht von Säugetierzellen, die eine Anzahl von Bündeln, zusammengesetzt aus dünn­ wandigen, schmalen, schlauchförmigen Hohlkörpern (21) aus einem gasdurchlässigem Material aufweist, wobei die Enden (22, 23) der Hohlkörper (21) jeweils mit einem Kopf (20, 24) verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlkörper (21) zwischen den Köpfen (20, 24) so angeordnet sind, daß sie sich geringfügig krümmen können.

2. Belüftungsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlkörper (21) aus Silikonharz bestehen.