CN102325870A - 生物反应器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物反应器、将生物反应器用于培养微生物和细胞培养物的用途以及用于培养微生物或细胞培养物的方法。
Description
本发明涉及生物反应器、生物反应器用于培养微生物和细胞培养物的用途以及用于培养微生物或细胞培养物的方法。
在培养微生物和细胞培养物尤其是动物细胞、植物细胞和人类细胞时，使用不同类型的生物反应器。除搅拌式生物反应器，尤其可以建立气升式生物反应器(Air-Lift-Bioreaktor)。在气升式生物反应器中，气体如空气被通入生物反应器的向上朝向的部分(在本技术领域中也称为提升管(Riser))。优选发生微小气泡曝气。提升管在其上端和下端与生物反应器的另一个向上朝向部分的上端和下端相连，其在本技术领域中被称为下降管(Downcomer)。基本呈圆柱形的气升式生物反应器的一个广泛流传的变型方案包括居中的圆柱形导管，导管将气升式生物反应器分为在导管内的浮升部分(提升管)和在气升式生物反应器的导管和容器外壁之间的环形间隙内的下降部分(下降管)。浮升部分位于导管和容器外壁之间的环形间隙中且下降部分位于导管内可能是完全一样好的。在提升管下端供应例如富氧气体减小了提升管内的悬浮培养物的平均密度，这导致在提升管内的液体向上游流动，结果，它替换下降管所盛纳的液体，所盛纳的液体进而流向提升管下端。通过这种方式，产生液体循环，该液体循环使悬浮培养物充分混合并且细胞保持悬浮，即保持在自由悬浮体中。对于需氧细胞，例如氧气溶解在营养介质中并且悬浮培养物所含的细胞呼出二氧化碳。这种“搅拌式”生物反应器的优点在于，在给细胞充分供应溶解在营养介质中的氧和充分排出在呼吸时产生的二氧化碳时，不需要活动部件如机械搅拌器。
根据现有技术所公开的气升式生物反应器的结构呈细长形，就是说，高度H与直径D的比例H/D对于在细胞培养中已知的气升式生物反应器为6至14。
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在生产规模中，细长结构导致气升式生物反应器在从几百升到多个立方米的常规工作容积下达到数米高的结构高度。例如在H/D比例为14时，12立方米工作容积对应14.4米结构高度。这样的气升式生物反应器因此必须安放在屋顶相当高的或多个楼层打通的房间中。这需要高昂的钢架结构。此外，气升式生物反应器必须现场蒸气灭菌并可能无法再作为整体连同细胞培养所需的周围设备在压热釜中被蒸气灭菌。与此不同，具有约为2的常用H/D比例的传统生物反应器能够被输送到压热釜中并在那里被蒸气灭菌。
通常，高的反应器难以操作。
因此，从现有技术出发，提出了以下任务，提供生物反应器，它在从几百升到若干立方米的工作容积下具有对应于常规房间高度的结构尺寸，从而无需用于装设的改装措施。此时，所需要的生物反应器像根据现有技术所公开的气升式生物反应器一样给细胞充分供应气体如氧气并充分排出气体例如在呼吸时产生的二氧化碳，不需要活动部件如机械搅拌器。
令人吃惊地发现，当高度与直径的比例明显低于6时，气升式生物反应器可被用在细胞培养中。
本发明的主题因此是高度H与直径D的比例H/D小于6的气升式生物反应器。
优选H/D比例为1至6，尤其优选为2至6。
气升式生物反应器是指这样的反应器，其具有提升管、下降管和曝气单元。
提升管和下降管优选通过其中设有圆柱形管的圆柱形容器构成(参见例如图1)。在一个优选实施方案中，提升管横截面积和下降管横截面积相差最多10％，特别优选它们同样大小(参见例如图2)。
圆柱形容器和圆柱形管优选具有相同的横截面形状。它们优选呈椭圆形或者圆形。
曝气单元或是安置在圆柱形导管内，或是安置在导管外壁和容器内壁之间。在第一种情况下，提升管位于导管内，下降管位于导管外壁和容器内壁之间；在第二种情况下，下降管在导管内，提升管在导管外壁和容器内壁之间。
除了给细胞或生物体供应气体如氧和排出气态代谢产物如二氧化碳外，曝气单元用于在提升管和下降管之间的循环流动。
优选使用这样的曝气单元，它产生直径小于2毫米的气泡。
在一个特别优选的实施方案中，曝气单元呈微气泡曝气器形式构造。微气泡曝气器是指这样的物体，其能够将呈微小气泡形式的气体尤其是氧气送入液体。“微小气泡”是指这样的气泡，其在所加入的培养物中不太易于聚结。例如过滤板、激光打孔板或由金属材料或陶瓷材料制成的特殊烧结体适合作为微气泡曝气器，它们具有直径一般小于100微米且优选15微米的孔或洞。曝气单元优选为空心体例如呈管状，气体可以流过其中。在低于0.5mh-1的低气体空管速度时，产生很微小的气泡，该气泡在通常细胞培养中所用的介质中不太易于聚结。
此外，薄膜软管适合作为微气泡曝气器。薄膜软管是指柔软的管形织物，其允许气体如氧气和二氧化碳透过。例如公开了由微孔聚丙烯构成的薄膜空心丝，如同例如在H.Büntemeyer等人的Chem.-Ing.-Tech.62(1990)，Nr.5，第393-395页所述的那样。
曝气单元优选安置在导管下边缘的附近。曝气单元优选呈环形或螺旋形，以便其仅仅不明显缩小流动横截面积。板状曝气单元导致增大的流动阻力。由此出现的压力损失必须通过更高的气体体积流来补偿，以保持提升管和下降管之间的循环流动。但是，较高的气体体积流导致升高的剪切率，高剪切率可能对敏感细胞是破坏性的，因此应加以避免。此外，优选为环形或螺旋形的曝气单元的直径应如此针对提升管横截面匹配构造，使得该横截面尽可能均匀承受气泡。据此要避免这样的曝气单元，其以小的环形直径安置在提升管中央，其中，其余的(外侧)提升管横截面没有充分接受所出现的气泡。也可以考虑，曝气单元蜿蜒曲折形成。可以考虑其它形状。
在一个优选实施方案中，本发明生物反应器中的所有边角都被倒圆，尤其是导管的边缘，以避免同样导致压力损失和更高剪切作用的涡流。
本发明的生物反应器优选具有流动导向机构，其有利于在提升管和下降管之间的环流以及保持小的压力损失和剪切作用。在一个优选实施方案中，生物反应器底部具有突出部，突出部使流向反应器底部的液体向上转向。流动横截面优选在生物反应器的发生流向转向且介质从提升管转入下降管或从下降管转入提升管的上部和下部中是相同大小的并且其尺寸对应于提升管和下降管的流动横截面。
在生物技术中常用于微生物和细胞培养的材料适合作为导管和容器的材料，例如VA钢或玻璃。
导管通过支架保持在容器内。支架可以安装在容器底部上、容器盖子上或者容器内壁上。在一个优选实施方案中，导管吊挂在支架上，支架安装在容器盖子上。通常通过盖子向生物反应器供给介质、营养物质、添加物质(如例如消泡剂和缓冲剂)和气体。
本发明的生物反应器适合培养所有类型的微生物和细胞(植物细胞、动物细胞和人类细胞)。将本发明的生物反应器用于培养微生物或植物细胞、动物细胞或人类细胞是本发明的主题。
本发明的主题还在于一种培养微生物或细胞培养物的方法。该方法的特征在于，在高度H与直径D的比例H/D小于6且优选为2至6的生物反应器中，在内部导管和在导管外壁和生物反应器内壁之间区域之间借助曝气单元产生环流(循环流动)。曝气单元优选是这样的单元，其产生直径小于2mm的气泡，特别优选的是，该单元是微气泡曝气器。
此时如此选择该气体体积流，保持环流并且给细胞充分供应气体如氧气，并且不含不希望的气体如二氧化碳，但保持最小的剪切率，以免敏感细胞受损。此外如此选择气体体积流，以保证细胞悬浮，就是说阻止沉淀。其它(次要)准则是混合时间足够短和形成尽量少的泡沫。
气泡可能导致形成泡沫。但是要避免形成泡沫，因为细胞易于随着泡沫浮起来(flotieren)。在泡沫层中，它们遇到不充分的培养条件。使用消泡剂在这里可以提供众所周知的帮助。
本发明方法优选如此运转，导管上方外壳面积和导管下方外壳面积相差最多10％，它们优选一样大小。此外，在一个优选实施方案中，导管和液体表面之间外壳面积的大小和/或导管和生物反应器底部之间的外壳面积与提升管和/或下降管的横截面积大小相差最多10％。在本发明方法的一个特别优选的实施方案中，用于循环流动的流动横截面积在反应器的所有区域内几乎同样大小或者同样大小，以减少压力损失。
在另一优选实施方案中，在导管和生物反应器底部之间的外壳面积小于提升管和下降管的横截面积。这样，在底部区域中产生更高的流动阻力，其有效防止细胞或微生物沉淀。导管和生物反应器底部之间外壳面积优选小最少5％和小最多50％，特别优选的是，小最少5％和小最多30％。
作为培养物，在本发明方法中可使用微生物以及动物细胞、植物细胞和人类细胞。
本发明的优点是：
-具有例如为2的高度与直径的比例的已有的生物反应器可以通过简单方式被改装以作为气升式生物反应器工作。消除昂贵的新投资。
-高度与直径比低的气升式生物反应器也因为不太突出的液静压力变化过程而具有较高的关于溶解氧、溶解二氧化碳和pH值的一致性(因此，高而细长的生物反应器易于受到局部的(取决于高度)总是影响到pH值的二氧化碳分压的影响)。给细胞不充分供应溶解氧的概率在气升式生物反应器的下降管中降低。总体更好地轴向混合还导致底物浓缩时更高的一致性。
-通常，给气升式生物反应器通入大气泡。以微气泡曝气导致高比体积的相界面并因此允许明显减少驱动液体流动所需要的气体体积流。随之出现与大气泡曝气相比明显降低的细胞剪切应力。
-消除了在根据现有技术所公开的气升式生物反应器中已知的缺陷。
以下，将结合附图和实施例来详细说明本发明，但本发明不局限于此。
图1示意性表示本发明的生物反应器，图1(a)以侧横截面视图，图1(b)以上方横截面视图。本发明的生物反应器包括圆柱形的容器(1)，在该容器中，优选居中安装了同样为圆柱形的导管(2)。在本实施例中，在导管中靠近导管下边缘地装入环形的曝气单元(3)。高度H与直径D的比例H/D为1至6，优选为2至6。
图2以上方横截面视图示意表示本发明生物反应器的优选实施方案，其中，在导管内的横截面积A和在导管(2)外侧与容器(1)内壁之间的面积B同样大小，就是说，提升管和下降管优选具有同样大小的流动横截面。
图3以侧视横截面图示意表示本发明生物反应器的一个优选实施方案。容器(1)优选在反应器底部上具有转向机构(9)。导管(2)以支架(5)固定在生物反应器的盖子(4)上。它具有倒圆的边缘，以避免由涡流和剪切作用引起的压力损失。优选呈环形的曝气单元在图3的例子中安置在导管内，在导管的下边缘附近，从而提升管位于导管内，下降管在导管和容器之间。而且，在反应器盖子上安装有气体供应通路(6)和供应介质和/或缓冲剂和/或添加物质(例如消泡剂)的通路(7)。通常，生物反应器具有加热和/或冷却用机构和在此情况下未标出的测量例如温度、pH值、溶解氧浓度、溶解二氧化碳浓度等的传感器。在反应器内的液面(8)优选处于这样的高度，在转向区域中和在提升管和下降管内的流动横截面一样大小。
图4表示本发明生物反应器的一个优选实施方案的拍摄照片。所示出的生物反应器包括带有双壁、盖子、底部阀门和导管的玻璃容器，导管可固定在盖子上。
图5示意性表示面积等同原理：提升管和下降管的横截面以及在导管之上和之下的外壳面积优选一样大小。
图6举例表示用于本发明生物反应器的呈环状微型布气器(Mikrosparger)形式的曝气单元。
图7以曲线图表示来自实施例2的BHK-21细胞在来自实施例1的生物反应器内的发酵结果。
分别画出了活细胞密度XV(左坐标，方框)，单位是[105细胞mL-1]，和活力V(右坐标，圆圈)，单位是百分比，与时间t小时(横坐标)的关系。时刻t＝0表示接种时刻。此外，在曲线图中示出了曝气速率。首先，以曝气速率F1＝15L/h开始，第二天，曝气速率提高到F2＝17.5L/h。
图8用于说明表1的报告。
附图标记列表
1容器
2导管
3曝气单元
4盖子
5支架
6气体供应通路
7通路
8液面
9流体导向机构；转向机构
A提升管/下降管的横截面；
B下降管/提升管的横截面；
C导管上方外壳面积；
D导管下方外壳面积。
实施例
实施例1：生物反应器
图4示出本发明生物反应器的一个优选实施方案。所示的生物反应器包括玻璃容器，其具有双壁、盖子、底部阀门和可固定在盖子上的导管。
多个盖孔适用于标准配件。因此，对随后的发酵重要的所有组成部件可以安装就位。作为曝气单元((微型)布气器)的供应管路的管可以高度可调地同样安装在盖子上。布气器居中安置在导管下部内。由此在内部发生液体上升流动和在外部发生液体下降流动。导管由空心的双壁圆柱体构成。它不仅用于流动导向，导管如此设计，可以安装内置的细胞分离器。由此，将工作容积从15升缩减到10升。
双壁用于在随后的发酵工作中热处理生物反应器。液体排出能通过底部阀门来实现。表1列出主要数据。
| 最大工作容积 | 0.0148 | m3 |
| H/D | 2 | |
| 下降管横截面积 | 0.0110 | m2 |
| ＝提升管横截面积 | 0.0110 | m2 |
| 提升管上方外壳面积 | 0.0110 | m2 |
| ＝提升管下方外壳面积 | 0.0110 | m2 |
| 实际工作容积 | 0.0096 | m3 |
| 提升管直径 | 0.1185 | m |
| 导管厚度 | 0.0280 | m |
| 导管至反应器壁的距离 | 0.0182 | m |
| 导管下边缘至反应器内最深点的距离 | 0.0450 | m |
| 导管上边缘至盖子底面的距离 | 0.2130 | m |
表1：本发明生物反应器的一个优选实施方案的设计。
在提升管横截面和下降管横截面之间存在面积等同以及在提升管上方外壳面积和提升管下方外壳面积之间存在面积等同。因导管而出现了最大工作容积和实际工作容积之差，导管的尺寸作为用于可能有的内置细胞分离器的安放支座。该图示出带导管的玻璃容器。
生物反应器按照2的H/D比例来设计。一般，气升式发酵装置的结构比较细长，就是说，具有更大的H/D比例。此外为了避免在下降管内的氧限制并且获得常用反应器的H/D比例，决定H/D＝2。从表1中同样看到提升管横截面和下降管横截面之间的面积等同以及在提升管上方外壳面积和提升管下方外壳面积之间的面积等同。结果，在反应器的所有部分中得到相同的流速。这样可避免液体压力损失和加速或减速。图5示意性表示面积等同原理。
为了曝气，使用Farmington，CT，USA，Mott公司的环形微型布气器(微气泡曝气器)，其如图6所示。表2列出了布气器性能概览。
表2：Farmington，CT，USA，Mott公司的微型布气器的性能
实施例2：发酵以进行生物表征
在得自实施例1的本发明生物反应器中进行BHK细胞系培养。BHK细胞(幼仓鼠肾细胞)是永生细胞，其由一天大的金仓鼠的肾得到。它是最初贴壁生长的成纤维细胞。但存在许多不同的BHK细胞系，它们大多适合悬浮培养。
因为其在培养物中的不受限制生长能力，所以所建立的BHK细胞系非常好地适用于发酵培养。
在细胞培养中出现了4×105细胞mL-1的初始细胞密度，活力为92％。首先保持15L/h的布气器曝气速率，但1天后提高到17.5L/h。
在培养中，如图7所示，细胞密度马上略微提高。在1天内，细胞密度翻倍。
在指数性生长阶段中出现μ＝0.055h-1的生长速度。这与文献记载的生长速度相比非常高。文献中提到了介于0.02-0.04h-1的值。在从中接种的培养中，确定了0.02h-1生长速度。该差值仅能部分以因所执行的单独测量而出现的不稳定性来说明。高生长速度表明，发酵条件能保证细胞最佳生长。批次发酵在此条件下是成功的。
此外可以确定，泡沫出现不是值得注意的问题。泡沫在偶然加入消泡剂C的情况下达到约30毫米最大厚度。消泡剂浓度在发酵结束时为大约40ppm，这是可接受的量。对于细胞系，目前研究达到500ppm的浓度并且视为不重要。就是说，更高的曝气速率没有造成泡沫问题。曝气速率应该主要因此缘故被选择为尽量低。因为结果表明泡沫形成没有超出容许尺度，所以能以17.5L/h来曝气。
Claims (12)
1.生物反应器，它以气升式生物反应器的形式构造，其特征在于，该生物反应器高度H与生物反应器直径D的比例H/D小于6。
2.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，该比例H/D为2至6。
3.根据权利要求1或2所述的生物反应器，其特征在于，为了曝气和产生循环流动，使用这样的曝气单元，该曝气单元产生直径小于2毫米的气泡。
4.根据权利要求1至3之一所述的生物反应器，其特征在于，作为曝气单元使用微泡曝气器。
5.根据权利要求1至4之一所述的生物反应器，其特征在于，该曝气单元以环形体或螺旋体的形式构造。
6.根据权利要求1至5之一所述的生物反应器，其特征在于，在反应器底部上设有使流动转向的机构。
7.根据权利要求1至6之一所述的生物反应器，其特征在于，提升管横截面和下降管横截面大小相同或者最大相差10％。
8.用于培养微生物或动物细胞或植物细胞或人类细胞的方法，其特征在于，在高度H和直径D的比例H/D小于6且优选为2至6的生物反应器中，在内部导管与该导管外壁和生物反应器内壁之间的区域之间借助曝气单元产生环流(循环流动)。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，导管和液体表面之间的外壳面积与导管和生物反应器底部之间的外壳面积大小相同或者最大相差10％。
10.根据权利要求8或9之一所述的方法，其特征在于，在导管和液体表面之间的外壳面积的大小和/或在导管和生物反应器底部之间的外壳面积与提升管和/或下降管的横截面积大小相差最大10％。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在导管和生物反应器底部之间的外壳面积小于提升管和下降管的横截面积。
12.根据权利要求1至7之一所述的生物反应器用于培养微生物或细胞培养物的用途。
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