DE102008039812A1

DE102008039812A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen

Info

Publication number: DE102008039812A1
Application number: DE102008039812A
Authority: DE
Inventors: Yvonne Ibold; Jochen Ringe; Michael Sittinger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-08-25
Filing date: 2008-08-25
Publication date: 2010-03-04

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Zellkulturgefäß 10 mit einem Behälter 2 mit einer Einlassöffnung 20 zur Aufnahme einer Zellsuspension, wobei in der Einlassöffnung 20 ein durch eine im wesentlichen einheitliche Maschenweite charakterisiertes Sieb 6 entfernbar angeordnet ist, einer Öffnung 30 zum Anlegen eines Druckunterschiedes zum Einsaugen oder Ausbringen einer Flüssigkeit in den Behälter 2 und durch einen im wesentlichen einheitlichen Durchmesser charakterisierte Mikroträger, umfassend ein Material zur Anhaftung von Zellen, wobei die Maschenweite geringer als der Durchmesser der Mikroträger ist. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von adhärenten Zellen aus einer Zellsuspension vermittels dem erfindungsgemäßen Zellkulturgefäß sowie die Verwendung der so gewonnenen Zellen zur Herstellung eines Arzneimittels.

Description

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Zellkultur von Säugerzellen, und insbesondere eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen gemäß den unabhängigen Ansprüchen.
Ein wichtiges Feld medizinischer Forschung ist die Zelltherapie. Mit diesem Begriff soll die Entnahme, Kultivierung, gegebenenfalls Modifizierung und anschließende therapeutische Verwendung von ganzen Zellen bezeichnet werden. Ein besonderes Interesse gilt dabei der Anwendung von Stammzellen. Weiterhin hervorzuheben sind die mesenchymalen Zellen, wie Knochen-, Knorpel- oder Muskelzellen, und mesenchymale Stammzellen, die zu diesen Zelltypen sowie Nervenzellen und Herzmuskelzellen differenzieren können.
Die genannten sowie weitere klinisch relevante Zelltypen zeichnen sich dadurch aus, dass sie in Kultur wie in-vivo an festen Oberflächen anhaften (adhärieren). Dies wird dazu genutzt, adhärente Zellen von nicht-adhärenten Zellen aus einer beide Zelltypen enthaltene Zellsuspension zu isolieren. Es wird dabei die beide Zelltypen enthaltene Zellsuspension, z. B. entnommenes Knochenmark, aus dem Entnahmegefäß, einer Spritze, in ein Zellkulturgefäß überführt. Nach dem Anwachsen der adhärenten Zellen können nicht-adhärente Zellen mit dem Überstand entfernt werden. Durch Ablösen der adhärenten Zellen durch Trypsinierung oder andere Verdauungsschritte erhält man eine Präparation von gereinigten, adhärenten Zellen, die gegebenenfalls in einen Patienten zurückgegeben werden können.
Alternativ können Zellen durch einen Dichtegradienten aus einer Suspension isoliert werden.
Die dargestellten Verfahren haben den Nachteil, dass durch die Behandlung, insbesondere den im erstgenannten Verfahren notwendigen Schritt des Ablösens, die Zellen geschädigt werden können.
Bei der Zelltherapie im human- und tiermedizinischen Bereich stellt sich weiterhin das Problem, dass die Entnahme, Behandlung und Kultivierung von Zellen außerhalb des Körpers hohe Anforderungen hinsichtlich der Sterilität an das dabei verwendete Material sowie die zum Einsatz kommenden Verfahren stellt. Die zur Therapie vorgesehenen Zellen müssen keimfrei bleiben, und gleichzeitig müssen ihnen die notwendigen Bedingungen zu Proliferation und gegebenenfalls Differenzierung geboten werden. Auch bei der Behandlung unter Sterilwerkbänken und mit sterilisierten Behältern und Vorrichtungen kann eine Kontaminationsgefahr nie vollkommen ausgeschlossen werden, da die zur Abtötung von Keimen verwendeten Verfahren fehlerhaft angewendet werden können. Auch besteht mit jedem Behandlungsschritt immer die Gefahr des Einschleppens von anhaftenden Keimen durch Personen, Gerätschaften oder Materialien.
US20030093034A1 zeigt eine Spritze, in welcher adhärente Zellen auf einer in der Spritze befestigten Matrix festwachsen sollen. Durch Auf- und Abbewegung der Oberfläche des Mediums über die Matrix wird das Medium oxygeniert.
Die Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark der Ratte auf Fibrin-Mikroträgern ist bekannt (Zangi et al., Tissue Engineering 12, 2343 (2006); WO99/15637 ).
Ausgehend vom beschriebenen Stand der Technik ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel bereitzustellen, die es erlauben, aus Zellsuspensionen auf einfache, schnelle und sichere Weise adhärente Zellen in Kultur zu nehmen und von nicht adhärenten Zellen zu separieren, sowie diese zur weiteren Verarbeitung bereitzustellen. Diese Aufgabe wird durch die Vorrichtung und das Verfahren der unabhängigen Ansprüche gelöst.
Erfindungsgemäß wird ein Zellkulturgefäß zur Verfügung gestellt, welches einen Behälter mit einer Einlassöffnung zur Aufnahme einer Zellsuspension in den Behälter und eine Öffnung zum Anlegen eines Druckunterschiedes zum Einsaugen oder Ausbringen einer Flüssigkeit in den Behälter umfasst. In der Einlassöffnung ist ein Sieb vorgesehen. Das Sieb ist so angebracht, dass es aus der Einlassöffnung entfernt werden kann. Das Sieb weist eine im wesentlichen einheitliche Maschenweite auf. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Sieb aus der Einlassöffnung entfernt, indem es mit einer auf die Einlassöffnung geschraubten, entfernbaren Kappe verbunden ist, welche durch eine kein Sieb enthaltene Kappe ausgetauscht werden kann.
Weiterhin sind in dem erfindungsgemäßen Zellkulturgefäß Mikroträger vorhanden. Dies sind im wesentlichen aus einem, vorzugsweise bioresorbierbaren, Material bestehende Partikel, welche zur Anhaftung von Zellen unter Kulturbedingungen geeignet sind. Die Mikroträger weisen einen im wesentlichen einheitlichen Durchmesser auf. Die Maschenweite des Siebs ist dabei mindestens so viel geringer als der Durchmesser der Mikroträger, dass beim Ausspülen einer Suspension von Mikroträgern in Flüssigkeit durch das Sieb zumindest die große Mehrheit der Mikroträger durch das Sieb im Behälter zurückgehalten wird.
Ebenfalls ist es möglich Mikroträger zu verwenden, welche eine nicht im wesentlichen einheitliche Größenverteilung aufweisen. Die Größenverteilung einer hinsichtlich ihrer Größe inhomogenen Mikroträgermenge lässt sich durch Sieb-Schritte einengen. Soweit eine im wesentlichen einheitliche Größenverteilung nicht erreicht werden kann, muss die Maschenweite des Siebs mindestens so viel geringer sein als die untere Durchmesser-Grenze der Mikroträger, dass beim Ausspülen einer Suspension von Mikroträgern in Flüssigkeit durch das Sieb zumindest die große Mehrheit der Mikroträger durch das Sieb im Behälter zurückgehalten wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das Zellkulturgefäß einen im wesentlichen längserstreckten Behälter, beispielsweise einen Zylinder auf. Dieser hat ein erstes Ende, in welchem die Einlassöffnung vorgesehen ist, und ein zweites Ende. Zwischen dem ersten und dem zweiten Ende bildet der Behälter damit einen Hubkolben. In diesem ist in der bevorzugten Ausführungsform ein in der Richtung vom ersten Ende zum zweiten Ende beweglicher Stempel vorgesehen. Dieser schließt mit der Wand des Behälters gasdicht ab und ist durch ein mit dem Stempel verbundenes Eingriffselement bewegbar.
Ein Beispiel für einen solchen Behälter ist eine klassische Spritze.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das Zellkulturgefäß eine Einlassöffnung auf, die so ausgeformt ist, dass sie das distale Endes einer Kanüle oder Punktionsnadel aufnehmen kann. Mit „distal” soll hier das Ende einer Kanüle oder Punktionsnadel verstanden werden, welches entlang der Kanüle dem spitzen Ende, welches zur Injektion bzw. zu Einschlag in einen Knochen verwendet wird, gegenüberliegt.
Durch die Verbindung der Einlassöffnung mit einer Kanüle oder Punktionsnadel kann eine Zellsuspension direkt aus einem Patienten ohne Zwischenschritte in das Zellkulturgefäß aufgenommen werden. Dadurch wird die Zahl der Arbeitsschritte verringert, und somit die Gefahr einer Kontamination verringert. Weiterhin entfällt die Notwendigkeit des Einsatzes zusätzlicher Aufbewahrungs- und Transfergefäße, was Kosten spart.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt der Durchmesser der Mikroträger zwischen 20 und 500 μm. Prinzipiell ist der Durchmesser der Mikroträger so zu wählen, dass diese eine möglichst große Oberfläche und eine geeignete Geometrie zum Anwachsen von Zellen bieten. Weiterhin sollen die Mikroträger Dimensionen aufweisen, die das Schweben der Mikroträger in einem Bioreaktor ermöglichen, soweit geplant ist, einen solchen einzusetzen. Bewährt haben sich Durchmesser der Mikroträger von 50 bis 250 μm, insbesondere von 150 bis 200 μm.
Zu große Mikroträger können das Auftreten von Scherkräften an der Oberfläche begünstigen, durch die anhaftende Zellen geschädigt werden können. Bei zu kleinen Mikroträgern kann die Geometrie dem Anhaften und der Teilung der Zellen entgegenwirken. Kugelförmige Mikroträger sind bevorzugt.
Als Material der Mikroträger kann im Säugetierorganismus resorbierbares oder nicht resorbierbares Material gewählt werden. Soweit die Kultivierung von Zellen im erfindungsgemäßen Zellkulturgefäß vorgesehen ist, um die Zellen anschließend in einen Bioreaktor zu überführen, um sie beispielsweise zu expandieren, kann nicht resorbierbares Material verwendet werden. Beispiele für nicht resorbierbare Materialien sind Polystyren, Polyethylen, quervernetztes Dextran (Cytodex) oder Glas.
Sollen die Zellen hingegen direkt nach der Kultivierung im erfindungsgemäßen Zellkulturgefäß in einen Patienten zurückgebracht werden, ist es bevorzugt, als Material der Mikroträger ein im Säugetierorganismus resorbierbares Material zu verwenden. Hierbei kommen insbesondere resorbierbare Polyester wie PLGA (poly-Lactyl-Glycolylsäure), PGA, PLA sowie Gelatine, Collagen, Dextran, Chitosan oder Fibrin in Frage. Bei der Entscheidung kann unter anderem eine Rolle spielen, wie schnell das Material resorbiert werden soll. So wird PGA beispielsweise schneller resorbiert als PLGA.
Es kann ebenfalls poröses und nicht-poröses Material unterschieden werden. Poröses Mikroträger bieten eine höhere Oberfläche, können jedoch in der Homogenität der Größenverteilung weniger gleichmäßig sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Einlassöffnung des Zellkulturgefäßes so gestaltet, dass sie mindestens zwei Zustände aufweist. In einem ersten Zustand ist die Einlassöffnung durch das Sieb versperrt, so dass die Mikroträger nicht aus dem Behälter entfernt werden können. In einem zweiten Zustand ist die Einlassöffnung frei. Die zwei Zustände können mechanisch reversibel ineinander überführt werden.
Insbesondere kann bei dieser Ausführungsform eine in der Einlassöffnung angebrachte, mechanisch verschiebbare Platte vorgesehen sein, in welcher das Sieb in einer ersten Position angeordnet ist. In einer zweiten Position ist eine Aussparung vorgesehen. Die Platte kann so verschoben werden, dass in einem ersten Zustand die erste Position, und in einem zweiten Zustand die zweite Position die Einlassöffnung einnimmt. Es liegt also im ersten Zustand das Sieb vor der Öffnung, und durch Verschieben der Platte kann das Sieb aus der Öffnung entfernt und eine Aussparung in der Platte vor die Öffnung geschoben werden.
Alternativ kann die im vorstehenden Absatz beschriebene Ausführungsform auch realisiert werden, indem die das Sieb und eine Einsparung aufnehmende Platte fest im Behälter angeordnet ist, die Einlassöffnung hingegen verschiebbar angeordnet ist.
Die beschriebene Anordnung weist den Vorteil auf, dass ohne Aufwendiges Eingreifen die Einlassöffnung z. B. zur Aufnahme der Suspension, zur Begasung im Zellkulturschrank oder zum Ausbringen der Mikroträger geöffnet werden kann. Zum Waschen oder, soweit die Suspension bei der Aufnahme in das Zellkulturgefäß gesiebt werden soll, beim Einbringen der Suspension kann das Sieb vor die Öffnung platziert werden.
Alternativ können weitere Zustände vorgesehen sein, die jeweils Positionen der verschiebbaren Platte entsprechen können. So kann ein dritter Zustand vorgesehen sein, der vollständig geschlossene. Dieser entspricht einer weder mit Aussparung noch mit Sieb versehenen, massiven Ausführung der entsprechenden Position der Platte. Dieser Zustand wird vorteilhaft zum Transport oder Schütteln des Zellkulturgefäßes verwendet.
Weitere Positionen können z. B. alternative Sieb-Maschenweiten betreffen, soweit z. B. für die Aufnahme der Suspension eine besondere Maschenweite als Filter vorgesehen ist. Ebenso kann eine Position mit einem Probennehmer z. B. zur Probennahme für Rückstellproben oder zur in-Prozess-Qualitätskontrolle ausgestattet sein.
In einer Ausführungsform ist das Sieb sowie eine zur Aufnahme des distalen Endes einer Kanüle vorgesehene Öffnung in einer auf den Behälter aufschraubbaren Kappe angeordnet. Darin kann auch die verschiebbare Platte angeordnet sein.
Alle Komponenten des Zellkulturgefäßes werden bevorzugt aus leicht sterilisierbarem Kunststoffmaterial hergestellt.
Weiterhin ist ein Verfahren zur Gewinnung von adhärenten Zellen aus einer Zellsuspension Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Dabei wird eine adhärente Zellen enthaltene Zellsuspension in ein erfindungsgemäßes Zellkulturgefäß gesaugt. Dieses Gefäß umfasst einen Behälter, eine Einlassöffnung in den Behälter mit einem entfernbar angeordneten Sieb, sowie Mikroträger.
Die Zellsuspension wird in einem ersten Kulturschritt in an den Mikroträgern anhaftende adhärente Zellen und einen Überstand getrennt. In einem ersten Waschschritt wird darauf der Überstand durch die mit einem Sieb versehene Einlassöffnung entfernt. Nach Entfernen des Siebes aus der Einlassöffnung werden dann die an den Mikroträgern anhaftenden adhärenten Zellen in einem Ernteschritt aus dem Behälter gewonnen.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt zwischen dem ersten Waschschritt und dem Ernteschritt ein zweiter Kulturschritt, in welchem die an den Mikroträgern anhaftenden adhärenten Zellen in Zellkulturmedium kultiviert werden. Ebenso kann mindestens ein zweiter Waschschritt folgen, in welchem das Zellkulturmedium durch die mit einem Sieb versehene Einlassöffnung entfernt wird.
Insbesondere ist das Verfahren geeignet zur Behandlung von Knochenmark. Bevorzugt wird dabei die Zellsuspension aus der Knochenmarkhöhle eines Säugetierknochens durch eine Kanüle direkt in den Behälter gesaugt. Die Behandlung von Blut ist mittels dieses Verfahrens ebenfalls möglich. Nach einem oder mehreren Kultur- und Waschschritten können dabei nach dem Ernteschritt die an den Mikroträgern anhaftenden adhärenten Zellen direkt zur therapeutischen Verwendung zur Verfügung stehen.
Der Vorteil der beschriebenen Ausführungsform ist dabei, dass entnommenes Knochenmark aus der Punktionskanüle direkt in ein Kulturgefäß überführt werden kann, in welchem die adhärenten Zellen kultiviert und von nicht-adhärenten Zellen separiert, und aus welchem die gewonnenen Zellen direkt zur therapeutischen Behandlung zurückgewonnen werden können. Es entfallen die verschiedenen Überführungsschritte, die jeweils mit Kontaminationsgefahren verbunden sind.
Als kultivierte Zellen kommen insbesondere mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks in Frage, insbesondere solche, die Knochen, Knorpel, Muskel, Nervenzellen oder Herzzellen bilden können. Ein besonderer Vorzug der Erfindung ist dabei, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren die Isolierung und Kultur in einem Schritt als Suspension ermöglichen.
Prinzipiell ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf Zellen des Knochenmarks beschränkt, sondern kann auf jede Suspension angewendet werden, in der adhärente Zellen vorhanden sind wie z. B. Blut. So könnte ebenfalls Gewebe durch Verdau in-vitro in eine Suspension überführt und dann als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Zellen zur Herstellung eines Arzneimittels. Dabei kommen als Anwendungsgebiete die Prävention oder Therapie von Knochen- oder Knorpeldefekten von (z. B. Frakturen, Osteoarthrose) oder Herzmuskelschäden (z. B. durch Myokardinfarkt) in Frage.
Figurenbeschreibung
Die Erfindung wird im Folgenden durch Zeichnungen und Beispiele detailliert beschrieben.
Es zeigen im einzelnen
1a eine Schnittansicht des Zellkulturgefäßes mit Sieb umfassender Kappe
1b eine Draufsicht der Kappe
1c eine Unteransicht der Kappe
2a eine Schnittansicht des Zellkulturgefäßes mit drehbarer Kappe
2b eine Draufsicht der drehbaren Kappe
2c eine Unteransicht der drehbaren Kappe
2d eine Aufsicht des Zelkulturgefäßes ohne Kappe
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung eines Zellkulturgefäßes
Für die Herstellung des beispielhaft in 1 gezeigten Zellkulturgefäßes 10 wurde eine Monowette (Sarstedt) zur Grundlage genommen. Das Septum wurde entfernt. Das Zellkulturgefäß 10 umfasst einen länglichen Behälter 2 mit einem an einem Ende des Behälters 2 gelegenen Außengewinde (nicht gezeigt) sowie eine abschraubbaren Kappe 1, welche ein Innengewinde (nicht gezeigt) aufweist. Ferner ist ein Stempel 3 vorhanden, welcher am der Kappe 1 gegenüberliegenden Ende des Behälters 2 angebracht ist, und durch das Herausziehen desselben ein Vakuum im Behälter 2 des Zellkulturgefäßes 10 erzeugt werden kann.
Das Zellkulturgefäß 10 wurde durch Einkleben des Siebes 6 in die Kappe 1 befestigt. Als Sieb 6 wurde der Nylonfilter eines Zellsiebes (Becton Dickinson) verwendet.
In dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel ist die Öffnung 20, durch welche Zellen bzw. Zellsuspensionen in den Behälter 2 aufgenommen werden können, zentriert in der Kappe 1 angeordnet. Ein Kanülenanschluss 5 kann das distale Ende einer Kanüle oder einer Punktionsnadel aufnehmen.
Die Kappe 1 trägt das Sieb 6 sowie einen Dichtungsring 7, welcher den Abschluss der Kappe 1 mit dem Behälter 2 im geschlossenen Zustand gewährleistet. Durch herausziehen des Stempels 4 in dem durch den Behälter 2 gebildeten Kolben 3 wird in Richtung der Öffnung 30 ein Unterdruck erzeugt. Dieser führt dazu, dass an der Öffnung 20 befindliche Zellen oder Zellsupsenionen in den Behälter 2 gesaugt werden können.
Durch Entfernen der Kappe 1 wird die Öffnung 20 freigemacht, so dass Mikroträger aus dem Behälter 2 ausgebracht werden können. Gegebenenfalls kann die Kappe 1 durch eine kein Sieb enthaltene Kappe ausgetauscht werden.
Alternativ kann der Behälter 2 auch wie in 2 gezeigt durch eine in einer verschiebbaren Platte 8 angeordnete Öffnung 20 befüllt werden. Dabei ist im die Einlassöffnung 20 enthaltenen Ende des Behälters 2 eine zylindrische Platte 9 angeordnet, welche 2 Aussparungen 12, 13 umfasst. Die Aussparung 12 ist dabei mit einem Sieb 6 versehen, die Aussparung 13 weist kein Sieb auf. Durch Verdrehen der Kappe 8 kann nun die Öffnung 20 jeweils über die offene oder die mit einem Sieb 6 verschlossene Position 12, 13 angeordnet werden. Eine Rasthalterung 11 kann dabei für die Arretierung der Positionen sorgen.
Beispiel 2: Isolierung und Kultivierung im Zellkulturgefäß
Knochenmark wird mittels dem vorstehend beschriebenen Zellkulturgefäß 10 und einer an den Kanülenanschluss 5 angeschlossenen Aspirationsnadel durch Ziehen des Stempels 4 durch den Kolben 3 aspiriert. Das aufgesogene Knochenmark wird mit den in dem Zellkulturgefäß 10 vorliegenden Mikroträgern vermischt, sodass adhärent wachsende Zellen an die Mikroträgeroberflache anhaften können. Ggf. kann im Anschluss zusätzlich Kulturmedium (DMEM (1 g/L Glukose) + 10% FBS, 100 U/mL Penicillin, 10.000 μg/mL Streptomycin, 20 mM Hepes, 2 mM L-Glutamin, 2 ng/mL rh bFGF) aufgesogen werden. Anstelle der Kanüle wird im Folgenden ein 0,2 μm Sterilfilter angebracht. So wird das Zellkulturgefäß 10 im Brutschrank bei 37°C und 5% CO₂ statisch oder dynamisch für bis zu 72 Stunden inkubiert.
Nach der Inkubationzeit, in der die Zellen an die Mikroträger anhaften, werden die adhärenten Zellen von den verbleibenden Suspensionszellen getrennt. Dazu wird der Stempel 4 in den Behälter 2 hineinbewegt. Beim Ausstoßen des Knochenmarks und der Suspensionszellen durch die Öffnung 20 werden die Mikroträger mit den adhärenten Zellen durch das Sieb 6 im Zellkulturgefäß 10 zurückgehalten.
Anschließend wird Kulturmedium durch den Filter in das Zellkulturgefäß 10 aufgesogen. Dieser Waschschritt kann ggf. mehrfach wiederholt werden. Durch den Wechsel von Inkubation im Brutschrank mit Sterilfilter-Aufsatz und Medienwechsel durch das Sieb lassen sich die Zellen in dem Zellkulturgefäß 10 kultivieren.
Anschließend können die Zellen auf den Mikroträgern aus dem Zellkulturgefäß ausgestoßen werden. Dazu wird die abschraubbare Kappe 1 mit dem Sieb 6 abgenommen und mit einer Kappe 1 ohne Sieb ersetzt. Diese kann ebenfalls mit einer Kanüle für die Injektion versehen werden.
Beispiel 3: Animpfen eines Bioreaktors
Die Isolation der Zellen erfolgt wie oben beschrieben. Im Anschluss an die Trennung von adhärenten und Suspensionszellen werden die Zellen jedoch für das Animpfen eines Bioreaktors verwendet. Dafür werden die Mikroträger über eine Kappe 1 ohne Sieb 6 direkt über ein Septum in den Bioreaktor, der bereits mit Kulturmedium und ggf. frischen Mikroträgern bestückt ist, injiziert. Das erlaubt eine Expansion unter kontrollierten und regulierten Bedingungen.
Beispiel 4: Alternative Ausführung des Ausgangs
Knochenmark wird mittels des in 2 beschriebenen Zellkulturgefäßes 10, welches eine drehbaren Kappe 1 sowie eine Platte 8 mit den verschiedenen Positionen „offen” 13, „Sieb” 12 und „geschlossen” für den Spritzenausgang ausgestattet ist, aspiriert. Dazu ist die Position des Ausgangs auf „offen” 13 eingestellt und eine Aspirationsnadel an den Kanülenanschluss 5 angeschlossen. Nach der Aufnahme des Knochenmarks und die Vermischung mit den in dem Zellkulturgefäß vorliegenden Mikroträgern kann das Zellkulturgefäß mittels Positionsänderung auf „geschlossen” für einen eventuellen Transport in das weiterverfahrende Labor verschlossen werden. Anstelle der Kanüle wird im Folgenden ein 0,2 μm Sterilfilter 6 angebracht und der Ausgang in die Position „offen” 13 gedreht. So wird das Zellkulturgefäß 10 im Brutschrank bei 37°C und 5% CO₂ statisch oder dynamisch für bis zu 72 Stunden inkubiert. Nach der Inkubationzeit, in der die Zellen an die Mikroträger anhaften, werden die adhärenten Zellen von den verbleibenden Suspensionszellen getrennt. Dazu wird der Ausgang des Zellkulturgefäßes 10 in die Position „Sieb” 12 gedreht und der Sterilfilter 6 durch eine Kanüle ersetzt. Beim Ausstoßen des Knochenmarks und der Suspensionszellen werden die Mikroträger mit den adhärenten Zellen im Sieb 6 zurückgehalten. Anschließend wird Kulturmedium (DMEM (1 g/L Glukose) + 10% FBS, 100 U/mL Penicillin, 10.000 μg/mL Streptomycin, 20 mM Hepes, 2 mM L-Glutamin, 2 ng/mL rh bFGF) durch den Filter in das Zellkulturgefäß aufgesogen. Dieser Waschschritt kann ggf. mehrfach wiederholt werden. Anschließend wird der Ausgang mittels Drehen in die Position ”offen” 13 freigegeben und die Mikroträger mit den adhärenten Zellen appliziert.

1: Abschraubbare Kappe mit Innengewinde
2: Behälter mit Außengewinde für 1
3: Kolben
4: Stempel
5: Kanülenanschluss
6: Sieb
7: Innenring der Kappe zur Abdichtung
8: Arretierte verschiebbare Kappe
9: Zylinder-Platte mit 2 Aussparungen
10: Zellkulturgefäß
11: Rasthalterung für die Arretierung der Positionen
12: Aussparung mit Sieb, Position „Sieb”
13: Aussparung, Position „offen”
14: Position „geschlossen”
15: Dichtung
20: Einlassöffnung
21: mit Stempel verbundenes Eingriffselement
30: Öffnung zum Anlegen eines Druckunterschiedes

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- US 20030093034 A1 [0007]
- WO 99/15637 [0008]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Zangi et al., Tissue Engineering 12, 2343 (2006) [0008]

Claims

Zellkulturgefäß (10) mit einem Behälter (2) umfassend – eine Einlassöffnung (20) zur Aufnahme einer Zellsuspension in den Behälter (2), wobei in der Einlassöffnung (20) ein durch eine im wesentlichen einheitliche Maschenweite charakterisiertes Sieb (6) entfernbar angeordnet ist, – eine Öffnung 30 zum Anlegen eines Druckunterschiedes zum Einsaugen oder Ausbringen einer Flüssigkeit in den Behälter, – durch einen im wesentlichen einheitlichen Durchmesser charakterisierte Mikroträger umfassend ein Material zur Anhaftung von Zellen, gekennzeichnet dadurch, dass die Maschenweite geringer als der Durchmesser der Mikroträger ist.
Zellkulturgefäß gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass das Material zur Anhaftung von Zellen bioresorbierbar ist.
Zellkulturgefäß gemäß Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass der Behälter (2) – im wesentlichen längserstreckt ist, – ein erstes Ende, umfassend die Einlassöffnung (20), und ein zweites Ende aufweist, – zwischen dem ersten und dem zweiten Ende einen Hubkolben (3) bildet, – wobei der Hubkolben (3) einen in der Richtung vom ersten Ende zum zweiten Ende beweglichen Stempel (4) aufweist, welcher mit der Wand des Behälters (2) gasdicht abschließt, – der Stempel (4) durch ein mit dem Stempel verbundenes Eingriffselement (21) bewegbar ist.
Zellkulturgefäß gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, dass die Einlassöffnung (20) zur Aufnahme des distalen Endes einer Kanüle ausgeformt ist.
Zellkulturgefäß gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, dass der Durchmesser der Mikroträger zwischen 20 und 500 μm beträgt.
Zellkulturgefäß gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, dass der Durchmesser der Mikroträger zwischen 50 und 250 μm beträgt.
Zellkulturgefäß gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, dass die Mikroträger im wesentlichen aus einem im Säugetierorganismus resorbierbaren Material bestehen.
Zellkulturgefäß gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, dass die Einlassöffnung (20) mindestens zwei Zustände aufweist, – wobei in einem ersten Zustand die Einlassöffnung (20) durch das Sieb (6) versperrt, und – in einem zweiten Zustand die Einlassöffnung (20) frei ist, und wobei – die mindestens zwei Zustände mechanisch reversibel ineinander überführt werden können.
Zellkulturgefäß gemäß Anspruch 8, gekennzeichnet durch eine in der Einlassöffnung (20) angebrachte, mechanisch verschiebbare Platte (8), in welcher das Sieb (6) in einer ersten Position (12) sowie eine Aussparung in einer zweiten Position (13) vorgesehen ist, und wobei die Platte (8) so verschoben werden kann, dass in einem ersten Zustand die erste Position (12), und in einem zweiten Zustand die zweite Position (13) die Einlassöffnung (20) einnimmt.
Verfahren zur Gewinnung von adhärenten Zellen aus einer Zellsuspension, wobei – eine adhärente Zellen enthaltene Zellsuspension in ein Zellkulturgefäß gemäß mindestens einem der vorstehenden – umfassend einen Behälter (2), – eine Einlassöffnung (20) in den Behälter (2) mit einem entfernbar angeordneten Sieb (6), – sowie Mikroträger gesaugt wird, – die Zellsuspension in einem ersten Kulturschritt in an den Mikroträgern anhaftende adhärente Zellen und einen Überstand getrennt wird, – der Überstand in einem ersten Waschschritt durch die mit Einlassöffnung (20), in der ein Sieb (6) angeordnet ist, entfernt wird, – nach Entfernen des Siebes (6) aus der Einlassöffnung (20) die an den Mikroträgern anhaftenden adhärenten Zellen in einem Ernteschritt aus dem Behälter gewonnen werden.
Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellsuspension Knochenmark eines Säugetiers umfasst.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche 10 bis 11, gekennzeichnet dadurch, dass zwischen dem ersten Waschschritt und dem Ernteschritt – mindestens ein zweiter Kulturschritt erfolgt, in welchem die an den Mikroträgern anhaftenden adhärenten Zellen in Zellkulturmedium kultiviert werden, und – mindestens ein zweiter Waschschritt folgt, in welchem das Zellkulturmedium durch die Einlassöffnung (20), in der ein Sieb (6) angeordnet ist, entfernt wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche 10 bis 12, gekennzeichnet dadurch, dass – die Zellsuspension aus der Knochenmarkhöhle eines Säugetierknochens durch eine Kanüle in den Behälter gesaugt wird, und dass – nach dem Ernteschritt die an den Mikroträgern anhaftenden adhärenten Zellen direkt zur therapeutischen Verwendung zur Verfügung stehen.
Verwendung von durch ein Verfahren gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche 10 bis 13 gewonnenen Zellen zur Herstellung eines Arzneimittels.
Verwendungsanspruch gemäß Anspruch 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder Therapie von Knochen- oder Knorpeldefekten oder Herzmuskelschäden.