CH631207A5

CH631207A5 - Verfahren zur zellzuechtung in vitro und vorrichtung zur ausfuehrung des verfahrens.

Info

Publication number: CH631207A5
Application number: CH440377A
Authority: CH
Inventors: Joseph Feder; Katharine Ku; Mau Jung Kuo
Original assignee: Monsanto Co
Priority date: 1976-04-12
Filing date: 1977-04-07
Publication date: 1982-07-30
Also published as: BE853416A; IL51858A0; FR2348270A1; JPS603474B2; IL51858A; IT1077765B; NL7703847A; JPS52125688A; FR2348270B1; US4087327A; DE2715821A1; ZA772208B; AU2411277A; CA1071556A; NL188808B; AU514239B2; NL188808C; GB1514906A; DE2715821C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Zellkultur in vitro, wobei längsgerichtete hohle oder volle Fasern in einer flachen Schicht als Matrix für die Zellanlagerung angeordnet werden, und der Fluss des Kulturmediums i o praktisch gleichförmig durch die Faserschicht und quer zur Ebene der Längsachsen der Fasern geleitet wird. Durch die Verwendung eines relativ flachen Faserbetts und eines relativ kurzen Flussweges für das Medium wird das Gefälle von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten im Vergleich zu den bishe- is rigen Bündel- oder Hülsenanordnungen wesentlich verringert und eine vollständigere Ausnutzung der Faseroberfläche erzielt. Der Begriff flache Schicht bedeutet eine Schicht oder ein Bett, dessen Länge und Breite wesentlich grösser sind als die Dicke der Schicht. Die Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens 20 ist gekennzeichnet, wie in Anspruch 4 angegeben wird.

Im Rahmen der Erfindung sind mehrere Variationen des Zellkulturverfahrens und der Vorrichtung möglich. Die folgende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen, zusammen mit den beigefügten Zeichnungen soll zum besseren 25 Verständnis beitragen:

Abb. 1 ist eine perspektivische Darstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung.

Abb. 2 ist eine auseinandergezogene Darstellung des Gefäs-ses der Abb. 1, in der die Innenteile gezeigt werden. 30

Abb. 3 ist ein Schnitt entlang derLinie3-3in Abb. 1.

Abb. 4 ist eine auseinandergezogene Darstellung einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform.

Abb. 5 ist eine perspektivische Darstellung einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform. 35

In den Abbildungen 1-3 bezeichnet die Zahl 10 allgemein ein Zellkulturgefäss. Das Gefäss 10 besteht aus einem im allgemeinen rechteckigen, parallelen, mit Rohren versehenen Gehäuse 11 mit einem abnehmbaren Unterteil 12 und Oberteil 13. Das untere Gehäuseteil 12 hat parallele Seitenwände 14und 40 15 sowie parallele Stirnwände 16 und 17. In gleicher Weise hat das obere Gehäuseteil 13 parallele Seitenwände 18 und 19 und parallele Stirnwände 20 und 21. Bei dem oberen Gehäuseteil 13 sind die unteren Teile der Wände 18,19,20 und 21 zurückgesetzt, so dass sie bündig in den Umfang der Innenseiten der 45 Wände 14,15,16 und 17 des unteren Gehäuseteils 12 passen, während die oberen Flanschteile der Wände 18,19,20 und 21 so gearbeitet sind, dass sie eben auf dem oberen Rand der Wände 14,15,16 und 17 aufsitzen.

Die zwei Teile des Gehäuses 11 werden in geeigneter Weise mit konventionellen Befestigungen wie Zwingen, Schrauben oder Bolzen 37 mit Flügelmuttern 22 wie abgebildet, oder in ähnlicher Weise miteinander verbunden. Wenn gewünscht kann für die beiden Gehäuseteile auch ein Klebver-schluss verwendet werden.

Im geschlossenen Zustand begrenzen die Teile 12 und 13 eine Kammer 23 innerhalb des Gehäuses. Der Boden 24 des Gehäuses ist praktisch flach, während die Decke 25, wie abgebildet, im allgemeinen eine konische Form hat, so dass die Höhe der Kammer 23 von Mittelpunkt der Decke 25 ausgehend radial in alle Richtungen abnimmt.

In die Wände des Reaktionsgefässes 10 und als Verbindung zu der Kammer 23 sind die Mediumeinlässe 26 und 27 in das Gehäuseunterteil 11 und der Mediumauslass 28 in die Mitte des Gehäuseoberteils eingefügt. Die Mediumeinlässe sind ausserdem mit einem Mediumvorratsbehälter verbunden, aus dem das Medium über Pumpen oder durch hydrostatischen Druck zufliesst (nicht abgebildet). Der Mediumauslass ist mit einem

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Behälter für verbrauchtes Medium verbunden (nicht abgebildet). Ebenso ist ein Zugang 29, der zur Beimpfung und Probenentnahme verwendet werden kann, im Gehäuseoberteil 11 angebracht. Zu jedem der Einlässe 26,27,28 und 29 gehört ein Adapter 30,31,32 bzw. 33 zur Regulierung des Mediumflusses und die Verteilung des Mediums in die Reaktionskammer.

Eine Schicht längsgerichteter Fasern 34 wird als relativ flaches, niederes Bett in der Kammer 23 auf einer rechteckigen Verteilerplatte 35 angeordnet. Eine Vielzahl von kleinen Öffnungen 36 ist in praktisch gleichmässigen Abständen voneinander auf der Oberfläche der Platte 35 für das Aufwärtsströmen des Mediums angeordnet. Diese Öffnungen oder Perforationen können z. B. etwa 1 bis 10 mm Durchmesser haben und können entsprechend bis zu beispielsweise etwa 10 cm voneinander entfernt liegen. Die Platte 35 ist in geeigneter Weise in der Kammer 23 montiert, so dass sie praktisch in einer horizontalen Ebene über den Mediumeinlässen 26 und 27 liegt. Diese Montierung kann mit konventionellen Mitteln wie Haltern, Flanschen, Verklebungen oder dergleichen erfolgen.

Die in dem Zellkulturgefäss 10 für die Zellanlagerung verwendeten längsgerichteten Fasern können hohle Röhrchen oder volle Fasern mit Durchmessern von im allgemeinen etwa 100 bis 1000 |im sein. Diese Fasern können aus jedem Material hergestellt werden, das für die Zellen nicht toxisch ist, das leicht zu Fasern gesponnen werden kann und das die Zellanlagerung erlaubt. Zu den geeigneten Materialien gehören z. B. verschiedene Acrylnitrilpolymere, Styrolpolymere, polyionische Polymere, Polycarbonate, Polysulfone, Polykohlehydrate wie Cellulose und Cellulosederivate, z. B. Celluloseacetat-, Cellulosetri-acetat- und Cellulosepropionatester, Polypeptide wie Collagen, Siliconkautschukpolymere, Fluorkohlenstoffe und ähnliche synthetische Harze. Beispiele geeigneter Fasern aus diesen Stoffen und Verfahren zu ihrer Herstellung sind in den US-PSen 3 228 876,3 583 907,3 691 068 und 3 821 087 beschrieben.

Die Fasern können wie in Abb. 2 parallel oder z. B. als geordnetes oder zufällig verteiltes Netz angeordnet werden. Das Faserbett kann auch mehrere Schichten übereinandergela-gerter einzelner Fasern enthalten und im allgemeinen ist die Verwendung von einer bis zu etwa 50 Faserschichten möglich. Wenn gewünscht, können zwischen einzelne Faserschichten Trägerplatten oder Distanzstücke eingeschoben werden. Diese Trägerplatten oder Distanzstücke können ähnlich wie die Verteilerplatte 35 sein, sie können auch als Gitter oder ähnliche Konstruktionen ausgebildet sein, durch die das Kulturmedium passieren kann. Das Faserbett kann auch aus einer fortlaufenden Faser bestehen, die so umgeschlagen und gefaltet wird,

dass sie eine Vielzahl von längsgerichteten Strängen oder Segmenten bildet, die horizontal in der Kammer hin- und herlaufen. Eine fortlaufende Faser kann auch um ein Gitter oder eine Trägerplatte gewickelt werden und so leicht zwei oder mehr Faserschichten in dem Bett bilden. Wenn gewünscht kann das Faserbett auch aufrecht, schräg, gefaltet, sinusförmig, gewunden oder andersförmig angeordnet werden, es muss aber eine relativ flache Faserschicht und ein relativ kurzer Mediumweg beibehalten und der Mediumfluss praktisch einheitlich durch das Faserbett und quer zur Ebene der Faserlängsachsen geführt werden.

Vorzugsweise hat das Faserbett einen im allgemeinen quadratischen horizontalen Querschnitt, um die gleichmässige Verteilung des Kulturmediums in alle Richtungen zu erleichtern.

In einem erläuternden Beispiel eines Faserbetts für ein rechteckiges Reaktionsgefäss mit Bettabmessungen von 10 cm x 10 cm können etwa 300 Fasern mit einem Durchmesser von je 3,4x 10"2 cm ideal in einer Schicht nebeneinander untergebracht werden. Eine Reaktionskammer mit fünf solcher Schichten hat dann eine effektive Faseroberfläche für die Zellanlagerung von etwa 1600 cm2.

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Die erfindungsgemässe Vorrichtung ist jedoch nicht auf Reaktionskammer ist vorzugsweise flach und nicht konkav wie diese speziellen Dimensionen beschränkt, da auch noch andere in den Abbildungen 1 -3.

Anordnungen beschrieben werden. In Abbildung 5 wird ein Zellkultur-Reaktionsgefäss 10 wie

Beim Betrieb eines Musterreaktionsgefässes wird Zellkul- in den Abbildungen 1 bis 3 dargestellt, jedoch sind zusätzliche turmedium durch die Einlasse 26 und 27 in die Kammer 23 5 Vorrichtungen für die Belüftung während der Inkubation vorgeleitet. Das Medium wird durch Einlass 29 mit einer Aus- gesehen. Bei dieser Ausführungsform sind die längsgerichteten gangskultur einer geeigneten Säugetier Zell-Linie beimpft und Fasersegmente hohl und für Luft und Sauerstoff durchlässig; die Kultur bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40 °C, Vorzugs- die Reaktionskammer ist mit Gasein- und -auslassleitungen ausweise etwa 35 bis 37 °C, bebrütet. Während der Inkubation gestattet, die mit dem Inneren der hohlen Fasern in Verbindung kann regelmässiger Mediumwechsel vorgenommen werden, 10 stehen. So sind der Gaseinlass 50 und der Gasauslass 51 einan-wobei das verbrauchte Medium durch den Auslass 28 abgege- der gegenüberliegend in den Gehäusestirnwänden 16 bzw. 17 ben und frisches Medium durch die Einlasse 26 und 27 wieder angebracht. Der Gaseinlass 50 erlaubt den Eintritt von Luft eingeführt wird. Wenn gewünscht, kann das Kulturmedium vor oder Sauerstoff durch ein Sammelstück in der Stirnwand 16 der Einleitung in das Zellkultur-Reaktionsgefäss mit konventio- und von da aus in die offenen Enden der darin eingelassenen nellen Mitteln belüftet werden. Im Anschluss an die Inkubation is hohlen Fasern. Gasauslass 51 ermöglicht die Entfernung des können die gewünschten Stoffwechsel- oder Nebenprodukte Abgases aus den anderen Faserenden, die in der Stirnwand 17 des Zellwachstums aus dem verbrauchten Medium isoliert wer- ebenfalls in einem Sammelstück eingelassen sind. Das frische den. Proben des makromolekularen Materials können durch Kulturmedium wird durch die Einlasse 26 und 27 eingeführt, den Zugang 29 zu jedem Zeitpunkt während der Inkubation das verbrauchte Medium wird wie oben durch den Auslass 28 entnommen werden. Das Reaktionsgefäss wird vorzugsweise 20 abgegeben. Wie in der Ausführung der Abbildungen 1 bis 3 ist kontinuierlich betrieben, wobei die Einlasse 26 und 27 sowie der Zugang zur Beimpfung und Probenentnahme durch die Öff-der Auslass 28 offengehalten und auf die gewünschte Fliessge- nung 29 möglich, die Adapter 52 und 53 ermöglichen eine schwindigkeit des Kulturmediums durch entsprechendes Pum- Steuerung des Luft- oder Sauerstoffstroms durch das Zellkul-pen oder den hydrostatischen Druck eingestellt werden. tur-Reaktionsgefäss.

Das Kulturmedium fliesst in den unteren Teil der Kammer 25 Es ist ersichtlich, dass viele weitere Modifikationen und 23 unter die perforierte Platte 35, die als Verteiler dient und Änderungen der beschriebenen erfindungsgemässen Ausfüh-eine gleichmässige Verteilung des Mediums sowie einen nach rungsformen ohne Abweichungen von den grundlegenden und oben und quer zur Ebene der Faserlängsachsen gerichteten neuen Konzepten der Erfindung möglich sind. So können zum Fluss bewirkt. Die Abnahme der Höhe des Kammeroberteils 23 Beispiel Überlauföffnungen oder zusätzliche Zugangs- und Zu-mit zunehmendem Abstand vom Mediumauslass 28 unterstützt 30 lauföffnungen an verschiedenen geeigneten Stellen in den den gleichmässigen Abfluss des verbrauchten Mediums ober- Gefässwänden angebracht werden. In den Ausführungsformeri halb des Faserbettes; damit wird dem Bedarf an die Fasern mit mehreren Faserschichten können geeignet Distanzstücke durchfliessendem Medium entsprochen, was zu einer grösseren angebracht werden, um die jeweiligen Schichten in einem Gleichförmigkeit der Durchströmung der Kammer führt. bestimmten Abstand voneinander zu halten. Die abnehmbaren

Der quer zum Faserbett verlaufende Fluss und der verhält- 35 oberen und unteren Gehäuseteile können weitere geeignete nismässig kurze Weg durch das Faserbett ergeben zusammen Vorsprünge haben, damit eine wasserdichte Verbindung der einen einheitlicheren Mediumstrom, als er bei dem parallelen beiden Teile möglich ist. Die Faserenden können an den Seiten-Durchfliessen eines Kapillarenbündels in den bisherigen Ver- oder Stirnwänden der Reaktionskammer befestigt werden, sie fahren zu erzielen war. Ferner wird eine gleichmässigere können aber auch in einem auswechselbaren Sammelstück mit

Verteilung des Zellwachstums auf den Fasern und bessere Aus- *o Vergussmasse gehalten werden, wie z. B. Epoxy und anderen nutzung der verfügbaren Faseroberfläche gefördert. Die härtenden organischen Klebemitteln, die als Dichtung für die

Anordnung der erfindungsgemässen Vorrichtung schliesst also Fasern dienen können. Die Mediumeinlässe können zusätzlich die Nachteile der bisherigen Reaktionsgefässe mit parallelem kleine Öffnungen haben, die um den Umfang einer in die Reak-Durchstrom aus, bei denen die Zellen die Faserbündel nicht tionskammer führenden Rohrleitung angeordnet sind und eine ausreichend durchdringen können und die Nährstoffe am Ein- 45 radiale Verteilung des frischen Kulturmediums bewirken.

lass verbraucht werden, während eine graduelle Nährstoffver- Das erfindungsgemässe Zellkultur-Reaktionsgefäss mit fla-armung und eine unerwünschte Stoffwechselprodukteanrei- chem Bett kann auch zu Vielfacheinheiten zusammengestellt cherung stattfinden, bis der Mediumstrom das andere Ende der werden. So kann zum Beispiel eine Vielzahl von Reaktionsge-Reaktionskammer erreicht. fässen leicht in einem Inkubator gestapelt werden und so ein

In Abb. 4 wird ein modifiziertes erfindungsgemässes Zell- so Zellkultursystem mit allen hier beschriebenen Vorteilen im kulturreaktionsgefäss mit einem oberen und einem unteren grösseren Massstab bilden.

Gehäuseteil 12 bzw. 13 dargestellt. Die Mediumeinlässe 26 und Zum Bau des Reaktionsgefässes kann Metall oder Plastik-27 und der Mediumauslass 28 sind im wesentlichen die gleichen material verwendet werden, das zur Herstellung einer verhält-wie in den Abbildungen 1 bis 3, ebenso der Zugang 29 und die nismässig starren Konstruktion geeignet ist. Im allgemeinen Faserschicht 34. Die perforierte Verteilerplatte 35 der Abbil- 55 können für das Reaktionsgefäss Spritzguss-Plastikteile oder düngen 1 bis 3 wurde jedoch durch ein Metall-Mikrofilter 40 bearbeitete Metallteile verwendet werden. Die Verwendung ersetzt. Das Metall-Mikrofilter kann z. B. aus rostfreiem Stahl von durchsichtigem Plastikmaterial, wie z. B. von Polycarbonat, sein und hat vorzugsweise eine Porengrösse von etwa 0,5 bis 10 Polystyrol und Methylacrylat, wird bevorzugt, wenn die visu-um. Es bewirkt auf vorteilhafte Weise eine noch gleichmässi- eile Beobachtung des Zellwachstums möglich sein soll. Rostgere Verteilung des Kulturmediums als die Verteilerplatte 35. 60 freier Stahl wird wegen seiner Eignung für die Dampfsterilisa-Das Faserbett kann auch zwischen zwei Metall-Mikrofilter ein- tion bevorzugt. Im allgemeinen sind biologisch inerte Stoffe für geschoben werden; in diesem Fall dient der untere Filter 40 als die Herstellung aller Teile der Reaktionskammer zu verwen-Verteilerplatte, der obere Filter 41 als Diffusionsbarriere, die den, die mit dem Kulturmedium und den Kulturprodukten in die Zellen am Passieren durch den Auslass hindert und den Kontakt kommen.

Rückfluss von verbrauchtem Medium aufhält. Der obere Filter 65 Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläu-hat vorzugsweise eine Porengrösse von etwa 10 bis 100 |xm. Bei ern. Die in diesen Beispielen verwendeten Zell-Linien und Kul-dieser Ausführungsform sollte der Zugang 29 unter der hori- turmedien sind lediglich Beispiele bekannter Linien und zontalen Ebene des oberen Filters liegen und die Decke 42 der Medien und die Erfindung ist nicht darauf beschränkt. So kön-

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nen in den erfindungsgemässen Verfahren und Vorrichtungen auch andere übliche Säugetier Zell-Linien wie menschliche Lugenfibroblasten (WI-38), Nierenzellen von Rhesusaffen (MK-2) und Cervixcarcinomzellen (HeLa) oder andere konventionelle Kulturmedien wie «Eagle's basal medium» und «Ear-le's» oder «Hank's balanced sait solution» verwendet werden. Ebenso sind die in den Beispielen angewandten Impf-, Inkuba-tions- und Gewinnungsverfahren nur beispielhaft zu verstehen. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass andere bekannte Zellkulturmethoden den erfindungsgemässen Verfahren und Vorrichtungen angepasst werden können.

Beispiel 1

3T3 Mäuseembryofibroblasten, transformiert durch Affenvirus 40 (SV3T3) wurden bis zur Konfluenz in einem 75 cm2 Fal-con-Gewebekulturkolben gezüchtet, der 10 ml eines Kulturmediums aus «Dulbecco's modified Minimum Essential Medium (MEM)» mit 10% fetalem Kalbsserum enthielt. Nach Entfernung des verbrauchten Kulturmediums aus dem Kolben wurden die Zellen einige Minuten mit 2 ml 0,25% Trypsin in phosphatgepufferter Salzlösung trypsiniert, anschliessend wurde das Trypsin durch Verdünnen mit weiteren 10 ml des gleichen Kulturmediums inaktiviert. Die Zellen wurden verteilt und dann in eine sterile Spritze zur Beimpfung eines Zellkultur-Reaktionsgefässes gegeben.

Ein erfindungsgemässes Zellkultur-Reaktionsgefäss mit flachem Bett wurde mit Äthylenoxid sterilisiert, zur Entfernung der Äthylenoxidreste mit sterilem Wasser ausgewaschen und mit einer Erstfüllung mit «Dulbecco's modified Minimum Essential Medium (MEM)», das 2% fetales Kalbsserum enthielt, equilibriert. Das Reaktionsgefäss war aus Plexiglas Methylacry-latplastik und enthielt ein Faserbett mit den Abmessungen 10,16 cm (4 Zoll) mal 10,16 cm (4 Zoll) mal 1,27 cm (Vi Zoll) Höhe. Das Bett bestand aus 114 laufenden Metern (427 ft.) eines fortlaufenden Stranges hohler Kapillarfaser, der in praktisch gleicher Dicke um drei offenmaschige Nylongitter gewickelt war. Der Faserstrang hatte einen Aussendurchmesser von 340 ^m und war aus Amicon XM-50 (Polyvinylchloridacryl-Copoly-mer) gesponnen. Eine 10,16 cm (4 Zoll) mal 10,16 cm (4 Zoll) mal 0,3175 cm (Vs Zoll) dicke perforierte Verteilerplatte wurde direkt unter dem Faserbett angebracht.

Das Reaktionsgefäss wurde mit 10 ml der oben beschriebenen Zellsuspension (die 5x 106 Zellen pro ml enthielt) beimpft und 5 Stunden bei 37 °C inkubiert. Gelegentlich wurde geschüttelt, um eine gleichmässigere Anlagerung der Zellen an die Faser zu fördern. Anschliessend an die Beimpfung wurde «Dulbecco's modified Minimum Essential Medium» mit 2% fetalem Kalbsserum mit einer Geschwindigkeit von 10 ml pro Stunde in das Reaktionsgefäss gepumpt und durch die perforierte Verteilerplatte in nach oben gerichtetem Strom quer zur horizontalen Ebene der Faserlängsachsen geleitet.

Mit zunehmender Zelldichte wurde die Fliessgeschwindigkeit nach und nach auf ein Maximum von 60 ml pro Stunde erhöht, die Inkubation wurde nach 24 Tagen beendet.

Nach Abschluss der Inkubation wurden die Zellen durch Abbau der Reaktionskammer und gründliches Auswaschen ihres Inhalts in normaler physiologischer Salzlösung gewonnen. Die beim Waschen abgefallenen Zellen und das Faserbett mit den noch an den Fasern haftenden Zellen (der Mehrzahl der Zellen) wurden 15 Stunden mit In NaOH zur Verdauung des gesamten Zellwachstums behandelt. Das Verdauungsprodukt wurde dann gefroren und für die DNA-Analyse zur Bestimmung der gewonnenen Zellmenge aufbewahrt.

Dieses Zellkulturverfahren wurde in einer ähnlichen Reaktionskammer mit flachem Bett wiederholt, jedoch betrug die gesamte Inkubationszeit 59 Tage.

Zum Vergleich wurde dieses Zellkulturverfahren in einem hülsenförmigen Zellkulturgefäss mit parallelem Mediumfluss und einer Faseroberfläche, die der des Flachbettbehälters entsprach, wiederholt. Es wurden etwa 800 einzelne hohle Kapillarfasern aus dem gleichen Material und mit dem gleichen Durchmesser wie oben in einem Hülsenbündel von 2 cm Durchmesser und 20 cm Länge angeordnet. Das Kulturmedium wurde nicht wie in der Kammer mit flachem Bett quer zum Faserbett geleitet, sondern strömte vom Einlass an einem Ende der Hülse zum Auslass am anderen Hülsenende. Wie bei der Reaktionskammer mit flachem Bett wurden zwei getrennte Inkubationen von 24 bzw. 59 Tagen durchgeführt.

Die DNA-Analysen der in den obigen Tests gewonnenen Zellen sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich:

Kammer

Inkubations

Zellanalyse

Zelläquivalent*

typ zeit in Tagen mg DNA

Flachbett

24

18,374

1,837X10'

Flachbett

59

18,84

1.84X109

Hülse

24

4,668

0,4668 xlO9

Hülse

59

11,836

l,18xl09

*Geschätzt über 10 (ig DNA = 106 Zellen

Zusätzlich zu der schnelleren Erzeugung einer grösseren Zellmenge waren in der Flachbettkammer die Zellen gleichförmiger über die vorhandene Faseroberfläche verteilt als in der Hülsenkammer.

Beispiel 2

Die Zellkulturverfahren von Beispiel 1 wurden in einem erfindungsgemässen Reaktionsgefäss mit flachem Bett wiederholt, wobei das Faserbett aus a) Polysulfonfaser mit einem Aussendurchmesser von 560 H,m und einer Gesamtlänge von 12,6 m (414 ft.) und b) Polyacrylnitrilfaser mit einem Aussendurchmesser von 757 n,m und einer Gesamtlänge von 89 m (293 ft.)

bestand.

Die gewonnenen Zellen wurden mittels DNA-Analyse geschätzt und entsprachen a) l,9x 109 Zellen bei Polysulfonfasern nach 31 Tagen Inkubation und b) 2,295 x 109 Zellen bei Polyacrylnitrilfasern nach 34 Tagen Inkubation.

Beispiel 3

Nierenzellen junger Hamster (BHK) (ATCC Nr. CCL10) wurden in einem erfindungsgemässen Reaktionsgefäss mit flachem Bett gezüchtet. Es wurde «Dulbecco's modified Minimum Essential Medium», das 10% fetales Kalbsserum enthielt, verwendet und das Medium während einer 23tägigen Inkubationszeit belüftet. Es wurden ähnlich gute Zellkulturresultate wie in Beispiel 1 und 2 erhalten.

«Dulbecco's modified Minimum Essential Medium» ist ein handelsübliches Standard-Kulturmedium. Es wurde von Micro-biological Associates, Bethesda, Maryland, unter Katalognummer 11-305 als Dulbecco's MEM, 4,5 g/1 Glucose bezogen; siehe auch In Vitro, Vol. 6, Nr. 2, S. 89-94 (1970).

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2 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Verfahren zur Zellkultur in vitro, bei dem die wachsenden wasserdichte Verbindung mit dem anderen Gehäuseteil verse-Zellen auf einer Vielzahl von längsgerichteten Fasern angela- hen ist, und dass die Faserschicht zwischen einen oberen gert werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Fasern in einer Metall-Mikrofilter mit einer Porengrösse von 10 bis 100 jim und flachen Schicht angeordnet sind und das Kulturmedium so ver- 5 einen unteren Metall-Mikrofilter, der als Verteiler dient und teilt wird, dass es praktisch gleichförmig durch die Faserschicht eine Porengrösse von 0,5 bis 10 |j.m hat, eingeschoben ist. und quer zur Ebene der Faserlängsachsen fliesst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass die Verteilung erfolgt, indem das Kulturmedium durch eine Einlassverteilerplatte fliessen muss, die eine Vielzahl von ">

kleinen Perforationen hat und praktisch parallel zu der Faserschicht und zwischen ihr und dem Einlass für das Medium Die Kultur lebender Zellen in vitro wird für eine Vielzahl angeordnet ist. von Zwecken benötigt, so für die Herstellung von Virus-Impf-

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Stoffen, die Gewinnung wertvoller Nebenprodukte des Zell-dass die Verteilerplatte ein Metall-Mikrofilter ist. 15 Stoffwechsels und die Herstellung gewebeartiger Stoffe für

4. Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens gemäss künstliche Organe.

Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Gehäuse, eine Reak- Für die Zellkultur in vitro sind bisher verschiedene Verfah-

tionskammer innerhalb des Gehäuses, Einlasse und Auslässe ren entwickelt worden. Bei einem weitverbreiteten Verfahren für ein Kulturmedium, die mit dieser Kammer in Verbindung haften und wachsen die Zellen auf der flachen Seite entspre-stehen, eine Vielzahl längsgerichteter Fasern, die in einer fla- 20 chend geformter stationärer Behälter wie z. B. den gewöhnlichen, in der Kammer befestigten Schicht angeordnet sind, chen Petrischalen oder rechteckig geformten Kulturplatten, sowie Verteilervorrichtungen, die den Fluss des Kulturmedi- Das Verfahren mit flachen Oberflächen wird auch bei den Vor-ums praktisch gleichförmig durch die Faserschicht und quer richtungen mit Plattenstapeln angewandt, bei denen eine konti-zur Ebene der Längsachsen der Fasern leiten. nuierliche Kunststoffolie um eine Reihe von in gewissem

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, 25 Abstand angeordneten Trägern geführt wird, wie dies in der dass die Verteilervorrichtung aus einer Einlass-Verteilerplatte US-PS 3 843 454 beschrieben wird. Als Trägerfläche für die mit einer Vielzahl kleiner Perforationen besteht und praktisch Zellzucht in Einzelschicht-Kultur wurde anstelle von blankem parallel zu der Faserschicht sowie zwischen Faserschicht und Glas oder Plastik auch collagenbeschichtetes Glas verwendet. Mediumeinlass angebracht ist. Als dreidimensionale Trägermatrix für die Zellkultur wurde

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, 30 auch ein collagenbeschichteter Celluloseschwamm vorgeschla-dass die Verteilerplatte ein Metall-Mikrofilter ist. gen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, Weitere Informationen über diese und andere konventio-dass ein Auslass-Metallmikrofilter auf der Auslassseite der nelle Zellkulturverfahren sind in Standardwerken wie z. B. dem Faserschicht und praktisch prallel zu ihr angebracht ist. von Kruse und Patterson, «Tissue Culture Methods and Appli-

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, 35 cations», Academic Press, New York, 1973, enthalten.

dass die Metallmikrofilter-Verteilerplatte auf der Einlassseite Kürzlich wurde die Verwendung hohler Fasern oder syn-

eine Porengrösse von 0,5 bis 10 (im und der Metallmikrofilter thetischer Kapillaren als Trägermatrix für die Zellkultur auf der Auslassseite eine Porengrösse von 10 bis 100 n,m hat. beschrieben. Knazek berichtet darüber in Science 178,65-67

9. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, (1972), die spezifische Vorrichtung für dieses Verfahren ist in dass Zugangsmöglichkeiten zu der Kammer für Beimpfung und « den US-PSen 3 821 087 und 3 883 393 beschrieben. Bei dieser Probenentnahme vorhanden sind. Vorrichtung ist ein Bündel von Ultrafiltrationsfasern in einem

10. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, zylindrischen Gehäuse oder einer Hülse gefasst. Im wesentli-dass getrennte Gasein- und Gasauslässe mit der Kammer in chen arbeitet die Vorrichtung mit Hilfe von Membranperfusion Verbindung stehen. durch künstliche Kapillaren. Die ausgedehnte Oberfläche des

11. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, 45 Hohlfasersystems erlaubt selektiven Transport durch die dass die Gehäusedecke innen konisch ist, wodurch die Höhe Faserwände und ermöglicht molekulare Austauschvorgänge der Kammer in alle Richtungen radial vom Deckenmittelpunkt zwischen dem das Faserinnere durchfliessenden Strom und ausgehend abnimmt, und dass der Auslass für das Kulturme- einem Bad auf der Aussenseite der Fasern durch einfache Gra-dium in der Mitte der Decke angebracht ist. dientendiffusion. Dieser Hohlfaserapparat wird von Knazek in

12. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, so Fédération Proc. 33,1978-81 (1974) und in Exptl. Cell Res. 84, dass das Gehäuse aus einem abnehmbaren Ober- und Unterteil 251-4 (1974) näher beschrieben. Dort wird er zur Herstellung besteht und eines der Gehäuseteile mit Vorsprüngen für eine von HCG-Hormon aus menschlichen Choriocarcinomzellen wasserdichte Verbindung mit dem anderen Gehäuseteil verse- verwendet. Die Wachstumsgeschwindigkeit ist elfmal grösser hen ist. als in einem 75 cm* Monolayer-Kolben (von Falcon). Hülsenge-

13. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, ss räte der von Knazek beschriebenen Artund ihre Verwendung dass die längsgerichteten Fasern aus einem fortlaufenden in der Zellkultur sind in American Lab., Oktober 1974, S. 33-38 Faserstrang bestehen, derin praktisch gleichmässiger Dicke um beschrieben.

ein Trägergitter gewickelt ist. Ungeachtet der Brauchbarkeit von Knazeks Vorrichtung

14. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, und Verfahren ergab sich in der Praxis, dass die Verwendung dass die Faserschicht aus 1 bis 50 Lagen einzelner Fasern eo der Bündel- oder Hülsenanordnung mit Durchfluss des Kulturbesteht. médiums durch die längsgerichteten Kapillarmembranen die

15. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, völlige Durchdringung des Faserbündels mit den Zellen verhin-dass die längsgerichteten Fasern hohl und für Luft und Sauer- dert und ein unerwünschtes Gefälle im Strom des Mediums stoff durchlässig sind, und dass die Reaktionskammer Gasein- erzeugt. Die Unfähigkeit der Zellen, das Faserbündel völlig zu lass- und Gasauslassleitungen für die Belüftung durch diese es durchdringen, führt zu ungleichmässiger Verteilung der Zellen hohlen Fasersegmente hat. und zu unvollständiger Ausnutzung der für die Zellanlagerung

16. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, vorhandenen Faseroberfläche. Das unerwünschte Gefälle dass das Gehäuse aus einem abnehmbaren Ober- und Unterteil besteht aus ungleichmässiger Verteilung und Ausnutzung des

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PATENTANSPRÜCHE besteht, von denen ein Gehäuseteil mit Vorsprüngen für eine

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flüssigen Kulturmediums. Beim Durchfluss des Mediums durch das Reaktionsgefäss stehen den Zellen in der Nähe des Einlasses mehr Nährstoffe zur Verfügung, während gegen den Aus-lass zu Stoffwechselprodukte wie z. B. Milchsäure im Medium zunehmen und in unerwünschter Weise den pH beeinflussen 5 und andere toxische Einwirkungen auf die Zellen erzeugen.