DE2221911A1 - Verfahren zur kontinuierlichen Filtration - Google Patents

Description

Patentanwälte "^/ιαΜ

Dr. Ing. Waiter Abitz
Dr. Dieter F. Morf
Dr. Hans-A. Brauns *- Mai 1972

8 München Lo, i-idiiz-inauersir. 28 I^ 6

MERCK & CO., INC. Rahway, New Jersey, V.St.A

Verfahren zur kontinuierlichen Filtration

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation biologischer Materialien in einem im wesentlichen reinen Zustand, insbesondere teilchenförmiger biologischer Materialien mit einer Teilchengrösse von über etwa 50 Millimikron von Wachstumsmedium-Komponenten, speziell die Isolation dieser biologischen Materialien unter Erhaltung sehr empfindlicher, biologischer Aktivität durch einen der kontinuierlichen Arbeits-« weise besonders zugänglichen Prozess.

Man kennt Vaccirie-Technologie seit vielen Jahren. Bei der Herstellung von Vaccinen gegen infektiöse Erreger erfolgt häufig eine Inkubation eines infektiösen Erregers in einer partiell künstlichen Umgebung, die verschiedene Nährstoffe, Zellgewebe tierischen Ursprungs, Plasma-Komponenten usf. umfassen kann. Alle diese oder die meisten dies-er Wachstumsmedium-Kompo-

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nenten müssen von den geernteten Mikroorganismen entfernt werden, bevor man eine völlig befriedigende Parenteral-Vaccine erzielen kann. Wahrscheinlich stellt dieses Konzentrlerungs- und Reinigungsproblem das Haupthindernis bei einer erfolgreichen Entwicklung technischer Vaeeineprodukte dar, das sich ergibt, nachdem die Krankheitserzeuger isoliert, identifiziert und mit Erfolg kultiviert worden sind.

Zur Durchführung von Konzentrierung und Reinigung hat man schon mit unterschiedlichem Erfolg verschiedene Techniken herangezogen, die drei Hauptkategorien zugeordnet werden können: 1. der Sedimentation, z. B. Schleuderung, 2. der Adsorption-Desorption, z. B. auf Bariumsulfat-Teilchen oder lonenaustauschharzen, und 3>. der Filtration. Jeder dieser Prozesse ist primär ein diskontinuierlicher Vorgang, und zudem nicht besonders wirkungsvoll, so dass der Einzel- bzw. Grundvorgang einer zahlreichen Wiederholung bedarf, um sich dem für eine Parenteral-Vaccine benötigten Reinheitszustand zu nähern. Die Wiederholung von Einzeln oder Grundvorgängen, insbesondere im technischen Massstab, aber ist nicht nur vom Arbeitsstandpunkt aus kostspielig, sondern im Falle biologischer Produkte nimmt auch die Mb'glichkeit von Verunreinigung stark zu, und auch die sich einstellenden Verluste können sich sehr kostensteiger-nd auswirken.

In der Literatur sind Einrichtungen und Techniken zur Konzentrierung, Abtrennung und Reinigung von Kolloiden und Makromolekülen, wie Virusteilohen, durch Ultrafiltration mit Membranen der Bauart "Diaflo" beschrieben ("Publication" 415 der Ainicon Corporation, Lexington,

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Mass.). Jedoch sind diese Membranen auf Grund ihrer Porosität für den Einsatz bei grösseren biologischen . Teilchen, wie solchen mit einer Grosse von 50 Millimikron bis etwa 10 Mikron, z. B. PPlO, Trachom-Erreger," Geflügelzellen und dergleichen, ungeeignet.

Es besteht dementsprechend ein deutlicher Bedarf an einer auf grössere biologische Teilchen anwendbaren Technik, die ihrer Wirkung nach der Anwendung wiederholter Reinigungs-Konzentrierungs-Stufen äquivalent, aber automatischer Natur ist und geschlossensystemig arbeitet, so dass Handhabung, Manipulation und Zumeinwirkeiikommen verunreinigender Quellen minimiert werden.

Bei dem Verfahren gemäss der Erfindung werden Konzentrierung und Reinigung der gewünschten biologischen Materialien, mit Durchmessern von etwa 50 Millimikron bis 10 Mikron, in geschlossenen, sterilen Einheiten durchgeführt, die leicht auf die Grosse von Produktionsapparaturen auslegbar sind. Das Verfahren ergibt eine · leichtere Handhabung des Produktes bei entsprechend vermindertem Verlust an Produkt auf Grund von Verunreinigung.

Bei dem Verfahren gema'ss der Erfindung werden biologische Rohflüssigkeiten bzw. -fluide unter Druck in eine umschlossene Filterzone mit Filterporen von etwa 0,22 bis 0,65 Mikron eingeführt, wobei man die Filteroberfläche von Feststoff-Ansammlung im wesentlichen freihält. Nach Erreichung der gewünschten Materialkonzentration in dem zurückgehaltenen Gut wird die Reinigung bewirkt, indem man dem Reservoir Waschlösung mit ungefähr der gleichen Geschwindigkeit, mit der Piltrat ausgetragen wird, zu-

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führt, bis der gewünschte Reinheitsgrad erreicht ist. Apparativ ist dies durchführbar in einem geschlossenen System mit einer Filterkammer mit einem Filter gelenkter Porosität in dem vorgenannten Bereich, mit Mitteln, um die Fllteroberfläche von Feststoffansammlung im i wesentlichen frei zu halten, Mitteln zum Austragen des Filtrates, Mitteln zum Zuführen von Waschflüssigkeit zu dem zurückgehaltenen Gut, und vorzugsweise einem Mittel zur Kreislaufrückführung des zurückgehaltenen Gutes oder Retentates durch das Beschickungsgut-Reservoir. Man kann andererseits auch eine Verdünnung des konzentrierten Materials mit Waschflüssigkeiten bzw. -fluiden und Wieder-Konzentrierung mehrere Male bis zur Erreichung der gewünschten Reinheit durchführen. Im Waschzyklus wird man häufig ein Filter einsetzen, das eine feinere Porosität als das in der Konzentrierungsphase eingesetzte hat, ohne dass dies jedoch eine Bedingung darstellt.

Die Freihaltung der Filteroberfläche von Feststoffan« Sammlung kann auf verschiedenen Wegen, wie durch Rühren, Vibration, Abschaben oder, vorzugsweise, Ultrafiltration im Kanalverfahren ("Thin-Channel"-Filtration), erfolgen. Die Filtration erfolgt bei Drücken von etwa 1,4 bis 4,2 at (20 bis 6o Pounds/Quadratzoll), und die Geschwindigkeit der Kreislaufrückführung von zurückgehal- * tenem Gut (soweit diese Anwendung findet) beträgt etwa 2 bis 5 l/Min. In Abhängigkeit von der Verunreinigung des Beschickungsgutes und der Teilchengrösse des gewünschten Produktes ist für jeden Konzentrations-Reinigungs-\^organg ein optimales Verhältnis von Beschickuragsvolumen su FiI-teroberflache bestimmbar, aber er- hat sich gezeigt, dan;; dieses im allgemeinen im Bereich von etwa 0,2 bis 2 1

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S ■ .

Beschickung/dm Filteroberfläche (etwa 2 bis 20 l/Quadrat fuss) liegt.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung des Ver« fahrens gernäss der Erfindung an Hand der Konzentrierung und Reinigung bestimmter biologischer Materialien, aber die Erfindung ist nicht auf solche bestimmten Materialien beschränkt, sondern eignet sieh zur Isolation ,"jeglichen teilchenförmigen biologischen Stoffs mit einer Teilchengrösse in dem beschriebenen Bereich. ■

Beisp i el 1 '

Konzentrierung und Reinigung von PPLO durch Ultrafiltration im Kanalverfahren

A) Herstellung roher PPLO-Brühe

In 1075 nil Kalbsserum (das zu einem früheren Zeitpunkt wärmebehandelt worden war) von 5 C wurden allmählich 299 ß Ammoniumsulfat (2?8 mg/ml) eingerührt.

Nach 5 Min. Rühren wurde der pH-Wert mit 10 η HCl auf 6,8 eingestellt, die Suspension 4 Std. bei 5° C gerührt und hierauf in einem Rotor Nr. 19 10 Min. bei 11000 U/Min, geschleudert, worauf die Anteile an überstehendem Gut dekantiert und vereinigt wurden. Das vereinigte Gut wurde in 4 Beuteln (68,6 χ 2,5 cm, flach) 24 Std. gegen laufendes Leitungswasser und dann 16 Std. bei 5° G gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung, enthaltend 7 g NaCl, 1,7 g NallPO^· 12H₂O und 0,2 g NaH₂PO₂^-H₂O je 1 Wasser, dialysiert, worauf der Inhalt der Dialysierbeutel vereinigt wurdej Endvolumeri etwa

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ΙβΟΟ rnl. Dieses vereinigte Gut wurde dann durch eine Kombination von Vorfilter und 0,45^<-Mikron-"Millipore"« Filter von 142 mm Durchmesser filtriert.

Es wurde weiter eine Kultur folgender Zusammensetzung zubereitet:

Difco-PPLO-Brühe 70,0 ml

Hefeextrakt 25gew./völlig, wässrig 10,0 ml

Fraktioniertes Kalbsserum 20,0 ml

NaH(XU, 7,5gew./vol.$ig, wässrig 4,0 ml

Traubenzucker, 50,0gew./vol.$ig_J wässrig 2,0 ml

Nach Submerskultur-Technlken wurde in diesem Medium PPIO 4 Tage bei ~$6° C kultiviert. Nach dem Ernten enthielt die Brühe ungefähr 500 ^DNA/l00 rnl.

B) Konzentrierung und Reinigung

In einer Einrichtung (Modul) für die Ultrafiltration

im Kanalverfahreri wurden unter Einsatz von 2,5 dm Filter von 0,45 Mikron Porosität 4 1 inaktivierte PPLO-BrUhe konzentriert. Die Filtration erfolgt bei 5>5 at und einer Geschwindigkeit der Innenumwälzung von 5 l/Min. Das FiItrat wurde mit im Durchschnitt 40 ml/Min, abgenommen, bis das zurückgehaltene Gut auf 4θΟ ml eingeengt war.

Das lOfach-Konzentrat wurde keimfrei zu einer anderen Einrichtung für die Ultrafiltration im Kanalverfahren mit 2,5 dm² Filter mit einer Porosität von 0,22 Mikron übergeführt, Unter Anwendung der gleichen Umwälzgeschwindigkeit, des gleichen Drucks und der gleichen Filtrierge-

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schwindägkeit wurde der PPIX) mit 8 1 phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen.

In dem PPLO-*Produkt waren nach Immunodiffusions-Standardtechniken keine Serumkomponenten feststellbar. .

- ■ ι

Beispiel 2 Konzentrierung von Entenembryo-Zellen

Entenembryo-Zellen wurden virusinfiziert und dann zur richtigen Zeit durch Standardtrypsinbehandlung gesammelt.

2 1 des InfizJerte-Entenembryozellen-Erntegutes wurden in einer Einrichtung zur Ultrafiltration im Kanalverfahren unter Einsatz eines 0,65-Mikron-Poren~Filters von

ρ
2,3 dm Fläche bei 2,1 at und bei einer Geschwindigkeit der Innenumwälzung von 3 l/Min, auf das 1Ofache konzentriert.

Beim Ersatz der Einrichtung zur Ultrafiltration im Kanalverfahren durch einen amagnetischen Rührstab zur Freihaltung der Filteroberfläche von Feststoffansammlung wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.

Beispiel 3

Konzentrierung und Reinigung von Trachomerreger

Der Traehomerreger wurde in üblicher Weise in der Dottersack-Membran befruchteter Hühnereier gezüchtet und geerntet. Aus dem Eriiteflüssiggut wurden in einer Klär^entri- ■ fuge bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 15 l/Std. und bei 12 000 G zellförmige Rückstände entfernt.

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Das geklärte Flüssiggut wurde wie in Beispiel 2 in einer Einrichtung zur Ultrafiltration im Kanalverfahren unter Einsatz eines 0,45-Mikron-Poren-Filters auf das lüfache konzentriert.

Das konzentrierte Erregergut wurde in eine zweite Filtra« tionseinheit mit einem 0,22-Mikrori-Poren-Fllter übergeführt und dort mit 15 Volumina phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen.

Ähnliche Ergebnisse wurden beim Ersatz der Ultrafiltra^ tionseinrichtung durch einen FiIterplattenvibrator zur Freihaltung der Filteroberfläche von Feststoffansammlungen erhalten.

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Claims (1)

1. 4. Mai I972 14 562

   Patentansprüche

   1, Verfahren zum Konzentrieren und Reinigen biologischen, teilchenförmigen Gutes von etwa 50 Millimikron bis etwa Mikron Durchmesser unter Konzentrierung durch Pil-» trleren und Reinigung durch wiederholtes Verdünnen mit Waschflüssigkeit bzw. -fluid und Wiederkonzentrieren . durch Filtration, dadurch gekennzeichnet, dass man

   a) biologische(s) Rohflüssigkeit bzw. -fluid, welche(s) das gewünschte biologische teilchenförmige Gut enthält, in ein geschlossenes System mit einem Filter gelenkter Porengrösse von etwa 0,22 bis 0,65 Mikron einführt, wobei die Filteroberfläche von Feststoff*-* ansammlung im wesentlichen freigehalten wird,

   b) den Inhalt des Systems einem Druck von etwa 1,4 bis ■Ί,2 at aussetzt,

   c) Filtrat austrägt, bis die gewünschte Konzentration des gewünschten, biologischen, teilchenförmigen. Gutes in dem zurückgehaltenen Material erreicht ist,

   d) mit ungefähr der gleichen Geschwindigkeit, mit welcher die Filtrat-Austragung erfolgt, Waschflüssigkeit einführt und hierdurch die Konzentration des gewünschten, biologischen, teilchenförmigen Gutes in dem zurückgehaltenen Material im wesentlichen konstant hält, und

   e) Stufe (el) fortsetzt, bis das das gewünschte, biologische, teilchenförmige Gut aufweisende zurückgehaltene Material im wesentlichen von verunreinigenden Stoffen frei ist.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nan die im wesentlichen Freihaltung der Filteroberfläche von Feststoffansammlung durch Ultrafiltration im Kanalve?fahren bei einer Umwalzgesehwindigkeit von etwa 2 bin

   „ q „

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   5 l/Min, bewirkt.

   J5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ihm PPLO als teilchenförmigen Gut unterwirft.

   K. Verfahren nach Anspruch. 1 oder 2, dadurch gekennzeich·^ net, dass man ihm Entenembryo-Zellen als teilchenföriniGut unterwirft.

   . Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, dass man ihm Traehomerreger als teilchenförmiges Gut unterwirft.

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