DK152678B - Fremgangsmaade til overfladedyrkning af kerneholdige celler og udvinding af cellekulturafhaengige stoffer - Google Patents

Description

: DK 152678B

i

Det er kendt, at dyrkning af ikke—transformerede kerneholdige celler (eukaryoter ) kun lykkes med over-fladedyrkningsmetoden. Dette betyder, at de celler, der holdes i suspension, ikke vokser. De skal tværtimod have 5 mulighed for at sætte sig på en egnet overflade for der at kunne formere sig indtil kontakthæmning.

Overfladedyrkningsmetoden gennemføres i sin enkleste form i et kar med plan bund, hvorved der må drages omsorg for, at karbunden ligger mest muligt nøj-10 agtigt vandret. Et sådant kar består fortrinsvis af glas eller et egiiet formstof, hvorved beholderens størrelse i sidste ende kun indskrænkes af den nødvendige håndtering. For at opnå den størst mulige overflade eksisterer der også beholdere, hvori der findes flere, horisontalt 15 oven på hinanden liggende, plane flader, der med passende åbninger er forbundet med hindnden. Følgende det samme princip er der også blevet beskrevet en karstabler, der har 10 oven over hinanden liggende kultur- 2 flader hver med 600 cm overflade, hvorved denne behol-20 der også kan kobles parallelt til blokke å 4 stk.

Endvidere anvendes ved andre cellekulturmetoder den totale indre overflade til cellekulturen ved omdrejning af beholderen, f.eks. ved de såkaldte rulleflasker. En sådan rulleflaske kan være forsynet med 25 skiver eller andre legemer, som gør overfladen større og endvidere kan forsyning med næringsstoffer sikres ved hjælp af et medium, samt den fornødne oxygentilførsel.

Disse fremgangsmåder finder dog deres grænser, 30 hvor de på grund af beholderrumfanget ikke mere eller kun med besvær kan håndteres. Desuden lader de til ændringer i kulturen nødvendige slangeforbindelser sig kun vanskeligt gennemføre under driften på grund af bevægelsen.

35 Endvidere er der i fransk offentliggørelses skrift nr. 1.598.245 helt alment beskrevet en overfladedyrkningsmetode under anvendelse af bevægelige fyld- 2

DK 152678 B

legemer. I dette skrift, som ikke indeholder et eneste eksempel, er der alene som foretrukne overfladelegemer omtalt kugler med en diameter på nogle mm og Raschig-ringe uden nogen som helst yderligere angivelser, og 5 desuden er der som eneste materiale for fyldlegemerne nævnt glas.

Der findes dog også apparater, der består af en beholder med flere cellekulturflader og en pumpe. Ved ompumpning af mediet sikres det nødvendige næringsstof-10 og oxygenudbud. Således beskrives f.eks. et apparat med 2 liters volumenindhold, hvori de plane kulturflader erstattes af små glascylindre, og det ompumpede mediums pH reguleres ved gasning. På lignende vis gås der frem ved den kendte organperfusionsteknik.

15 Ved den beskrevne overfladedyrkningsmetode med små glascylindre med ca. 6 mm's længde, ca. 4 mm ydre diameter og ca. 2 mm indre diameter i en beholder med samtidig ompumpning af mediet er en dækning af alle kulturoverflader dog ikke mulig på grund af de optræden-20 de fysiske fænomener, såsom befugtning, kapillarvirkning og andre grænsef ladef asnomener, især på grund af dannelsen af luftbobler.

Af samme årsager kan de med celler daskkede kulturflader ikke skylles tilstrækkeligt. Der sker ingen fuld-25 s tænding tilbages trømning/ef tersem en del af d>et oprindelige medium hårdnakket fastholdes. De fysiske kræfter hos de hidtil ved overfladedyrkning benyttede glascylindre eller kugler forhindrer direkte, f.eks. ved fibroblast-interferonfraastilling ,den nødvendige fuld-30 stændige fjernelse af induktionsmediet eller fremmed protein ved hjælp af skylning. Endvidere ødelægger de ved interferonfremstillingen sædvanligvis anvendte pumper rved hvilke der optræder forskydningskræfter, den største del af det allerede fremstillede interferon.

35 Under betegnelsen microcarrier-teknik suspenderes egnede kugler, såsom f.eks. af dextran,med et tværsnit på ca. 0,15 - 0,25 mm,i et medium og holdes ved bevægel

DK 152678 B

3 se i suspension. På overfladen af disse kugler kan der ved egnet teknik (se Biotechnology and Bioengineering, bind XXI, side 433-442 (1979)) dyrkes celler. Den til rådighed stående overflade, der angives ved betegnelsen 5 medium/volumen, er her særdeles stor. Den udgør ved 2 0,5 g dextranbærere i 100 ml medium 3.000 cm . De cellebevoksede kugler er dog meget ømfindtlige over for rtiekaniske påvirkninger. Ved aflejring af bæreren og afsugning af den ovenover stående væske fjernes me-10 diet. Derved muliggøres ligeledes ingen fuldstændig skylning.

Det har nu overraskende vist sig, at de ovenfor beskrevne ulemper ved overfladedyrkning og således ved udvinding af cellekulturafhængige stoffer, såsom inter-15 feron, vira, fermenter, antistdffer/ som f.eks. immun-globuliner, kan udelukkes, når der som kulturflader anvendes legemer, der på grund af deres form ikke udviser nogen forstyrrende grænsefladefænomener og altså tillader en fuldstændig dækning og tilstrækkelig skylning 20 af kulturfladerne. Hertil anvendes hensigtsmæssigt fyldlegemer, der har en til en cellekultur gunstig overflade og giver kulturen en tilfredsstillende fasthæftnings-mulighed.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til overflade-25 dyrkning af kerneholdige celler og udvinding af cellekulturafhængige stoffer fra de således opnåede celler, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der som kulturoverflade anvendes vindelformede, saddelformede eller spiralformede fyldlegemer, hver fremstillet af me-30 tal, hvorhos disse legemer efter udløb af det vandige kulturmedium tilbageholder mindre end 8% af mediet i forhold til det frie volumen, og at forholdet mellem kulturoverfladens overfladeareal og det frie volumen sam- -1 tidig ligger mellem 20:1 og 5:1 cm 35 Der kan benyttes forskellige hensigtsmæssige udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen som angivet i krav 2-5.

Særligt foretrukne bevægelige fyldlegemer er vin- 4

DK 152678 B

delformede, spiralformede eller saddelformede legemer, især vindelformede legemer og trådspiraler i strakt form af V2A- eller V^A-stål, ved hvilke de enkelte vindinger ikke berører hinanden indbyrdes, eller saddel-5 formede legemer, eftersom disse samtidig med en stor overflade kun har en ringe flydemodstand for det omløbende medium og ved skylning kun har en ringe hæftevirkning for mediet. Som trådspiraler er herved især de egnede, der har en totallængde på 4-8 mm, dog for-10 trinsvis 5-7 mm, en total bredde på 4-8 mm, dog fortrinsvis 5-7 mm, og et trådtværsnit på 0,4-0,8 mm, dog fortrinsvis 0,5-0,7 mm, hvorhos mellemrummet mellem de enkelte vindinger er 0,1-0,5 mm, dog fortrinsvis 0,2-o,4 mm.

15 Udtrykket "VA-stål" står for rustfrit chrom-nik- kel-stål. Nærmere angivet indeholder et ^^A-stål 17-20% chrom og 8-12,5% nikkel, og et V^Ar-stål indeholder 16,5-18,5% chrom, 10,5-14% nikkel og 2-2,5% molybden.

P.eks. blev fyldlegemerne 20 a = V^A-spiraler (ydre tværsnit: 6 mm, trådtværsnit: 0,6 mm, længde: 6 mm) og B = saddelformede legemer (tværsnit: 6 mm, længde 6 mm), undersøgt i sammenligning med C = glascylindre (ydre tværsnit: 4 mm, indre tværsnit: 25 2 mm, længde 6 mm) for deres egnethed ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen som følger:

Metodik: 1. Et glasrør (indre tværsnit: 3-5 cm) tilspid-ses forneden til en tragt, Øges med et rør med ca. 0,5 cm indre tværsnit som udløb og forsynes med en hane.

Ved tragtens overgang til 0,5 cm's røret anbringes en markering. Derpå fyldes glasrøret med lukket hane til 35 dette mærke med vand, og rumfanget bestemmes ved afvejning af udløbet. Derpå fyldes der atter til dette mærke med vand, og der tilsættes en afvejet mængde vand (f .eks.

200 ml) . Det øvre spejl forsynes med et· mærke. Derpå

^ DK 152678B

5 udledes vandet indtil det underste mærke. Samtidig bestemmes restmængden af vand, der hæfter til glasvæggen, ved vejning af den udledte mængde, og subtraktion fra det tilsatte rumfang. Det hele gentages flere gange, 5 og middelværdien fastholdes som tømmeværdi.

Før hvert forsøg skal prøverøret være fuldstændigt tørt (f.eks. ved afvaskning med acetone og påfølgende gennemblæsning med luft). Ligeså skal de fyldlegemer, der skal afprøves, tørres i et tørreskab. Til 10 afprøvning fyldes fyldlegemerne i glasrøret indtil det øverste mærke. Derpå bestemmes vægten af de påfyldte fyldlegemer og styk-antallet. Derefter påfyldes tragten med fyldlegemerne i og med lukket hane fra en afvejet mængde vand indtil det øverste mærke, påfyldningsmængden ]_5 bestemmes ved vejning af den tiloversblivende mængde og anvendes som "frit volumen". Derefter åbnes hanen, og den mængde vand, der løber ud indtil det underste mærke, bestemmes ved opsamling i et tareret bæger på en vægt.

Ved subtraktion af den afløbne mængde fra "frit volumen" 20 beregnes "restmængden" af vand, der forbliver i fyldlegemerne. Derved tages der hensyn til tømmeværdien. Fyldlegemernes overflade beregnes eller fremstillerens angivelser anvendes.

Som resultat beregnes de eksperimentelt opnåede 25 data til de følgende værdier: frit volumen pr. liter i cm^, forholdet mellem fyldlegemernes overflade og frit volumen i cm-1 samt restmængden efter udløb i % i forhold til frit volumen.

2. Med det samme glasrør (tørt) påfyldes den 30 samme mængde fyldlegemer, og der fyldes op med farvet vand (f.eks. 1% neutralrødt - 100%). Derpå lukkes den øverste åbning lufttæt med en ålange, der er fyldt med vand og lukket med en slangepumpe. Efter åbning af hanen tilsættes der over slangepumpen vand i en afmålt mængde 35 på 100 ml pr. minut, og skylleeffekten pr. minut fastlægges ved måling af farveintensiteten i et fotometer.

Den målte værdi sættes i forhold til startværdien og 6

DK 152678 B

betegnes som skyllevirkning i % restfarve efter x-gange skylning med fri volumenmængde. 5 Minutter efter skylningens begyndelse afbrydes vandtilførslen, søjlen rystes kort og værdien måles efter 30 sekunders til-5 pumpning. Værdien angives som restfarve i % efter x-ganges skylning med fri volumenmængde efter påfølgende udrystning.

Den efterfølgende tabel indeholder de fundne værdier: 7

DK 152678 B

tj G

φ Φ g g _ o

O' H

<d g o co h O'-Η > - - δ .-g ra n ^

«Η-Ρ θ' >ι·Η Q) X U

> ram u____ g SJ « w cm 1) IIP *> pi o o h 0) O' G oo

tø Ό ni H

<D 0) tn « +J g . . o o o m <D ___ 0 Und G O' 0) O'-Η G O' G G fti G «Μ Γ" -Η H g G cm ro C! >i G OP O' *· “·

X X 0) o o O

tø W g ro •H 3---— > (1) H 0) <D O' 0 O' H G > G co Η σι HG G cm σι σι >ι Οι-H O' «. *- *· X tø ο ο ο w κ η <ν Λ +>

(ϋ τθι-Η Ό Η tø ΟιΌ Η Go G

g m o m oo in g tø G g o co σι 4j <d g * ** * W +> d° H ro CO oo (D ih O PS (U H >

W T

<u g G O' Gd

tø O <U

(Dg Η Η H

g <D 3 (D T3 H ·· ·· ·· Ό O' G 0 ri g H)H ^ o ΦΗΉ σι "3* 'i rS H 1(5 tø -P «· - _*

tø Η H Hl -H O in H

O (D > tø Η H CM

h g m o m tø (U G +» (D -H , g r+0 +> G g

HH · 0 CO CM CM

tø O tø in cm ro

Pn > ft-H oo CO m tø

(D

s! emu >1® fcl <—i _ _ ------ ------- 8

DK 152678 B

På basis af den ovennævnte metodik konstateres, at sådanne fyldlegemer, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og som altså efter udløb af mediet tilbageholder mindre end 5 8% af mediet i forhold til det frie volumen (ved- hæf tning s indhold) efter 4 gange skylning med fri volumenmængde udviser en restfarve på maksimalt 0,15% eller efter 4 gange skylning med fri volumenmængde 10 og påfølgende rystning udviser en restfarve på maksimalt 0,5%.

Sådanne fyldlegemer muliggør en vedhæftning af de i suspension tilførte kerneholdige celler, f.eks. fibroblastceller, epithelceller, inden for et kort tids-15 rum, f.eks. i løbet af 1 til 3 timer, i -Endvidere optages næringsstof ferne i det omløbaxle medium godt, således at der sikres en hurtig vaskst af cellerne. Særligt fordelagtigt er dog, at de tætvoksende kulturer inden for det ønskede tidsrum kan bringes i forbindelse med 20 induktionsstoffer, og derefter at den nødvendige fjernelse af induktionsstofferne ved simpel skylning ikke giver nogen besværligheder. Skylningen kan herved ske kontinuert eller diskontinuert, d.v.s. ved erstatning af det omløbende medium med (ét skyllemedium eller ved 25 eventuel flere gange udledning af mediet og påfølgende opfyldning med et skyllemedium, i det sidste tilfælde sker tilførslen af skyllemedium fortrinsvis nede fra.

yderligere kan de benyttede fyldlegemer renses uden besvær og derpå atter anvendes. Dette betyder 30 altså at cellerne hæfter tilstrækkeligt på sådanne fyldlegemers overflade til at der sikres uforstyrret cellevækst, på den anden side hæfter disse dog ikke så fast, at cellerne ved den påfølgende rensning ikke mere kan løsnes.

35 Fyldlegemerne udviser således ikke nogen forstyr rende fysiske egenskaber, f.eks. ingen forstyrrende grænsefladevirkninger (befugtning, kapillarvirkning). Til om- 9

DK 152678 B

pumpning af mediet anvendes der hensigtsmæssigt pumper, ved hvilke der ikke optræder forskydningskræfter, f.eks. slangepumper.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen har vist sig 5 særligt fordelagtig ved fibroblast-interferonfremstillingen. Hertil fyldes et reaktionskar,fortrinsvis et trykstabilt reaktionskar, f.eks. et 25 liters dobbeltkapper eaktionskar af duranglas, der på kendt vis er forsynet med et til- og afløb, pH-elektroder og permeator, 10 med omhyggeligt vaskede fyldlegemer, fortrinsvis med V^A-trådspiraler i strakt form (længde 6 mm, bredde 6 mnv trådtværsnit 0,6 mm, stigning 0,3 mm), ca. 3/4 og steriliseres fortrinsvis med komprimeret damp. Herved udgør forholdet mellem fyldlegemernes overflade og det fri vo-15 lumen ca. 11/1 cm . Derpå suspenderes celler, der fortrinsvis er udvundet ved trypsinering fra overflade-cellekulturer i Minimum Essential Medium, der hensigtsmæssigt er tilføjet 10% føtalt kalveserum og et antibio-ticum, såsom kanamycin,i en koncentration på 200 yg/ml, 20 i en cellekoncentration på hensigtsmæssigt 20.000 .

2 celler/cm kulturoverfladeareal.

Den tilførte cellekultursuspension forbliver uden ompumpning i 2-4 timer ved 37°C, derpå ompumpes mediet fortrinsvis raed en slangepumpe med et omdrej-25 ningstal på 30 omdrejninger pr. minut og pH indstilles mellem 7,3 og 7,5. 24-48 timer efter tilsætning af cellekultursuspensionen udtages med regelmæssige mellemrum medium, og der tilsættes frisk vækstmedium med samme sammensætning, ialt tilføres og udtages i de følgende 30 3-4 dage 80 liter medium. Den yderligere fremgangsmåde retter sig efter det stof, der skal udvindes fra cellekulturen. Ved interferon f.eks. fjernes det totale medium 8-10 dage efter tilsætning af cellekulturen, og derpå induceres efter kendte fremgangsmåder f.eks. med 35 poly I:C, mitomycin C, virus eller andre egnede stoffer.

Det skal bemærkes, at udtrykket poly I:C står for et syntetisk fremstillet dobbeltstrenget ribonucleotidmole- 10

DK 152678B

kyle bestående af komplekser polyriboinosin/polyribo-cytidylsyre.

Derefter fjernes det totale induktionsmedium, og cellerne vaskes flere gange med Minimum Essential Medium.

5 Derpå tilsættes der på ny medium, der er tilsat en egnet stabilisator for interferon, f.eks. serum-albumin. Denne væske ompumpes på ny som angivet ovenfor. Efter yderligere 12-24 timer høstes mediet og det opnåede råinterferon koncentreres og renses på i og for sig kendt vis.

10 Der anvendes fortrinsvis en slangepumpe, der ved et omdrejningstal på 25-60 pr. minut har en kapacitet på 50-400% af totalvolumenet pr. time.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan altså gennemføres med betydeligt større volumenmængder end de hidtil 15 kendte fremgangsmåder og begrænses kun af en tilstraskkel ig næringsstof- og oxygenforsyning, samt en konstant-holdelse af pH inden for et område, der er egnet for cellerne.

En yderligere fordel ved fremgangsmåden ifølge 20 opfindelsen består i, at de cellekulturafhængige stoffer såsom f.eks. interferon, der dannes under produktionsfasen, kan udjages diskontinuert eller kontinuert fra kredsløbet og'erstattes med nyt medium, ogat f.eks. det således udtagne interferon kan anbringes på en 25 rensnings- og koncentreringssøjle.

Yderligere giver tilsætningen af et såkaldt stimulatorstof eller en blanding af sådanne stoffer til ethvert ønsket tidspunkt under fremgangsmåden for at forøge udbyttet af et cellekulturafhængigt stof, eller 30 disses fjernelse ingen besvær (se EP-A-0.005.476 fra samme ansøger).

Det følgende eksempel belyser opfindelsen nærmere: Eksempel.

Et 25 liters dobbeltkappereaktionskar af duran-35 glas fyldes med 17 liter omhyggeligt vaskede V4A-trådspiraler i strakt form, længde 6 mm, bredde 6 mm, tråd tværsnit 0,6 mm, stigning 0,3 mm (forhold mel-

DK 152678B

11 lem fyldlegemernes overflade og det fri volumen = ca.11/1 cm”}. Til- og afløb forsynes med silicongUmmislanger, indre tværsnit 8-10 mm, føres hen over pH-elektroder med pH-meter og permeator og forbindes til kredsløbet. Op-5 stillingen steriliseres med komprimeret damp. Ved tryp- sinering af overfladecellekulturef udvundne celler suspenderes i 17 liter Minimum Essential Medium med 10% føtal kalveserum o og 200/tg/ml kanamycin i en mængde på 20.000 celler/cm kulturoverfladeareal og anbringes i reaktionskarret.

10 Reaktionskarret opvarmes over dobbeltkappen og en vandbadstermostat ved 37°C og holdes ved denne temperatur.

Den tilførte cellekultursuspension bliver i 2-4 timer i reaktionskarret uden ompumpning. Derpå indsættes sili-conslangen i en slangepumpe, og der ompumpes ved et om-15 drejningstal på 30 omdrejninger pr. minut med en kapacitet på 40-80 liter/time. pH reguleres mellem 7,3 og 7,5, 24-48 timer efter tilsætning udtages der med regelmæssige intervaller medium og tilsættes frisk vækstmedium med samme sammensætning. I alt udtages og 20 tilsættes der i de følgende 3-4 dage 80 liter medium.

8-10 dage efter tilsætningen af cellekulturen udtages det totale medium, cellerne vaskes ved tilsætning af Minimum Essential Medium uden serum og tilsættes derpå induktionsmediet, der indeholder 100 yg/ml poly I:C og 25 2,5 yg/ml cycloheximid. Mediet forbliver 3 timer i reaktionskarret. Derpå tilsættes 2 yg/ml actinomycin D.

En time efter actinomycin D-tilsætningen fjernes det totale induktionsmedium og cellerne vaskes mindst 4 gan-r 30 ge med Minimum Essential Medium uden serum. Derefter tilsættes Minimum Essential Medium med 1000 yg/ml serumalbumin, og der ompumpes som beskrevet tidligere. pH-re-guleringen indstilles til 7,5-7,6. 19-20 timer senere høstes mediet og koncentreres og renses efter kendte 35 f remg angsmåder.

Interferonudbytterne i råopløsningen udgør i forhold til det internationale reference-præparat G 023-902-527 fra National Institute of Health (USA) 900-2.000 enheder/cm2 kulturoverflade.

»

DK 152678 B

12

Under anvendelse af forskellige fyldlegemer i forskellige tilsætningsmængder blev der analogt fremstillet fibroblast-interferon med de følgende resultater: 5 Fyldlegemer+ Tilsætnings- Interferon^reference- mængde i enheder/cin liter Kulturoverflade A 2,2 1.580 A 17/0 1.374.

A 108,0 1.103 10 B 0,2 470

Kontrol (c)+ 0/2 23 _0^2_19__ 15 + se det ovenfor omtalte teknikkens stade med flere cellekulturflader og en pumpe

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til overfladedyrkning af kerne-holdige celler og udvinding af cellekulturafhængige stoffer fra de således opnåede celler, k endeteg-n e t ved, at der som kulturoverflade anvendes vindel- 5 formede, saddelformede eller spiralformede fyldlegemer, hver fremstillet af metal, hvorhos disse legemer efter udløb af det vandige kulturmedium tilbageholder mindre end 8% af mediet i forhold til det frie volumen, og at forholdet mellem kulturoverfladens overfladeareal og det _1 10 frie volumen samtidig ligger mellem 20:1 og 5:1 cm

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes vindelformede, saddelformede eller spiralformede fyldlegemer af V2A- eller V^A-stål.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kende tegnet ved, at der som fyldlegemer anvendes en spiral i strakt form med en total længde på 4-8 mm, dog fortrinsvis 5-7 mm, en total bredde på 4-8 mm, dog fortrinsvis 5-7 mm, et trådtværsnit på 0,4-0,8 mm, dog for-20 trinsvis 0,5-0,7 mm, og en stigning på 0,1-0,5 mm, dog fortrinsvis 0,2-0,4 mm, eller saddelformede legemer, hver bestående af V2A- eller V4A-stål.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der som fyldlegemer benyttes en V^A-tråd-25 spiral.

5. Fremgangsmåde ifølge kravene 1- 4 kendetegnet ved, at der som cellekul tur af hasngigt stof fremstilles interferon.