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Verfahren zur Oberflächenzüchtung von kernhaltigen
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Zellen und Gewinnung von Zellkultur-abhängigen Stoffen /Zusatz zum
DBP * (Patentanmeldung P 29 26 091.1 Es ist bekannt, daß die Züchtung von nicht
transformierten, kernhaltigen Zellen (Eukaryonten) nur mit der Oberflächen-Züchtungsmethode
gelingt. Dies bedeutet, daß die in Suspension gehaltenen Zellen nicht wachsen. Sie
müssen vielmehr Gelegenheit haben, sich auf einer geeigneten Oberfläche abzusetzen,
um sich dort bis zur Kontakt-Inhibition vermehren zu können.
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Die Oberflächen-Züchtungsmethode wird in ihrer einfachsten Art in
einem Gefäß mit planem Boden durchgeführt, wobei darauf geachtet werden muß, daß
der Gefäßboden möglichst genau waagerecht liegt. Ein derartiges Gefäß besteht vorzugsweise
aus Glas oder einem geeigneten Kunststoff, wobei die Größe des Behälters letztlich
nur durch die erforderliche Handhabung beschränkt wird.
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Um hierbei eine möglichst große Oberfläche zu erzielen, existieren
auch Behälter, in denen mehrere horizontal übereinander liegende plane Flächen,
welche durch entsprechende öffnungen mit-
einander verbunden sind,
angeordnet sind. Dem gleichen Prinzip folgend wurde auch ein Wannenstapler beschrieben,
der 10 über-2 einanderliegende plane Lulturflächen mit je 600 cm Oberfläche aufweist,
wobei dieser Behälter auch zu Blöcken à 4 Stück parallel geschaltet werden kann.
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Desweiteren wird bei anderen Zellkultur-Verfahren durch Drehen des
Behälters die gesamte Innenfläche, z.B. bei den sogenannten Rollerflaschen, für
die Zellkultur verwendet. Eine derartige Rollerflasche kann mit Scheiben oder anderen
Körpern so beschickt werden, daß die Oberfläche vergrößert und außerdem die Versorgung
mit Nährstoffen mittels eines Mediums sowie das erforderliche Sauerstoffangebot
sichergestellt werden kann.
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Diese Verfahren finden jedoch dort ihre Grenzen, wo sie wegen des
Behälterumfanges nicht mehr oder nur schwer gehandhabt werden können. Überdies lassen
sich während des Betriebs die für Änderungen in der Kultur erforderlichen Schlauchverbindungen
wegen der Bewegung nur schwer bewerkstelligen.
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Es gibt jedoch auch Geräte, die aus einem Behälter mit mehreren Zellkulturflächen
und einer Pumpe bestehen. Durch Umpumpen des Mediums wird das erforderliche Nährstoff-
und Sauerstoffangebot gewährleistet. So wird beispielsweise ein Gerät von 2 Liter
Volumeninhalt beschrieben, in dem die planen Kulturflächen durch kleine Glas-Zylinder
ersetzt werden und der pH des umgepumpten Mediums durch Begasung reguliert wird.
In gleicher Weise wird bei der bekannten Organ-Perfusions-Technik verfahren.
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Bei dem beschriebenen Oberflächen-Züchtungsverfahren mit kleinen Glaszylindern
von ca. 6 mm Länge, ca. 4 mm äußerem Durchmesser und ca. 2 mm innerem Durchmesser
in einem Behälter bei gleichzeitigem Umpumpen des Mediums ist jedoch aufgrund der
auftretenden physikalischen Wirkungen wie Benetzung, Kappilarwirkung und anderer
Grenzflächenwirkungen, insbesondere wegen der Bildung von Luftblasen, eine Bedeckung
aller Kulturflächen nicht möglich.
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Aus den gleichen Gründen lassen sich die mit Zellen bedeckten Kulturflächen
nicht ausreichend spülen. Es erfolgt kein vollständiger Rückfluß, da ein Teil des
ursprünglichen Mediums hartnäckig festgehalten wird. Die physikalischen Kräfte der
bisher bei der Oberflächenvermehrung benützten Glas-Zylinder oder Kugeln verhindern
aber gerade beispielsweise bei der Fibroblasten-Interferon-Herstellung die erforderliche
vollständige Entfernung des Induktionsmediums bzw. des Fremdproteins mittels Spülen.
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Außerdem zerstören die bei der Interferonherstellung üblicherweise
verwendeten Pumpen, bei welchen Scherkräfte auftreten, größtenteils das bereits
hergestellte Interferon.
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Unter der Bezeichnung Microcarrier-Technik werden geeignete Kugeln,
wie beispielsweise aus Dextran, mit einem Durchmesser von ca. 0,15 - 0,25 mm im
Medium suspendiert und durch Bewegung in Suspension gehalten. Auf der Oberfläche
dieser Kugeln lassen sich bei geeigneter Technik (siehe Biotechnology and Bioengineering,
Vol. XXI, 433-442 (1979)) Zellen züchten. Die zur Verfügung stehende Oberfläche,
gegeben durch die Beziehung Medium/Volumen, ist hier besonders groß. Sie beträgt
bei 0,5 g Dextran-Trägern in 100 ml Medium 3.000 cm2. Die mit Zellen bewachsenen
Kugeln sind jedoch gegen mechanische Einflüsse sehr empfindlich. Durch Absetzenlassen
der Carrier und Absaugen der überstehenden Flüssigkeit wird das Medium entfernt.
Damit läßt sich gleichfalls keine vollständige Spülung ermöglichen.
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Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß sich die oben geschilderten
Nachteile bei der Oberflächenzüchtung und somit bei der Gewinnung von Zellkultur-abhängigen
Stoffen wie Interferon, Viren, Fermente, Immunabwehrstoffe, wie z.B. Immunglobuline,
ausschalten lassen, wenn als Kulturflächen Körper verwendet werden, die auf Grund
ihrer Form keine störenden Grenzflächenwirkungen erzeugen und somit eine vollständige
Bedeckung und ausreichendes Spülen der Kulturfläche gestattet. Zweckmäßigerweise
werden hierbei Füllkörper verwendet, die eine für eine Zellkul-
tur
günstige Oberfläche aufweisen und ihnen eine ausreichende Haftungsmöglichkeit bieten,
sowie nach Auslaufen des Mediums weniger als 8 % des Mediums bezogen auf freies
Volumen zurückhalten.
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Als derartige Füllkörper kommen die in der Chemie bei der fraktionierten
Destillation zur Herstellung einer optimalen Fläche für die Phasenberührung fest
eingebauten Körper wie Böden und Siebe und beweglichen Körper wie Sattelkörper,
kugelförmige oder zylindrische Füllkörper in Betracht, welche aus Materialien wie
Glas, Keramik, z.B. aus Ton oder Porzellan, Kunststoffe, z.B. aus Duranit, Azidur
oder Teflon, Metallen, z.B. aus Titan, V2A- oder V4A-Stahl, oder Sinterprodukten,
z.B. aus Korund, hergestellt werden können.
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Unter dem Begriff der "beweglichen Füllkörper" kommen insbesondere
Ringe wie Pallringe, Raschig-Ringe, Prymringe, Porzellanringe, Perforinge, Streckmetallringe
und Intosringe, Wendeln und Spiralen wie Glasspiralen, Wilson-Spiralen, Federwendeln,
Glaswendeln, Drahtspiralen, Spulen und Rollen, Sattelkörper wie der Perl-Sattel,
Supersattel und Novalox-Sattel, Intalox- und Interpackfüllkörper, Perlen, Kugeln,
Sternfüllkörper, Zwillingskörper und Vollkörper in Betracht.
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Besonders bevorzugte bewegliche Füllkörper stellen jedoch die Spiralen,
Wendeln und Sattelkörper dar, insbesondere Wendeln und Drahtspiralen in gestreckter
Form aus V2A- oder V4A-Stahl, bei denen sich die einzelnen Windungen gegenseitig
nicht berühren, oder Sättel, da diese gleichzeitig bei einer großen Oberfläche auf
das umlaufende Medium nur einen geringen Fließwiderstand und beim Spülen nur eine
geringe Haftwirkung auf das Medium aufweisen. Als Drahtspiralen sind hierbei insbesondere
diejenigen geeignet, die eine Gesamtlänge von 4-8 mm, vorzugsweise jedoch 5-7 mm,
eine Gesamtbreite von 4-8 mm, vorzugsweise jedoch 5-7 mm, und einen Drahtdurchmesser
von 0,4 - 0,8 mm, vorzugsweise jedoch 0,5 - 0,7 mm, aufweisen, wobei der Zwischen
raum
der einzelnen Windungen 0,1 - 0,5 mm, vorzugsweise jedoch 0,2 - 0,4 mm, beträgt.
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Beispielsweise wurden die Füllkörper A = Glasstäbe (Durchmesser: 10
mm, Länge: 30 mm), B = Teflon-Ringe (äußerer Durchmesser: 10,5 mm, innerer Durchmesser:
5,5 mm, Länge: 10,2 mm), C = Duranit-Zylinder (äußerer Durchmesser: 10,5 mm, innerer
Durchmesser: 6,5 mm, Länge: 11,5 mm), D = V4A- Spiralen (äußerer Durchmesser: 6
mm, Drahtdurchmesser: 0,6 mm, Länge: 6 mm), E = Glaskugeln (Durchmesser: 10 mm),
F = Duranit-Zylinder (äußerer Durchmesser: 8 mm, innerer Durchmesser: 5 mm, Länge:
9,5 mm), G = Glasstäbe (Durchmesser: 6 mm, Länge: 10 mm), H = Sättel (Durchmesser:
6 mm, Länge: 6 mm), I = V4A- Drahtgewebe-Zylinder (Durchmesser: 3 mm, Länge: 5 mm)
und K = Glaskugeln (Durchmesser: 3,5-5 mm) im Vergleich zu L = Glaszylinder (äußerer
Durchmesser: 4 mm, innerer Durchmesser: 2 mm, Länge: 6 mm) wie folgt auf ihre Eignung
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht:
Methodik: 1. Ein
Glasrohr (innerer Durchmesser: 3-5 cm) wird unten zu einem Trichter verjüngt, mit
einem Rohr von ca. 0,5 cm innerer Durchmesser als Auslauf angestückt und mit einem
Hahn versehen. Am Übergang des Trichters zum 0,5 cm Rohr wird eine Markierung angebracht.
Dann wird bei geschlossenem Hahn das Glasrohr bis zu dieser Marke mit Wasser gefüllt
und das Volumen durch Wiegen des Auslaufs bestimmt. Anschließend wird wieder bis
zu dieser Marke mit Wasser gefüllt und eine abgewogene Menge Wasser (z.B. 200 ml)
zugegeben. Der obere Spiegel wird mit einer Marke versehen. Dann wird das Wasser
bis zur unteren Marke abgelassen. Gleichzeitig wird die Restmenge Wasser, die an
der Glaswand haften bleibt durch Wiegen der abgelassenen Menge und Subtrahierung
von dem angesetzten Sollvolumen ermittelt. Das Ganze wird mehrmals wiederholt und
der Mittelwert äls Leerwert festgehalten.
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Vor jedem Versuch muß das Prüfrohr vollständig trocken sein (z.B.
durch Auswaschen mit Aceton und anschließendem Durchblasen mit Luft). Ebenso sind
die zu prüfenden Füllkörper im Trockenschrank zu trocknen. Zur Prüfung werden die
FUllkörper in das Glasrohr bis zur oberen Marke eingefüllt. Dabei wird das Gewicht
der eingefüllten Füllkörper und die Stückzahl ermittelt. Anschließend wird bei geschlossenem
Hahn bis zur oberen Marke eine abgewogene Menge Wasser eingefüllt, die Einfüllmenge
durch Wiegen der übrigbleibenden Menge ermittelt und als "freies Volumen" festgehalten.
Anschließend wird der Hahn geöffnet, das bis zur unteren Marke ablaufende Wasser
durch Auffangen in ein tariertes Gefäß auf einer Waage ermittelt. Durch Subtraktion
der abgelaufenden Menge von "freien Volumen" wird die "Restmenge" Wasser berechnet,
die in den Füllkörpern verblieben ist. Dabei wird der Leerwert berücksichtigt. Die
Oberfläche der Füllkörper wird entweder berechnet oder den Angaben des Herstellers
entnommen.
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Als Ergebnis werden die experimentell ermittelten Daten zu 3 folgenden
Werten berechnet: Freies Volumen pro Liter in cm Verhältnis der Füllkörper zum freien
Volumen und Restmenge nach Auslauf in % zum freien Volumen.
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2. Mit dem gleichen Glasrohr (trocken) wird die gleiche Menge Füllkörper
eingefüllt und mit gefärbtem Wasser (z.B. 1 % Neutralrot = 100 %) aufgefüllt. Dann
wird die obere öffnung luftdicht mit einem Schlauch verschlossen, der mit Wasser
gefüllt und durch eine Schlauchpumpe abgeklemmt ist. Nach öffnung des Hahnes wird
über die Schlauchpumpe Wasser in einer abgemessenen Menge von 100 ml pro Minute
zugegeben und der Spüleffekt pro Minute durch Messung der Farbintensität im Photometer
erfaßt. Der gemessene Wert wird in Beziehung zum Ausgangswert gesetzt und als Spülwirkung
in % Rest farbe nach x-facher Spülung mit freier Volumenmenge errechnet. 5 Minuten
nach Beginn der Spülung wird der Wasserzulauf abgestellt, die Säule kurz geschüttelt
und der Wert nach 30 Sekunden langem Zupumpen gemessen. Der Wert wird als Restfarbe
in % nach xfacher Spülung mit freier Volumenmenge nach anschließendem Schütteln
angegeben.
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Die nachfolgende Tabelle enthält die gefundenen Werte:
| Fülkorper Freies Volumen Verhältnis der Restmenge nach Spülwirkung
nach x-facher Restfarbe |
| pro Liter in Oberfläche der Auslauf in % Spülung mt freier
Vo- nach x- |
| cm³ Fülkörper zum zum freien lumenmenge facher |
| freien Volumen Volumen Spüllumg |
| 2 mal 3 mal 4 mal % mit freiem |
| Volumen |
| A 507 5,19 : 1 1,3 1,9 0,48 0,14 0,09 4,3 |
| B 595 7,4 : 1 1,43 1,87 0,24 0,08 0,24 3,7 |
| C 684 6,25 : 1 2,79 2,3 0,5 0+ 0,46 3,5 |
| D 856 10,9 : 1 3,05 0,26 0 0 0 3 |
| E 452 7,65 : 1 4,67 1,3 0,22 0,06 0,02 4,7 |
| F 627 8,37 : 1 4,67 1,27 0,15 0+ 0,09 3,5 |
| G 384 14,5 : 1 6,51 2,74 0,18 0,05 0,074 5,4 |
| H 622 15,4 : 1 6,68 0,91 0,22 0 0 3,6 |
| I 940 21,4 : 1 4,68 0,02 0 0 0 2,5 |
| K 373 24,8 : 1 7,53 1,62 0,08 0,04 0,15 5,6 |
| L 532 21,4 : 1 8,95 0,99 0,37 0,18 1,25 4,1 |
Die mit (+) gekennzeichnet Werte sind nur graphish ermittelt, der letzte exp. Wert
liegt davor.
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Auf Basis der obigen Methodik sind somit alle Füllkörper für das erfindungsgemäße
Verfahren geeignet, welche 1. nach Auslaufen des Mediums weniger als 8 % des Mediums
bezogen auf freies Volumen (Haftinhalt) zurückhalten und 2. nach 4-maligem Spülen
mit freier Volumenmenge eine Restfarbe von max. 0,15 % bzw. nach 4-maligem Spülen
mit freier Volumenmenge eine Restfarbe von max. 0,5 % aufweisen.
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Derartige Füllkörper ermöglichen ein Anhaften der in Suspension eingebrachten
kernhaltigen Zellen, z.B. Fibroblasten-Zellen, Epithelzellen, innerhalb einer kurzen
Zeitspanne, beispielsweise während 1 bis 3 Stunden. Desweiteren werden die Nährstoffe
des umlaufenden Mediums gut aufgenommen, sodaß ein rasches Wachstum der Zellen gewährleistet
ist. Besonders vorteilhaft ist jedoch, daß sich die dicht gewachsenen Kulturen mit
Induktionssubstanzen innerhalb des gewünschten Zeitraumes in Verbindung bringen
lassen und anschließend die erforderliche Entfernung der Induktionssubstanzen durch
einfaches Spülen keinerlei Schwierigkeiten bereitet. Das Spülen kann hierbei kontinuierlich
oder diskontinuierlich erfolgen, das heißt durch Ersatz des umlaufenden Mediums
durch ein Spülmedium oder durch gegebenenfalls mehrmaliges Ablaufenlassen des Mediums
und anschließendem Auffüllen mit einem Spülmedium, in letzterem Fall erfolgt das
Einbringen eines Spülmediums vorzugsweise von unten her.
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Ferner lassen sich die benützten Füllkörper ohne Schwierigkeiten säubern
und anschließend wieder verwenden. Dies bedeutet aber, daß die Zellen auf der Oberfläche
derartiger Füllkörper ausreichend haften, um ein ungestörtes Zellwachstum zu gewährleisten,
andererseits haften diese aber nicht so fest, daß sich die Zellen bei der anschließenden
Säuberung nicht mehr ablösen lassen.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein neues Verfahren
zur Oberflächenzüchtung von kernhaltigen Zellen (Eukaryonten) und Gewinnung von
Zellkultur-abhängigen Stoffen unter Verwendung von Füllkörpern, welche nach Auslaufen
des Mediums weniger als 8 % des Mediums bezogen auf freies Volumen zurückhalten,
also einen geringeren Haftinhalt als 8 % aufweisen, und somit keine störenden physikalischen
Eigenschaften, z.B.
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keine störenden Grenzflächenwirkungen (Benetzung, Kapillarwirkung),
besitzen, wobei zum Umpumpen des Mediums zweckmäßigerweise Pumpen verwendet werden,
bei denen keine Scherkräfte auftreten, z.B. Schlauchpumpen.
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Besonders bevorzugte Füllkörper stellen hierbei diejenigen dar, bei
denen gleichzeitig das Verhältnis Oberfläche der Füllkörper zum freien Volumen 20
: 1 bis 2 : 1, vorzugsweise jedoch 15 : 1 bis 5 : 1, beträgt.
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Als besonders vorteilhaft hat sich das erfindungsgemäße Verfahren
bei der Fibroblasten-Interferon-Herstellung erwiesen.
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Hierzu wird ein Reaktionsgefäß, vorzugsweise ein druckstabiles Reaktionsgefäß,
z.B. ein 25 l-Doppelmantel-Reaktionsgefäß aus Duranglas, das üblicherweise mit einem
Zu- und Ablauf, pH-Elektroden und Permeator versehen ist, mit sorgfältig gewaschenen
Füllkörpern, vorzugsweise mit V4A-Drahtspiralen gestreckter Form (Länge: 6 mm, Breite:
6 mm, Drahtdurchmesser: 0,6 mm, Ganghöhe: 0,3 mm) zu ca. 3/4 gefüllt und vorzugsweise
mit gespanntem Dampf sterilisiert. Hierbei beträgt das Verhältnis Oberfläche der
Füllkörper zum freien Volumen ca. 11/1. Anschließend werden Zellen, die vorzugsweise
durch Trypsinierung von Oberflächen-Zellkulturen gewonnen wurden, in Minimum Essential
Medium, dem zweckmäßigerweise 10 % fötales Kalbserum und ein Antibioticum wie Kanamycin
in einer Konzentration von 200 rg/ml beigefügt sind, in einer Zelldichte von zweckmäßigerweise
20.000 Zellen/ cm2 suspendiert.
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Die eingebrachte Zellkultursuspension bleibt ohne Umpumpen 2-4 Stunden
bei 370C, anschließend wird vorzugsweise mit einer Schlauchpumpe bei einer Umdrehungszahl
von 30 Umdrehungen pro Minute das Medium umgepumpt und der pH zwischen 7,3 und 7,5
eingestellt. 24-48 Stunden nach Einbringen der Zellkultursuspension wird in regelmäßigen
Abständen Medium entnommen und frisches Wachstumsmedium der gleichen Zusammensetzung
zugegeben, insgesamt werden in den folgenden 3-4 Tagen 80 Liter Medium zu- und abgeführt.
Das weitere Verfahren richtet sich nach dem Stoff, der aus der Zellkultur gewonnen
werden soll.
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Bei Interferon zum Beispiel wird 8-10 Tage nach Ansatz der Zellkultur
das gesamte Medium entfernt und anschließend nach bekannten Verfahren, z.B. mit
Poly I:C, Mitomycin C, Virus oder anderen geeigneten Substanzen, induziert. Danach
wird das gesamte Induktionsmedium entfernt und die Zellen mit Minimum Essential
Medium mehrmals gewaschen. Anschließend gibt man erneut Medium zu, dem ein für Interferon
geeigneten Stabilisator, z.B. Serum-Albumin, zugefügt war. Diese Flüssigkeit wird
erneut wie oben angegeben umgepumpt. Nach weiteren 12-24 Stunden wird das Medium
geerntet und das erhaltene Rohinterferon nach an sich bekanntem Verfahren konzentriert
und gereinigt.
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Erfindungsgemäß wird vorzugsweise eine Schlauchpumpe benützt, die
bei einer Umdrehungszahl von 25 bis 60 pro Minute eine Förderleistung von 50 bis
400 % des Gesamtvolumens pro Stunde aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren läßt
sich somit mit erheblich größeren Volumen-Mengen als die bisher bekannten Verfahren
durchführen und wird nur durch eine ausreichende Nährstoff- und Sauerstoffversorgung,
sowie einer Konstanzhaltung des pH innerhalb eines für die Zellen geeigneten Bereichs
begrenzt.
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Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin,
daß die während der Produktionsphase gebildeten Zellkultur-abhängigen Stoffe wie
z.B. Interferon diskontinuierlich oder kontinuierlich aus dem Kreislauf entnommen,
durch neues
Medium ersetzt, und beispielsweise das so entnommene
Interferon auf eine Reinigungs- und Konzentrierungssäule gebracht werden kann.
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Außerdem bereitet die Zugabe einer sogenannten Stimulatorsubstanz
oder eines Gemisches derartiger Substanzen zu jedem gewünschten Zeitpunkt des Verfahrens,
um die Ausbeute eines Zellkultur-abhängigen Stoffes zu steigern, bzw. deren Entfernung
keinerlei Schwierigkeiten (siehe europäische Anmeldung 79.101 299.0 der gleichen
Anmelderin vom 30. 04. 1979).
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Das nachfolgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern:
Beispiel
Ein
25 Liter-Doppelmantel-Reaktionsgefäß aus Duranglas wird mit 17 Litern sorgfaltig
gewaschenen Füllkörpern: V4A-Drahtspiralen, gestreckte Form, Länqe 6 mm, Breite
6 mm, Drahtdurchmesser 0,6 mm, Ganghöhe: 0,3 mm, gefüllt (Verhältnis Oberfläche
der Füllkörper zum freien Volumen (= ca. 11/1). Zu- und Ablauf werden mit Silicon-Gummischläuchen,
Innendurchmesser 8-10 mm, versehen, über pH-Elektroden mit pH-Meter und Permeator
geführt und zum Kreislauf verbunden. Die Anlage wird mit gespanntem Dampf sterilisiert.
Durch Trypsinierung von Oberflächen-Zellkulturen gewonnene Zellen werden in 17 Liter
Minimum Essential Medium mit 10 % fötalem Kälberserum und 200 µg/ml Kanamycin in
einer Zahl von 20.000 Zellen/cm² suspendiert und in das Reaktionsgefäß eingebracht.
Das Reaktionsgefäß wird über den Doppelmantel und einem Wasserbadthermostaten auf
37°C aufgeheizt und bei dieser Temperatur geregelt. Die eingebrachte Zellkultursuspension
bleibt 2-4 Stunden ohne Umpumpen im Reaktionsgefäß.
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Anschließend wird der Siliconschlauch in eine Schlauchpumpe eingelegt
und bei einer Umdrehungszahl von 30 Umdrehungen pro Minute bei einer Förderleistung
von 40-80 1/Stunde umgepumpt. Der pH wird zwischen 7,3 und 7,5 geregelt. 24-48 Stunden
nach Ansatz wird in regelmäßigen Abständen Medium entnommen und frisches Wachstumsmedium
der gleichen Zusammensetzung zugegeben. Insgesamt werden in den folgenden 3-4 Tagen
80 Liter Medium zu- und abgeführt. 8-10 Tage nach Ansatz der Zellkultur wird das
gesamte Medium abgelassen, die Zellen durch Zugabe von Minimum Essential Medium
ohne Serum gewaschen und anschließend das Induktionsmedium zugegeben, das 100 rg/ml
Poly I:C und 2,5 pg/ml Cycloheximid enthält. Das Medium bleibt 3 Stunden im Reaktionsgefäß.
Anschließend wird 2 pg/ml Actinomycin D zugegeben. Eine Stunde nach der Actinomycin
D-Zugabe wird das gesamte Induktionsmedium entfernt und die Zellen mindestens 4
x mit Minimum Essential Medium ohne Serum gewaschen. Anschließend wird Minimum Essential
Medium mit 1 000 pg/ml Serum-Albumin zugegeben und, wie vorher beschrieben, umgepumpt.
Die pH-Regulierung wird auf 7,5 - 7,6 eingestellt. 19-20 Stunden später wird das
Medium geerntet und nach bekannten Verfahren konzentriert und gereinigt.
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Die Ausbeuten an Interferon in der Roh-Lösung betragen unter Bezug
auf das internationale Referenz-Präparat G 023-902-527 des National Institutes of
Healt (USA) 900-2.000 Einheiten/cm2 Kulturfläche.
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Unter Verwendung von verschiedenen Füllkörpern in verschiedenen Ansatzmengen
wurde Fibroblasten-Interferon analog mit folgenden Ergebnissen hergestellt:
| Ansatz-Menge Interferon-Referenz-Einheiten/cm² |
| Füllkörper in Liter Kulturfläche |
| A 0,2 1.147 |
| A 0,2 1.956 |
| A 1,2 593 |
| B 0,3 83 |
| D 2,2 1.580 |
| D 17,0 1.374 |
| D 108,0 1.103 |
| H 0,2 470 |
| Vergleich (L) 0,2 23 |
| 0,2 19 |
Definition siehe Seite 5