DE3033885A1

DE3033885A1 - Verfahren zum zuechten von zellen

Info

Publication number: DE3033885A1
Application number: DE19803033885
Authority: DE
Inventors: Göran Einar Samuel Dr. phil. Almunge Lindgren; Per Ake Herman Dr. phil. Uppsala Vretblad
Original assignee: Pharmacia Fine Chemicals AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1979-09-12
Filing date: 1980-09-09
Publication date: 1981-04-02
Also published as: GB2059991B; GB2059991A; FR2464994B1; SE445116B; JPH0154992B2; SE7907573L; DE3033885C2; FR2464994A1; JPS5651981A

Description

Beschreibun

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten bzw. Kultivieren von Zellen in einem Kulturmedium, das teilchenförmige Mikroträger enthält.

In den letzten Jahren ist das Züchten von Zellen in vitro eine unerläßliche Technik in der Forschung geworden. Durch ein derartiges Züchten von Zellen werden Informationen über die Zellteilung, das Zellwachstum, die Differenzierung, die Struktur, den Metabolismus und das Altern erhalten. Diese Methode ist für Forschungen, unter anderem auf dem Gebiet der Pflanzenphysiologie, der Zoophysiologie, der Biochemie, der Pathologie, der Histologie, der Immunologie und der Krebsforschung von großer Signifikanz geworden. Diese Methode stellt die Grundtechnik der wissenschaftlichen Disziplin der Zellbiolpgie dar.

Weiterhin bringt das Züchten von Zellen in vitro den Durchbruch bei der Verwendung im technischen Maßstab, wo die rein technischen Schwierigkeiten des Erhalts einer genügenden Ausbeute von Zellen oder von Zellen abgesonderten Produkten innerhalb begrenzter Materialquellen ein begrenzender Faktor war. Dies trifft beispielsweise auf die Herstellung von Biochemikalien, Arzneimitteln, Hormonen und Virusimpfstoffen zu.

Bei Methoden zum Züchten von Zellen, die Produkte für den medizinischen oder veterinär-medizinischen Gebrauch ergeben sollen, ist man dem Gesetz nach gezwungen, mit normalen, diploiden Zellen zu arbeiten. Die große Vielzahl von Säugetierzellen, die in diesem Zusammenhang am besten untersucht worden sind, erfordern ein festes Substrat, um zur Proliferation

imstande zu sein. Man sagt, daß diese Zellen verankerungsabhängig sind. Säugetierzellen, die dazu imstande sind, in freier Suspension zu wachsen (z.B. menschliche HeLa-Zellen oder Hamster-Nierenzellen, BHK-Zellen) sind vom genetischen Gesichtspunkt her gesehen nicht vollständig normal und sie können bei der Injektion Tumore bewirken.

Bei den klassischen Methoden zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen werden Glas- oder Kunststoffschalen oder Rollflaschen oder Kolben verwendet, in denen es möglich ist, eine Schicht (Monoschichten) der Zellen zu erhalten. Bei der Durchführung einer solchen Technik in größerem Maßstab ist es bislang notwendig gewesen, die Anzahl der Kulturgefäße zu erhöhen. Die Zwischenstufen der Veränderung des Mediums, der Subzüchtung, der Ernte der Zellen etc. haben eine sehr große Anzahl von manuellen Maßnahmen unter sterilen Bedingungen erforderlich gemacht.

Eine klare Verbesserung im Vergleich zu den oben genannten Methoden ist durch Einführung der sog. Mikroträgerkultur erzielt worden. Bei dieser Technik läßt man die Zellen sich an kleinste Teilchen, die in dem Nährmedium durch langsames Rühren suspendiert gehalten werden können, anheften und darauf wachsen. Diese Teilchen bieten eine erheblich größere Oberfläche pro Volumeneinheit des Kulturgefäßes und sie ermöglichen daher die Züchtung von großen Mengen von Zellen in einem einzigen Tank. Bezüglich des Raums, des Arbeitsaufwands und der direkten Betriebskosten bringt diese Technik erhebliche Vorteile sowohl beim Arbeiten im Laboratorium als auch beim Arbeiten in größerem Maßstab mit sich.

Eine Methode unter Verwendung von solchen Mikroträger-Kulturtechniken wird in dem Artikel "Microcarrier culture of animal cells" von A.L. van Wezel in"Tissue Culture, Methods

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¹ - ί ' Q O r

- .. - ■·;. ϊ'.ΐΊ·\ i-..ιΐ. ί atltrson, Jr.,

, ,--^u-:.T.i-, i:-fcs& (Ί973)" Seiten 372 - 377, beschrieben.

Das in diesem Falle verwendete Trägermaterial besteht aus unlöslichen Perlen aus Dextran, das mit Epichlorhydrin vernetzt ist, welches mit Diethylaminoethyl-Gruppen substituiert ist.

Teilchenförmige Mikroträger sollten die folgenden Eigenschaften haben:

Die Dichte in Gegenwart von Wasser (d.h. im mit Wasser gequollenen Zustand) sollte sich vorzugsweise nicht nennenswert von der Dichte der wäßrigen Umgebung unterscheiden, in der das Trägermaterial eingesetzt wird, um eine homogene Suspension von Teilchen unter sorgfältigem Rühren zu erhalten; d.h. im allgemeinen sollte die Dichte im Bereich von 0,95 - 1,20 g/ml, vorzugsweise 1,00 - 1,10 g/ml und insbesondere 1,02 - 1,05 g/ml liegen.

Um eine gleichförmig wirksame Kapazität und eine gleichförmige Adhäsion und ein Wachstum der Zellen zu erhalten, sollten die Teilchen aus einer sehr engen Fraktion hinsichtlich der Teilchengröße bestehen. Im allgemeinen wird eine durchschnittliche Teilchengröße im mit Wasser gequollenen Zustand verwendet, die im Bereich von 100 - 500/um, vorzugsweise im Bereich von 100 - 300/um, z.B. im Bereich von 150 - 300/um, liegt.

Die Teilchen sollten glatt sein (und vorzugsweise eine kugelförmige oder sphäroidale Form haben), um eine zufriedenstellende Zelladhäsion und die geringste mögliche Chance der Zellen zur Verschiebung, wenn die Teilchen miteinander zusammenstoßen, haben. Die Teilchen sollten weiterhin dazu imstande

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sein, mechanischen Zug- und Druckspannungen im suspendierten Zustand zu widerstehen, so daß sie nicht in kleinere Teilchen zerfallen.

Eine Transparenz erleichtert mikroskopische Untersuchungen der wachsenden Kulturen.

Die Teilchen dürfen gegenüber primären Zellen, ausgebildeten Zellinien und Stämmen von diploiden Zellen von Menschen und Tieren nicht toxisch sein.

Die Fähigkeit der Teilchen aus dem Kultivierungsmedium andere Komponenten als diejenigen, die beim Mechanismus des Anhaftens der Zellen an den Teilchen teilnehmen, zu absorbieren, sollte vernachlässigbar sein.

Die bekannten Mikroträger sind jedoch bestimmten Begrenzungen unterworfen. So hat es sich beispielsweise bei bestimmten Umständen aus unbekannten Gründen als unmöglich erwiesen, menschliche diploide Zellen auf diesen Trägern zu züchten. Die Bindung zwischen der Zelle und dem Mikroträger mit ionisierbaren Gruppen, welche Bindung am Anfang elektrovalent ist, jedoch sekundär durch andere Typen von Bindungskräften mechanischerund/oder chemischer Natur verstärkt wird, ist nicht immer genügend stark. So kann beispielsweise erwähnt werden, daß bestimmte Typen von Lymphoid-Zellen an diesen Mikroträgern nicht befestigt werden. Weiterhin kann es sein, daß die Zellen sich entweder während des Wachstums oder während der Aufrechterhaltung der Kulturen ablösen. Dies ist beispielsweise beim Züchten einer Anzahl von normalen Fibroblasten beobachtet worden.

Bei anderen Zelltypen hat sich gezeigt, daß diese sich an

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vorliegende Mikroträger mit einer solchen Festigkeit binden, daß Probleme entstehen, wenn die Zellen zum Ernten davon befreit werden sollen. Die herkömmliche Methode in diesem Zusammenhang ist die Trypsinisierung, d.h. die Behandlung der Kultur mit einem proteolytischen Enzym. Eine zu starke Trypsinisierung führt aber zum Absterben oder zur Beschädi-■ gung der Zellen.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Züchten von Zellen in einem Kulturmedium zur Verfügung zu stellen, das kugelförmige Mikroträger enthält, die den oben beschriebenen Erfordernissen hinsichtlich der Mikroträger genügen und die weiterhin nicht die oben erwähnten Nachteile von bekannten Mikroträgern haben, die aber auch dazu verwendet werden können, Zellen in solchen Systemen zu züchten, wo bereits vorhandene Mikroträger technische Probleme ergeben.

Die Erfindung baut sich auf der Anwendung der biospezifischen Affinität auf, welche zwischen einerseits bestimmten Polypeptiden und andererseits einem oder mehreren Proteinen, die unter der Bezeichnung Fibronectine bekannt sind und im Serum und in den Membranen des Hauptteils von Zelltypen vorliegen, existiert. Indem man solche Polypeptide an einen Mikroträger anheftet, werden Teilchen erhalten, die in Anwesenheit von Fibronectin zu einer Bindung an Zellen imstande sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird dadurch charakterisiert, daß man als Mikroträger kugelförmige Teilchen einer vernetzten, organischen, makromolekularen Substanz verwendet, die in Wasser unlöslich, jedoch in Wasser quellbar ist, wobei diese Teilchen an ihren Außenoberflächen kovalent gebunde-

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nes Polypeptid haben, das dazu imstande ist, biospezifisch Fibronectin zu bilden. Die Teilchen haben im mit Wasser gequollenen Zustand eine Dichte im Bereich von 0,95 - 1,20 g/ml, vorzugsweise 1,00 - 1,10 g/ml und eine durchschnittliche Teilchengröße im Bereich von 100 - 500/um. (Die hierin verwendete Bezeichnung Polypeptid soll auch Proteine einschließen. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt soll dieser Ausdruck sowohl ein einziges Polypeptid als auch ein Gemisch einer Anzahl von Polypeptiden einschließen.).

Die makromolekulare Substanz kann beispielsweise ein PoIysaccharid oder ein Protein oder ein Derivat davon sein, das vernetzt worden ist. Beispiele für geeignete Polysaccharide sind Dextran und Agarose und Derivate davon. Beispiele für geeignete Proteine sind Kollagen, Kollagenähnlichkeiten oder Abbauprodukte davon, z.B. Gelatine, wobei das Polypeptid, das die Fähigkeit der biospezifischen Bindung von Fibronectin hat, die gleiche Substanz wie die makromolekulare Substanz sein kann. Die makromolekulare Substanz kann auch ein vernetztes, synthetisch hergestelltes^ Polymeres sein, das in Wasser unlöslich jedoch quellbar ist und das gegenüber den Zellen nicht toxisch ist.

Die Vernetzung von makromolekularen Substanzen die z.B. Aminogruppen oder Hydroxylgruppen enthalten (z.B. Proteine und Polysaccharide) mit mindestens einem bifunktionellen Vernetzungsmittel ist bereits bekannt (vgl. GB-PSen 854 715, 974 054 und 1 013 585). Die makromolekulare Substanz kann auch eine Kombination aus zwei oder mehrerenmakromolekularen Substanzen sein. Teilchen mit kugelförmiger Form können durch Perl-Polymerisations-Techniken hergestellt werden. In diesem Falle wird das Reaktionsgemisch zu Tröpfchenform in einer inerten Flüssigkeit, die damit nicht mischbar ist, dis-

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- :. ;.: ν d.ircii die Reaktion in den Tröpf-

■-.--, « trf.ixt.ieLen vernetzten unlöslichen Teilchen gewonnen (vgl. z.B. GB-PS 974 054). Die gewünschte Teilchengröße kann erhalten werden, indem man die Größe der Tröpfchen einstellt und indem man die Teilchen fraktioniert, beispielsweise durch Sieben. Das Vernetzungsmittel für makromolekulare Substanzen, die Hydroxylgruppen und Aminogruppen enthalten, kann z.B. eine Verbindung des Typs

X * A₁ * Z (I) und X * A₂ * Z (II)

sein, worin X, Y und Z jeweils ein Halogenatom, vorzugsweise Chlor oder Brom sind, und A₁ und Ap jeweils eine geradkettige oder verzweigte aliphatische, gesättigte Kohlenwasserstoff kette, die mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen (z.B. 1-3 Hydroxylgruppen) substituiert ist und die vorzugsweise 3-20 Kohlenstoffatome, z.B. 3-10 Kohlenstoffatome enhält, und die gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome (z.B. 1-3 Sauerstoffatome) unterbrochen ist, sind. Als Vernetzungsmittel können auch entsprechende Epoxidverbindungen, die aus der Verbindung (i) oder (II) durch Abspaltung von Halogenwasserstoff erhalten werden, verwendet werden. Beispiele für bifunktionelle Substanzen mit der Formel X * A₁* Z und entsprechende Epoxidverbindungen, die aus X" A₁ * Z durch Abspaltung von Halogenwasserstoff erhältlich sind, sind z.B. Dichlorhydrin, Epichlorhydrin und 1,4-Butandiol-Diglycid-Äther. Die Vernetzungen können somit z.B. geradkettige oder verzweigte aliphatische gesättigte Kohlenwasserstoffketten, die durch ein oder mehrere Hydroxylgruppen (z.B. 1 - 3 Hydroxylgruppen) substituiert sein können und die 3-20 Kohlenstoffatome, z.B. 3-10 Kohlenstoffatome enthalten und die gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome (z.B. 1-3 Sauerstoffatome) unterbrochen sind, sein. Es sind viele weitere Typen von Vernetzungs-

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mitteln bekannt, z.B. Diisocyanate und Diisothiocyanate. Die Quellkapazität und die Dichte der Teilchen im mit Wasser gequollenen Zustand kann variiert werden, indem man unterschiedliche, makromolekulare Substanzen und Vernetzungsmittel auswählt und indem man den Grad der Vernetzung variiert.

Erfindungsgemäß wird ein besonderer Vorteil erhalten, wenn man Teilchen verwendet, die Poren haben, welche so klein sind, daß das Polypeptid zu einem vorherrschenden Ausmaß auf der Oberfläche der Teilchen verbleibt und nicht in die Poren eindringt, und daß hochmolekulare Substanzen, die beim Züchten der Zelle gebildet werden, nicht in einem nennenswerten Ausmaß in die Poren eintreten.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird das Polypeptid in Form einer Oberflächenschicht auf ein Teilchen aufgebracht, welches aus einem anderen makromolekularen Material besteht als das Polypeptid. In dieser Hinsicht werden als Polypeptid Kollagen oder seine Abbauprodukte, z.B. Gelatin, bevorzugt. Weiterhin wird gemäß dieser Ausführungsform das Polypeptid an das teilchenförmige Material mit kovalenten Bindungen gebunden, die gegenüber den normalen Kultur-und Waschbedingungen beständig sind. Eine große Anzahl von Methoden zur Erzeugung von kovalenten Bindungen ist in der Literatur in Verbindung mit dem Kuppeln von Polypeptiden an Träger auf einer Polysaccharid- oder Proteinbasis beschrieben worden. Somit ist das Ankuppeln mittels Cyanogenhalogeniden beispielsweise in der US-PS 3 645 852, das Ankuppeln mittels Cyanaten beispielsweise in der US-PS 3 788 948 und das Ankuppeln durch Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen beispielsweise in der DE-OS 2 808 515 beschrieben worden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden

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als Mikroträger Kollagen oder seine Abbauprodukte, die so vernetzt worden sind, daß die gewünschte Unlöslichkeit in Wasser erhalten wird, verwendet.

Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung werden die Zellen zum gewünschten Zeitpunkt von dem Träger mit einem proteolytischen Enzym (z.B. Kollagenase, wenn das Polypeptid Kollagen oder Gelatine ist) nach beendigtem Wachstum der Zellen freigesetzt. Insbesondere im Falle von Kollagenase kann eine gute Ausbeute an lebensfähigen Zellen leicht freigesetzt werden (Kollagenase steht mit den Zellen erheblich besser im Einklang als Trypsin).

Die Teilchen können neutral sein oder sie können zusätzlich zu dem Polypeptid Ionenaustauschergruppen an der Oberflächenschicht haben. Die Ionenaustauschergruppen können an sich bekannte Anionen oder Kationenaustauschergruppen sein, z.B. Aminogruppen oder Carboxylgruppen.

Wie vorstehend erwähnt wurde, erscheint Fibronectin auf den Zeiloberflächen. Bei bestimmten Zelltypen, z.B. bei transformierten Zellen ist der Fibronectingehalt niedrig. Wenn das erfindungsgemäße Verfahren auf diesen Zelltyp angewendet wird, dann kann das Fibronectin in das System in einer geeigneten Form eingegeben werden, beispielsweise indem man Serum zusetzt oder indem man Mikroträger mit Fibronectin verwendet, welches an das Polypeptid auf der Außenschicht des Mikroträgers gebunden worden ist.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

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Beispiel 1 Wachstum von Vero-Zellen auf Mikroträgern

(Vero ist eine eingerichtete Zellinie, die von Affennierenzellen /Grüner Afrikanischer Affe_7 herrührt und die im Handel von Flow Laboratories, Ltd., Irwine, England erhältlich ist).

Im Autoklaven behandelte Mikroträger (z.B. BTV, vgl. unten) in einer 30 mg Trockensubstanz entsprechenden Menge wurden in einer Petrischale in 10 ml Dulbecco-Medium (Smith, J.D., Freeman, G., Vogt, M. and Dulbecco, R. (1960) Virology 12, 185-196), das 3mM Glutamin und 10% fetales Kalbsserum enthielt mit einer AnfangsZellkonzentration von 2 · 10 Zellen/ml suspendiert. Das Wachstum erfolgte in einem COp-Inkubator bei 37°C über einen Zeitraum von 160 Stunden, und es wurde dadurch gemessen, daß die Zellkerne mit 0,156 Kristallviolett angefärbt wurden und indem im Mikroskop gezählt wurde. Parallel zu diesem Versuch wurde die Züchtung unter identischen Bedingungen mit Cytodex ^1 (Mikroträger auf der Basis von vernetztem Dextran, das mit Diethylaminoethyl-Gruppen derivatisiert worden ist, im Handel von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden erhältlich) bewirkt.

Bei beiden Züchtungstests haben sich ungefähr 2 · 10 Zellen/ml an die Mikroträger nach 18 Stunden angeheftet. Nach 160 Stunden war die Anzahl der Zellen in beiden Kulturen auf wenig mehr als 10 /ml erhöht.

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Beispiel 2 Ernte von Zellen von den Mikroträgern

0,5 ml Suspension von Mikroträger (von Beispiel BV und Cytodex ^ 1) des Beispiels-1 wurden in Zentrifugierröhrchen übertragen. Der Überstand wurde durch leichtes Zentrifugieren (Beschleunigung bis zu 200 χ Schwerkraft und Verzögerung, insgesamt 5 Minuten) abgetrennt. Die Mikroträger wurden zweimal mit 1 ml von 0.03% EDTA in Puck-Kochsalzlösung (Puck, T. T., Cieciura, S.J., and Robinson, A. (1958), Journal of Experimental Medicine 108 945-956) und einmal mit 1 ml Puck-Kochsalzlösung ohne EDTA gewaschen.

Nach der letzten Zentrifugierung wurden 1 ml Enzymlösung in Puck-Kochsalzlösung, 0,05% Kollagenase (Boehringer-Mannheim, Deutschland) oder 0,05% Trypsin (Serva, Feinbiochemica GmbH & Co., Heidelberg, Deutschland) zugefügt. Nach Inkubation über einen Zeitraum von 5 und 10 Minuten bei 37°C wurde die Anzahl der freigesetzten Zellen gezählt (vgl. Tabelle 1).

Tabelle 1

Freisetzung der Vero-Zellen von Mikroträgern. Die Meßwerte stellen die Durchschnittswerte von zwei parallelen Tests dar.

Mikroträger Zugabe Anzahl der freigesetzen Zellen (%) Nach 5 Min. Nach 10 Min.

Gelatine Kollagenase in

Mikroträger Puck-Kochsalz-

^& lösung 76 97

Trypsin in Puck-Kochsalzlösung 48 80

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Tabelle 1 (Fortsetzung)

Mikroträger

Zugabe

Anzahl der freigesetzten Zellen (96)
Nach 5 Min. Nach 10 Min.

Cytodex

Puck-Ko chs alz- lösung	nicht be stimmt	4
Kollagenase in Puck-Kochsalz lösung	9	38
Trypsin in Puck- Kochsalzlösung ·	21	61
Puck-Kochsalz lösung	nicht be stimmt	1

Somit wird bei Züchtung gemäß der vorliegenden Erfindung eine erheblich höhere Ausbeute an freigesetzten Zellen, insbesondere wenn bei der Freisetzung Kollagenase verwendet wird, erhalten.

Beispiel 3

Züchtung von Vero-Zellen auf Gelatin-Sephadex^->'G50 und Cytodex

0.0375 ml gepackte Mikroträger des Beispiels BTT wurden in einem Kolben suspendiert und es wurden 1x10 Zellen/ml Züchtungsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit 1096 fetalem Kalbsserum, 3mM Glutamin und 2OmM HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethan-sulfonsäure)-Puffer) zugegeben. Es wurde bei 37°C in Gegenwart von mit Wasser gesättigter Luft

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{5% CO₂-) wachsen gelassen und die Kultur wurde mit einem

Magnetrührer mit einer Geschwindigkeit von 60 U-.p.ifl.ge-

(R]

rührt. Das Züchten der Zellen erfolgte auf CytodexviVi bei identischen Bedingungen. Das Wachstum gemessen als Anzahl von Zellen/ml Kulturmedium ist in Tabelle 2 zusammengestellt.

	Tabelle 2	Cytodex®1
Zeit, Stunden	Gelatin-Sephadex \-s	Zellen/ml
	G50 Zellen/ml	7,65 x 10⁴
19	11,5 x 10⁴	12,2 χ 10⁴
41	26,8 χ 10⁴	22,8 χ 10⁴
65	37,6 χ 10⁴	34,5 x 10⁴
97	49 x 10⁴	57 x 10⁴
138	56 χ 10⁴	57 x 10⁴
161	64,6 χ 10⁴

Es ist von Interesse festzustellen, daß das Wachstum auf Gelatin-Sephadex\JG50 am Beginn des Züchtungsprozesses erheblich rascher war. Die Differenz zwischen den verschiedenen Mikroträgern kann weiter erhöht werden, wenn die Zellkulturen wiederholt nach zwei'- bis viertägiger Inkubation reproduziert werden.

Die in diesen Beispielen verwendeten Mikroträger wurden auf folgende Weise hergestellt:

A. Herstellung von aktivierten Mikroträgern

I. 10 g mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran mit der Form von kugelförmigen Teilchen (Sephadexv-/G50 von Pharmacia

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Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) wurden auf einem Glasfilter mit Wasser gewaschen und in ein 500 ml Gefäß mit Wasser zu einem Gesamtvolumen von Wasser plus Teilchen von 300 ml überführt. 12 g Natriumhydroxid gelöst in 15 ml Wasser und 0,1 g Natriumborhydrid wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde auf 60⁰C erhitzt. 38 ml Epichlorhydrin wurden zugefügt und das Gemisch wurde 2 Stunden lang umsetzen gelassen. Danach wurden die Teilchen mit Wasser auf einem Glasfilter gewaschen und das Wasser wurde durch Absaugen entfernt.

II. 40 ml sedimentierte Teilchen von mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran (Sephadexv_/G50 von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) oder Teilchen von vernetzter Agarose (SepharoseVs^/CL 4B von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) und 20 ml Wasser wurden in ein 250 ml Gefäß übertragen und mit 60 ml einer Cyanogenbromidlösung (80 mg CNBr/ ml HpO) vermischt. Das Gemisch wurde bei einem pH-Wert von 11,4 6 Minuten lang bei 4°C umsetzen gelassen. Die Teilchen wurden sodann auf einem Glasfilter mit 1000 ml 0,1 M Natriumhydro gencarbonatlösung gewaschen.

B. Kupplung von Proteinen oder Peptiden an aktivierte Mikroträger

1 g Protein (Polypeptid ) wurde in 50 ml 0,1 M NaHCO,, das 0,5 M NaCl in Wasser enthielt (pH 8,0), erforderlichenfalls unter Erhitzen,aufgelöst. Der pH-Wert wurde auf 9,5 - 10,5 eingestellt. Die Lösung wurde zu Mikroträgern gegeben, die, wie oben unter A angegeben, aktiviert worden waren. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wonach die Teilchen abwechselnd mit 0,2 M Na-Acetatpuffer mit 0,5 M NaCl in Wasser (pH 4,5) und 0,2 NaHCO₃ mit 0,5 M NaCl in Wasser (pH 8,0) auf einem Glasfilter gewaschen wurden. Die Flüssigkeit wurde durch Absaugen entfernt.

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I. Kollagen (Kollagen Typ I von Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, USA) wurde auf aktiviertes Sephadexv-b G5O von A I auf die oben beschriebene Art und Weise gekuppelt.

Ausbeute: 11 mg Kollagen/g Trockenprodukt. Die Teilchengröße war 160-200/um und die Dichte war 1,03 g/ml.

II. Gelatine (Gelatine Typ III von Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, USA) wurde auf die oben beschriebene Art und Weise an aktiviertes Sephadexv_/G50 von A I angekuppelt.

Ausbeute: 4 mg Gelatine/g Trockenprodukt. Die Teilchengröße
1,03 g/ml.

chengröße war 160-200/um und die Dichte war

III. Kollagen (gleiches Produkt wie oben unter I angegeben) wurde auf die oben beschriebene Art und Weise an aktivierte Sepharosev-xCL 4B von A II angekuppelt.

Ausbeute; 80 mg Kollagen/g Trockenprodukt. Die Teilchengröße war 100-150/um und die Dichte war 1,02 g/ml.

IV. Gelatine (gleiches Produkt wie oben unter II angegeben) wurde auf die oben beschriebene Art und Weise an aktivierte SepharoseV^CL 4B von A II angekuppelt.

Ausbeute; 95 mg Gelatine/g Trockenprodukt. Die Teilchengröße war 100-150/um und die Dichte war 1,02 g/ml.

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V. Kollagen (gleiches Produkt wie oben unter I angegeben) wurde auf^die oben beschriebene Art und Weise an aktiviertes Sephadexv-^G50 von A II angekuppelt.

Ausbeutet 19 mg Kollagen/g Trockenprodukt. Die Teilchengröße war 130-150/um und die Dichte war 1,04 g/ml.

VI. Gelatine (gleiches Produkt wie oben unter II angegeben) wurde auf die oben beschriebene Art und Weise an Sephadex^/ G5o von A II angekuppelt.

Ausbeute: 12,5 mg Gelatine/g Trockenprodukt. Die Teilchengröße war 130-180/um und die Dichte war 1,04 g/ml.

Die obigen Werte betreffend die Teilchengröße und die Dichte beziehen sich auf Teilchen in mit Wasser gequollenem Zustand.

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Claims

KRAUS & WEISERT PATENTANWÄLTE r3L033885 UNO ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENT/ DR. WALTER KRAUS D 1 PLO M C H EM I KER · D R.-l N G. AN N EKÄTE WEISERT DIPL-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMSARDSTRASSE 15 ■ D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/79 70 77-79 70 78 · TELEX O5-212156 kpatd TELEGRAMM KRAUSPATENT 2681 ¥K/lh PBLARMACIA FINE CHEMICALS AB Uppsala 1, Schweden Verfahren zum Züchten von Zellen Patentansprüche

1. Verfahren zum Züchten von Zellen in einem Kulturmedium, das teilchenförmige Mikroträger enthält, dadurch g e kennz eichnet, daß die Mikroträger kugelförmige Teilchen einer in Wasser unlöslichen, jedoch in Wasser quellbaren, vernetzten, organischen, makromolekularen Substanz sind, wobei die Teilchen an ihren Oberflächen ein kovalent gebundenes Polypeptid mit der Fähigkeit, Fibronectin biospezifisch zu binden, aufweisen und wobei die Teilchen im mit Wasser gequollenen Zustand eine Dichte im Bereich von 0,95 - 1,20 g/ml, vorzugswei-

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se 1,00 - 1,10 g/ml und eine durchschnittliche Teilchengröße im Bereich von 100-500/um haben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Substanz ein in Wasser unlösliches, jedoch in Wasser quellbares Polymeres ist, welches gegenüber den Zellen nicht toxisch ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 od. 2, dadurch gekennzeich net, daß das Polypeptid in Form einer Oberflächenschicht auf ein Teilchen einer anderen makromolekularen Substanz als das Polypeptid aufgebracht ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennz ei chnet, daß das Polypeptid Kollagen oder ein Abbauprodukt davon ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mikroträger aus vernetztem Kollagen oder Abbauprodukten davon bestehen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen von dem Träger mittels eines proteolytischen Enzyms freigesetzt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid Kollagen oder Gelatine ist, und daß die Zellen von dem Träger mittels Kollagenase freigesetzt werden.

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