FR2464994A1 - Procede de culture de cellules dans un milieu de culture renfermant des micro-porteurs particulaires - Google Patents

Abstract

L'INVENTION A POUR OBJET UN PROCEDE DE CULTURE DE CELLULE DANS UN MILIEU DE CULTURE RENFERMANT DES MICRO-PORTEURS PARTICULAIRES. LES MICRO-PORTEURS SONT DES PARTICULES SPHERIQUES D'UNE SUBSTANCE ORGANIQUE MACRO-MOLECULAIRE RETICULEE, INSOLUBLE DANS L'EAU MAIS GONFLABLE PAR L'EAU, LESDITES PARTICULES PORTANT A LEURS SURFACES UN POLYPEPTIDE LIE PAR VOIE COVALENTE POSSEDANT L'APTITUDE DE LIAISON DE LA FIBRONECTINE SUR LE MODE BIOSPECIFIQUE, LESDITES PARTICULES AYANT A L'ETAT GONFLE PAR L'EAU UNE DENSITE COMPRISE ENTRE 0,95 ET 1,20GML, DE PREFERENCE ENTRE 1,00 ET 1,10GML, ET AYANT UNE GROSSEUR MOYENNE DE PARTICULES DE 100 A 500MICRONS. CULTURE DES CELLULES A ECHELLE INDUSTRIELLE POUR USAGES MEDICAUX ET VETERINAIRES.

Description

La présente invention concerne un procédé de cul-

ture de cellules dans un milieu de culture contenant

des micro-porteurs sous une forme particulaire.

Depuis quelques années la culture de cellules in vitro est devenue une technique indispensable dans la recherche. Une telle culture de cellules procure des

informations concernant la division des cellules, la crois-

sance des cellules, la différenciation, la structure, le métabolisme et le vieillissement et elle présente une grande importance dans la recherche concernant, entre autres, la physiologie des végétaux, la zoophysiologie, la biochimie, la pathologie, l'histologie, l'immunologie et la recherche concernant le cancer et, cette culture constitue la technique fondamentale dans la discipline

scientifique générale de la biologie des cellules.

En outre, la culture des cellules in vitro est sur le point de se frayer un chemin pour son utilisation à l'échelle industrielle, c'est-à-dire un domaine dans lequel

le facteur qui limitait jusqu'à présent un tel développe-

ment était constitué de difficultés purement techniques pour obtenir avec des ressources matérielles limitées un rendement suffisant en cellules ou produits excrétés par les cellules* Il en est par exemple ainsi dans le domaine de la préparation des produits biochimiques, des produits

pharmaceutiques, des hormones et des vaccins viraux.

Pour ce qui est des procédés de culture de cellules permettant d'obtenir des produits à usage vétérinaire ou

médical, la loi oblige les professionnels à opérer uni-

quement avec des cellules diploïdes normales. La très

grande majorité de cellules de mammifères, qui sont par-

ticulièrement étudiées dans le présent contexte, exigent un substrat solide pour pouvoir proliférer; on dit que ces cellules sont tributaires de leur ancrage. Les cellules de mammifères capables de croître en suspension libre (par exemple les cellules humaines HeLa ou les cellules de reins d'hamster, qu'on appelle "cellules B.H.K.".) ne sont pas entièrement normales du point de vue génétique et

peuvent provoquer des tumeurs quand on les injecte.

Les procédés classiques de culture de cellules tributaires d'ancrage font appel à des plateaux en verre

ou en matière plastique ou encore à des flacons ou bal-

lons à galets, dans lesquels on peut obtenir une couche (0monocouche") de cellules. Quand on met en oeuvre une telle technique à plus grande échelle, il fallait jusqu'à

maintenant augmenter le nombre de récipients de culture.

Les stades intermédiaires consistant à changer le milieu, à effectuer des sous-cultures, à recueillir les cellules

etc., ont exigé un très grand nombre d'opérations ma-

nuelles dans des conditions stériles.

Un perfectionnement évident par rapport aux procé-

dés précités a été obtenu par l'introduction de ce qu'on

appelle la culture avec micro-porteurs. Selon cette techni-

que, les cellules sont autorisées à se fixer spontanément

à des particules minuscules et à crottre sur ces parti-

cules, ces dernières étant Maintenues en suspension dans un milieu nutritif, l'opération étant réalisée par une agitation lente des particules. Les particules en question présentent une surface de contact beaucoup plus importante par unité de volume du récipient de culture et on est ainsi en mesure de cultiver au sein d'une seule cuve des quantités importantes de cellules. Sur les plans de l'espace nécessaire, de la maind'oeuvre requise et des

frais opératoires directs, cette technique offre des avan-

tages considérables aussi bien pour les travaux en labo-

ratoire que pour des travaux à plus grande échelle.

Un procédé utilisant des techniques de culture sur micro-porteurs est décrit dans l'article "Microcarrier culture of animal cells" par A.L. Van Wezel dans Tissue

Culture, Methods and Applications, P.F. Kruse Jr. et M.K.

Patterson Jr., éditeurs, Academic Press (1973), pages

372-377.

La matière porteuse utilisée dans ce cas comprend

des perles insolubles de dextrane réticulé avec l'épichlor-

hydrine substitué par des groupes diéthylaminoéthyle.

Les micro-porteurs particulaires doivent posséder les propriétés ciaprès: la densité en présence d'eau (cWest-à-dire à l'état gonflé par l'eau) ne doit pas, de préférence, différer d'une façon marquée de la densité de l'environ- nement aqueux dans lequel on emploie la matière porteuse pour obtenir une suspension homogène des particules dans des conditions minutieuses d'agitation, ctest-à-dire qu'en général cette densité doit être comprise entre 0,95 et 1,20, de préférence entre 1,00 et 1,10 et, mieux encore,

entre 1,02 et 1,05 g/ml.

Pour obtenir une capacité unitaire efficace et une adhésion uniforme ainsi qu'une croissance régulière des cellules, les particules doivent représenter une fraction très étroite concernant leur grosseur. En général, on

utilise une grosseur moyenne de particules à l'état gon-

flé à l'eau comprise entre 100 et 500, de préférence

entre 100 et 300 et, par exemple, entre 150 et 300 microns.

Les particules doivent être lisses (de préférence de forme sphérique ou sphéroMdale) afin d'obtenir une

adhérence satisfaisante des cellules et réduire au rigou-

reux manimum les risques d'un délogement des cellules

lors d'une collision des particules les unes avec les au-

tres et ces particules doivent également pouvoir supporter les efforts et les contraintes mécaniques quand elles

sont en suspension, de sorte que les particules-ne se dé-

sintègrent pas en des fragments plus petits.

La transparence facilite les études au microscope

des cultures en cours de croissance.

Les particules doivent être non toxiques aux cel-

lules primaires, aux lignes cellulaires établies etjaux

souches de cellules diploïdes d'origine humaine ou ani-

male. L'aptitude des particules à absorber du milieu de culture des composants autres que ceux qui participent au mécanisme d'adhérence des cellules aux particules doit

être négligeable.

Cependant, les micro-porteurs connus présentent certaines limitations. Par exemple, dans certains cas il s'est révélé difficile pour des raisons non élucidées de cultiver sur les porteurs de ce genre des cellules diploïdes d'origine humaine. Etant donné que la liaison

entre une cellule et un micro-porteur comprend des grou-

pes ionisables, cette liaison devant être initialement

électrovalente mais étant amplifiée sur un mode secon-

daire avec d'autres types de forces liantes de nature mécanique et/ou chimique, on peut considérer que cette liaison n'est pas toujours suffisamment résistante. A titre d'exemple, on peut mentionner que certains types

de cellules lymphoïdes ne se fixent pas à ces micro-

porteurs. Les cellules sont également aptes à être ébran-

lées pendant la croissance ou pendant la conservation des cultures. On a observé ce phénomène, par exemple, lors de la culture d'un certain nombre de fibroblastes normaux.

D'autres types de cellules se lient aux micro-

porteurs existants avec une force telle que des problèmes se posent lorsqu'on désire libérer les cellules pour les

récolter. Le procédé classique dans ce but est la trypsi-

nisation, c'est-à-dire le traitement de la culture par une enzyme protéolytique. Une trypsinisation excessive se

traduit par la mort ou l'endommagement des cellules.

En conséquence, l'invention a pour but principal de fournir un procédé de culture de cellules dans un

milieu de culture renfermant des micro-porteurs sphéri-

ques qui répondent aux exigences précitées, les cellules étant placées sur les micro-porteurs qui, par ailleurs, sont exempts des inconvénients précités des micro-porteurs connus mais que l'on peut également utiliser pour cultiver

des cellules dans'des systèmes- d'un type tel que les micro-

porteurs connus auraient posé des problèmes techniques.

L'invention est basée sur l'utilisation de l'affi-

nité biospécifique xEz.ctoae1aM, dnte part, certains poly-

peptides et, d'autre part, une ou plusieurs protéines

connues sous l'appellation *fibronectines" et qui exis-

tent dans le sérum et dans les membranes de la plupart de types de cellules. En fixant de tels polypeptides à

un micro-porteur, on obtient des particules qui en pré-

sence d'une fibronectine sont capables de lier les cellules. Selon le procédé qui fait l'objet de l'invention,

les micro-porteurs utilisés sont des particules sphéri-

ques d'une substance organique macromoléculaire réticu-

lée qui est insoluble dans l'eau mais gonflable dans

celle-ci, les particules portant sur leurs surfaces ex-

térieures un polypeptide lié sur le mode covalent et capable de lier la fibronectine par voie biospécifique, lesdites particules présentant à l'état gonflé par l'eau

une densité comprise entre 0,95 et 1,20 g/ml et, de pré-

férence, entre 1,00 et 1,10 g/ml et ayant une grosseur moyenne de particules comprise entre 100 et 500 microns (le terme polypeptide utilisé dans le présent mémoire englobe également les protéines; d'autre part, ce terme est utilisé pour désigner un seul polypeptide ou bien un

mélange de deux ou plusieurs polypeptides).

La substance macromoléculaire peut être, par exem-

ple, un polysaccharide ou une prOtéine ou encore un dérivé d'un tel composé ayant subi une réticulation. Parmi les polysaccharides utilisables, il convient de citer le dextrane et l'agarose ainsi que leurs dérivés. Parmi les protéines utilisables, il convient de citer les

collagènes, les précurseurs des collagènes ou leurs pro-

duits de dégradation comme par exemple les gélatines, si bien que le polypeptide possédant la capacité de lier les fibronectines par voie biospécifique pourrai-t être la même substance que la substance macromoléculaire. La

substance macromoléculaire peut également être un poly-

mère synthétique réticulé qui est insoluble mais gonflable

dans l'eau et qui n'est pas toxique pour les cellules.

La réticulation des substances macromoléculaires contenant, par exemple, des groupes amino ou des groupes

hydroxyle (par exemple les protéines et les polysaccha-

rides) avec un agent de réticulation au moins bifonction-

nel est bien connue des spécialistes (voir par exemple

les brevets G.B. 854 715, 974 054 et 1 013 585). La subs-

tance macromoléculaire peut également comprendre une

combinaison de deux ou plusieurs substances macromolécu-

laires. On peut préparer des particules de forme sphéri-

que par des techniques de polymérisation de perles. Dans ce cas, on disperse le mélange de réaction SOUS forme de

gouttelettes dans un liquide inerte qui n'est pas misci-

ble avec le mélange de réaction, puis on récupère les particules insolubles réticulées formées par la réaction

des gouttelettes (voir par exemple le brevet G.B. 974 054).

On peut obtenir les particules ayant la grosseur désirée par un réglage de la dimension des gouttelettes et par un fractionnement des particules, par exemple par un tamisage de ces dernières. L'agent de réticulation pour les substances macromoléculaires contenant des groupes hydroxyle ou des groupes amino peut être, par exemple, un composé de formule: Y X. A1. Z (I) ou X. A2 * z (II) dans laquelle X, Y et Z représentent chacun un atome d'halogène, de préférence de chlore ou de brome, alors que A1 et A2 représentent chacun une chaîne hydrocarbonée aliphatique saturée, droite ou ramifiée et substituée par un au plusieurs groupes hydroxyle (par exemple 1 à 3 groupes hydroxyle) et renfermant, de préférence, de 3 à

atomes de carbone, par exemple de 3 à 10 atomes de car-

bone, ladite chaine étant facultativement interrompue par un ou plusieurs atomes d'oxygène (par exemple 1 à 3 atomes d'oxygène), ou bien des composes epoxydés correspondants

qu'on obtient à partir du composé (I) ou (II) par sépara-

tion du composant halogenhydrique. Comme exemples de substances bifonctionnelles répondant à la formule X. Ai. Z et de composés époxydés correspondantSobtenables

à partir de X. A1. Z par séparation du composant halo-

genhydrique, on peut citer la dichlorhydrine, l'épichlor-

hydrine et l'éther diglycidylique de 1,4-butanediol.

Ainsi les réticulations peuvent contenir, par exemple, des chalnes hydrocarbonées aliphatiques saturées, droites ou ramifiées pouvant être substituées par un ou plusieurs groupes hydroxyle (par exemple 1 à 3 groupes hydroxyle) et contenant de 3 à 20 atomes de carbone, par exemple 3 à 10 atomes de carbone, ces chaînes étant facultativement interrompues par un ou plusieurs atomes d'oxygène (par exemple 1 à 3 atomes d'oxygène). On connaît de nombreux autres types d'agents de réticulation, par exemple des diisocyanates et des diisothiocyanates. La capacité de gonflement et la densité des particules à l'état gonflé

par l'eau peuvent être modifiées en choisissant des subs-

tances macromoléculaires différentes et d'autres agents de réticulation, ou encore par une variation du degré

de réticulation.

Selon linvention, on réalise des avantages par-

ticulièrement importants quand on utilise des particules dont les pores sont tellement petits que le polypeptide demeure par prédominance à la surface des particules sans pénétrer dans les pores, si bien que les substances d'un poids moléculaire élevé qui sont formées par la culture des cellules ne pénètrent pas à un degré notable dans

les pores.

Selon un mode de réalisation de l'invention, on

applique le polypeptide sous forme d'une couche superfi-

cielle sur une particule qui comprend une matière macro-

moléculaire autre que celle du polypeptide. A cet égard, le polypeptide préféré est un collagène ou un produit de dégradation de celui-ci tel qu'une gélatine. D'autre part, selon ce même mode de réalisation, le polypeptide est lié à la matière particulaire par des liaisons covalentes capables de résister aux conditions normales de culture et de lavage. De nombreux procédés d'établissement de liaisons covalentes ont été décrits dans la littérature au sujet du couplage de polypeptides aux supports sur une base de polysaccharide ou de protéine. Ainsi le couplage à l'aide dthalogénures de cyanogène a été

décrit, par exemple, dans le brevet U.S. 3 645 852; le-

couplage avec les cyanates a été décrit dans le brevet

U.S. 3 788 948; et le couplage avec des réactions dtéchan-

ge de thiol-disulfures a été décrit dans le brevet D.T.

2 808 515;

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les micro-porteurs sont en collagène ou en produits de

dégradation de celui-ci ayant subi la réticulation néces-

saire pour obtenir l'insolubilité désirée dans l'eau.

Selon un autre aspect de l'invention, les cellules sont libérées des porteurs quand on le désire à l'aide d'une enzyme protéolytique (par exemple la collagénase quand le polypeptide est un collagène ou une gélatine) après l'achèvement de la croissance des cellules. En

particulier, dans le cas de la collagénase, on peut faci-

lement libérer des cellules viables en un rendement élevé (la collagénase a beaucoup plus d'affinité aux cellules

que la trypsine).

Les particules peuvent être neutres ou peuvent,

en plus du polypeptide, contenir des groupes échangeurs-

d'ions dans'la couche superficielle. Les groupes échan-

geurs d'ions peuvent être des échangeurs d'anions ou de cations connus, comme par exemple des groupes amino-ou carboxyliques.

Comme il a été précédemment expliqué, une fibro-

nectine apparait sur les surfaces des cellules. Avec certains types de cellules, par exemple avec des cellules

transformées, la teneur en fibronectine est faible.

Quand on applique le procédé selon l'invention à des cellules de ce genre, on peut ajouter une fibronectine au système sous une forme appropriée quelconque, par

exemple par addition de sérum ou par utilisation de micro-

porteurs portant de la fibronectine liée au polypeptide

sur la couche extérieure.

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Les exemples suivants servent-à illustrer l'in-

vention sans aucunement en limiter la portée.

EXEMPLE 1

Croissance de cellules "Vero" sur des micro-porteurs

("Vero" est une ligne cellulaire bien établie et prove-

nant des cellules de reins de singe, en iloccuzxDe des singes africains verts, ce produit étant disponible dans le commerce et étant vendu par Flow Laboratories, Ltd.,

Irwine, Angleterre).

On met en suspension des micro-porteurs traités en

autoclave (par exemple BIV, voir plus bas) en une propor-

tion qui correspond à 30 mg de substance sèche dans une botte de Pétri dans 10 ml d'un milieu "Dulbecco" (Smith, J.D., Freeman, G, Vogt, M et Dulbecco R., 1960, Virology 12, 185-l96), renfermant 4 millimoles de glutamine et % de sérum de foetus de veau avec une concentration

initiale de cellules de 2 X 105 cellules /ml. La croissan-

ce a lieu dans un incubateur à C02 à 370C pendant 160 heu-

res et on la-mesure en tachant des noyaux cellulaires

avec du violet cristallin à 0,1 % et par comptage micros-

copique. Parallèlement à cet essai, on effectue la culture dans des conditions identiques en utilisant le produit "Cytodex-l" (marque déposée d'un micro-porteur à base de dextrane réticuléeayant subi un traitement de dérivation avec des groupes diéthylaminoéthyle, qu'on trouve dans le commerce chez Pharmacia Fine Chemicals AB, UPPSALA, Suède). Dans les deux tests de culture, environ 2 x 10 cellules /ml se sont fixées aux microporteurs après 18 heures. Après 160 heures, le nombre de cellules dans les deux cultures a augmenté à une valeur légèrement supérieure

à 106/mî.

EXEMPLE 2

Récolte des cellules à partir des micro-porteurs On transfère 0,5 ml de suspension de micro-porteurs (à partir de l'exemple BV et "Cytodex 1") de l'exemple 1 dans des tubes centrifugeurs. On sépare le liquide qui surnage par une légère centrifugation (accélération à x gravité et retard, total 5 minutes). On lave les micro-porteurs à deux reprises avec 1 ml dtEDTA à 0,03 %

dans la solution saline Puck (Puck, T.T. Cieciura, S.J.

et Robinson, A. (1958) Journal of Experimental Medicine 108 945-956) et une fois avec 1 ml de la solution saline

de Puck ne contenant pas d'EDTA.

Après la dernière centrifugation, on ajoute 1 ml d'une solution d'enzyme dans la solution saline de Puck, 0,05 de collagénase (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Allemagne) ou 0,05 % de tripsine (Serva, Feinbiochemica GmbH & Co, Heidelberg, Allemagne). Après 5 et 10 minutes d'incubation à 37 C, on compte le nombre de cellules

libérées (voir tableau I).

TABLEAU I

Libération des cellules "Vero" à partir des micro-por-

teurs (les valeurs indiquées sont les valeurs moyennes

de deux essais parallèles).

Micro-porteur Addition Nombre de cellules libérées(%) Après 5 mn Après 10 mn Gélatine "Cytodex 1" 3o collagénase dans salin de Puck trypsine dans salin de Puck salin de Puck collagénase dans salin de Puck trypsine dans salin de Puck salin de Puck non déterminé non déterminé Ainsi, quand on cultive selon l'invention, on

obtient un rendement beaucoup plus élevé en cellules libé-

rées, surtout quand on emploie la collagénase pour la libération. il

EXEMPLE 3

Culture des cellules "Vero" sur gélatine-Sephadex G 50

et Cytodex i (marques déposées).

On met en suspension 0,0375 ml de micro-porteurs tassés provenant de l'exemple BII dans un ballon et on ajoute 1 x 105 cellules par millilitre de milieu de culture (milieu d'Eagle modifié par Dulbecco à l'aide de

% de sérum de foetus de veau, 4 millimoles de gluta-

mine et 20 millimoles de "HEPES" qui est un tampon cons-

titué par l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-l-pipérazino-éthane-

sulfonique). On permet à la croissance de se poursuivre - à 370C en présence d'air saturé avec de l'eau (5 % C02), la culture étant agitée à une vitesse de 60 tours/minute

à l'aide d'un agitateur magnétique. -

On effectue la culture de cellules sur "Cytodex l" dans des conditions identiques. La croissance exprimée par le nombre de cellules par ml de milieu de culture

est indiquée dans le tableau II.

TABLEAU II

Temps (h) Cellules/ml de Cellules/ml de Gélatine-Sephadex G 50 Cytodex 1 19 11,5 x 104 7,65 x 10 41 26,8 z 104 12,2 x 104 37,6 z lO4 22,8-x 104 97 49 z 104 34,5 x 104 138 56 x 1o4 57 x 104 161 64,6 x 104 57 x 104 Il est intéressant de faire remarquer que la

croissance est beaucoup plus rapide sur la gélatine-

Sephadex G 50 au début du procédé de culture. Cette dif-

férence entre les différents micro-porteurs peut être encore plus marquée si l'on reproduit de façon répétée les cultures des cellules après une incubation d'une

durée de 2 à 4 jours.

Pour préparer les micro-porteurs utilisés dans les exemples, on opère comme suit: A - Préparation des micro-porteurs activés I - On lave 10 g de dextrane réticulé avec de

1lépichlôrhydrine et ayant la forme de particules sphé-

riques ("Sephadex G 50", marque déposée de Pharmacia Fine Chemicals AB; Uppsala, Suède) sur un filtre de verre avec de l'eau et on transfère dans un récipient de 500 ml avec de l'eau pour obtenir un volume total d'eau plus les particules de 300 ml. On ajoute 12 g d'hydroxyde de sodium dissous dans 15 ml d'eau et 0,1 g de borohydrure de sodium. On chauffe le mélange à 600C. On ajoute 38 ml d'épichlorhydrine et on laisse réagir pendant deux heures, puis on lave les particules avec de l'eau sur un filtre

de verre et on élimine l'eau par aspiration.

II - On transfère dans un récipient d'une capacité de 250 ml, 40 ml de particules sédimentées de dextrane réticulé avec l'épichlorhydrine ("Sephadex G-50") ou des particules d'agarose réticulé ("Sepharose CL 4 B" produit de Pharmacia Fine Chemicals AB) et 20 ml d'eau et on

mélange avec 60 ml d'une solution de bromure de cyano-

gène (80 mg CNBr/ml H20). On laisse le mélange réagir à un pH de 11,4 pendant 6 minutes à 40C. On lave ensuite les particules sur un filtre de verre avec 1.000 ml d'une

solution 0,1 M d'hydrogénocarbonate de-sodium.

B - Couplage des protéines ou des peptides aux micro-

porteurs activés On dissout 1 gramme de protéine (polypeptide) dans ml d'une solution 0,1 M de NaHC03 contenant 0,5 mole de NaCl dans l'eau (pH 8,0) tout en chauffant si nécessaire et on règle le pH à 9,5-10,5. On ajoute la solution à des micro-porteurs activés selon le paragraphe A cidessus et on agite le mélange pendant 24 heures,à température ambiante, puis on lave les particules en alternance avec un tampon 0,2 M d.acétate de sodium contenant 0,5 mole de NaCl dans l'eau (pH 4,5) et une solution 0,2 M de NaHC03 contenant 0,5 mole de NaCl dans l'eau (pH 8,0)

sur un filtre de verre et on enlève le liquide par aspi-

ration. I - On couple du collagène ("Collagène du type 1" vendu par Sigma Chemical Company, Saint-Louis, Missouri, USA) au Séphadex G-50 activé du paragraphe A 1 comme précédemment expliqué. On obtient 11 mg de collagène par gramme de produit sec. La grosseur des particules

est de 160 à 200-microns et la densité est de 1,03 g/ml.

Il - On couple une gélatine ("Gélatine du type 3" vendue par Sigma Chemical Company, Saint-Louis) de la

façon décrite plus haut au Sephadex G-50 active du para-

graphe A I. On obtient 4 mg de gélatine par gramme de produit sec. La grosseur des particules est de 160 à 200

microns et la densité est de 1,03 g/ml.

III - On couple le même collagène que dans I ci-

dessus de la façon décrite au Sepharose CL 4B activé du paragraphe A II. On obtient 80 mg de collagène par gramme de produit sec. La grosseur des particules est de 100 à

microns et la densité est de 1,02 g/ml.

IV - On couple la même gélatine que dans le para-

graphe II ci-dessus, de la façon décrite au Sepharose CL 4B activé provenant du paragraphe A II. On obtient mg de gélatine par gramme de produit sec. La grosseur des particules est de 100 à 150 microns et la densité

est de 1,02 g/ml.

V - On couple le même collagène que dans le para-

graphe I ci-dessus de la façon décrite au Sephadex activé G-50 provenant du paragraphe A II. On obtient 19 mg de collagène par gramme de produit sec. La grosseur des particules est de 130 à 150 microns et la densité est

de 1,04 g/ml.

VI - On couple la même gélatine que dans le para-

graphe Il ci-dessus de la façon décrite au Sephadex G-50 du paragraphe A II. On obtient 12,5 mg de gélatine par gramme de produit sec. La grosseur des particules est de

à 180 microns et la densité est de 1,04 g/ml.

Les valeurs indiquées des grosseurs de particules et de densité sont déterminées sur des particules à l'état

gonflé par l'eau.

Claims (7)

REVENDICATIONS

1 - Procédé de culture de cellules dans un milieu de culture renfermant des micro-porteurs particulaires,

caractérisé en ce que les micro-porteurs sont des par-

ticules sphériques d'une substance organique macro-molé- culaire réticulée, insoluble dans l'eau mais gonflable par l'eau, lesdites particules portant à leurs surfaces un polypeptide lié par voie covalente possédant l'aptitude de liaison de la fibronectine sur le mode biospécifique, lesdites particules ayant à ltétat gonflé par l'eau une densité comprise entre 0,95 et 1,20 g/ml, de préférence entre 1,00 et 1, 10 g/ml1,et ayant une grosseur moyenne-de

particules de 100 à 500 microns.

2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance macromoléculaire est un polymère insoluble dans l'eau mais gonflable par l'eau et qui

n'est pas toxique pour les cellules.

3 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou

2, caractérisé en ce qu'on applique le polypeptide sous forme d'une couche superficielle sur une particule d'une

substance macromoléculaire autre que le polypeptide.

4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3,

caractérisé en ce que le polypeptide est un collagène

ou des produits de dégradation de collagène.

5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microporteur est un collagène réticulé ou

des produits de dégradation du collagène également réti-

culé.

6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5,

caractérisé en ce que les cellules sont libérées des por-

teurs à l'aide d'une enzyme protéolytique.

7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polypeptide est un collagène ou une gélatine et en ce que les cellules sont libérées des porteurs à

l'aide de collagénase.