JPH0732B2 - 細胞培養担体及び細胞培養方法 - Google Patents
細胞培養担体及び細胞培養方法Info
- Publication number
- JPH0732B2 JPH0732B2 JP60036777A JP3677785A JPH0732B2 JP H0732 B2 JPH0732 B2 JP H0732B2 JP 60036777 A JP60036777 A JP 60036777A JP 3677785 A JP3677785 A JP 3677785A JP H0732 B2 JPH0732 B2 JP H0732B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell culture
- carrier
- protein
- silica
- porous material
- Prior art date
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は、細胞培養担体及び細胞培養方法に関するもの
である。詳しくは、付着依存性の細胞培養に適した担体
及び方法に関するものである。
である。詳しくは、付着依存性の細胞培養に適した担体
及び方法に関するものである。
［従来技術とその欠点］ 近年、細胞培養法は生物学的な研究のみでなく、医療、
薬剤、食品工学等の面で有用な物質、例えば、酵素、ホ
ルモン、抗体、核酸などの生産方法として着目されてい
る。現在、細胞培養は、いかにして工業的規模で大量に
細胞組織を培養するかにつき種々の検討が行なわれてい
る。一般に、動物細胞は培養時には付着依存性を有して
おり、培養中の容器の壁面上に単層で生育する物質があ
る。そのため、大量に培養する為には例えば多数の容器
を用いるか、又は容器中に多数のガラス板等をお互いに
接触しないように工夫して配置するなど特殊な培養槽を
用いることが必要であった。ところが、近時、このよう
な低生産性で複雑なものではなく、培地中に微細な固体
粒子を加え、この固体表面に細胞を付着させ、一定培地
中の使用可能な表面積を上昇させ、懸濁状態で増殖させ
る方法が提案され注目されている。この方法では従来の
浮遊培養システムの装置がそのまま付着依存性組織の培
養に適応できるため装置が単純化され、また、従来の方
法に較べて、一定容積当りの培地での生産能力が増大さ
れる利点がある。このような細胞培養に適する担体とし
ては以下のような条件が要求される。
薬剤、食品工学等の面で有用な物質、例えば、酵素、ホ
ルモン、抗体、核酸などの生産方法として着目されてい
る。現在、細胞培養は、いかにして工業的規模で大量に
細胞組織を培養するかにつき種々の検討が行なわれてい
る。一般に、動物細胞は培養時には付着依存性を有して
おり、培養中の容器の壁面上に単層で生育する物質があ
る。そのため、大量に培養する為には例えば多数の容器
を用いるか、又は容器中に多数のガラス板等をお互いに
接触しないように工夫して配置するなど特殊な培養槽を
用いることが必要であった。ところが、近時、このよう
な低生産性で複雑なものではなく、培地中に微細な固体
粒子を加え、この固体表面に細胞を付着させ、一定培地
中の使用可能な表面積を上昇させ、懸濁状態で増殖させ
る方法が提案され注目されている。この方法では従来の
浮遊培養システムの装置がそのまま付着依存性組織の培
養に適応できるため装置が単純化され、また、従来の方
法に較べて、一定容積当りの培地での生産能力が増大さ
れる利点がある。このような細胞培養に適する担体とし
ては以下のような条件が要求される。
担体表面に細胞が付着しやすい。
担体と培地の溶液との比重差が小さい。
担体が生物学的に不活性である。
担体は光を透過し、付着した細胞を簡単に顕微鏡で観
察できる。
察できる。
担体の滅菌処理が可能である。
適度の硬度があり取り扱い易い。
しかしながら、以上の条件をすべて十分に満足する担体
は今までのところ見当らず、例えば、有機物系の高分子
物質よりなる担体が市販されているが、まだ問題点があ
り一般に普及されるまでには至っていない。すなわち、
第一に担体表面と細胞との親和性を上昇させるために
は、担体上に電荷を有する官能基又は細胞との親和製を
有する、例えば、コラーゲンの様な物質を化学反応的に
結合させる必要があり、高価な試薬が数段階の工程を必
要とするので、担体の製造コストが高かった。又、培地
との比重差を小さくするため、光透過性を向上させるた
め、更に、培地の栄養の透過性及び保持力を考慮し内部
に培地溶液を保有させる必要があるため、例えば、多孔
質のもの又は水により膨潤するような物質が選択されて
きたが、このような有機物高分子の担体はかなり柔らか
く、もろいものが多く撹拌操作により割れ、摩耗が生
じ、培養操作の制御が難しかった。また外部から圧力を
加えると変形してろ過等の分離操作が困難であった。
は今までのところ見当らず、例えば、有機物系の高分子
物質よりなる担体が市販されているが、まだ問題点があ
り一般に普及されるまでには至っていない。すなわち、
第一に担体表面と細胞との親和性を上昇させるために
は、担体上に電荷を有する官能基又は細胞との親和製を
有する、例えば、コラーゲンの様な物質を化学反応的に
結合させる必要があり、高価な試薬が数段階の工程を必
要とするので、担体の製造コストが高かった。又、培地
との比重差を小さくするため、光透過性を向上させるた
め、更に、培地の栄養の透過性及び保持力を考慮し内部
に培地溶液を保有させる必要があるため、例えば、多孔
質のもの又は水により膨潤するような物質が選択されて
きたが、このような有機物高分子の担体はかなり柔らか
く、もろいものが多く撹拌操作により割れ、摩耗が生
じ、培養操作の制御が難しかった。また外部から圧力を
加えると変形してろ過等の分離操作が困難であった。
［解決しようとする問題点と解決手段］ 本発明者は、上記実情に鑑み、上記〜の担体として
の性質を満足し、しかも、安価で製造できる担体を得る
べく検討を重ねた結果、シリカ系多孔材料を基材とした
担体を用いることにより、従来の担体よりも取り扱い性
に優れ、また簡単な操作で細孔の付着性が向上されるた
め極めて安価に製造が可能であることを見い出し、本発
明を完成した。
の性質を満足し、しかも、安価で製造できる担体を得る
べく検討を重ねた結果、シリカ系多孔材料を基材とした
担体を用いることにより、従来の担体よりも取り扱い性
に優れ、また簡単な操作で細孔の付着性が向上されるた
め極めて安価に製造が可能であることを見い出し、本発
明を完成した。
［発明の要旨］ 即ち、本発明の細胞培養担体は、シリカ系多孔材料から
なる微粒子の表面に蛋白質を吸着させると共に、該蛋白
質同士を架橋して不溶化させることによりコーティング
したことを特徴とする。
なる微粒子の表面に蛋白質を吸着させると共に、該蛋白
質同士を架橋して不溶化させることによりコーティング
したことを特徴とする。
さらに、本発明の細胞培養方法は、前記細胞培養担体を
用いて細胞を培養することを特徴とする。
用いて細胞を培養することを特徴とする。
［発明の構成］ 以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で用いるシリカ系多孔材料としては、一般にシリ
カゲル又は多孔質ガラスなどである。これらの物質は、
無定型で結晶構造を有さず、可視部での光吸収がないた
め透光性である。また、これら多孔材料は細孔を有して
いるため光の回折範囲以上となると界面上での光の反射
により光透過性が劣ってくるが、水中においては例え
ば、100nm以下の細孔を有するものは十分な透過性があ
り、顕微鏡観察が可能であるので特に望ましい。更に、
多孔質であるため培地中では内部に培地溶液を含有でき
るため、細胞の増殖に好都合であるだけでなく、見掛け
の比重も本来の真比重（2.2〜2.3）より大幅に低減され
るので、暖やかな撹拌により浮遊状態にさせることが可
能である。
カゲル又は多孔質ガラスなどである。これらの物質は、
無定型で結晶構造を有さず、可視部での光吸収がないた
め透光性である。また、これら多孔材料は細孔を有して
いるため光の回折範囲以上となると界面上での光の反射
により光透過性が劣ってくるが、水中においては例え
ば、100nm以下の細孔を有するものは十分な透過性があ
り、顕微鏡観察が可能であるので特に望ましい。更に、
多孔質であるため培地中では内部に培地溶液を含有でき
るため、細胞の増殖に好都合であるだけでなく、見掛け
の比重も本来の真比重（2.2〜2.3）より大幅に低減され
るので、暖やかな撹拌により浮遊状態にさせることが可
能である。
シリカ系多孔材料として一般的に用いられるシリカゲル
又は多孔性ガラスとしては市販されているものでよく、
これらの基材は種々の表面積、細孔容積、細孔径のもの
が市販されているが、本発明においては、光透過性の面
から100nm以下の細孔のもの、また、培地中の担体の見
掛け比重を下げる面から細孔容積の大きなものが望まし
い。
又は多孔性ガラスとしては市販されているものでよく、
これらの基材は種々の表面積、細孔容積、細孔径のもの
が市販されているが、本発明においては、光透過性の面
から100nm以下の細孔のもの、また、培地中の担体の見
掛け比重を下げる面から細孔容積の大きなものが望まし
い。
これらは従来の有機系高分子担体と較べて、高い強度を
有しており、また、高温条件下、例えば500℃において
も、物性が変化することはなく、その上、種々の薬品に
対しても安定であり、滅菌操作について制限がほとんど
ない。また、多くの細孔を有し構造が複雑であるため、
例えば、ガラス表面と較べて凹凸を担体表面上に有して
いるので、後で蛋白質をコーティングした場合、機械的
操作においても表面から剥がれ落ちない利点を有する。
有しており、また、高温条件下、例えば500℃において
も、物性が変化することはなく、その上、種々の薬品に
対しても安定であり、滅菌操作について制限がほとんど
ない。また、多くの細孔を有し構造が複雑であるため、
例えば、ガラス表面と較べて凹凸を担体表面上に有して
いるので、後で蛋白質をコーティングした場合、機械的
操作においても表面から剥がれ落ちない利点を有する。
基材としての担体の粒子の大きさは、培地の表面積を上
昇させる観点からは微粒子であればあるほど望ましい
が、通常、培養する細胞が数ミクロンから数10ミクロン
であるので、操作面から例えば、10〜1000ミクロン、好
ましくは50〜500ミクロンが適切である。粒子の形状は
あまりこだわる必要はないが、培地として使用する表面
の均一性及び機械的摩耗性の面から破砕型よりは球型が
望ましい。
昇させる観点からは微粒子であればあるほど望ましい
が、通常、培養する細胞が数ミクロンから数10ミクロン
であるので、操作面から例えば、10〜1000ミクロン、好
ましくは50〜500ミクロンが適切である。粒子の形状は
あまりこだわる必要はないが、培地として使用する表面
の均一性及び機械的摩耗性の面から破砕型よりは球型が
望ましい。
本発明の細胞培養担体では、上述のようなシリカ系多孔
材料からなる微粒子の表面に蛋白質を吸着させると共
に、該蛋白質同士を架橋して不溶化させることによりコ
ーティングしたことを必須の要件とするものである。す
なわち、このコーティングによって担体表面と細胞との
親和性が向上し、特に、付着依存性細胞の培養に適した
担体となるのである。本発明で用いられる蛋白質として
は、通常、水溶性のものであればよく、例えば、市販の
ゼラチン又はコラーゲンが使用される。ゼラチンとは、
コラーゲンの加水分解生成物であり、種々の物性、例え
ば分子量、等電点のものが市販されているが何ら限定さ
れることはない。
材料からなる微粒子の表面に蛋白質を吸着させると共
に、該蛋白質同士を架橋して不溶化させることによりコ
ーティングしたことを必須の要件とするものである。す
なわち、このコーティングによって担体表面と細胞との
親和性が向上し、特に、付着依存性細胞の培養に適した
担体となるのである。本発明で用いられる蛋白質として
は、通常、水溶性のものであればよく、例えば、市販の
ゼラチン又はコラーゲンが使用される。ゼラチンとは、
コラーゲンの加水分解生成物であり、種々の物性、例え
ば分子量、等電点のものが市販されているが何ら限定さ
れることはない。
これらの担体へのコーティング方法としては、上記の蛋
白質の水溶液を調製し、次いで、水溶液中に担体を浸漬
することにより担体の表面に吸着処理される。蛋白質水
溶液の濃度は通常、0.1〜10％であり、担体の浸漬時間
は通常、２〜48時間である。吸着現象を促進させるため
には溶液のpHを制御することが重要である。例えば、一
般にゼラチンは水溶液としてはコロイド状態で存在して
おり、その等電点は中性付近にあり、酸性溶液中では表
面に正の電荷を有しているが、一方、シリカゲル、多孔
性ガラス表面はほとんどがシリカでありこの等電点はpH
2付近にあり、pH2以上では負の電荷を有している。従っ
て、吸着力を高めるためには溶液をpH2から用いるゼラ
チンの等電点の間、例えば、pH3〜４に調整することが
望ましい。
白質の水溶液を調製し、次いで、水溶液中に担体を浸漬
することにより担体の表面に吸着処理される。蛋白質水
溶液の濃度は通常、0.1〜10％であり、担体の浸漬時間
は通常、２〜48時間である。吸着現象を促進させるため
には溶液のpHを制御することが重要である。例えば、一
般にゼラチンは水溶液としてはコロイド状態で存在して
おり、その等電点は中性付近にあり、酸性溶液中では表
面に正の電荷を有しているが、一方、シリカゲル、多孔
性ガラス表面はほとんどがシリカでありこの等電点はpH
2付近にあり、pH2以上では負の電荷を有している。従っ
て、吸着力を高めるためには溶液をpH2から用いるゼラ
チンの等電点の間、例えば、pH3〜４に調整することが
望ましい。
本発明では次いで、吸着された蛋白質を不溶化処理する
ことが必要である。要するに、この不溶化処理を施さな
いで、担体を乾燥した場合には、例えば、この担体を滅
菌のためにオートクレーブで熱処理すると、吸着された
ゼラチンなどの蛋白質が水溶性であるため、蛋白質のほ
とんどが溶解して表面から遊離し、また、担体に残存す
る蛋白質もしだいに遊離し、効果が低下するとともに培
地を汚染させる。しかし、本発明では担体上に吸着され
た蛋白質を不溶化し、完全に担体に固着させているので
上記のオートクレーブの熱処理に際しても、安定して担
体上に存在することとなるのである。
ことが必要である。要するに、この不溶化処理を施さな
いで、担体を乾燥した場合には、例えば、この担体を滅
菌のためにオートクレーブで熱処理すると、吸着された
ゼラチンなどの蛋白質が水溶性であるため、蛋白質のほ
とんどが溶解して表面から遊離し、また、担体に残存す
る蛋白質もしだいに遊離し、効果が低下するとともに培
地を汚染させる。しかし、本発明では担体上に吸着され
た蛋白質を不溶化し、完全に担体に固着させているので
上記のオートクレーブの熱処理に際しても、安定して担
体上に存在することとなるのである。
本発明における蛋白質の不溶化処理は架橋剤を用いて蛋
白質の分子をお互いに化学反応により結合することによ
り実施される。すなわち、この化学反応は蛋白分子に存
在するアミノ基またはカルボキシル基末端をこれと反応
し得る官能基を複数有する加橋剤と反応することにより
行なわれる。このようなアミノ基又はカルボキシル基と
反応し得る官能基としては、例えばアルデヒド基、アミ
ノ基、エポキシ基等が利用され、架橋剤はこれら官能基
を複数有する化合物が使用される。例えば、グルタール
アルデヒドはアルデヒド基を１対有しており、本発明の
不溶化に特に適している。反応は例えば、ゼラチンを吸
着した担体がゼラチン水溶液に存在している条件下で行
なうことが連続操作上簡便であり、架橋剤は水溶性でゼ
ラチンと温和な条件下で反応するものが望ましい。架橋
剤の使用量は、通常、吸着処理に用いた蛋白質１部に対
して0.1〜10部であり、この架橋反応は例えば、０〜80
℃の温度で、２〜48時間程度実施される。その後、ゼラ
チンをコーティングした担体は水洗されて、未反応のゼ
ラチン及び価橋剤が担体から取り除かれ、培養のために
使用される。また必要であれば、乾燥してもよい。
白質の分子をお互いに化学反応により結合することによ
り実施される。すなわち、この化学反応は蛋白分子に存
在するアミノ基またはカルボキシル基末端をこれと反応
し得る官能基を複数有する加橋剤と反応することにより
行なわれる。このようなアミノ基又はカルボキシル基と
反応し得る官能基としては、例えばアルデヒド基、アミ
ノ基、エポキシ基等が利用され、架橋剤はこれら官能基
を複数有する化合物が使用される。例えば、グルタール
アルデヒドはアルデヒド基を１対有しており、本発明の
不溶化に特に適している。反応は例えば、ゼラチンを吸
着した担体がゼラチン水溶液に存在している条件下で行
なうことが連続操作上簡便であり、架橋剤は水溶性でゼ
ラチンと温和な条件下で反応するものが望ましい。架橋
剤の使用量は、通常、吸着処理に用いた蛋白質１部に対
して0.1〜10部であり、この架橋反応は例えば、０〜80
℃の温度で、２〜48時間程度実施される。その後、ゼラ
チンをコーティングした担体は水洗されて、未反応のゼ
ラチン及び価橋剤が担体から取り除かれ、培養のために
使用される。また必要であれば、乾燥してもよい。
次に、本発明の細胞培養方法について説明する。本発明
の細胞培養方法は、従来のそれぞれの細胞に適した条件
下で行うことができ、使用について何ら特別な処理を施
す必要なく、上記本発明の細胞培養担体を用いることが
できる。細胞培養方法としては、スターラーユニットま
たは揺動台を用いた懸濁培養方法、ローラーボトル法、
固定床法、流動床法等が挙げられる。
の細胞培養方法は、従来のそれぞれの細胞に適した条件
下で行うことができ、使用について何ら特別な処理を施
す必要なく、上記本発明の細胞培養担体を用いることが
できる。細胞培養方法としては、スターラーユニットま
たは揺動台を用いた懸濁培養方法、ローラーボトル法、
固定床法、流動床法等が挙げられる。
［実施例］ 次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本
発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定され
るものではない。
発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定され
るものではない。
実施例１ ＜担体の製造例＞ 細孔径62nm、細孔容積0.99cm3/g、粒度125〜250μの物
性を有する球状シリカゲル（商品名：マイクロビーズ
［富士デヴィソン化学社製］）20gをゼラチンＧ−1253
（新田ゼラチン社製）の１％水溶液に酢酸を加えてpH3
とされた溶液100g中に加え、30℃の温度で12時間撹拌し
た後、0.2Mグルタールアルデヒド20mlを加え、30℃の温
度で５時間撹拌を行なった。次いで、ゼラチンを吸着、
不溶化したシリカゲルをガラスフィルターに移し、脱イ
オン水を用いて洗液がコーマシー・ブリリアント・ブル
ー試薬による発色反応が生じなくなるまで洗浄し、更
に、90℃の温度で12時間乾燥することにより、ゼラチン
がコーティングされたシリカゲル担体を得た。
性を有する球状シリカゲル（商品名：マイクロビーズ
［富士デヴィソン化学社製］）20gをゼラチンＧ−1253
（新田ゼラチン社製）の１％水溶液に酢酸を加えてpH3
とされた溶液100g中に加え、30℃の温度で12時間撹拌し
た後、0.2Mグルタールアルデヒド20mlを加え、30℃の温
度で５時間撹拌を行なった。次いで、ゼラチンを吸着、
不溶化したシリカゲルをガラスフィルターに移し、脱イ
オン水を用いて洗液がコーマシー・ブリリアント・ブル
ー試薬による発色反応が生じなくなるまで洗浄し、更
に、90℃の温度で12時間乾燥することにより、ゼラチン
がコーティングされたシリカゲル担体を得た。
＜培養例＞ 上述の方法で得られたシリカゲル担体を用いて、次のよ
うな培養試験を行なった。
うな培養試験を行なった。
すなわち、 細胞はRPMI1640の培養液（Gibco社製）に牛胎児血清（G
ibco社製）を10％加えたものを用い、空気95％CO25％に
設定したCO2インキュベーター内で37℃で培養した。用
いた細胞はWKAラット胎児肺由来のRFL細胞を用いた。オ
ートクレーブ滅菌（120℃、20分）したマイクロキャリ
ヤーは培養液に懸濁後、沈降した容量が2mlになるよう
に調製し、底面積４×6.5cm2のフラスコに担体を入れ培
養液を5ml加えて培養した。細胞の増植は担体をPBS
（−）で洗浄して培養液を除去した後、界面活性剤（Zw
ittergent detergent,Calbiochem−Bebring社製）を用
いて細胞を担体から剥離させ、上清の蛋白質を分光光度
計を用いて、OD280値を測定することにより決定した。
ibco社製）を10％加えたものを用い、空気95％CO25％に
設定したCO2インキュベーター内で37℃で培養した。用
いた細胞はWKAラット胎児肺由来のRFL細胞を用いた。オ
ートクレーブ滅菌（120℃、20分）したマイクロキャリ
ヤーは培養液に懸濁後、沈降した容量が2mlになるよう
に調製し、底面積４×6.5cm2のフラスコに担体を入れ培
養液を5ml加えて培養した。細胞の増植は担体をPBS
（−）で洗浄して培養液を除去した後、界面活性剤（Zw
ittergent detergent,Calbiochem−Bebring社製）を用
いて細胞を担体から剥離させ、上清の蛋白質を分光光度
計を用いて、OD280値を測定することにより決定した。
現在細胞培養に用いられているほとんどの表面には、特
定の密度で荷電分子が存在して細胞付着と増殖とを促進
しているが、一方ある種の蛋白質（結合組織蛋白質、コ
ラーゲン、変性コラーゲン）でも培養細胞を増殖させる
ための表面を形成させることができることが知られてい
る。実施例１の担体は、培養細胞を増殖させるために、
表面を変性コラーゲンであるゼラチンでコーティングし
たものであるが、細胞播種後、３時間後にはほとんどの
細胞が付着し、12時間後には付着細胞が伸展し増殖して
いるのが顕微鏡下に観察された。96時間後の細胞増殖率
は同じ大きさのフラスコで単層培養したものに比べ9.82
倍であり、顕微鏡下にも担体全表面が増殖した細胞でお
おわれているのが観察された。
定の密度で荷電分子が存在して細胞付着と増殖とを促進
しているが、一方ある種の蛋白質（結合組織蛋白質、コ
ラーゲン、変性コラーゲン）でも培養細胞を増殖させる
ための表面を形成させることができることが知られてい
る。実施例１の担体は、培養細胞を増殖させるために、
表面を変性コラーゲンであるゼラチンでコーティングし
たものであるが、細胞播種後、３時間後にはほとんどの
細胞が付着し、12時間後には付着細胞が伸展し増殖して
いるのが顕微鏡下に観察された。96時間後の細胞増殖率
は同じ大きさのフラスコで単層培養したものに比べ9.82
倍であり、顕微鏡下にも担体全表面が増殖した細胞でお
おわれているのが観察された。
実施例２、３、４ 実施例１において、担体を表１に示すように、変更し実
施例１と同じ条件でコーティング処理及び培養試験を行
なった。その結果を表１に示す。
施例１と同じ条件でコーティング処理及び培養試験を行
なった。その結果を表１に示す。
本実施例担体は静置では速やかに沈降し、透明で顕微鏡
による観察が容易である。また、培地成分の吸着や細胞
毒性を示さない。表面が平滑な球状でありビーズ間の衝
突による細胞の剥離や被覆していない表面で長期間大量
培養を行なった場合にしばしば起こる細胞の膜状剥離も
認められなかった。
による観察が容易である。また、培地成分の吸着や細胞
毒性を示さない。表面が平滑な球状でありビーズ間の衝
突による細胞の剥離や被覆していない表面で長期間大量
培養を行なった場合にしばしば起こる細胞の膜状剥離も
認められなかった。
比較例１ 実施例１において球状シリカの代りに同じ粒度のガラス
ビーズを用い同様な方法でコーティング処理して得た担
体を用いて培養を行なった場合の結果を表２に示す。結
果から培養担体は単に増殖の為の表面を提供するだけで
なく、多孔材料の培地の栄養を透過させる性質が性能に
寄与していることが明らかである。
ビーズを用い同様な方法でコーティング処理して得た担
体を用いて培養を行なった場合の結果を表２に示す。結
果から培養担体は単に増殖の為の表面を提供するだけで
なく、多孔材料の培地の栄養を透過させる性質が性能に
寄与していることが明らかである。
比較例２ 実施例１において、担体のコーティング処理を行なわず
シリカゲルをそのまま担体として用いて培養を行なった
場合の結果を表２に示す。結果から表面に蛋白質がコー
ティングされていない担体は細胞との親和性が悪く着
床、増殖が行なわれにくいことが明らかである。
シリカゲルをそのまま担体として用いて培養を行なった
場合の結果を表２に示す。結果から表面に蛋白質がコー
ティングされていない担体は細胞との親和性が悪く着
床、増殖が行なわれにくいことが明らかである。
比較例３ 実施例１においてグルタールアルデヒドを用いた架橋処
理を行なわずにゼラチンを球状シリカゲル表面に吸着さ
れただけの試料を作成し培養を行なった場合の結果を表
２に示す。結果から実施例１と較べて増殖量が低下して
おり、また培養液中にもゼラチンが溶出していると推定
される。架橋剤によるゼラチンの不溶化処理が必要であ
ることは明らかである。
理を行なわずにゼラチンを球状シリカゲル表面に吸着さ
れただけの試料を作成し培養を行なった場合の結果を表
２に示す。結果から実施例１と較べて増殖量が低下して
おり、また培養液中にもゼラチンが溶出していると推定
される。架橋剤によるゼラチンの不溶化処理が必要であ
ることは明らかである。
比較例４ 細孔径8nm、最孔容積0.86cm3/g、粒度125〜250μの物性
を有する球状シリカゲル（商品名：マイクロビーズ［富
士デヴィソン化学社製］）20gを100mlトルエン中に加
え、さらにγ−アミノプロピルトリエトキシシラン10g
を加え、110℃で撹拌しながら12時間還流させた後、冷
却してアミノプロピル化されたシリカゲルをガラスフィ
ルターに移し、トルエン次いでメタノールで洗浄後80℃
の温度で12時間乾燥させた。ゼラチンＧ−1253（新田ゼ
ラチン社製）１％水溶液100gを加え、30℃の温度で12時
間撹拌した後、0.2Mグルタールアルデヒド20nmを加え30
℃での温度で５時間撹拌を行なった。この操作でゼラチ
ンはシリカゲル表面のアミノ基を化学的に結合する。ゼ
ラチンを化学結合させたシリカゲルをガラスフィルター
に移し、脱イオン水を用いて洗液がコーマシー・ブリリ
アントブルー試薬による発色反応が生じなくなるまで洗
浄し、更に、90℃の温度で12時間乾燥させた。得られた
担体は赤かっ色であった。この試料を用いて培養試験を
行なった場合の結果を表２に示す。結果から担体は細胞
培養のための中程度の性質を有しているが、担体を製造
するための操作が多く、また高価な試薬を用いているた
め、経済性の面から不適当である。
を有する球状シリカゲル（商品名：マイクロビーズ［富
士デヴィソン化学社製］）20gを100mlトルエン中に加
え、さらにγ−アミノプロピルトリエトキシシラン10g
を加え、110℃で撹拌しながら12時間還流させた後、冷
却してアミノプロピル化されたシリカゲルをガラスフィ
ルターに移し、トルエン次いでメタノールで洗浄後80℃
の温度で12時間乾燥させた。ゼラチンＧ−1253（新田ゼ
ラチン社製）１％水溶液100gを加え、30℃の温度で12時
間撹拌した後、0.2Mグルタールアルデヒド20nmを加え30
℃での温度で５時間撹拌を行なった。この操作でゼラチ
ンはシリカゲル表面のアミノ基を化学的に結合する。ゼ
ラチンを化学結合させたシリカゲルをガラスフィルター
に移し、脱イオン水を用いて洗液がコーマシー・ブリリ
アントブルー試薬による発色反応が生じなくなるまで洗
浄し、更に、90℃の温度で12時間乾燥させた。得られた
担体は赤かっ色であった。この試料を用いて培養試験を
行なった場合の結果を表２に示す。結果から担体は細胞
培養のための中程度の性質を有しているが、担体を製造
するための操作が多く、また高価な試薬を用いているた
め、経済性の面から不適当である。
備考 １ 実施例に用いた材料はいずれも富士デヴィソン化学
（株）製である。
（株）製である。
２ 培養試験の顕微鏡観察の説明 観察：担体に光透過性があり顕微鏡によって担体上にお
ける細胞の着床、増殖の状態を良好に観察できるかどう
かの試験 着床：培養開始から６時間後担体上への細胞付着程度 増殖：着床した細胞が担体上で増殖が行なわれている程
度 評価◎ 非常に良好 〇 良好 × 不良 ３ 細胞増殖率：同じ大きさの培養フラスコ単層培養の
細胞量を１とした場合の値を示す。
ける細胞の着床、増殖の状態を良好に観察できるかどう
かの試験 着床：培養開始から６時間後担体上への細胞付着程度 増殖：着床した細胞が担体上で増殖が行なわれている程
度 評価◎ 非常に良好 〇 良好 × 不良 ３ 細胞増殖率：同じ大きさの培養フラスコ単層培養の
細胞量を１とした場合の値を示す。
［発明の効果］ 以上説明した通り、本発明の細胞培養担体によれば、付
着依存性細胞との親和性が良好で、付着依存性細胞が付
着しやすく、付着依存性細胞の培養に適している。ま
た、付着した細胞を顕微鏡で直接観察できる。
着依存性細胞との親和性が良好で、付着依存性細胞が付
着しやすく、付着依存性細胞の培養に適している。ま
た、付着した細胞を顕微鏡で直接観察できる。
特に、シリカ系多孔材料からなる微粒子を基材に用いた
ので、従来技術として示した様な有機物系の高分子物質
に比べて硬さがあり、撹拌等を施しても損傷や摩耗が発
生しにくく、きわめて取り扱いやすい。
ので、従来技術として示した様な有機物系の高分子物質
に比べて硬さがあり、撹拌等を施しても損傷や摩耗が発
生しにくく、きわめて取り扱いやすい。
、また、微粒子の表面に蛋白質を吸着させると共に、該
蛋白質同士を架橋して不溶化させることによりコーティ
ングしたので、担体に対して加熱による減菌処理を施す
ような場合でも、蛋白質が溶解したり遊離したりしにく
く、コーティング状態は安定している。
蛋白質同士を架橋して不溶化させることによりコーティ
ングしたので、担体に対して加熱による減菌処理を施す
ような場合でも、蛋白質が溶解したり遊離したりしにく
く、コーティング状態は安定している。
しかも、蛋白質を微粒子に対して結合させて不溶化した
ものとは異なり、高価な試薬や数段階の工程を必要とし
ないので、製造コストは安価であり、その産業的価値は
大きいものである。
ものとは異なり、高価な試薬や数段階の工程を必要とし
ないので、製造コストは安価であり、その産業的価値は
大きいものである。
また、本発明の細胞培養方法によれば、上記細胞培養担
体を用いて細胞を培養するので、コストが低減されると
ともに、細胞が細胞培養担体に付着しやすいので、細胞
培養の効率が極めて良好である。
体を用いて細胞を培養するので、コストが低減されると
ともに、細胞が細胞培養担体に付着しやすいので、細胞
培養の効率が極めて良好である。
Claims (14)
- 【請求項１】シリカ系多孔材料からなる微粒子の表面に
蛋白質を吸着させると共に、該蛋白質同士を架橋して不
溶化させることによりコーティングしたことを特徴とす
る細胞培養担体。 - 【請求項２】シリカ系多孔材料がシリカゲル又は多孔性
ガラスであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の細胞培養担体。 - 【請求項３】シリカ系多孔材料の細孔径が100nm以下の
光透過性を有するものであり、顕微鏡観察可能な担体で
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の細胞
培養担体。 - 【請求項４】シリカ系多孔材料が球状であることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の細胞培養担体。 - 【請求項５】蛋白質がゼラチンであることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の細胞培養担体。 - 【請求項６】不溶化に当り、蛋白質と結合性のある管能
基を少なくとも２つ以上有する架橋剤を用いたことを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の細胞培養担体。 - 【請求項７】架橋剤がグルタールアルデヒドであること
を特徴とする特許請求の範囲第６項記載の細胞培養担
体。 - 【請求項８】シリカ系多孔材料からなる微粒子の表面に
蛋白質を吸着させると共に、該蛋白質同士を架橋して不
溶化させることによりコーティングした細胞培養担体を
用いて細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。 - 【請求項９】シリカ系多孔材料がシリカゲル又は多孔性
ガラスであることを特徴とする特許請求の範囲第８項記
載の細胞培養方法。 - 【請求項１０】シリカ系多孔材料の細孔径が100nm以下
の光透過性を有するものであり、細胞培養担体が顕微鏡
観察可能であることを特徴とする特許請求の範囲第８項
記載の細胞培養方法。 - 【請求項１１】シリカ系多孔材料が球状であることを特
徴とする特許請求の範囲第８項記載の細胞培養方法。 - 【請求項１２】蛋白質がゼラチンであることを特徴とす
る特許請求の範囲第８項記載の細胞培養方法。 - 【請求項１３】不溶化に当り、蛋白質と結合性のある官
能基を少なくとも２つ以上有する架橋剤を用いたことを
特徴とする特許請求の範囲第８項記載の細胞培養方法。 - 【請求項１４】架橋剤がグルタールアルデヒドであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第13項記載の細胞培養方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60036777A JPH0732B2 (ja) | 1985-02-26 | 1985-02-26 | 細胞培養担体及び細胞培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60036777A JPH0732B2 (ja) | 1985-02-26 | 1985-02-26 | 細胞培養担体及び細胞培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61195687A JPS61195687A (ja) | 1986-08-29 |
| JPH0732B2 true JPH0732B2 (ja) | 1995-01-11 |
Family
ID=12479199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60036777A Expired - Fee Related JPH0732B2 (ja) | 1985-02-26 | 1985-02-26 | 細胞培養担体及び細胞培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0732B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07106146B2 (ja) * | 1987-04-24 | 1995-11-15 | 千代田化工建設株式会社 | 動物細胞の流通培養床及びその製造方法 |
| KR100484636B1 (ko) * | 2002-04-30 | 2005-04-20 | 경북대학교 산학협력단 | 간세포 배양용 매트릭스 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4008126A (en) * | 1976-03-15 | 1977-02-15 | Owens-Illinois, Inc. | Immobilization of proteins by in-situ polymerization |
| SE445116B (sv) * | 1979-09-12 | 1986-06-02 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Sett att odla celler pa mikroberare med fibronektinytskikt |
| JPS6030508B2 (ja) * | 1981-10-27 | 1985-07-17 | 住友ベークライト株式会社 | 細胞培養用容器 |
| JPS59154984A (ja) * | 1983-02-04 | 1984-09-04 | チヤ−ルズ リバ− ユ− ケイ リミテツド | 固定細胞複合体を使用した細胞培養装置および培養方法 |
-
1985
- 1985-02-26 JP JP60036777A patent/JPH0732B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61195687A (ja) | 1986-08-29 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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