JPS59154984A - 固定細胞複合体を使用した細胞培養装置および培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は細胞培養に関する。より詳細には、本発明は特
に錨着可能（ａ’ｎｃｈｏｒａｂ　Ｉ　ｅ　）な動物お
よび植物細胞の培養に有用な大量組繊細胞培養装置／方
法および固定細胞複合体（ｉｍｍｏｂｉ−１ｉｚｅｄ　
ｃｅｌｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）に関する。

（従来技術） 本発明において、組織培養とは、組繊細胞をインビトロ
、すなわち比較的制御された条件下において人工培地中
で増殖する方法全意味する。

一般に、組繊細胞は懸濁液中において、増殖するかある
いは固形支持体に付着して増殖する。ある種の細胞は固
形支持体を必要とせず、しかも懸濁状態で増殖可能であ
る。しかしながら、他の細胞は表面に付着した場合にの
み増殖する錨着依存細胞（ａｎｃｈｏｒａｇｅ　−ｄｅ
ｐｅｎ−ｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ）である。本発明におい
て、錨着可能細胞（ａｎｃｈｏｒａｂｌｅ　ｃｅｌ　Ｉ
ｓ　）とはこれら両タイプの細胞全意味する。

現在、最も一般的な大規模組織培養法は複数のローラー
ボトル（ｒｏｌｌｃｒ　ｂｏｔｔｌｅ）　ノ使用を伴う
ものである。イエンセン（Ｊ　ｅｎｓｅｎ　）が、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｂｉｏｅｎｇ、、　２３．２７０
３　（１９８１）　＋に記載したように、ローラーボト
ル培養は非常に高価であり、集中的な労力′ｆｆ：要し
、インキュベーション装置にかなり多くの出費が必要と
なる。また、ローラーボトル法は主として、数百もの別
個の処理を伴うバッチ法であるために汚染の危険性が増
大する点でも不利である。

最近、これらの欠点を改善するために多くの考案がなさ
れてきた。これらの考案の例としては、マイクロキャリ
ヤビーズ（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｃｒｂｅａｄｓ）、人
工キャピラリー（中空繊維）、および束管（ｂｕｎｄｌ
ｅｄ　ｔｕｂｅｓ）がある。また、ローラーボトル自体
を改良しようとする試みもなされた。

米国特許第４，３１７，８８６号の開示するローラーボ
トルは中空室全回む外被からなり、この中空室内に位置
する少なくとも１つの環状部材は外被から放射線上に短
い間隔を置いて内側に配置されている。このローラーボ
トルは、実際には単一の外被中に配置され１こ、より／
］・さなローラーボトル群と同等である。

従来のローラーボトル中の表面面積全増大させるもう１
つの方法が米国特許第３，８５３，７１２号に開示され
ている。ここでは、可撓性ストリップ全曲けるか、ある
いは連続的な方向変換により変形してローラーボトル内
に適合する小型の細胞支持体全形成している。実施例と
して、１片の波形ス）　ｌ／ツブ材料と１片の平滑な板
状ストリップ全曲・げ合わせ、自然に間隔を置いた螺旋
が形成された。

哨乳類の錨着依存細胞全懸濁中において培養するために
マイクロキャリヤ全使用することが近年注目を集めてき
ているが、このような使用はＭ接、本発明に関連するも
のではない。マイクロキャリヤ培養系は文字通り数百力
の別個の微小ビーズの怠濁に基づくもので、モノリシッ
ク支持体を用いるものではない。

より最近注目されているのは錨Ｎ細胞の培養に複数の貨
を使用することである。例えは、米国特許第３，７３２
，１４９号は均一な長さ全有する互いに平行な複数のカ
ラムからなる装置を開示している。これらのカラムはカ
ラムと平行なシャフト上に固定されたマニホールドによ
り端部において固定される。使用時においては、カラム
全通して培地が送り込まれ、細胞はカラムの内表面上で
増殖する。全装置はシャフトの回りを回転する。実際に
は、この装置はローラーボトル技術の変形である。

これといくらか似た装置が米国特許第３．８２７９４３
号にも記載されている。ここでは、内径１〜１０ｃ／ｎ
の別個の管が単一の入口／出口管全共有している。この
特徴は汚染の危険性を減するものとされている。

束管法のもう１つの変形はジャイロジエン（ｔｈｅＧｙ
ｒｏｇｅｎ　）である。これは上述の２装置と形状が似
ているが、培地が管の中および周囲の両方を循環する点
が異なっている。したがって、細胞は管の内外表面双方
に付着することが可能である。上述の束管装置と同様に
、この全装置は中心軸の回りで回転する。例えば、Ｈ９
Ｃ，ジラルド（Ｇｉｒａｒｄ）他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、。

且、４７７　（１（１８０）参照。

束管法およびその変形は人工キャピラリーもしくは中空
繊維の概念と混同される°べきではない。これらは全く
別のものである。人工キャピラリー法においては細胞と
培地は混合しない。例えば、細胞はキャピラリ一つ外表
面に付着し、一方、栄養培地はキャピラリーを通過して
流れる。栄養物質はキャピラリー壁を通って細胞中に拡
散し、一方、細胞生成物もしくは代謝産物は細胞からキ
ャピラリー壁を通って培地中に拡散する。米国特許第３
゜８８３．３９３号、Ｊ、に、力ｙ（Ｋａｎ）他旦１ｏ
ｔｅｃｈｎｏｌユＢｉｏｅｎｇ、、２０，２１７　（１
９７８）、および米国特許第４，０７５，０９２号参照
。

培養容器の体積に対する表面積？増大させるもう１つの
方法は、培養容器に不活性物質小片全充填することであ
る。ある開示によれば、二重壁円筒状ガラス容器に長さ
約６　ｍｍのガラス管片を充填して表−面積ケ増大させ
ることが可能である。この反応容器は、ガスおよび培地
の自動制御を有する器具もしくは装置の一部であった。

Ｈ１八−ムズ（Ｈａｒｍｓ）他、［細胞生物学（Ｃｙｔ
ｏｂｉｏｌｏｇｉｅ、）　Ｊ　、　１８　、６７　（１
９７８）参照。

最近の細胞培養一般に関する概要については、Ｔ、カー
トライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈり他［プロセス生化学（
Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　Ｊ　、
　１３　＋　３　（１９７８）Ｌ、キー（Ｋｅａｙ）他
「プロセス生化学」、旦、１７（１９７９）・、および
、上述のＭ、Ｄ、イ’ｆ−７セフ　（Ｊｅｎ−ｓｅｎ）
論文参照。

最後に、本発明の固定した動物もしくは植物細胞複合体
の製造に有用な支持体の実施′例は酵素および微生物用
の支持体として記載されている。特にＭ、ｉ（、ベノイ
ト（Ｂｅｎｏｉｔ）　福、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｂ
ｉｏｅｎｇ、、　２７　、１６１７　（１９７５）、は
市販のモノリシック触媒支持体上におけるカタラーゼの
固定化を記載している。グルタルアルデヒドで活性化し
たシランカップリング剤の仲介により、この酵素は支持
体に共有結合された。

モノリシック物質は固定化したアセトバクターアセチ（
ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｃｅｔｉ　）細胞による酢
酸製造の研究において使用された。この細胞は吸引によ
り菫青石セラミック支持体に付着せしめられた。Ｃ，ゴ
ムミツド（Ｇｈｏｍｍ　ｉｄｈ　）他、Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、、　２４’、　６０５　（１９
８２）参照。

ただし、この文献の少なくとも一部は１　’！、ノ８０
年に発行されたｒ、ゴムミツドの論文に基づくものと思
われる。

（発明の目的） 本発明は、細胞の採取用のみ、あるいは代謝産物や酵素
等、細胞培地から得ることのできる有用な生産物の製造
用に細胞を増殖するために、固定細胞複合体を用いる大
規模細胞培養装置／方法を提供すること全目的とするも
のである。

本発明の他の目的は上記目′的と同様に本明細書および
特許請求の範囲の記載から、当業者にとって明らかとな
るであろう。

（発明の構成および効果） 本発明による固定細胞複合体は、表面に動物もしくは植
物細胞群を付着−させた、光′ｒｋＪ槓の大きな支持体
からなること全特徴とする。

との支持体は培地不溶性であり、細胞に対して非毒性で
ある。支持体構造はほぼハニカム状のモノリスである。

支持体には、モノリス中の孔を通して錨着細胞に栄養分
全供給するための入口端および出口端が設けられている
。

孔は流れの方向に対してほぼ、平行である。

好ましい実施例による、表面に勤′物もしくは植物細胞
群を付着させた、表面積の体積に対する割合の大きな支
持体は、モノリシック構造体が薄い有孔性壁の行列から
なること全特徴とする。これらの壁によって複数の通路
が区切られる。これらの壁はこのような構造物の入口端
から出口端までモノリスを貫通して互いに平行に縦に伸
びている。形成される通路は構造物の断面積平方インチ
あたり、少なくとも約２０通路（約３通路／　ｃｙｉｔ
　）である。

また、本発明は新規な固定細胞複合体ケ使用する、錨着
可能な植物もしくは動物組繊細胞培養のための特に有効
な方法を開示するものである。本発明の方法は、栄養培
地を流すことによって、体積に対する表面積比の高い反
応器の支持体表面上に密来しＴこ錨着細胞群を培養する
ことを可能にするものである。細胞用に管理された環境
全供給するために栄養培地は絶えず調整する。流れの方
向は反応器中の支持体表面とほぼ平行である。

この固定細胞複合体は、複数の互いに平行な孔を有する
モノリシックハニカム構造によって特徴づけられる。孔
壁は、かなり変化させることのできる、培地不溶性の非
毒性有孔無機組成物より形成される。この全装置は孔壁
に乱流の生じない・層流全通過させる手段によって囲ま
れでいる。

典型的な支持体は、菫青石からなるセラミックハニカム
構造物である。これは、複数のまっすぐな、断面積が正
方形である孔全内包しておジ、断面における孔の密度は
１００〜１０００個／平方インチである。この支持体は
、液体の層流が孔葡通過するように包囲もしくはカプセ
ル化されている。

この支持体の孔壁に錨着されるのは植物もしくは動物組
織由来の錨着可能な細胞群であり、最も好ましくは動物
のリンパ細胞、上皮細胞もしくは線維芽雅胞であるが、
これらに限定されるものではない。

本発明による細胞培養法においては、細胞培養に適［７
た公知の液体培地を、接種された錨着細胞上に流す。流
速は、少なくとも細胞の維持、必要であれば増殖のため
の酸素および栄養分の必要量を細胞に供給するに十分な
ものとする。孔を通過する培地の層流は、増殖要素の連
続的な大量供給および代謝産物の絶え間ない除去を可能
にする。したがって、支持体の有孔壁表面上に比較的密
度の高い細胞群が形成される。

好ましくは、モノリス表面上全通過させた後に培地を回
収する。この培地は増殖最適値まで必要な栄養分および
ガスを補充した後、再循環する。これらの値の監視およ
び調整は自動的かつ連続的に行なうことができる。

支持体が全暴露表面において均一に増殖する細胞を有す
る場合、より多く、より効率的に細胞を増殖するととか
できる。このような増殖を達成するには、まずモノリス
への接種時に細胞を均ゴに分配しなければならない。

本発明による接種法は均一な接種を比。較的単純な、労
力を節約した方法で可能にする。

接種は、前記複合体全培地で満たすことから開始される
。孔壁の一面°を水平になるように配置した後、−膜処
理法においては、好ま゛しくは約５％の動物血清金倉む
細胞増殖培地および公知の方法で製造された細胞懸濁液
で満たす。

充満後には定Ｎを行なう。重力によって細胞は水平な孔
表面上に均一に定着する。定着した細胞を錨着させるに
十分な時間、典型的には１５分間、放置させた後、モノ
リス複合体を垂直位置に戻す。ここで、均一な細胞懸濁
液全５分間、モノリス上に速い流速、典型的（ては約０
．１〜２．５６ｒｎ／秒の線速度で再循環させる。

この定Ｎ／再循環サイクルは孔表面各面について行なう
。換言すれば、断面が正方形である孔を有する支持体に
均一な接種を行なうためには、配向を４回行なわねば′
ならない。

各回において、モノリスは水平軸中で９０°回転される
。その結果、各面に対して余分な細胞懸濁濃縮物を添加
する必要なく、複合体に均一な接種を行なうことができ
る。

また、別の処理法、すなわち多段処理法（ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ　ｃｈａｒｇｅ　ｍｅｔｈｏｄ）　　ｆ使用すれば
、接種溶液中に５％動物血清を入れる必要がない。

この方法における相異点は、各配向に先立って細胞濃縮
物を系に新しく添加しなければならないことである。必
要であれば、動物血清を含む培地を用いて多段接種性全
使用することも可能である。

接種された細胞は、細胞増殖もしくは維持、すなわち健
康な、吸収された細胞で支持体？飽和し絖けるために最
適な環境に存在させね。

ハナらない。栄養分、温度およびガラスは全支持体中に
おいて増殖もしくは維持に十分な程度存在する必要があ
る。さらに、細胞代謝産物は培地中に遊離され、細胞増
殖を遅くする場合には常に除去もしくは中和されねばな
らない。

言うまでもなく、どの条件をどの程度変える必要がある
かを知るためには、これらの定性的な増殖パラメーター
の現時点における定量的な状態を知らねばならない。し
たがって、これらのパラメーターの測定手段を本発明の
培養系に供給すべきである。好ましくは、プローブおよ
びセンサーで培地のｐＨ、グルコース、溶存酸素および
溶存二酸化炭素の値を、支持体に対する供給前およびそ
の放出後に読み出すべきである。

この測定手段には別の利点がある。栄養成分の消費量お
よび代謝産物産出値は細胞数と正比例するため、十分な
長さの時間において、増殖パターンもしくは支持体の特
性を測定することが可能である。すなわち、特定のパラ
メーターの変化率が得られれば、増殖細胞数および支持
体が飽和するまでの時間を正しく予想することがｂ」能
である。

細胞増殖は視覚的観察すなわち顕微鏡によって監視する
ことが可能であるが、以下の増殖パラメーターの変化率
すなわち、 １）支持体ケ通じた培地のｐＨ値の差（ΔｐＩ−Ｉ）、
すなわち入口のｐｎ対出口のｐＨｚ ２）　グルコース消費率（ＯＣＲ）すなわち最適な、も
し２くは与えられた（［’に維持するために添加しなけ
ればならないグルコースの割合、３）支持体を通じた溶
存酸素（Ｄ　Ｏ）の差（ΔＤＯ）、すなわち入口のＤＯ
対出口のＤ（Ｊ。

４）二酸化炭素（ＣＯ２）要求量（ＣＯＩＪ）　、すな
わち最適な、もしくは与えられたｐＨ値金維持するため
に必要とされるＣＯ２の割合、および ５）酸素（０２）消費率（ＯＣＲ’）　、すなわち最適
な、もしくは与えら−れた値を維持するために培地中に
導入せねばならない０２０割合 も細胞増殖の監視弄段となる。

言うまでもなく１　より多くのパラメーターの変化率が
監視され、また測定頻度が増大すれば、より良好に支持
体上に存在する細胞増殖全定量化することが可能である
。

本発明におい４て細胞増殖性が重要なことは確かである
が、それが全てではない。あらゆる培養方法／装置の効
率は、増殖細胞の採取性にも依存するからである。採取
は、量すなわち産出率、および質すなわち再生産性を保
有する無傷な細胞の割合によって判断されるべきである
。

本発明による＃Ｉ胞採取法は主として以下の３段階すな
わち、 １）−分離剤の効力？阻害し得る培地中の可溶成分を除
去する段階、 ２）採取すべき細胞上、分離剤すなわち、細胞間および
細胞−表面間の相互作用全破壊することのできる試薬に
より、必要な程度の破壊が生じるに十分な時間処理する
段階、および ３）液体培地全循環させることにより、処理された前記
細胞にパルス化した剪断力を加える段階 からなる。さらに、処理した細胞を培地から分離するた
めの第４段階を行なってもよい。

第１段階においては、可溶阻害因子全培地から除去しな
ければならない。好ましい方法はカルシウム／マグネシ
ウムを含まない燐酸緩衝塩（ＣＭＦ−ＰＢＳ）等、キレ
ート化剤全添加することである。言うまでもなく、添加
量は全ての阻害因子を結合するに十分でなければならな
い。

次に、細胞全公知の分離剤で処理する。これらの分離剤
は、細胞間および細胞と表面の間の双方に生じた引力も
しくは結合力全破壊する働きをする。適当な分離剤には
蛋白分解酵素とキレート化剤が含まれる。ＦＪｏ、　１
％のトリズシン溶液全約ｏ、　ｓ　ｍＭのエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　溶液と化合させたものが好ま
しい。

分離処理は、細胞間および細胞−表（２）間の相互作用
のほぼ全て全破壊するに十分な時間、継続する。、した
がって、細胞密度の高い場合には密度の低い場合よりも
長い時間が必要である。例えば、細胞密度が約２．２　
Ｘ　１０５／ｃｔｌの場合に好ましい処理時間は約３０
分である。

言うまでもなく、この時間内においては、培地をモノリ
ス支持体上に循環させないことが好ましい。

第３段階において、細胞は支持体表面から分離できる状
態になる。処理された細胞を放逐するに十分な速度で培
地を前記細胞上に循環することによって細胞上に剪断力
を加える。

培地の好ましい流速は細胞の密度および型により、約０
．７５〜６Ｃ７ＩＬ／秒である。また、可能、な限９の
完全な除去が必要なのか、量的な除去、あるいは例えば
サンＺ−ングを目的とする単に部分的な除去が必要なの
かによって特別の選択を行なうことができる。いずれに
せよ、この段階し、ま必要な分離度が得られるまで継続
される。

天童細胞培養装置／方法に使用される固定細胞複合体の
もたらす重要な利点は、全長にわたって、全ての孔を通
じて細胞全必須栄養分に十分に暴露させることができる
点である。

細胞密度か高い場合にも、縦横比が高く断面孔の小さい
ことを特徴とする本発明の複合体は上記利点を有する。

この点で重要のは、非乱流供給手段を支持体近傍に配置
することである。

支持体を囲む手段はモノリスの全断面および全長全通じ
て乱流のない培地の層流を確保するように設計かつ形成
する。典型的な形態は、孔端のみを露出してモノリスを
被う密層ジャケットである。場合により、ジャケットは
分割する。

この露出部分には、流れる培地全モノリスの内外に円滑
に転移することができるような形状を有する転移手段を
設ける。転移手段の最も太い部分はモレリスの直径であ
り、最も細い部分は支持体への培地供給手段の直径であ
り、しだいに細くなっている。″培地の分配手段は、転
移領域中すなわち流れ自体の中に設けることが好ましい
。この分配手段は培地を支持体の全孔に均一に分配する
。重要なのは、はぼ完全に乱流全除去し、かつモノリス
の全断面に適当な培地の流れ全供給するように考慮する
ことである。

非乱流を確保する手段として適した材料には様々なもの
があるか、これらは全て培地不溶性であり、増殖細胞に
対して非毒性である。

適当な組成物はガラス、セラミック、グラスチックス、
金属および他の公知の材料である。

言うまでもなく、材質によって構成法は異なる。

複合体は迅速に組立てもしくは分解できるよ′）に形成
することが好ましい。非乱流確保手段は、容易に分解で
き、モノ、リスの設置もしくは取外し全迅速に行なうこ
とができ、再び當閉して連結できる。少なくとも２つの
部分に分割される。

典型的な形状全以下に示す。モノリスジャケットは同一
形状の２つの円筒部分からなる。

各々は円筒形支持体が挿入できるように設計かつ形成さ
れた内径を有している。各部分の一端は他の部分と密着
する突合せフランジ全形成するように成形される。他端
は、適当な長さの挿入されたモノリスが、組立てられた
複合体内で移動しないようにし、かつ流れの供給手段と
モノリスの間に円滑な転移手段を供給するように成形さ
れる。

複合体は、適当に形成された１つの円筒部分内にモノリ
スを挿入して組立てる。次いで、補完し合う部分をフラ
ンニジ端部が接触するまでモノリスの露出端部上で滑動
させる。最後に従来から突合せガラス管の保持および密
閉に使用されたクランプ全フランジ端近傍に配置して締
める。この複合体は滅菌および接種のできる態勢にある
。

複合体と同様に、非乱流供給手段も支持体も構成および
組立てを容易にするために分割することができる。支持
体は互いに補完し合うノツチ付き部分の形状とすること
ができる。

各部分は隣接部分と適正に整列かつ配向するように設計
する。重要なのは、孔が支持体内に非乱流を流し、同時
に接種時における配向変換回数全最小とするように、考
慮することである。この組立品は１片の構成物という概
念からはモノリスとみなし得ないが、支持体増殖表面の
整列および配合が連結部分を通じて維持される点でモノ
リスである。

本発明による細胞培養装置は公知の細胞培養装置よりも
かなり優れている。本発明による支持体形状は取扱いの
容易な体積の反応器内に比較的大きな細胞錨着領域を供
給する一方で、はとんど制限のない液体培地層流の供給
を可能にする。したがって、全細胞に対して培地が十分
に供給されるのみならず、再循環ｍ１に迅速に栄養培地
を平衡させて最適な状態とすることが可能となる。

また、培地の生産性は（表面積／体積の比が一定の場合
）、支持体体積に正比例する。

すなわち、生産規模の拡大はかなり単純かつ直接的に実
現される。これは、例えばローラーボトル支持体に基づ
くような公知の細胞培養系では不可能である。本発明に
・よれば、ローラーボトルやマイクロキャリヤ細胞培養
工程の規模拡大に伴う労力、処理段階および汚染の危険
性の増大を招くことすく、比較的太きな、高産出性細胞
増殖装置全製造することが可能である。

細胞保持および／もしくは増殖に必要な溶存栄養物およ
びガスを自動的かつ連続的に監視し調節することによっ
て、さらに労力および材料を節約することが可能である
。

典型的なローラーボトル操作のように一度に培地を完全
に取り換えることなく、本発明の装置は公知の培養系よ
！ｌｌも少ない培地で同等数の細胞を培養することがで
きる。これは、消費された培地の回収および／もしくは
貯蔵手段、必要とされる補充度全監視する手段、および
最適化した培地の再循環手段の組合せによって達成され
る。この組合せは全て自動的に行なうことが好ましい。

さらに、細胞産出物の回収において処理コストの低減が
達成される。本発明の複合体において、錨着細胞は常に
栄養成分容器から分離される。必要な産出物が細胞から
培地中に遊離された場合には、従来の方法で栄養成分容
器から分離することによって容易に回収することができ
る。前記容器の容量を変えるとそれにつれて産出物濃度
も変化する。例えば容器中の培地量が少なくなると産出
物は面濃度になる。マイクロキャリヤあるいは懸濁培養
系においては、このような利点は得られない。

（好ましい実施例の説明） 以下に本発明の好ましい実施例を説明する。

なお、本発明において「縦横比」とはモノリスの最大断
面積に対する長さく孔に平行に測定したもの）の比を意
味する。

好ましい実施例において、固定細胞複合体は支持体と流
体供給手段とからなる集合体である。第１図および第２
図に示すように、固定細胞複合体用の支持体は、共通の
壁１４で分割されたほぼ同一の寸法全行する平行な孔１
２からなるモノリスである。この支持体は様々な長さお
よび断面積とすることのできる単体全構成し、密層する
ジャケット１６中に内包されることによって、モノリス
全孔を通じて乱流のない層流を流すことが可能になる。

この結果、従来技術において問題であった、孔壁に錨着
した細胞を培地中の栄養分に均一に暴露させることが可
能となり、極めて有利である。

第６図に示すように、好ましい支持体集合体は円筒状モ
ノリス支持体１０と、培地の非乱流全支持体内に導入し
、通過させ、排出するための分割された供給手段１６と
からなる。

図示した集合体において供給手段１６は対称的な２つの
ガラスジャケット部分１８，２０と、これらの連結手段
２２とからなる。

入口ガラスジャケット部分１８は集合体中に培地全導入
するための入口２４を有しており、出口３８全有する出
口部分２０と組合わされて、供給手段１６を形成する。

入口に隣接するのは流体転移領域２６である。円錐形の
この領域は入口と支持体の各断面を結合する。この領域
の支持体側の端にはガラス沢板２８が配置される。この
ｆ板は、支持体全孔１２中に培地の流れを分配するよう
な寸法かつ形状を有している。

転移領域から、入口ジャケット部分１８は支持体を被う
円筒形となる。入口ジャケット部分１８のスリーブ端３
０は、内包される支持体の中央付近で、同−状の出口ガ
ラスジャケット部分２０の補完する端３２と突合せるよ
うになっている。出口部分は入口部分と同−状であり、
沢板３４、流体転移領域３６、および出口３８を有して
いる。これらのジャケット部分はガラス管クランプ２２
等、従来の手段で連結される。

集合体は別の形状とすることもできる。例えば、第１０
図に示すように、公知の熱収縮性材料を用いた場合、（
少なくとも収縮時において）支持体を補完する形状を有
するように選択された部材内に挿入することが可能であ
る。予収縮させた部材１６は挿入？可能にするため、支
持体よりも若干大きくなっている。非乱流手段の転移部
分２６．３６は死体分配器２８．３６’に有しており、
支持体を内包する本体から分離されている。これらの転
移部分は、本体が支持体および端部双方の周囲で収縮す
る際に非乱流手段が形成されるように非熱収縮材料で製
造される。

複合体を組立てる際には、予収縮させたプラスチック成
形物中に支持体上挿入する。そして、端部を孔の開口と
整列するように挿入する。加熱全行なシと、第１１図に
示すようにグラスチック材料は支持体および端部ひ周囲
で収縮し、モノリス孔を通し錨着細胞全通過させるよう
に非乱流全流す手段を形成する。

複合体全製造する別の方法を第１２図に示す。モノリス
１０の外面には孔端開口を除いて公知の上薬１６が被覆
されている。選択された上薬材料はモノリスに噴霧する
ことも、モノリスを浸漬させることもできる。塗布後、
モノリスに例えば熱処理等、公知の上薬の凝固に適した
技術全適用する。収縮性グラスチック複合体の場合と同
様に、流体分配器２８゜３４を有する転移端部２６，３
６が必要となることもある。これらは集合体全形成する
ための従来の方法により、孔端においてモノリスに連接
させることができる。

例えば、アルミナとジルコンとからなるセラミツ・クハ
ニカム組成物を押出成形し、１６０００Ｃにおける焼成
後に６−３．９ｗｔ％のムライト＋３６．１ｗｔ％のジ
ルコニア全産出するモノリス支持体とすることができる
。この物質の熱膨張率は室温〜１０００℃の範囲におい
て、５８×１０−７／’Ｃ，である。この物質は膨張率
の近似した上薬で被膜されるが、上薬は圧縮付着される
ように若干低目の膨張率を有することが好ましい。上薬
の適当な組成例は、、　４５．２　％のシリカ、２９．
６％のｐｂｏ　、、　　Ｂ、　ｏ％の酸化硼素、７、１
　％　（ＤＣａｏ、　　５．’７　％ノアルミナ、２３
％のソーダ、０．９％（７）ボタシア（ｐｏｔａｓｓｉ
ａ　）、０７楚のジルコニアおよび０．２％のＣｄＯ’
ｉ含むものである。

浴融後、組成物は約３２５メツシユの微粒粉末に分解す
る。この粉末は、小量の有機結合剤を加え１こ水中懸濁
物としてハニカム表面に付着させる。１００℃において
乾燥させた後、被覆した支持体を大気中において１０９
０°Ｃで１時間焼成する。この結果、表面が液体不浸透
性である。良好に密層する上薬で処理されたハニカムが
得られる。

複合体を組立てる第３の方法は、ガラスケーシングを使
用するものである。この方法においてはモノリス支持体
を、支持体よりも若干大きな補完形状であるガラス材料
内に配置する。孔端はケーシング中の開口に符合する。

例えば、円筒状モノリスを、その内径が支持体の外径よ
りも若干大きなガラス管内に挿入する。ガラスを選択す
る際には支持体およびガラスの熱膨張率が一致もしくは
近似するように考慮することが必要である。こうするこ
とによって、次の工程中におけるガラスおよび支持体双
方に対する応力を減することができる。

次に、第９図に示すように、従来の方法によりガラス全
モノリス１０の周囲で熱収縮させる。例えば、ガラス１
６を全長にわたって加熱しながら軸方向に回転すればよ
い。分離した転移端部２６，３６の使用全避けるため、
加熱したガラス端を加工可能状態において、必要な寸法
に拡大もしくは縮小することもできる。流体分配器２８
．．３４は転移領域内に配置してもよい。

上記複合体はそれぞれ、組成、構成要素および組立法に
おいて異なっている。しかしながら、これらは全て、前
述した新規なモノリス支持体と、支持体に錨着した細胞
に乱流のない培地の層流が供給されるように流れを導入
し、通過させ、排出する手段とを有している。

モノリス支持体 モノリス支持体も、第４図および第５図に示すように分
割した部分４０〜４８とすることができる。各分割部分
は、その隣接する部分と適正に整列かつ配向するように
設計する。

ここで、支持体内部において非乱流が流れ、また接種段
階における配向回数を最小となるように孔を一致させる
よう考慮することが重要である。第５図は２つの分割部
分がどのように合体するかｔ示す分解図である。この集
合体は、単体構成物という観点からはモノリシックとは
見なせない可能性があるが、支持体増殖表面の整列卦よ
び配向が、連結された全部分を通じて維持される点でモ
ノリシックである。

支持体構造全形成する孔１２の形状は重要ではない。矩
形、−円形、三角形および他の形状のものは、本発明に
よる細胞培養の目的上、はぼ同等である。しかしながら
、孔の寸法は支持体の適合性に影響を与える重要な変数
である。孔が過大であると支持体の体積に対する衣面積
の比が減少するため、得られる培地の体積全効率的に使
用することかで＠ない。

一方、孔が過小であると培地の流れが制限されるため、
培地が細胞に隣接した際に最適のｐＨ値および溶存ガス
値を維持することが困難である。孔を通過する培地の最
大流速が、孔のほぼ全長を通じて細胞に適正値の栄養分
を供給し、同時に廃棄物最大値金避けるように廃棄副産
物を除去し得る限りにおいて、モノリスの縦横比は重要
な因子ではない。本発明の細胞培養支持体において実現
し得る流速範囲に適当な縦横比は約１：１００の範囲に
ある。

モノリスの孔壁の組成は有機でも無機でもよいが、以下
の特性、すな、わち１）実質的に、培地不溶性かつ培養
される細胞群に対し非毒性であること、２）対象とされ
る型の動物もしくは植物組繊細胞が錨着し得る表面であ
ること、および３）孔壁を形成するに十分な強度の材料
に結合できること、金満たすものでなければならない。

適当な材料の例としては、シリカ、半融硼珪酸ガラス、
ムライト（３Ａｚ２０ｓ・２ＳＩＯ，、）、菫青石（２
Ｍｇ０・２Ａ１２０３・５ＳＩＯ２）、マンガン菫青石
（〔β−ａ　）Ｍ’ｇＯ−ａＭｎＯ・２Ａ４０３・５８
１０２）、ジルコン（ＺｒＯ２・Ｓｉｎ、、）、雲母、
およびリチア４　石（Ｌ　ｌ、、　０−Ａ１２０ｇ　・
４８１０２　）　カ挙ケラレル。アルミナ（Ａ４０ｓ　
）およびチタニア（ＴｉＯ□）も、使用前に完全に洗浄
すれば適用できることが認められた。訝うまでもなく、
。上記の適当な物質全２つ以上組合わせてもよい。

細胞 支舟体材料の選択は、培養される組繊細胞にある程度依
存する。組織／支持体材料のある種の組合せは、プラス
チックローラーボトルの場合と同等以上の結果ケもたら
すが、他の組合せでＪまいくらか効果が劣るであろう。

第１表は、本発明により供給される複合体全使用して培
養することのできる特定の組織型の例をいくつか示すも
のである。この表には、使用される細胞型、および組織
培地における細胞の特性もしくは典型的な使用および細
胞に対する培地適性を示す好ましい支持体材料の例全記
載している。

第　　１　　表 細　胞　名　　　　　（細胞系−／供給源１゛・、・！
Ｗ’Ｉ　−３８倍数繊維芽細胞／ヒト肺ＨｅＬａ　　　
　　　　　　　形質転換ヒト腫瘍ＢＨＫ−２１繊維芽細
胞／ハムスター腎ＣＥＩ”−次（’Ｐｒ　ｉｍａｒｙ　
）　　　繊維芽細胞／ヒナ胚Ｖｅｒｏ　　　　　　　　
　　上皮＃Ｉ胞／ザル腎ＨＦＳ　　　　　　　　　　繊
維芽細胞／ヒト包皮ＲＰＭ’ｌ−１７８８！Ｊンバ細胞
／ヒト末梢血液）ｔＴＧ−ｚ　　　　　　　　繊維芽細
胞／ニジマス生殖腺ヤブカ（Ａｅｄｅｓ　ａｌｂｏｐｉ
ｃｔｕｓ）　　上皮細胞／蚊幼虫−次サル（Ｐ’ｒ　ｉ
ｍａｒｙ　Ｍｏｎｋｅｙ　）　　上皮細胞／アカゲザル
腎細胞名　　　　特性／使用 Ｗｉ　−３８ワクチン製造 ＨｅＬａ　　　　　　　腫瘍研究 ＢＨＫ−２１ウィルス製造 ＣＥＦ−次　　　　獣医ワクチン Ｖｅｒｏ　　　　　　　　ウィルス製造ＨＦＳ　　　　
　　　　インターフェロン製造ＲＰＭＩ　−１７８８’
免疫グロブリン分泌ｎＴＧ−２魚ウィルス研究 ヤブカ　　　　　　　　　　アル最ウィルス（ａｒｂｏ
ｖｉｒｕｓ）源−次サル　　　　　ワクチン、ウィルス
学細胞培養系 本発明のモノリス支持体は、最小の補給で最大の細胞増
殖もしくは細胞維持が達成するように設計された系にお
いて使用することが最も望ましい。したがって、適当な
栄養物が増殖細胞に絶えず供給されなければならな（・
０また、増殖を阻害する廃棄物は除去せねばならない。

第３図は、モノリス支持体を使用する好ましい培養系を
示す概略図である。細胞の増殖もしくは維持に適した栄
養分を含む培地は、ポンプ５０によって液溜５２かもモ
ノリス支持体１０内に導入され、支持体を通過し、その
増殖表面上に供給される。さらに、複数の支持体を平行
に連接した場合には、これらを同時に運用することも可
能である。培地および支持体は従来の方法で最適温度に
維持する。

培地は支持体内外を再循環する際に、ｐＨグルコース、
溶存ＣＯ２および溶存０２の各値を測定する連続した自
動センサー！５４　、５６を通過する。センサーはこれ
らの値を絶えず中枢工程制御コ／ピユータ−５８に出力
し、この値に応じてコンピューターは培地の流れ（ポン
プ５０）および培地の補充を制御する。

より詳細には、制御コンピューターは、ガス侵透器６０
．ポンプ８０を備えたバッファーおよびグルコースの液
溜６２等、使用された培地の消耗を回復させる機構を操
作する。回収口６４において小量の培地のサンプリング
および添加が行なわれる。

第７図は系の自動−制御をより詳細に示すものである。

ここでは、ヲ°ロープ５４および５６がｐＨ、グルコー
ス、溶存ＣＯ２および０２の各値を感知する。あるいは
、アミノ酸および細胞代謝産物の濃度を測定してもよい
。この情報は電気信号に変換され、増幅器６６で増幅さ
れた後、連合自動／手動インターフェイス６８に送られ
る。即時に読み出しが行なえるように前記インターフェ
イスにぼパネルメーター７０が接ｉされている。手動操
作が望ましい場合には、技術者がパネル読み出しを監視
し、手動制御装置７２を用いてグルコース、ｐＨ２溶存
ＣＯ２，，０２″および溶存窒素（Ｎ２）を調節しても
よい。

自動制御が望ましい場合には、系の制御機構を迅速に駆
動するに十分なメモリーおよび演算能力を有する中枢コ
ンピューター７４にセンサーのデータを送りこむ。この
コンピューターとして適当なものの１例は、ヒユーレッ
トバラカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ　−Ｐａｃｋａｒｄ　）
社のＨＰ９９１５機である。コンピューターは支持体に
出入する培地の状態に関する情報を得て、再循環前に培
地を再生するために必要な変化量を計算する。これらの
計算法は当業者に公知であるソフトウェアプログラムに
基づき、常に最新化される。

計算とほぼ同時に、コンピューターはセンサーのデータ
、系の必要要件および、これら必要要件を修正するに必
要な作用をプロッター７６および／もしくはビデオ端末
７８に表示する。コンピューターは同時に信号をインタ
ーフェイスに戻し、そこで適当なサーボ機構に中継する
。例えば、ノくツファーとグルコースの溶液の供給ポン
プ８０は、系の必要要件、ポンプの出力および溶液濃度
に基づ（・た設定時間に作動させることができる。さら
に、ガス流制御装置８２を作動させて、ガス浸透器６０
に導入する、０２　、　ＣＯ２およびＮ２の量を増減す
ることも可能であり、さらに、これらのガス気泡を生じ
させな（・ような流速で液溜５２（図示せず）゛に導い
てもよい。

この制御系は培地の要求を自動的かつ連続的に監視し、
補充工程を自動的かつ連続的に行なうことのできる手段
となり、効果的である。したがって、労力および材料の
節約の達成されることが重要である。

また、本発明によれば培養系運用者に有用な細胞増殖曲
線もしくは輪郭（ｐｒｏｆｉｌｅ　）を描く方法が開示
される。第８図に示すように、ＱＣＲ（酸素消費速度）
および０ＣＲ（グルコース消費速度）の変化は支持体に
おける細胞の飽和、すなわち細胞数の停滞に関係する。

したがって、ＯＣＲおよびＧＣＲ〜を監視すれば細胞の
飽和を知ることができる。

実施例１ 以下に詳細に説明する実施例は、本発明による細胞培養
複合体の製造法および使用法を明らかにするものである
。

支持体 培養支持体として使用するために、断面が正方形である
複数の孔から々るハニカム構造形状のモノリシックセラ
ミック支持体を選択する。このモノリスは菫青石（２Ｍ
ｇ０・２Ａ、ｄ　２０３　拳５ＳｉＯｚ　、）からなり
、直径約２　ｃｍ　、長さ約６（１７７１の円筒形であ
る。この構造物には全長を貫通する孔が、断面積１イン
チあたり約３００個存在して（・る。

支持体を効果的に使用するためには、培地を非乱流とし
て支持体に導入し、通過させ、排出する密着円筒ジャケ
ットで支持体を覆うことが好ましい。こうして得た集合
体は公知の洗浄および滅菌技術により、使用に備える。

細胞 モノリス上で培養すべき細胞は、ヒト包皮繊維芽細胞（
ＨＦＦ）の二次培地から採取する。

細胞は、バッファーを加えた蛋白分解酵素溶液（ｐＨ７
，４の、カルシウム／マグネシウムを含まない燐酸緩衝
塩（ＣＭＦ−ＰＢＳ　　）　ＫＯ，２５％のトリプシン
を添加したもの）を使用して、ＣＭＦ−１）ＢＳ　で二
次培地を完全にすすぎ洗いすることにより血清・を含有
する全ての増殖培地を除去した後に二次培地から分離す
る。前記酵素溶液は二次培地の表面積２５７あた９約０
．５　ｍｌの容量で二次培地に添加し、３７℃において
１０分間インキュベートした後、１０％の胎生血清（Ｆ
ＢＳ）を含有する冷たい（４℃）増殖培地を添加して容
量を少なくとも２倍にする。そして、細胞は懸濁液から
遠心分離した後、使用に先立って新鮮な冷たい増殖培地
に再懸濁する。この培地は全ての細胞生成および増殖に
使用されるものであり、Ｌ−グルタミンおよびＮＥＡＡ
（再入アミノ酸）を含有し、ＨＥＰＥＳバフ７７−（２
ＱｍＭ″）。

０．０３５ｇ／　ｌ　（７）　ＮａＨｃＯ３、１０ＯＡ
ｇ／ｍｌのガラマイシンおよび１０％のＦＢＳを添加し
たもので、ノ・ンクスの最低必須培地（ＭＥＭ−Ｈａｎ
ｋｓ　）と呼ばれる。

支持体の接種 滅菌１したモノリス−に、懸濁培地１　ｍｌあたり１．
２５Ｘ１０５個の細胞を含有する細胞懸濁液からＨＦＦ
細胞を接種する。血清は細胞を孔壁に付着させるようモ
ノリス中に輸送する運搬手段に過ぎないため、この培地
中には必要ない。

均一な接種を達成するため、予め循環する無血清培地で
満たしたモノリスを水平に配置し、長（・シリコン管を
用いて接種懸濁液の入ったフラスコと接続する。この際
、モノリスは４蔵の孔側壁のうちの１つが水平に配置さ
れるように配向する。そしＬモノリス中に存在する無血
清培地はモノリス中に同体積の細胞懸濁培地をポンプす
ることによって除去する。

重力による細胞の水平な孔壁上への定着を生じ′させる
１５分間の間隔の後、モノリスを円筒軸の回りで９０°
回転し、２粗目の孔壁に対しても接種工程を反復する。

この工程は正方形の鉗の４つの側面の全てに対して接種
が完了されるまで反復する。

接種細胞の培養 接種完了後、モノリス中の無血清培地を、１０％のＦＢ
Ｓ　　を含有するＭＥＭ−Ｈａｎｋｓ増殖培地で置換し
、モノリスを数時間放置する。

その後、モノリスを通して増殖培地を緩慢に再循環する
が、その速度はモノリス上における細胞増殖の初期遅滞
期において０．２５ＣＩ′／Ｌ／時である。この流速は
細胞培養の急速増殖期中においては０，５〜４０ｃＩｒ
ｔ／分の範囲まで増加させることができる。周期に対応
して培地のｐＨおよび再循環する増殖培地の置換を連続
的に監視することにより、細胞に最適な増殖状態が維持
される。

比較例 モノリスの組繊細胞培養支持体としての有効性は、ロー
ラーボトルもしくはマイクロキャリヤ支持体等のプラス
チック支持媒体を用いた比較試験によって立証すること
ができる。

支持体性能の尺度は、急速な細胞増殖の開始に先立つ遅
滞期の継続期間、培地の急速増殖期中の細胞増殖速度、
および支持体上で達成可能な最大細胞密度である。

これらの変数の数量化は、接種後の様々な時間において
各支持体に存在する細胞蛋白を分析することによって容
易に達成される。支持体表面積１ｉあたりの細胞蛋白を
支持体表面積１ｄあた９の紺胞数に変換することは公知
であり、当業者に受容されている。例えば、存在ｉる蛋
白質１ｍｌ？を２．６Ｘ１０６個の細胞に変換する換算
式を使用することができる。

蛋白質分析法は公知であυ、適半な技術の１つはＮａ１
ｌ−（を使用して支持体から細胞蛋白を溶出し、フォリ
ンフェノール試薬を使用し、７５０　ｎｍにおける赤外
線吸収より溶出液中に存在する蛋白質を定量測定するも
のである。

この測定法は、０．Ｈ９ｏウリ−（Ｌｏｗｒｙ　）　　
等により、「フォリンフェノール試薬による蛋白質測定
（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ
　ＦｏｌｉｎＰｈｅｎｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ　）Ｊ　、
　Ｊ−Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　１９３　。

２６５〜２７５ページ（１９５１）により詳細に記載さ
れておシ、方法に関する詳細な情報を得ることができ為
。

本発明による菫青石モノリス支持体と先行技術において
広く用いられる型のプラスチックローラーボトル支持体
およびマイクロビーズ支持体の多数のものとの間で培養
支持体特性の比較を行なった。最初に全支持体に対して
濃度約１．２５　Ｘ　１０’　／ｅｔａのＩ−Ｉ　Ｆ　
Ｆ細胞懸濁層を接種した。ローラーボトルおよびマイク
ロキャリヤは公知の許容される方法で操作した。

前記３つの支持体で得た最大細胞産出量を第２表に示す
。

プラズマ処理ポリスチレン（コーニング）　　　６．２
　Ｘ　１０　’　（測定数６）誘導セファロースビーズ
（ファーマシア）　　　６．８Ｘ１０’（測定数３）菫
青石モノリス支持体　　ｘ３．ｒｘ１ｏ’（ｍ＋淀数２
）接種後の期間および急速増殖は３つの異なった培養支
持体においてほぼ同様であったが、モノリス支持体上で
得られる細胞群の密度は全ての場合において、プラスチ
ック支持体において得られる値の２倍以上であった。

実施例２ 本実施例は本発明による細胞培養装置および方法に接続
した複合体の優れた性能を示すものである。

第６図および第７図に示す１つの装置を用いて、２つの
培養を行なった。メリーランド州ロックビルのアメリカ
基準培養収集（ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＲｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　）から市販されている
サル腎上皮細胞系であるＶｅｒｏ　　細胞をローラボト
ルコントロールと、５０本のローラーボトルと同等（５
０Ｒ，Ｂ、Ｅ、）な細胞増殖表面積を有するモノリス支
持体とに、２０〜２５ＸＩＯ６細胞／ＲＢＥの割合で接
種した。

８日間にわたって、１１あたｌ）４．５　ｇのグルコー
スを含有する７′′ルベツコの（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
）最低必須（ＤＭＥ）受養増殖培地を前記コントロール
および支持体に供給した。支持体培養系は上述の方法で
操作し、ローラーボトルは従来の方法で運用した。この
後、第６図の装置に使用するために前述した好ましい方
法によって、増殖細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで採取し
た。細胞産出量は以下の通９であった。

５ＱＲＢＥ支持体試験／１６１　　　　、５．５５Ｘ１
０８個／ＲＢＥ５０ＲＢＥ支持体試験Ａ６２　　　　７
．８５Ｘ１０８個／ＲＢＥローラーボトルコントロール
試験　　２．００　Ｘ　４．００　Ｘ　１０８個／ＲＢ
Ｅ実施例３ 実施例２と同様に前述の接種、培養および採取技術を使
用してモノリス支持体上にＶｅｒ。

細胞の培養を行なった。ただし本例において、支持体の
規模は２２０Ｒ，ｆ３Ｅであった。８日後に採取した細
胞数は以下の通シであった。

２２０　ＲＢＥ支持体試験　　　　５．００Ｘ１０８個
／ＲＢＥローラーボトルコントロール試験　２．００〜
４．００　Ｘ　１０８個／ＲＢ　Ｅ本発明は好ましく・
形態について特に言及して説明したが、当業者にとって
明らかなように、本発明を理解した後には、特許請求の
範囲に記載された本発明の精神および範囲を逸脱するこ
となく、様々な変更および修正を行なうことが可能であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のモノリス支持体を示す部分断面立面図
、 第２図はその断面図、 第３図は本発明のモノリス支持体複合体を用いた細胞培
養装置を示す略図、 第４図は本発明の分割されたモノリス支持体を示す立面
図、 第５図はその分解図、 第６図は本発明の分割された非乱流手段を有する固定細
胞複合体を示す部分断面側面図、第７図は本発明の細胞
培養装置に使用される自動連続工程制御系を示す略図、 第８図は本発明の制御変数と細胞増殖との相関関係を示
すグラフ、 第９図は本発明のガラス被覆モノリス支持体集合体を示
す側面図、 第１０図は本発明のモノリス支持体および転移端キャッ
プを熱可塑性プラスチックスリーブに挿入した状態を示
す部分断面側面図、第１１図はそのスリーブが収縮した
状態を示す側面図、 第１２図は本発明の上薬を被覆したモノリス支持体を示
す分解立面図である。 １０・・・モノリス支持体　　　１２・・・　　　孔１
４・・・孔　　　壁　　１６・・・ジャケット２２・・
・り　ラ　ン　グ　　　２４・・・入　　　　　口２６
．３６・・・・・・転移領域　　２８．３４・・・ガラ
スＰ板３８・・・出　　　　口　　　５０．８０・・ポ
　ン　プ５２．６２・・・液　　　溜　　　５４．５６
・・・センサー５８・・・工程制御コンピューター ６０・・・ガス浸透器　　６４・・・回　収　口６６・
・・増　　幅　　器　　　６８・・・インターフェイス
７０・・・パネルメーター　　　７２・・・手動制御装
置７４・・・中枢コンヒータ一番　　７６・・・プロッ
ター７８・・・ビデオ端末　　　８２・・・ガス流制御
装置ｈν、７ Ｆ々、θ ■４６４０１２ ＠１９８３年２月４日Ｑ米国（ＵＳ） ■４６４０２７ ■１９８３年２月４日■米国（ＵＳ） ■４６４０２８ ＠１９８３年２月４日■米国（ＵＳ） ■４６４０４０ ■１９８３年２月４日■米国（ＵＳ） ■４６４１２６ ０発　明　者　ピョン・ケネス・ライダーセンアメリカ
合衆国ニューヨーク州 １４８１４ビツグ・フラッフ・オル コツト・ロード２９６７ ０発　明　者　ゴートン・グリムショー・ピュアメリカ
合衆国ニューヨーク州 １４８４５ホース・ヘツズ・グラン ド・セントラル・アベニュー４０ ■発明　　者　バーベンダー・ポール・シャーマ アメリカ合衆国ニューヨーク州 １４８５８リンドレイ１２０５ステート・ロード・アー
ル・ディー１ボ ックス２４６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（ａ）　　培地不溶性の非毒性組成物から形成され
   た壁を有する、断面積平方インチあたり少なくとも約２
   ０個゛の互いに平行な貫通孔を有する表面積の大きなモ
   ノリシック支持体、および （１））　　前記孔壁に錨着した植物もしくは動物組繊
   細胞 からなることを特徴とする固定細胞複合体。 ２）前記支持体の縦横比が約１：、１００の範囲にある
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の複合体。 ３）前記孔壁が菫青石、アルミナ、シリカ、チタニア、
   ムライト、ジルコン、リチア輝石、雲母、およびそれら
   の組合せからなる群より選択された、焼結した有孔セラ
   ミック材料から形成されていること全特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の複合体。 ４）＠記支持体が少なくとも２つの部分からなり、各部
   分は培地が支持体中をくまなく流れるように隣接部分と
   整列かつ配尚するような寸法および形状を有しているこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の複合体。 ５）　前記支持体が上薬−の被膜されたものであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の複合体。 ６）前記孔および孔壁が、前記支持体の断面積平方イン
   チあたりに約１００〜１０００個の孔全存在させる寸法
   を有していること全特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の複合体。 ７）前記支持体が少なくとも４００個／平方インチの孔
   を有すること全特徴とする特許請求の範囲第６項記載の
   複合体。 ８）細胞゛全モノリシックな、培地不溶性の非毒性支持
   体に錨着させ、前記細胞全通過させ、もように測胞栄養
   培地全流すことからなる、植物もしくは動物組繊細胞の
   培養方法において、 ａ）前記支持体が、互いに平行な複数の貫通孔を有する
   １つのモノリスからなり、ｂ）前記孔が細胞の錨着に適
   した壁を有し、ｃ）　　ｒｌｎＪｌｎ特記が、断面積平
   方インチあたり少なくとも約２０個の孔を有すること、
   全特徴とする細胞培養法。 ９）前記栄養培地の栄養および代謝産物の水準を絶えず
   監視し、栄養水準を最適とするように培地に対して絶え
   ず調整を行なうこと全特徴とする特許請求の範囲第８項
   記載の方法。 １０）前記孔壁が、菫青石、アルミナ、シリカ、チタニ
   ア、ムライト、ジルコン、リチア輝石、雲母、およびそ
   れらの組合せからなる群より選択された組成物からなる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の方法。 １１）ａ）　　前記支持体が、収縮性材料で被覆された
   、互いに平行な複数の貫通孔を有するモノリスからなり
   、 ｂ）Ｒ記細胞栄養培地の流れの転移手段全前記収縮性材
   料の収縮時に固定されるように＠記モノリスの両端に供
   給すること、全特徴とする特許請求の範囲第８項記載の
   方法。 １２）前記支持体が上薬の被膜されたものであることを
   特徴とする特許請求の範囲第８項記載の方法。 １３）細胞を錨着さ払−る少なくとも１つの培地不溶性
   非毒性支持体と、細胞栄養培地の流れ？供給する手段と
   を有する植物もしくは動物組繊細胞培養装置において、 ａ）前記支持体が、互いに平行な複数の貫通孔？有する
   モノリシック支持体構造物からなり、 ｂ）　　Ｍ配孔が、細胞の錨着に適した壁を有しており
   、 Ｃ）前記支持体が、断面積平方インチあたす少なくとも
   約２０個の孔七有しており、の　錨着した細胞を通過さ
   ・せるように前記細胞栄養培地全溝く手段が設けられて
   いること、 を％徴とする細胞培養装置。 １４）前記モノリシック支持体構造物か、菫青石、アル
   ミナ、シリカ、チタニア、ムライト、ジルコン、リチア
   輝石、雲母、およびこれらの組合せからなる群より選択
   された有孔組成物であること全特徴とする特許請求の範
   囲第１３項記載の装置。 １５）前記細胞栄養培地の栄養および代謝産物水準全絶
   えず監視し、この培地の栄養水準を最適の水準に調整す
   る手段が設けられていることを特徴とする特許請求の範
   囲第１３項記載の装置。 １６）前記支持体が少なくとも２つの部分からなり、各
   部分は培地が支持体中ｋｒまなく流れるように隣接部分
   と整列かつ配向するような寸法および形態を有している
   こと全特徴とする特許請求の範囲第１３項記載の装置。 １７）前記細胞培地が錨着細胞全通過して導かれるよう
   に、前記モノリスが収縮性材料で被われていることを特
   徴とする特許請求の範囲第１３項記載の装置。 １８）前記支持体が上薬の被膜されたものであること全
   特徴とする特許請求の範囲第１３項記載の装置。 １９）　　増殖用内表面勿肩するモノリス支持体と、均
   一に細胞栄養培地を支持体内外に流す入口および出口の
   転移手段と、乱流のない培地の流れを支持体に導く手段
   とを有する固定細胞複合体全製造する方法において、ａ
   ）１）前記支持体を補完するような形状を有し、 １１）前記支持体の挿入が可能であり、１１Ｄ＠記入口
   および出口の転移手段の挿入が可能である 寸法および形状を有するガラス外被全選択し、 ｂ）　　ＭｉＪ記支持体全この外被中に挿入し、Ｃ）前
   記転移手段をそれぞれ前記支持体の入口および出口の端
   に位置するよう前記外被中に挿入し、 ｄ）前記外被が前記転移手段の周囲で収縮し、前記支持
   体が前記転移手段に対して同定されるように、この外被
   を加熱すること、 全特徴とする方法。 ２０）増殖用内表面を有するモノリス支持体と、均一に
   細胞栄養培地を支持体内外に流す入口および出口の転移
   手段と、乱流のない培地の流れ全支持体に導く手段とを
   有する固定細胞複合体を製造する方法において、ａ）１
   ）前記支持体全補完するような形状を有し、 ＩＩ）前記支持体の挿入が可能であり、１１Ｄ前記入口
   および出口の転移手段の挿入が可能である 寸法および形状′ｆｆ：有する収縮性造形物を選択し、 ｂ）前記支持体をこの造形物中に挿入し、Ｃ）前記転移
   手段全それぞれ前記支持体の入口および出口の端に位置
   するよう前記外被中に挿入し、 ｄ）前記造形物ケ収縮させることによって、前記支持体
   と前記転移手段を固定し、培地が乱流？生じることなく
   複合体に入り、この中音通過し、排出されるよ′）なジ
   ャケットを形成すること、 全特徴とする方、法。 ２１）錨着可能な植物もしくは動物組繊細胞を少なくと
   も１つの、培地不溶性の非毒性支持体に接種する方法に
   おいて、 ａ）動物血清全含有する培地で前記支持体を満たし、 ｂ）前記支持体を縦匹水平な位置に配置し、Ｃ）前記支
   持体上を循環する均一な細胞懸濁物全前記培地に接種し
   、 ｄ）前記細胞が、水平なＭｉ前記支持体表面上に接着す
   るに十分な時間、支持体上にこの＃Ｉ胞を定着し、 ｅ）前記細胞培地全前記支持体上に再循環し、 ｆ）暴露されていない表面領域が水平な位置に配置され
   るように＠記支持体の配向４変化せしめ、 ｇ）支持体の全表面が水平な位置において定着細胞に暴
   露するまで、定着、再循環および再配向段階を反復する
   こと、 を特徴とする方法。 ２２）錨着可能な植物もしくは動物組繊細胞を少なくと
   も１つの、培地不溶性の非毒性支　二押体に接種する方
   法において１ ａ）動物血清を含有する培地で前記支持体金満たし、 ｂ）　　Ｍ記支持体を縦に水平な位置に配置し、Ｃ）　
   　Ｍｉ前記支持体上を循環する均一な細胞懸濁物全前記
   培地に接種し、 の　前記細胞が、水平な前記支持体表面上Ｖ？−接Ｎす
   るに十分な時間、支持体上にこの細胞を定着し、 ｅ）前記細胞培地を前記支持体上に再循環し、 ｆ）接柾段階７反値し、 の　暴露されていない表面領域が水平な位置に配置され
   。るように前記支持体の配向を変化せしめ、 ｈ）支持体の全表面が水平な位置において定着細胞に暴
   １するまで定着、再循環および再配向段階を反復するこ
   と、 全特徴とする方法。 ２３）　ａ）　　分離剤の効力を阻害し得る培地中の可
   溶成分を除去し、 ｂ）採取すべき細胞を、細胞間および細胞表面間の相互
   作用を破壊することのできる試薬すなわち分離剤により
   、必要な程度の破壊が生じるに十分な時間処理し、Ｃ）
   液体培地を循環させることにより、処理された前記細胞
   にパルス化した剪断力？加えること、 を特徴とする錨着可能な植物もしくは動物組繊細胞全支
   持体から採取する方法。 ２４）　ａ）　　まず、細胞増殖の輪郭を得るように、
   飽和全得るまで、増殖細胞群のグルコースおよび酸素の
   消費速度を監視し、 ｂ）次いで、細胞培地中のグルコースおよび酸素消費速
   度の変化率全監視し、選択された時間において前記輪郭
   とこの監視された変化率とを比較することによって細胞
   培地中の細胞飽和率を計算すること、全特徴とする支持
   体上に錨着した植物および動物組繊細胞の飽和度測定法
   。 ２５）前記選択された時間が、前記変化率の遅滞開始時
   であることを特徴とする特許請求の範囲第２４項記載の
   方法。