SE445116B - Sett att odla celler pa mikroberare med fibronektinytskikt - Google Patents

Description

7907573-5 De klassiska metoderna för odling av förankrings- lberoende celler utnyttjar glas- eller plastskålar eller rullflaskor, i vilka man kan erhålla ett lager (“monolager") av celler. överföring av en sådan teknik till större skala har tidigare endast inneburit en ökning av antalet odlings- kärl, vilket medfört att byte av medium, subkultivering, skörd av celler etc. inneburit ett mycket stort antal manuella operationer under sterila betingelser.

En klar förbättring i jämförelse med ovannämnda metod har uppnåtts genom införandet av s.k. mikrobärarkultur.

Celler får i denna teknik fästa sig och tillväxa på små partiklar, vilka med hjälp av långsam omrörning kan hållas suspenderade i näringsmediet. Dessa partiklar erbjuder en radikalt mycket större yta per volymenhet odlingskärl och ger alltså möjligheter till odling av stora cellmängder i en enda odlingstank. Både för arbete i laboratorie- och storskala erbjuder denna teknik avsevärda fördelar i fråga om krav på utrymme, arbetskraft och direkta driftskostnader.

En metod som använder en sådan mikrobärarkultur finns beskriven i uppsatsen “Microcarrier culture of animal cells" av A L van Wezel i Tissue Culture, Methods and Applications, P F Kruse Jr. och M K Patterson Jr, Eds., Academic Press (1973) sid. 372-377. Det härvid använda bärarmaterialet ut- gjordes av pärlor av med epíklorhydrin tvärbunden dextran, substituerad med dietylaminoetylgrupper. Detta bärarmate- rials lämplighet är baserat på att materialet uppfyller följande krav, som ställs på ett gott bärarmaterial förutom olöslighet i vatten: Densiteten i närvaro av vatten (dvs. i vattensvällt tillstånd för material svällbara i vatten) bör företrädes- vis vara obetydligt skilt från densiteten för den vatten- haltiga omgivning i vilken bärarmaterialet används för uppnående av en homogen suspension av partiklar under för- siktig omrörning, dvs. i allmänhet bör densiteten ligga inom området 0,95 - 1,20 g/ml, företrädesvis 1,00 - 1,10 g/ml, speciellt 1,02 - 1,05 g/ml. 7907573-5 Partiklarna bör tillhöra en snäv fraktion för upp- nående av enhetlig effektiv kapacitet och jämn vidhäftning och tillväxt av cellerna. I allmänhet används en medelpar- tikelstorlek inom området 100 - 500 jun, företrädesvis i omrâdet 150 - 300 Jpm.

Partiklarna bör vara släta (innefattande företrädes- vis sfärisk eller sfäroid form) för god cellvidhäftning och minsta möjliga avskavning vid kollisioner mellan par- tiklarna samt tåla den mekaniska påfrestningen vid suspen- deringen så att de inte sönderfaller i mindre delar. I Transparens underlättar mikroskopiska studier av växande kulturer.

Partiklarna måste vara icke-toxiska gentemot primära celler, upprättade cellinjer och stammar av diploida cel- ler från människor och djur.

Partiklarnas upptag av andra komponenter från od- lingsmediet än sådana som deltager i mekanismen för cel- lernas vidhäftning till partiklarna bör vara försumbart.

Det finns emellertid vissa begränsningar med de kända mikrobärarna. Dessa begränsningar yttrar sig på så sätt att det i några fall av ej känd anledning har visat sig vara svårt att odla humana diploida celler på nämnda bärare. Bindningen mellan cell och mikrobärare med joni- serbara grupper, vilken bindning initialt är elektrovalent men sekundärt förstärks med andra typer av sammanhållande krafter av mekanisk och/eller kemisk natur, är ej alltid tillräckligt stark. Som ett exempel kan nämnas att vissa typer av lymfoida celler inte fäster till mikrobärarna.

Celler kan också lossna antingen under tillväxten eller vid vidmakthållande av kulturen. Detta har exempelvis iakt- tagits vid odling av en del normala fibroblaster.

Andra celltyper har visat sig binda så bra till existe- tande mikrobärare att problem har uppstått då man velat fri- göra cellerna i och för skörd eller överföring. Den gängse metoden i detta sammanhang är trypsinering, dvs. behandling 7907573-5 av kulturen med ett proteolytiskt enzym. Extensiv tryp- sinering leder till att cellerna skadas eller dör.

Användning av existerande mikrobärare har ej heller medfört någon fördel vad gäller kravet på närvaro av rela- tivt höga koncentrationer av serum i kulturmediet för att optimal celltillväxt skall erhållas. Serum är den i cellod- lingssammanhang ojämförligt största utgiftsposten på kemi- kaliesidan.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är därför att åstadkomma ett sätt att odla och/eller fästa celler i ett odlingsmedium innehållande sfäriska mikrobärare, vilka uppfyller ovan nämnda på mikrobärare ställda krav och därut- över inte är behäftade med ovan nämnda nackdelar hos de kända mikrobärarna utan kan användas för fästning och od- ling av celler även i sådana system, där nu existerande mikrobärare ger tekniska problem.

Uppfinningen baserar sig på utnyttjandet av den bio- specifika affinitet som föreligger mellan â ena sidan vissa polypeptider och å andra sidan ett eller flera proteiner, som går under benämningen fibronektiner och förekommer i serum samt i membraner hos de flesta celltyper. Genom att fästa den ena av dessa komponenter till en mikrobärare erhållas konjugat, som i närvaro av den andra komponen- ten kan binda till celler.

I enlighet härmed kännetecknas sättet enligt uppfin- ningen av att som mikrobärare används sfäriska partiklar av ett i vatten olösligt men svällbart, tvärbundet, orga- niskt makromolekylärt ämne, vilka partiklar i sitt ytskikt uppvisar kovalent bunden polypeptid med förmåga att bio- specifikt binda fibronektin och vilka partiklar i vatten- svällt tillstånd har en densitet inom området 1,00-1,10 g/ml och en medelpartikelstorlek inom området 100-500 um.

(Uttrycket polypeptid omfattar här och i kraven även prote- iner). 7907573-5 Det makromolekylära ämnet kan exempelvis vara en i vatten olöslig men företrädesvis svällbar polymer, som ej är toxisk gentemot cellerna. Det makromolekylära ämnet kan med fördel vara en eventuellt tvärbunden polysackarid, som är olöslig men svällbar i vatten.

Enligt uppfinningen är det speciellt fördelaktigt att använda partiklar med så små porer att substansen till övervägande del stannar på partiklarnas yta och inte träng- er in i porerna och att från cellodlingen bildade högmole- kylära substanser inte heller går in i porerna i nämnvärd utsträckning.

Enligt en utföringsform anbringas substansen i form av ett ytskikt på en partikel av annat material. Härvid föredrages som nämnda substans kollagen eller nedbrytnings- produkter därav såsom gelatin. Vidare enligt denna ut- föringsform föredrages att substansen har bundits till partikelmaterialet med bindningar som kan motstå normala odlings- och tvättbetingelser, speciellt kovalenta bind- ningar. Ett stort antal metoder för åstadkommande av ko- valenta bindningar har beskrivits i litteraturen i samband med koppling av polypeptider till bärare på polysackarid- eller proteinbasis. Sålunda har exempelvis koppling med hjälp av cyanhalogenider beskrivits i amerikanska patent- skriften 3 645 852, med cyanater i amerikanska patentskrif- ten 3 788 948 och med tiol-disulfidutbytesreaktioner i tyska "Offenlegungsschrift" 2 808 515.

Enligt en annan utföringsform av uppfinningen använ- des som mikrobärare sådana av kollagen eller nedbrytnings- produkter därav, vilka eventuellt har tvärbundits för upp- nående av önskad olöslighet i vatten.

Enligt en annan aspekt av uppfinningen frigöres cel- lerna när så önskas, från bäraren med proteolytiskt enzym (t.ex. kollagenas, när substansen är kollagen eller gelatin) efter avslutad tillväxt av cellerna. Speciellt vid fallet med kollagenas kan man på ett enkelt sätt frigöra fullt livsdugliga celler i gott utbyte. (Kollagenas är betydligt 19o7s7s~s 6 skonsammare för cellerna än trypsin.) Partiklarna kan vara neutrala eller kan förutom nämnda substans i ytskiktet uppvisa jonbytande grupper. De jonby- tande grupperna kan vara i och för sig kända anjon- eller katjonbytande grupper såsom aminogrupper eller karboxyl- grupper.

Såsom tidigare nämnts förekommer fibronektin på cellytor. Vid vissa celltyper, exempelvis vid transfor- merade celler, är halten fibronektin låg. Vid applicering av sättet enligt uppfinningen på denna typ av celler kan fibronektin tillsättes systemet i någon lämplig form, exempelvis genom tillsats av serum eller genom användning av mikrobärare som i sitt ytskikt uppvisar fibronektin.

Polypeptider med förmåga att biospecifikt binda fibronektin förekommer å andra sidan i allmänhet på cellytor i för sättet enligt uppfinningen tillräcklig mängd, varför några speciel- la åtgärder för att säkerställa dessas närvaro ej behöver vidtagas.

Uppfinningen kommer i det följande att illustreras närmare av ett antal exempel.

EXEMPEL 1 Tillväxt av Vero-celler på mikrobärare (Vero är en etablerad cellinje som härletts från ap- njurceller /African Green monkey/ och är kommersiellt till- gänglig från Flow Laboratories, Ltd., Irwine, England.) Autoklaverade mikrobärare (från exempel BIV,se nedan) i en mängd motsvarande 30 mg torrsubstans suspenderades i en petriskål i 10 ml Dulbecco's medium (Smith, J.D., Freeman, G., Vogt, M. och Dulbecco, R. (1960) Virology 12, 185-196.) innehållande 4 mM glutamin och 10% fetalt , kalv- serum samt med en initial cellkoncentration av 2'105 celler/ml.

Tillväxt fick äga rum i en C02-inkubator vid 37°C under 160 timmar och mättes genom infärgning av cellkärnor med 0,1% kristallviolett och mikroskopräkning. Parallellt före- togs en odling under identiska betingelser med Cytodexq1 7907573-5 (en mikrobärare baserad på tvärbundet dextran som deriva- tiserats med dietylaminoetylgrupper, kommersiellt till- gänglig från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige).

I bägge odlingarna hade efter 18 timmar cirka 2'104 celler/ml fäst sig vid mikrobärarna. Efter 160 timmar hade detta antal i bägge odlingarna ökat till drygt 106 /ml.

EXEMPEL 2 Skörd av celler från mikrobärare 0,5 ml suspension av mikrobärare (från exempel BV samt Cytodex 1) från Exempel 1 överfördes till centrifugrör.

Genom lätt centrifugering (acceleration till 200xg och inbromsning, totalt 5 minuter) avskildes supernatanten.

Mikrobärarna tvättades 2 gånger med 1 ml 0,03% EDTA i Puck's saltlösning (Puck, T.T., Cieciura, S.J. och Robinson, A. (1958) Journal of Experimental Medicine lgg, 945-956) och en gång med 1 ml Puck's saltlösning ej innehållande EDTA.

Efter den sista centrifugeringen tillsattes 1 ml enzymlös- ning i Puck's saltlösning, 0,05% kollagenas (Boehringer- Mannheim, Mannheim, Tyskland) eller 0,05 % trypsin (Serva, Feinbiochemica GmbH & Co., Heidelberg, Tyskland). Efter 5 och 10 minuters inkubation vid 37OC räknades antalet fri- satta celler (se tabell 1).

TABELL 1 Frigörande av Vero-celler från mikrobärare. Mätvär- dena är medelvärden av dubbelprov.

Mikrobärare Tillsats Antal frigjorda celler (%) Efter 5 min. Efter 10 min.

Gelatinmikrobärare kollagenas i Puck's salt- lösning 76 97 trypsin i Puck's saltlösning 48 80 Puck's saltlösning ej best. 4 Cytodex()1 kollagenas i Puck's saltlösning 9 38 trypsin i Puck's saltlösning 21 61 Puck's saltlösning ej best. 1 7907573-5 8 Sålunda möjliggjorde odlingen enligt föreliggande uppfin- ning avsevärt högre utbyte vid frisättningen av de bundna cel- lerna speciellt vid användning av kollagenas vid frisättningen.

EXEMPEL 3 Odling av Vero-celler på gelatin-SephadexC>G50 och Cytodex -1 I en flaska med magnetisk omrörning suspenderades 0,0375 ml packade mikrobärare från Exempel BII och 1 x 105 celler per ml odlingsmedium (Dulbecco's modifierade Eagle's medium med 7,5 % fetalt kalvserum, 4 mM glutamin och 20 mM HEPES (4- (2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra)buffert). Tillväxten fick ske vid 37°C i närvaro av vattenmättad luft (5 % C02) var- vid flaskan roterades med en hastighet av 60 varv per minut.

Odling på Cytodex 1 företogs under identiska betingelser.

Tillväxten mätt i antal celler per ml odlingsmedium är redo- visad i Tabell 2.

TABELL-2 tid gelatin-Sephadex ® G50 Cytodex ® 1 tim celler/ml celler/ml 19 6 11,5 x 10: 7,65 x 10â 41 26,8 x 10 12,2 x 10 65 31,6 X 104 22,0 X 104 4 4 97 49 x 10 34,5 x 10 138 56 x 104 57 X 104 161 64,6 X 104 57 x 104 Notabel är den betydligt snabbare tillväxten på gelatin- Sephadex G50 i början av odlingen. Denna skillnad mellan de olika mikrobärarna kan ytterligare ökas om cellkulturerna omsätts upprepade gånger efter 2 - 4 dagars inkubation.

De i ovanstående utföringsexempel använda mikrobärarna framställdes på följande sätt: A. Framställning av aktiverade mikrobärare I. 10 g med epiklorhydrin tvärbundet dextran i form av sfärisku partiklar (Sephadex G50 från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) tvättas på glasfilter med vatten och överföres till ett 500 ml kärl med vatten till en total volym vatten plus partiklar av 300 ml. 12 g natrium- 7907573-5 hydroxid löst i 15 ml vatten och 0,1 g natriumborhydrid till- sättes. Blandningen värms till 60°C. 38 ml epiklorhydrin till- sätts och blandningen får reagera i 2 h, varefter partiklarna tvättas med vatten på glasfilter och avsuges.

II. 40 ml sedimenterade partiklar av med epiklor- hydrin tvärbundet dextran (Sephadex Chemicals AB, Uppsala, Sverige) eller av tvärbunden agaros CL4B från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, G50 från Pharmacia Fine (Sepharose Sverige) och 20 ml vatten överföres till ett 250 ml kärl och försättes med 60 ml bromcyanlösning (80 mg CNBr/ml H20). Bland- ningen får reagera vid pH 11,4 och 4°C i 6 minuter. Därefter tvättas partiklarna på glasfilter med 1000 ml 0,1 M natrium- vätekarbonatlösning.

B. Koppling av_proteiner eller peptider till aktiverade mikrobärare 1 q protein (polypeptid) löses i 50 ml 0,1 M NaHCO3 innehållande 0,5 M NaCl i vatten (pH 8,0) under värm- ning vid behov och pH justeras till 9,5 - 10,5. Lösningen sättes till enligt A. ovan aktiverade mikrobärare och bland- ningen omröres i ett dygn vid rumstemperatur, varefter par- tiklarna tvättas omväxlande med 0,2 M Na-acetat-buffert med 0,5 M NaCl i vatten (pH 4,5) Och 0,2 M NaHCO3 med 0,5 M NaCl i vatten (pH 8,0) på glasfilter och avsuges.

I. Kollagen (Kollagen typ I från Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, USA) kopplades pâ ovan angiv- na sätt till aktiverad Sephadex G50 från A I.

Utbyte : 11 mg kollagen/g torr produkt. Partikelstorlek 160 - 200/um,densitet 1,03 g/ml.

II. Gelatin (gelatin typ III från Sigma Chemical Company, saint Louis, Missouri, USA) kopplades på ovan angiv- na sätt till aktiverad Sephadex G50 från A I.

Utbyte : 4 mg gelatin/g torr produkt. Partikelstorlek 160 - 200/um, densitet 1,03 g/ml.

III. Kollagen (samma som vid I ova?š)kopp1ades på ovan angivna sätt till aktiverad Sepharose CL 43 från A [1_ Utbyte : 80 mg kollagen/g torr produkt. Partikelstorlek 100 - 150/um, densitet 1,02 g/ml. 7907573-5 10 IV. Gelatin (samma som vid II ovaxëkopplades på ovan angivna sätt till aktiverad Sepharose CL 43 från A 11, Utbyte : 95 mg gelatin/g torr produkt. Partikelstorlek 100 - 150/um, densitet 1,02 g/ml.

V. Kollagen (samma som vid I ovan) kopplades på ovan angivna sätt till aktiverad Sephadex G50 från A II.

Utbyte : 19 mg kollagen/g torr produkt. Partikelstorlek 130-150/um, densitet 1,04 g/ml.

VI. Gelatin (samma som vid II ovan) kopplades på ovan angivna sätt till Sephadex G50 från A II.

Utbyte : 12,5 mg gelatin/g torr produkt. Partikelstorlek 130 - 180/um, densitet 1,04 g/ml.

Ovan angivna värden för partikelstorlek och densitet av- ser partiklar i vattensvällt tillstånd.

Claims (7)

7907573-5 _ PATENTKRAV

1. Sätt att odla celler i ett odlingsmedium innehållan- de partikelformiga mikrobärare, k ä n n e t e c k n a t av att som mikrobärare används sfäriska partiklar av ett i vatten olösligt men svällbart, tvärbundet, organiskt makromolekylärt ämne, vilka partiklar i sitt ytskikt uppvisar kovalent bunden polypeptid med förmåga att biospecifikt binda fibronektin och vilka partiklar i vattensvällt tillstånd har en densitet inom området 1,00 - 1,10 g/ml och en medelpartikelstorlek inom om- rådet 100 - 500/um.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att det i vatten olösliga men svällbara makromolekylära ämnet är en polymer, som ej är toxisk gentemot cellerna.

3. Sätt enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att substansen är anbringad i form av ett ytskikt på en partikel, varvid nämnda ytskikt och partikel är av skilda mate- rial.

4. Sätt enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att substansen är kollagen eller nedbrytningsprodukter därav.

5. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att som mikrobärare används sådana av kollagen eller nedbrytninge- produkter därav, vilka har tvärbundits för uppnående av önskad olöslighet i vatten.

6. Sätt enligt något av kraven 1 - 5, k ä n n e t e c k-l n a t av att cellerna frigöres från bäraren med proteolytiskt enzym.

7. Sätt enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t av att substansen är kollagen eller gelatin och att cellerna frigöras från bäraren med kollagenas.