JPH07106146B2

JPH07106146B2 - 動物細胞の流通培養床及びその製造方法

Info

Publication number: JPH07106146B2
Application number: JP62290679A
Authority: JP
Inventors: 一三青木; 耕司渡部; 葭人橋本; 治松本; 恵一安楽城; 登安藤
Original assignee: Chiyoda Corp
Current assignee: Chiyoda Corp
Priority date: 1987-04-24
Filing date: 1987-11-19
Publication date: 1995-11-15
Anticipated expiration: 2010-11-15
Also published as: JPS6427464A

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕本発明は動物細胞を高密度にかつ大量に培養するのに適
した流通培養床及びその製造方法に関するものである。

〔従来技術〕

近年、バイオテクノロジーの進歩により、微生物または
動物細胞を遺伝子工学的に改良し、医薬上有用な物質を
生産する技術が開発されて来ている。インターフェロ
ン、ヒト成長ホルモン、インシュリンなどがその例であ
る。しかし、微生物を遺伝子工学的に改良し、目的生産
物質（有用タンパク質）を得ようとした場合、そこから
得られるタンパク質には糖鎖部分がなく、全体構成とし
て動物細胞が産生する天然型の異ったものであり、薬理
的な効果上から動物細胞で生産したタンパク質が今後の
主流になるものと考えられる。

一方、動物細胞の遺伝子工学的改良技術の進歩によって
もたらされる有用生産物質は量的に微量である為、その
物質を大量に生産する立場からみると、動物細胞の大量
培養技術の確立が望まれている。従来の動物細胞培養装
置としては、ローラボトル、スパイラルフィルム型、チ
ューブ型、ホロファイバー型、マイクロキャリア型、エ
アリフト型等が実験室規模を含めて開発されており、工
業的規模にあっては、浮遊培養に対してはエアリフト型
及びホロファイバー型が、接着依存性の強い動物細胞の
培養にあってはマイクロキャリア型が適当とされてい
る。また、接着依存性動物細胞または組織の培養に対す
る細胞培養床としての細胞（組織）適合性材料の研究も
なされ、ゼラチンやコラーゲンの如きポリペプチドが優
れた効果をもたらすことが報告されている。ポリペプチ
ドは動物細胞との生体適合性が高い為、これを動物細胞
培養床基材として用いることにより、細胞の付着性がよ
く増殖速度が大きく高細胞密度の培養ができること等が
実験的事実として知られている。ポリペプチドを基材と
した培養床としては、デキストラン化合物のビーズ状支
持体上にゼラチンを塗布したマイクロキャリアが販売さ
れている。このマイクロキャリアは仕込量によっては液
体培地1ml当りの表面積が約20cm²と大きくとれ、工業規
模の培養に適しているといわれている。

しかしながら、このマイクロキャリアは製法が極めて複
雑で、製造コストが高価であり、その上、このものは浮
遊培養床として使用されることから、培養液中に浮遊状
態を保持するために培養液との比重差を考慮したり、撹
拌を制御したりする必要があり、またその取扱いも簡便
とはいえない。さらに接着依存性動物細胞の培養におい
ては浮遊状態より静止状態に置くのが好ましく、浮遊床
培養では撹拌による剪断力も培養に不都合を生ずる。

また、無機系材料であるガラスシリカ系多孔質を担体と
する細胞培養担体も開発されている（特開昭61−195687
号）。この無機系担体は浮遊培養床として適用されるも
ので、デキストラン化合物などの従来から知られている
有機系担体と比較して、もろさを改善できた結果、撹拌
操作などに耐えることができるようになったほか、ろ過
圧力に対しての変形も防止できるためにろ過分離操作が
確実に行うことができるようになったなど利点を有して
おり、付着性の細胞の大量培養においての利用面ではか
なりの改善が行われることができた。しかしながら、ポ
リペプチドなどの蛋白質で担体表面を処理する場合にガ
ラスなど無機質では表面電位が高く、コラーゲンなどの
蛋白質を付着させることが比較的に困難であるという欠
点があり、培養時の物理的特性は改善されたというもの
の、細胞の付着性を考えるうえでは満足したものという
ことはできなかった。

〔目的〕

そこで、本発明は、高比表面積のポリペプチド表面を確
保でき、かつ工業的に安価に供給し得る流通培養床及び
その製造方法を提供することを目的とする。

〔構成〕本発明によれば、第１の発明として、架橋不溶化された
ポリペプチド表面を有する繊維構造体からなり、該繊維
構造体は、太さ0.01〜1mmの繊維の３次元的からみあい
によって形成されたもので、その空隙率が50％以上及び
その体積に対する表面積比が10〜300cm²/mlであること
を特徴とする動物細胞の流通培養床が提供される。

また、本発明によれば、第２の発明として、太さ0.01〜
1mmの繊維の３次元的からみあいによって形成されたも
ので、その空隙率が50％以上及びその体積に対する表面
積比が10〜300cm²/mlである繊維構造体をポリペプチド
溶液で表面処理する工程と、ポリペプチド表面を架橋不
溶化する工程からなる動物細胞の流通培養床の製造方法
が提案される。

本発明において、ポリペプチド表面を有する繊維構造体
とは、繊維構造体を構成する繊維がポリペプチドで被覆
されていること及び／又は該繊維が形成する空間にポリ
ペプチドの膜を有する繊維構造体を意味し、繊維構造体
とは、細い繊維が３次元的にからみあって、一定の形状
を示す微細空隙を内部に有する構造体を意味する。

本発明の培養床を得るには、先ず、細い繊維が３次元的
にからみあった綿状体のものを、板状又はシート状に成
形した不織布状又は、一部を接着剤で補強したいわゆる
ロック状の繊維構造体を培養床の構造を維持するための
支持材としての用いる。この場合、繊維構造体には、ナ
イロン、ポリエステル、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニ
ル、ポリビニルアルコール、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニリデン等の合成繊維
が用いられる。

そしてこの繊維構造体をポリペプチドを用いて表面処理
し、繊維構造体を構成する繊維上にポリペプチド被膜を
形成させると共に、場合によっては、繊維間にポリペプ
チドの膜を張らせることができる。

この繊維構造体を、ポリペプチドで表面処理せずに培養
床とした場合には、細胞の付着が不充分であったり、細
胞の培養が効率よく行われなかったりするので、ポリペ
プチドによる担体の表面処理の操作は、重要な意味を有
している。

この繊維構造体をポリペプチドで処理する操作は繊維構
造体の構成材料が有機系の高分子であり、ガラスなどの
無機系の材料と比較して表面電位を低くすることができ
ることから、容易に行うことができるという利点があ
る。

繊維の太さは、通常、0.01〜1mm、好ましくは0.03〜0.3
mmである。この繊維構造体は、空隙率50％以上、好まし
くは90％以上で、体積に対する表面積の比が10〜300cm²
/ml、好ましくは10〜200cm²/mlのものを用いる。

本発明による流通培養床は、繊維構造体をポリペプチド
溶液で表面処理する工程と、これにより形成されたポリ
ペプチド表面をポリペプチド架橋剤、紫外線、γ線など
により架橋不溶化する工程とによって製造される。ポリ
ペプチド溶液で繊維構造体を表面処理する工程は、ポリ
ペプチド溶液に繊維構造体を浸漬するか、繊維構造体に
ポリペプチド溶液を流通接触させて行う。

ポリペプチド溶液の濃度は、約0.001〜10重量％、好ま
しくは約0.02〜1.0重量％がよい。濃度が高い方が吸着
しやすく被膜形成が容易であるが、10重量％以上では粘
度が高くなり、操作上被覆が困難となる。

またポリペプチド溶液のpHは約２〜８の範囲で、好まし
くは約３〜７がよい。pH2以下ではポリペプチドが繊維
に吸着しないため、被覆することができない。一方、pH
8以上ではポリペプチドが分解するため好ましくない。
溶液のpH及び濃度、浸漬時間を適宜選択することによっ
て、被覆の厚さを変化させることができる。

ポリペプチド溶液にエタノール、アセトン等の水と相溶
性のアルコール類、ケトン類等の有機溶剤又は塩化ナト
リウム等の塩類を添加することにより表面処理を容易に
することができる。有機溶剤は、溶液の粘度を低下させ
る働きを有し、高濃度のポリペプチド溶液を用いる場
合、繊維構造体の空隙がポリペプチドで閉塞されるのを
防止することに効果がある。添加量は、溶液の濃度、粘
度によって選択すればよく、通常10〜30％が適当であ
る。

塩類は、ポリペプチドの凝集作用に影響を与え、繊維へ
のポリペプチドの吸着力を向上させる。塩の添加量は他
の表面処理操作条件によって選択すればよいが、通常0.
1〜5g/が適当である。

ポリペプチド溶液の温度は約０℃〜40℃、好ましくは約
５〜30℃である。ポリペプチドの吸着は高温になる程容
易に行われる。しかし、ポリペプチドの種類によって
は、約30〜40℃近辺から変性が始まる場合もあるため、
高温で行う場合には、操作を短時間で終了させる必要が
ある。例えば、コラーゲンの場合、約38℃で約２時間以
内であればよいが、これを越えれば変性する。この場
合、上記の通り塩類の添加量を適宜選択して、操作温度
を下げ操作時間を短縮する。

本発明において、ポリペプチドとしては、従来公知の種
々のものが使用可能であるが、通常は、コラーゲンやゼ
ラチンが使用される。コラーゲンを用いる場合、コラー
ゲンとしては、可溶性コラーゲン、例えば酸可溶コラー
ゲンや、ペプシン等の酵素可溶化コラーゲンが用いら
れ、さらにコラーゲン骨格に化学修飾を施した各種コラ
ーゲン誘導体も用いられる。なお、ポリペプチドとして
ゼラチンを用いる場合、その繊維構造体への被覆は、コ
ラーゲンが吸着被覆と考えられるのに対し、ゼラチンは
そのゲル化によって付着するものと考えられるため、ゼ
ラチン溶液をゲル化温度以上に保持して浸漬等の表面処
理した後、繊維構造体を引上げてゲル化温度以下に保持
する。ゲル化温度は、ゼラチンの種類、溶液濃度、pHに
よって変化するため各条件で処理温度を選択する。通常
は、約35〜40℃で溶液浸漬等の処理を行えばよい。

前記のようにして得られたポリペプチド表面を有する繊
維構造体に、架橋処理を施し、ポリペプチド表面を架橋
して、不溶固定化させる。ポリペプチドの架橋処理は従
来知られている方法に従って実施することができる。即
ち、ポリペプチド構造中のアミノ基に対して反応性を示
す多価化合物、例えば、グルタルアルデヒド等の２価ア
ルデヒドをポリペプチド架橋剤として用いて実施するこ
とができる。この場合、ポリペプチド架橋剤は、通常、
濃度0.1〜１％の水溶液として用いられる。また、この
水溶液には、リン酸２ナトリウム等のリン酸塩等の塩類
をポリペプチドのアミノ基とアルデヒドとの反応に必要
なpHを保持する目的で添加する。この塩類の添加量は、
溶液中10〜20mmol/の割合である。この架橋処理は、
前記ポリペプチドを用いる表面処理の場合と同様に、ポ
リペプチド架橋剤溶液中にポリペプチド表面を有する繊
維構造体を５〜10分間浸漬したり、あるいはこの繊維構
造体にポリペプチド溶液を流通還流することによって実
施することができる。

本発明による架橋不溶化されたポリペプチド表面を有す
る繊維構造体は、動物細胞の増殖に適したものであり、
優れた、動物細胞の流通培養床として用いられる。この
場合、ポリペプチド表面を形成する被膜の厚さは特に制
限されず、繊維の表面がポリペプチドにより実質的に覆
われていればよい。本発明の流通培養床は、空隙率50％
以上、体積に対する表面積比が10〜300cm²/mlを有する
架橋不溶化されたポリペプチド表面を有する繊維構造体
からなる。

前記空隙率や表面積比が前記範囲より小さくなると、細
胞の高密度付着ができなくなり、効率の良い培養が達成
できなくなる。一方、前記範囲より大きくなると、繊維
構造体の強度が弱くなり、取扱い性の悪いものとなる。

〔効果〕

本発明の流通培養床は、架橋不溶化されたポリペプチド
表面を有する合成樹脂からなる繊維構造体からなるもの
である。そして、この繊維構造体は、取扱い操作も簡便
であり、製造コストも安価であるなどの利点を有してい
る。

〔実施例〕

次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例１酸及びアルカリで洗浄後水洗した表−１に示した不織布
を、リン酸２ナトリウムでpH7に調整した0.2％ペプシン
可溶化コラーゲン水溶液に20℃で１時間浸漬して、不織
布にコラーゲン表面を形成させた後、風乾させた。

次いで、20mmol/のリン酸２ナトリウムを加えた0.5％
グルタルアルデヒド水溶液に10分間浸漬してコラーゲン
表面を架橋不溶化させた後水洗し乾燥した。

以上の操作で得られた流通培養床は、構成する繊維の表
面が均一にコラーゲンで被覆されており、繊維が形成す
る空間の随所にコラーゲン被膜を持つものであることを
光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡で確認した。

実施例２直径2.7cm、長さ50cmのガラス製カラムに、直径2.7cmの
円盤状に切った表−１に示した不織布100枚層状に装填
ち、苛性ソーダでpH5に調整した0.05％ペプシン可溶化
コラーゲン水溶液500mlを20℃で200ml/minの流量で１時
間循環させ不織布の表面にコラーゲン表面を形成させた
後、空気で乾燥させた。

次いで0.2％ヘキサメチレンジイソシアネート・メタノ
ール溶液300mlを200ml/minの流量で10分間循環させ、コ
ラーゲン表面を架橋不溶化した後水洗した。

以上の操作で同時に大量の流通培養床を製作することが
できた。得られた流通培養床は構成する繊維の表面が均
一にコラーゲンで被覆されており、繊維が形成する空間
の随所にコラーゲン被膜を持っていた。

実施例３実施例１で示した繊維構造体の表面を洗浄し、苛性ソー
ダ処理した後、洗浄し、中性化し、次いで乾燥し、17〜
20℃に冷却した。一方、下記組成のゼラチン溶液を調整
し、温度35〜37℃とした。

ゼラチン： 12重量部グリセリン： 40重量部エチルアルコール： 150重量部水： 1000重量部前記冷却した繊維構造体を上記溶液に1.5〜２分間完全
に浸した後引き上げ、ゼラチン溶液を十分振り切った
後、25℃に保持して３〜４分で膜を固化させた後、十分
に乾燥した。

次に、このゼラチン被覆された繊維構造体を、実施例１
の場合と同様にして架橋不溶化処理した。

以上の操作により架橋不溶化されたゼラチン表面を有す
る繊維構造体からなる流通培養床を製作することができ
た。

実施例４実施例１で得られた流通培養床と、酸及びアルカリで洗
浄後水洗した表−１に示した不織布をそれぞれ4mm角に
切り、その80個づつを直径3.7cm、長さ4cmのガラス製カ
ラムに入れて流通培養カラムを作り、オートクレーブで
滅菌後牛胎児血清５％を含むHam−F12培地100mlを流し
コンディショニングした。

このカラムにフラスコで４日間前培養したチャイニズハ
ムスター卵巣細胞CHO−K1細胞２×10⁶個含む播種液50ml
を2.5ml/minの流量で１時間循環流通させ播種したとこ
ろ、培養床には2.1×10個⁵/cm³、不織布には2.3×10⁴個
/cm³の細胞が付着していた。

次いで牛胎児血清５％を含むHam−F12倍地500mlを2.5ml
/minの流量で循環流通させながら37℃で流通培養を行っ
たところ、５日間の培養で、培養床では1.2×10⁷個/c
m³、不織布では7.4×10⁵個/cm³の細胞が増殖していた。

この場合、培養操作をCO₂インキュベーター中で行い、
循環配管の一部をシリコンチューブとし、酸素をそのシ
リコンシューブを介して供給した。

以上の結果、コラーゲン表面を有する繊維構造体からな
る流通培養床の効率として播種細胞の付着率約10倍、細
胞の増殖速度約２倍が認められた。

実施例５実施例２で得られた培養床９枚を、直径2.7cm、長さ4cm
のガラス製カラムに層状に装填し、オートクレーブで滅
菌後牛胎児血清５％を含むHam−F12培地100mlを流しコ
ンディショニングした。

このカラムにフラスコで４日間前培養したチャイニズハ
ムスター卵巣細胞CHO−K1細胞１×10⁶個を含む播種液50
mlを2.5ml/minの流量で１時間循環流通させ播種した
後、牛胎児血清５％を含むHam−F12培地500mlを2.5ml/m
inの流量で循環流通させながら、実施例４と同様にCO₂
インキュベーター中でシリコンチュープを介して酸素を
供給しなから37℃で４日間流通培養し、培地を交換して
更に２日間流通培養した。

培養終了後、カラムに0.25％トリプシン溶液を流し増殖
した細胞を回収したところ、3.3×10⁸個の細胞が得られ
た。

以上の流通培養操作で細胞は約300倍に増殖し、その時
の細胞密度は培養床1cm³当り約1.6×10⁷個であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者安楽城恵一神奈川県横浜市緑区竹山３―１―８，3102 ―242 (72)発明者安藤登神奈川県藤沢市鵠沼桜が岡１―１―17 (56)参考文献特開昭61−195687（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】架橋不溶化されたポリペプチド表面を有す
る合成繊維構造体からなり、該繊維構造体は、太さ0.01
〜1mmの繊維の３次元的からみあいによって形成された
もので、その空隙率が50％以上及びその体積に対する表
面積比が10〜300cm²/mlであることを特徴とする動物細
胞の流通培養床。
【請求項２】太さ0.01〜1mmの繊維の３次元的からみあ
いによって形成されたもので、その空隙率が50％以上及
びその体積に対する表面積比が10〜300cm²/mlである合
成繊維構造体をポリペプチド溶液で表面処理する工程
と、ポリペプチド表面を架橋不溶化する工程からなる動
物細胞の流通培養床の製造方法。