JPH0622744A - 細胞培養用コラ−ゲン担体及びその製造方法 - Google Patents

細胞培養用コラ−ゲン担体及びその製造方法

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JPH0622744A JP4204239A JP20423992A JPH0622744A JP H0622744 A JPH0622744 A JP H0622744A JP 4204239 A JP4204239 A JP 4204239A JP 20423992 A JP20423992 A JP 20423992A JP H0622744 A JPH0622744 A JP H0622744A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】細胞培養に使用されるコラ−ゲン担体およびそ
の製造方法に関し、特に、高密度に培養できる細胞培養
用コラ−ゲン担体およびその製造方法に関する。 【構成】本発明は、50〜2000μmの範囲のコント
ロ−ルされた気泡径を有し、該気泡は一方の面より他方
の面に真直で連通し、且つ実質的に各気泡相互は独立的
に存在していることを特徴とする細胞培養用コラ−ゲン
担体である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞培養に使用される
コラ−ゲン担体およびその製造方法に関し、特に、高密
度に培養できる細胞培養用コラ−ゲン担体およびその製
造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】細胞培養、特に動物細胞を培養する方法
としては、担体に細胞を接着して培養する方法や培養液
に細胞を浮遊した状態で培養する方法等がある。このう
ち接着細胞の場合細胞を接着する担体としてはマイクロ
キャリア、中空糸膜、不織布などが知られている。
【0003】例えば特開平3−43076号公報には支
持体自身が重合性モノマ−を構成単位とする水不溶性高
分子から成るか、或いは支持体表面が該水不溶性高分子
によって被覆されて成り、且つ該高分子は正に荷電し得
る化学的残基及び負に荷電し得る化学的残基を含有して
成ることを特徴とする細胞培養担体について記載されて
いる。しかし、この培養担体は、細胞がその表面にのみ
接着可能であるため培養効率が悪かった。担体の培養効
率を上げるためスポンジ状の担体を使用することも知ら
れている。例えば特公昭62−502936号公報に
は、多孔質球状コラ−ゲン担体の1例として約1μmか
ら約150μmの範囲の平均細孔寸法を有するコラ−ゲ
ンよりなるミクロスポンジ担体が記載されている。しか
し、このミクロスポンジ担体の製造法は煩雑でミクロス
ポンジの生産効率が悪く多量生産に適さず且つその孔径
をコントロ−ルすることは困難であった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者は、
上述の従来方法における欠点を改良し、更に優れた増殖
性及び培養密度の高い細胞培養担体を得るべく種々検討
した結果、コラ−ゲン溶液をアンモニアガスによりその
コラ−ゲンの等電点付近に近づけるとコラ−ゲンのゲル
状繊維が一方の面より他方の面に並列状に形成され同時
にコラ−ゲンゲル中に水分は円柱状の水柱として分離
し、これを凍結乾燥することにより実質的に一方の面よ
り他方の面に真直で連通した気泡を有する非常にポ−ラ
スなコラ−ゲンスポンジを製造することが出来、このコ
ラ−ゲンスポンジが細胞培養用として極めて優れている
ことを見出し、本発明を完成したもので、本発明の目的
は高密度に培養できる細菌培養用コラ−ゲン担体および
その製造方法を提供するにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、50〜
2000μmの範囲のコントロ−ルされた気泡径を有
し、該気泡は一方の面より他方の面に真直で連通し、且
つ実質的に各気泡相互は独立的に存在していることを特
徴とする細胞培養用コラ−ゲン担体であり、その製造方
法として、コラ−ゲンの酸性溶液をアンモニアガスに曝
すことより、一方の面より他方の面に真直に配列したコ
ラ−ゲン線維を形成すると同時に一方の面より他方の面
に真直な水柱を生じさせたゲル状体とし、しかる後、凍
結乾燥によりゲル内部の水分を揮散させて50〜200
0μmの範囲のコントロ−ルされた気泡径を有し、該気
泡は一方の面より他方の面に真直で且つ実質的に各気泡
相互は独立的に存在していることを特徴とする細胞培養
用コラ−ゲン担体の製造方法である。
【0006】すなわち、本発明においては、孔径が50
〜2000μmの範囲にあるようにコントロ−ルされた
各気孔が実質的に独立され、一方の面から他方の面に連
通した細胞培養用コラ−ゲン担体であって、孔径50μ
m以下の場合には細胞が内部に入ることができず培養不
能であり、また、2000μm以上では担体としては大
きくなり過ぎ培養効率が悪く、壁が薄くなり強度が得ら
れないので好ましくない。
【0007】本発明の製造方法では、コラ−ゲン溶液を
アンモニアガスに曝してコラ−ゲンの等電点に近づけ
て、ゲル状にコラ−ゲン繊維が形成されるが、その際、
コラ−ゲン繊維は一方の面より他方の面に真直に配列
し、また、水分は離漿してコラ−ゲンゲル中に円柱状の
水柱として存し、これを凍結乾燥することにより一方の
面(表面層)より他方の面(裏面層)に真直で且つ実質
的に各気泡相互が独立的に存在する気泡を有するコラ−
ゲンスポンジが形成されるのである。そして、この製造
方法において、コラ−ゲン量とアンモニアガス濃度との
調節によって気泡径をコントロ−ルすることができ、コ
ラ−ゲンスポンジの孔径を変化することができる。以
下、本発明について更に詳細に説明する。
【0008】本発明で使用するコラ−ゲンとしては、酸
に可溶性で且つアンモニアガスによってコラ−ゲン線維
を形成するコラ−ゲンであれば何れでも良く、アテロコ
ラ−ゲン、酸可溶性コラ−ゲン等が好ましい。このコラ
−ゲンを酸性溶媒に溶解する。使用する酸性溶媒として
は塩酸、酢酸等の無機酸、有機酸の何れでもよく、また
その溶液のPhに特に制限はない。そして、コラ−ゲン
の濃度についても特に制限がないが0.1〜10%程度
が好ましい。
【0009】このコラ−ゲン酸性溶液にアンモニアガス
を曝すと、コラ−ゲンは真直に一方の面より他方の面に
向かって繊維状に析出し、白濁し、水分は水柱状として
離漿する。コラ−ゲン線維が一方の面より他方の面に向
って配列していることは、得られたゲル体を引張ること
によって裂けるような状態で切れることより容易に理解
することができる。この時アンモニアガスとしてはボン
ベよりコラ−ゲン溶液のある密閉容器内に導入するか或
いはコラ−ゲンのある密閉容器内に濃度を調節したアン
モニア水を置くことによって中和する。
【0010】以下実施例をもって本発明を具体的に説明
する。
【実施例】
実施例1 1.0%アテロコラ−ゲン(pH3.0)溶液を10×
20cmトレ−に300gずつ分注後、容量5lの密閉
容器に先のトレ−2枚を入れる。その容器の中に更に5
0ml容器に30mlの3.0%のアンモニア水を入れ
たものを入れ12時間室温で放置する。放置後流水にて
形成したゲルを1晩洗浄後凍結乾燥を行うことによりポ
アサイズ300〜500μmのスポンジを得ることが出
来る。これを数mm角にカットし滅菌後CHO細胞の培
養を行ったところ5日後に図1に示すようにポアの内部
にまで細胞は均一に接着増殖していた。
【0011】実施例2 実施例1のアンモニア中和の際、各トレ−にコラ−ゲン
溶液を500g分注し、他の条件を同様に中和、洗浄、
凍結乾燥することによりポアサイズ800〜1000μ
mのスポンジを得ることが出来る。 実施例3 実施例1のアンモニア中和の際、各トレ−にコラ−ゲン
溶液を150g分注し、他の条件を同様に中和、洗浄、
凍結乾燥することによりポアサイズ100〜400μm
のスポンジを得ることが出来る。
【0012】
【発明の効果】以上述べたように、本発明では、気泡径
がアンモニアガスの濃度によってコントロ−ルできるの
で培養すべき細胞に最適な気泡径を有するコラ−ゲン担
体を得ることができると共にその表面積を増大できるの
で高密度に培養できる細胞培養用コラ−ゲン担体を提供
することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施例1で得られたコラ−ゲン担体に
CHO細胞を接着、5日後の状態を示す写真である。写
真中の白線は100μmである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成4年11月5日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0009
【補正方法】変更
【補正内容】
【0009】このコラーゲン酸性溶液にアンモニアガス
を曝すと、コラーゲンは真直に一方の面より他方の面に
向かって繊維状に析出し、白濁し、水分は水柱状として
離漿する。コラーゲン線維が一方の面より他方の面に向
って配列していることは、得られたゲル体を引張ること
によって裂けるような状態で切れることより容易に理解
することができる。この時アンモニアガスとしてはボン
ベよりコラーゲン溶液のある密閉容器内に導入するか或
いはコラーゲンのある密閉容器内に濃度を調節したアン
モニア水を置くことによって中和する。中和後凍結乾燥
を行いスポンジを作製する。得られたスポンジは、用途
に合わせ切断等により希望する形に成型することが出来
る。例えばさいころの様なキューブ状、ブロック状、板
状その板状物を重ねた積層状、板状物を巻いたもの或は
紐状等に成型し利用することができる。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0010
【補正方法】変更
【補正内容】
【0010】以下実施例をもって本発明を具体的に説明
する。
【実施例】 実施例1 1.0%アテロコラーゲン(pH3.0)溶液を10×
20cmトレーに300gずつ分注後、容量5lの密閉
容器に先のトレー2枚を入れる。その容器の中に更に5
0ml容器に30mlの3.0%のアンモニア水を入れ
たものを入れ12時間室温で放置する。放置後流水にて
形成したゲルを1晩洗浄後凍結乾燥を行うことによりポ
アサイズ300〜500μmのスポンジを得ることが出
来る。これを数mm角にカットし滅菌後CHO細胞の培
養を行ったところ5日後に図1に示すようにポアの内部
にまで細胞は均一に接着増殖していた。また、この実施
例で得られたコラーゲン担体にBHK細胞を接着7日後
の状態を図2として示す。同様にこの実施例で得られた
コラーゲン担体にヒト皮膚線維芽細胞を接着10日後の
状態を図3として、また、このコラーゲン担体にウシ血
管内皮細胞を接着5日後の状態を図4としてそれぞれ示
す。これら写真中の白線は100μmを表わす。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施例1で得られたコラーゲン担体に
CHO細胞を接着、5日後の状態を示す写真である。写
真中の白線は100μmである。
【図2】本発明の実施例1で得られたコラーゲン担体に
BHK細胞を接着、7日後の状態を示す写真である。写
真中の白線は100μmである。
【図3】本発明の実施例1で得られたコラーゲン担体に
ヒト皮膚線維芽細胞を接着、10日後の状態を示す写真
である。写真中の白線は100μmである。
【図4】本発明の実施例1で得られたコラーゲン担体に
ウシ血管内皮細胞を接着、5日後の状態を示す写真であ
る。写真中の白線は100μmである。
【手続補正4】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図2
【補正方法】追加
【補正内容】
【図2】
【手続補正5】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図3
【補正方法】追加
【補正内容】
【図3】
【手続補正6】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図4
【補正方法】追加
【補正内容】
【図4】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 11/02 (72)発明者 伊藤 博 東京都目黒区中根2−11−21 株式会社高 研研究所内

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 50〜2000μmの範囲のコントロ−
    ルされた気泡径を有し、該気泡は一方の面より他方の面
    に真直で連通し、且つ実質的に各気泡相互は独立的に存
    在していることを特徴とする細胞培養用コラ−ゲン担
    体。
  2. 【請求項2】 コラ−ゲンの酸性溶液をアンモニアガス
    に曝すことより、一方の面より他方の面に真直に配列し
    たコラ−ゲン線維を形成すると同時に一方の面より他方
    の面に真直な水柱を生じさせたゲル状体とし、しかる
    後、凍結乾燥によりゲル内部の水分を揮散させて50〜
    2000μmの範囲のコントロ−ルされた気泡径を有
    し、該気泡は一方の面より他方の面に真直で且つ実質的
    に各気泡相互は独立的に存在していることを特徴とする
    細胞培養用コラ−ゲン担体の製造方法。
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