JP3170693B2 - 細胞培養用コラ−ゲン担体及びその製造方法 - Google Patents
細胞培養用コラ−ゲン担体及びその製造方法Info
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- JP3170693B2 JP3170693B2 JP20423992A JP20423992A JP3170693B2 JP 3170693 B2 JP3170693 B2 JP 3170693B2 JP 20423992 A JP20423992 A JP 20423992A JP 20423992 A JP20423992 A JP 20423992A JP 3170693 B2 JP3170693 B2 JP 3170693B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/14—Scaffolds; Matrices
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞培養に使用される
コラ−ゲン担体およびその製造方法に関し、特に、高密
度に培養できる細胞培養用コラ−ゲン担体およびその製
造方法に関する。
コラ−ゲン担体およびその製造方法に関し、特に、高密
度に培養できる細胞培養用コラ−ゲン担体およびその製
造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞培養、特に動物細胞を培養する方法
としては、担体に細胞を接着して培養する方法や培養液
に細胞を浮遊した状態で培養する方法等がある。このう
ち接着細胞の場合細胞を接着する担体としてはマイクロ
キャリア、中空糸膜、不織布などが知られている。
としては、担体に細胞を接着して培養する方法や培養液
に細胞を浮遊した状態で培養する方法等がある。このう
ち接着細胞の場合細胞を接着する担体としてはマイクロ
キャリア、中空糸膜、不織布などが知られている。
【０００３】例えば特開平３−４３０７６号公報には支
持体自身が重合性モノマ−を構成単位とする水不溶性高
分子から成るか、或いは支持体表面が該水不溶性高分子
によって被覆されて成り、且つ該高分子は正に荷電し得
る化学的残基及び負に荷電し得る化学的残基を含有して
成ることを特徴とする細胞培養担体について記載されて
いる。しかし、この培養担体は、細胞がその表面にのみ
接着可能であるため培養効率が悪かった。担体の培養効
率を上げるためスポンジ状の担体を使用することも知ら
れている。例えば特公昭６２−５０２９３６号公報に
は、多孔質球状コラ−ゲン担体の１例として約１μｍか
ら約１５０μｍの範囲の平均細孔寸法を有するコラ−ゲ
ンよりなるミクロスポンジ担体が記載されている。しか
し、このミクロスポンジ担体の製造法は煩雑でミクロス
ポンジの生産効率が悪く多量生産に適さず且つその孔径
をコントロ−ルすることは困難であった。
持体自身が重合性モノマ−を構成単位とする水不溶性高
分子から成るか、或いは支持体表面が該水不溶性高分子
によって被覆されて成り、且つ該高分子は正に荷電し得
る化学的残基及び負に荷電し得る化学的残基を含有して
成ることを特徴とする細胞培養担体について記載されて
いる。しかし、この培養担体は、細胞がその表面にのみ
接着可能であるため培養効率が悪かった。担体の培養効
率を上げるためスポンジ状の担体を使用することも知ら
れている。例えば特公昭６２−５０２９３６号公報に
は、多孔質球状コラ−ゲン担体の１例として約１μｍか
ら約１５０μｍの範囲の平均細孔寸法を有するコラ−ゲ
ンよりなるミクロスポンジ担体が記載されている。しか
し、このミクロスポンジ担体の製造法は煩雑でミクロス
ポンジの生産効率が悪く多量生産に適さず且つその孔径
をコントロ−ルすることは困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者は、
上述の従来方法における欠点を改良し、更に優れた増殖
性及び培養密度の高い細胞培養担体を得るべく種々検討
した結果、コラ−ゲン溶液をアンモニアガスによりその
コラ−ゲンの等電点付近に近づけるとコラ−ゲンのゲル
状繊維が一方の面より他方の面に並列状に形成され同時
にコラ−ゲンゲル中に水分は円柱状の水柱として分離
し、これを凍結乾燥することにより実質的に一方の面よ
り他方の面に真直で連通した気泡を有する非常にポ−ラ
スなコラ−ゲンスポンジを製造することが出来、このコ
ラ−ゲンスポンジが細胞培養用として極めて優れている
ことを見出し、本発明を完成したもので、本発明の目的
は高密度に培養できる細菌培養用コラ−ゲン担体および
その製造方法を提供するにある。
上述の従来方法における欠点を改良し、更に優れた増殖
性及び培養密度の高い細胞培養担体を得るべく種々検討
した結果、コラ−ゲン溶液をアンモニアガスによりその
コラ−ゲンの等電点付近に近づけるとコラ−ゲンのゲル
状繊維が一方の面より他方の面に並列状に形成され同時
にコラ−ゲンゲル中に水分は円柱状の水柱として分離
し、これを凍結乾燥することにより実質的に一方の面よ
り他方の面に真直で連通した気泡を有する非常にポ−ラ
スなコラ−ゲンスポンジを製造することが出来、このコ
ラ−ゲンスポンジが細胞培養用として極めて優れている
ことを見出し、本発明を完成したもので、本発明の目的
は高密度に培養できる細菌培養用コラ−ゲン担体および
その製造方法を提供するにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、多数の
気泡を有するスポンジ状の細胞培養用コラ−ゲン担体で
あって、該気泡は５０〜２０００μｍの範囲のコントロ
−ルされた気泡径を有し、且つ、該気泡は一方の面より
他方の面に真直で連通し、且つ実質的に各気泡相互は独
立的に存在していることを特徴とするスポンジ状の細胞
培養用コラ−ゲン担体であり、その製造方法は、コラ−
ゲンの酸性溶液をアンモニアガスに曝すことより、一方
の面より他方の面に真直に配列したコラ−ゲン線維を形
成すると同時に一方の面より他方の面に真直な水柱を生
じさせたゲル状体とし、しかる後、凍結乾燥によりゲル
内部の水分を揮散させて５０〜２０００μｍの範囲のコ
ントロールされた気泡径を有し、該気泡は一方の面より
他方のの面に真直でかつ実質的に核気泡相互は独立的に
存在していることを特徴とするスポンジ状の細胞培養用
コラーゲン担体の製造方法である。
気泡を有するスポンジ状の細胞培養用コラ−ゲン担体で
あって、該気泡は５０〜２０００μｍの範囲のコントロ
−ルされた気泡径を有し、且つ、該気泡は一方の面より
他方の面に真直で連通し、且つ実質的に各気泡相互は独
立的に存在していることを特徴とするスポンジ状の細胞
培養用コラ−ゲン担体であり、その製造方法は、コラ−
ゲンの酸性溶液をアンモニアガスに曝すことより、一方
の面より他方の面に真直に配列したコラ−ゲン線維を形
成すると同時に一方の面より他方の面に真直な水柱を生
じさせたゲル状体とし、しかる後、凍結乾燥によりゲル
内部の水分を揮散させて５０〜２０００μｍの範囲のコ
ントロールされた気泡径を有し、該気泡は一方の面より
他方のの面に真直でかつ実質的に核気泡相互は独立的に
存在していることを特徴とするスポンジ状の細胞培養用
コラーゲン担体の製造方法である。
【０００６】すなわち、本発明においては、孔径が５０
〜２０００μｍの範囲にあるようにコントロ−ルされた
各気孔が実質的に独立され、一方の面から他方の面に連
通した細胞培養用コラ−ゲン担体であって、孔径５０μ
ｍ以下の場合には細胞が内部に入ることができず培養不
能であり、また、２０００μｍ以上では担体としては大
きくなり過ぎ培養効率が悪く、壁が薄くなり強度が得ら
れないので好ましくない。
〜２０００μｍの範囲にあるようにコントロ−ルされた
各気孔が実質的に独立され、一方の面から他方の面に連
通した細胞培養用コラ−ゲン担体であって、孔径５０μ
ｍ以下の場合には細胞が内部に入ることができず培養不
能であり、また、２０００μｍ以上では担体としては大
きくなり過ぎ培養効率が悪く、壁が薄くなり強度が得ら
れないので好ましくない。
【０００７】本発明の製造方法では、コラ−ゲン溶液を
アンモニアガスに曝してコラ−ゲンの等電点に近づけ
て、ゲル状にコラ−ゲン繊維が形成されるが、その際、
コラ−ゲン繊維は一方の面より他方の面に真直に配列
し、また、水分は離漿してコラ−ゲンゲル中に円柱状の
水柱として存し、これを凍結乾燥することにより一方の
面（表面層）より他方の面（裏面層）に真直で且つ実質
的に各気泡相互が独立的に存在する気泡を有するコラ−
ゲンスポンジが形成されるのである。そして、この製造
方法において、コラ−ゲン量とアンモニアガス濃度との
調節によって気泡径をコントロ−ルすることができ、コ
ラ−ゲンスポンジの孔径を変化することができる。以
下、本発明について更に詳細に説明する。
アンモニアガスに曝してコラ−ゲンの等電点に近づけ
て、ゲル状にコラ−ゲン繊維が形成されるが、その際、
コラ−ゲン繊維は一方の面より他方の面に真直に配列
し、また、水分は離漿してコラ−ゲンゲル中に円柱状の
水柱として存し、これを凍結乾燥することにより一方の
面（表面層）より他方の面（裏面層）に真直で且つ実質
的に各気泡相互が独立的に存在する気泡を有するコラ−
ゲンスポンジが形成されるのである。そして、この製造
方法において、コラ−ゲン量とアンモニアガス濃度との
調節によって気泡径をコントロ−ルすることができ、コ
ラ−ゲンスポンジの孔径を変化することができる。以
下、本発明について更に詳細に説明する。
【０００８】本発明で使用するコラ−ゲンとしては、酸
に可溶性で且つアンモニアガスによってコラ−ゲン線維
を形成するコラ−ゲンであれば何れでも良く、アテロコ
ラ−ゲン、酸可溶性コラ−ゲン等が好ましい。このコラ
−ゲンを酸性溶媒に溶解する。使用する酸性溶媒として
は塩酸、酢酸等の無機酸、有機酸の何れでもよく、また
その溶液のＰｈに特に制限はない。そして、コラ−ゲン
の濃度についても特に制限がないが０．１〜１０％程度
が好ましい。
に可溶性で且つアンモニアガスによってコラ−ゲン線維
を形成するコラ−ゲンであれば何れでも良く、アテロコ
ラ−ゲン、酸可溶性コラ−ゲン等が好ましい。このコラ
−ゲンを酸性溶媒に溶解する。使用する酸性溶媒として
は塩酸、酢酸等の無機酸、有機酸の何れでもよく、また
その溶液のＰｈに特に制限はない。そして、コラ−ゲン
の濃度についても特に制限がないが０．１〜１０％程度
が好ましい。
【０００９】このコラーゲン酸性溶液にアンモニアガス
を曝すと、コラーゲンは真直に一方の面より他方の面に
向かって繊維状に析出し、白濁し、水分は水柱状として
離漿する。コラーゲン線維が一方の面より他方の面に向
って配列していることは、得られたゲル体を引張ること
によって裂けるような状態で切れることより容易に理解
することができる。この時アンモニアガスとしてはボン
ベよりコラーゲン溶液のある密閉容器内に導入するか或
いはコラーゲンのある密閉容器内に濃度を調節したアン
モニア水を置くことによって中和する。中和後凍結乾燥
を行いスポンジを作製する。得られたスポンジは、用途
に合わせ切断等により希望する形に成型することが出来
る。例えばさいころの様なキューブ状、ブロック状、板
状その板状物を重ねた積層状、板状物を巻いたもの或は
紐状等に成型し利用することができる。
を曝すと、コラーゲンは真直に一方の面より他方の面に
向かって繊維状に析出し、白濁し、水分は水柱状として
離漿する。コラーゲン線維が一方の面より他方の面に向
って配列していることは、得られたゲル体を引張ること
によって裂けるような状態で切れることより容易に理解
することができる。この時アンモニアガスとしてはボン
ベよりコラーゲン溶液のある密閉容器内に導入するか或
いはコラーゲンのある密閉容器内に濃度を調節したアン
モニア水を置くことによって中和する。中和後凍結乾燥
を行いスポンジを作製する。得られたスポンジは、用途
に合わせ切断等により希望する形に成型することが出来
る。例えばさいころの様なキューブ状、ブロック状、板
状その板状物を重ねた積層状、板状物を巻いたもの或は
紐状等に成型し利用することができる。
【００１０】以下実施例をもって本発明を具体的に説明
する。
する。
【実施例】実施例１ １．０％アテロコラーゲン（ｐＨ３．０）溶液を１０×
２０ｃｍトレーに３００ｇずつ分注後、容量５ｌの密閉
容器に先のトレー２枚を入れる。その容器の中に更に５
０ｍｌ容器に３０ｍｌの３．０％のアンモニア水を入れ
たものを入れ１２時間室温で放置する。放置後流水にて
形成したゲルを１晩洗浄後凍結乾燥を行うことによりポ
アサイズ３００〜５００μｍのスポンジを得ることが出
来る。これを数ｍｍ角にカットし滅菌後ＣＨＯ細胞の培
養を行ったところ５日後に図１に示すようにポアの内部
にまで細胞は均一に接着増殖していた。また、この実施
例で得られたコラーゲン担体にＢＨＫ細胞を接着７日後
の状態を図２として示す。同様にこの実施例で得られた
コラーゲン担体にヒト皮膚線維芽細胞を接着１０日後の
状態を図３として、また、このコラーゲン担体にウシ血
管内皮細胞を接着５日後の状態を図４としてそれぞれ示
す。 これら写真中の白線は１００μｍを表わす。
２０ｃｍトレーに３００ｇずつ分注後、容量５ｌの密閉
容器に先のトレー２枚を入れる。その容器の中に更に５
０ｍｌ容器に３０ｍｌの３．０％のアンモニア水を入れ
たものを入れ１２時間室温で放置する。放置後流水にて
形成したゲルを１晩洗浄後凍結乾燥を行うことによりポ
アサイズ３００〜５００μｍのスポンジを得ることが出
来る。これを数ｍｍ角にカットし滅菌後ＣＨＯ細胞の培
養を行ったところ５日後に図１に示すようにポアの内部
にまで細胞は均一に接着増殖していた。また、この実施
例で得られたコラーゲン担体にＢＨＫ細胞を接着７日後
の状態を図２として示す。同様にこの実施例で得られた
コラーゲン担体にヒト皮膚線維芽細胞を接着１０日後の
状態を図３として、また、このコラーゲン担体にウシ血
管内皮細胞を接着５日後の状態を図４としてそれぞれ示
す。 これら写真中の白線は１００μｍを表わす。
【００１１】実施例２ 実施例１のアンモニア中和の際、各トレ−にコラ−ゲン
溶液を５００ｇ分注し、他の条件を同様に中和、洗浄、
凍結乾燥することによりポアサイズ８００〜１０００μ
ｍのスポンジを得ることが出来る。 実施例３ 実施例１のアンモニア中和の際、各トレ−にコラ−ゲン
溶液を１５０ｇ分注し、他の条件を同様に中和、洗浄、
凍結乾燥することによりポアサイズ１００〜４００μｍ
のスポンジを得ることが出来る。
溶液を５００ｇ分注し、他の条件を同様に中和、洗浄、
凍結乾燥することによりポアサイズ８００〜１０００μ
ｍのスポンジを得ることが出来る。 実施例３ 実施例１のアンモニア中和の際、各トレ−にコラ−ゲン
溶液を１５０ｇ分注し、他の条件を同様に中和、洗浄、
凍結乾燥することによりポアサイズ１００〜４００μｍ
のスポンジを得ることが出来る。
【００１２】
【発明の効果】以上述べたように、本発明では、気泡径
がアンモニアガスの濃度によってコントロ−ルできるの
で培養すべき細胞に最適な気泡径を有するコラ−ゲン担
体を得ることができると共にその表面積を増大できるの
で高密度に培養できる細胞培養用コラ−ゲン担体を提供
することが出来る。
がアンモニアガスの濃度によってコントロ−ルできるの
で培養すべき細胞に最適な気泡径を有するコラ−ゲン担
体を得ることができると共にその表面積を増大できるの
で高密度に培養できる細胞培養用コラ−ゲン担体を提供
することが出来る。
【図１】本発明の実施例１で得られたコラーゲン担体に
ＣＨＯ細胞を接着、５日後の状態を示す写真である。写
真中の白線は１００μｍである。
ＣＨＯ細胞を接着、５日後の状態を示す写真である。写
真中の白線は１００μｍである。
【図２】
本発明の実施例１で得られたコラーゲン担体に
ＢＨＫ細胞を接着、７日後の状態を示す写真である。写
真中の白線は１００μｍである。
ＢＨＫ細胞を接着、７日後の状態を示す写真である。写
真中の白線は１００μｍである。
【図３】
本発明の実施例１で得られたコラーゲン担体に
ヒト皮膚線維芽細胞を接着、１０日後の状態を示す写真
である。写真中の白線は１００μｍである。
ヒト皮膚線維芽細胞を接着、１０日後の状態を示す写真
である。写真中の白線は１００μｍである。
【図４】
本発明の実施例１で得られたコラーゲン担体に
ウシ血管内皮細胞を接着、５日後の状態を示す写真であ
る。写真中の白線は１００μｍである。
ウシ血管内皮細胞を接着、５日後の状態を示す写真であ
る。写真中の白線は１００μｍである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 伊藤 博 東京都目黒区中根２−11−21 株式会社 高研研究所内 (56)参考文献 特開 昭64−20082（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−60586（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−102795（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−502936（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 1/00 C12N 5/00 C12M 3/00 C12N 11/02
Claims (2)
- 【請求項１】多数の気泡を有するスポンジ状の細胞培養
用コラ−ゲン担体であって、該気泡は５０〜２０００μ
ｍの範囲のコントロ−ルされた気泡径を有し、且つ、該
気泡は一方の面より他方の面に真直で連通し、且つ実質
的に各気泡相互は独立的に存在していることを特徴とす
るスポンジ状の細胞培養用コラ−ゲン担体。 - 【請求項２】コラ−ゲンの酸性溶液をアンモニアガスに
曝すことより、一方の面より他方の面に真直に配列した
コラ−ゲン線維を形成すると同時に一方の面より他方の
面に真直な水柱を生じさせたゲル状体とし、しかる後、
凍結乾燥によりゲル内部の水分を揮散させて５０〜２０
００μｍの範囲のコントロールされた気泡径を有し、該
気泡は一方の面より他方のの面に真直でかつ実質的に核
気泡相互は独立的に存在していることを特徴とするスポ
ンジ状の細胞培養用コラーゲン担体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20423992A JP3170693B2 (ja) | 1992-07-09 | 1992-07-09 | 細胞培養用コラ−ゲン担体及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20423992A JP3170693B2 (ja) | 1992-07-09 | 1992-07-09 | 細胞培養用コラ−ゲン担体及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622744A JPH0622744A (ja) | 1994-02-01 |
| JP3170693B2 true JP3170693B2 (ja) | 2001-05-28 |
Family
ID=16487157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20423992A Expired - Lifetime JP3170693B2 (ja) | 1992-07-09 | 1992-07-09 | 細胞培養用コラ−ゲン担体及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3170693B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007020713A1 (ja) | 2005-08-18 | 2007-02-22 | Koken Co., Ltd. | 生体内に埋設可能な細胞培養担体 |
| WO2009005596A1 (en) | 2007-07-03 | 2009-01-08 | Histogenic Corp. | Double-structured tissue implant and a method for preparation and use thereof |
| US8070827B2 (en) | 2007-07-03 | 2011-12-06 | Histogenics Corporation | Method for use of a double-structured tissue implant for treatment of tissue defects |
| US8921109B2 (en) | 2005-09-19 | 2014-12-30 | Histogenics Corporation | Cell-support matrix having narrowly defined uniformly vertically and non-randomly organized porosity and pore density and a method for preparation thereof |
| US9993326B2 (en) | 2007-07-03 | 2018-06-12 | Histogenics Corporation | Method for use of a double-structured tissue implant for treatment of tissue defects |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1370194B1 (en) | 2001-03-23 | 2013-01-23 | Histogenics Corporation | Composition and methods fro the production of biological tissues and tissue constructs |
| US20040151705A1 (en) | 2002-03-22 | 2004-08-05 | Shuichi Mizuno | Neo-cartilage constructs and a method for preparation thereof |
| JP2003219865A (ja) * | 2002-01-29 | 2003-08-05 | Japan Tissue Engineering:Kk | スフェロイドの作製方法、スフェロイド及びスフェロイド含有組成物 |
| FR2881434B1 (fr) * | 2005-02-02 | 2007-05-11 | Coletica Sa | Dispositif de support de culture de cellules |
| WO2009026392A1 (en) | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Histogenics Corporation | A method for improvement of differentiation of mesenchymal stem cells using a double-structured tissue implant |
| JP6429490B2 (ja) * | 2014-05-12 | 2018-11-28 | 多木化学株式会社 | コラーゲン線維架橋多孔体 |
| JP6432967B2 (ja) * | 2014-05-12 | 2018-12-05 | 多木化学株式会社 | 溶解性コラーゲン線維多孔体 |
| US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
| JP6856969B2 (ja) * | 2015-11-05 | 2021-04-14 | 多木化学株式会社 | 線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法 |
-
1992
- 1992-07-09 JP JP20423992A patent/JP3170693B2/ja not_active Expired - Lifetime
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0622744A (ja) | 1994-02-01 |
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