JP6856969B2 - 線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法 - Google Patents
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Description
(a) 可溶化コラーゲン溶液にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を添加してコラーゲンを線維化させた後、凍結乾燥する方法。
(b) 可溶化コラーゲン溶液にPBSを添加してコラーゲンを線維化させた後、線維化コラーゲンをエタノールシリーズ(エタノール濃度を段階的に高めたエタノールと水との混合液。エタノール濃度:50%、70%、90%、100%)で脱水・脱塩し、次に溶媒をt-ブタノールに置換し、凍結させた後、凍結乾燥する方法。
(c) 可溶化コラーゲン溶液を凍結乾燥した後、PBSでコラーゲンを線維化させる方法。
[1]架橋されているコラーゲン成形体であって、当該成形体は三次元の細胞培養が可能な多孔質構造を有し、当該成形体の外形は線状体の構造を有することを特徴とする線状コラーゲン架橋多孔体。
[2]前記線状コラーゲン架橋多孔体の走査型電子顕微鏡像における、最表面に観察される孔の数が少なくとも30個である一定区画内において、当該孔の最大個数がnであるときに、
平均孔径={Σ(孔iの最大幅+孔iの最小幅)/2}/n(但し、i=1〜n)
の数式によって算出される平均孔径が、50〜300μmの範囲である上記[1]記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
[3]前記線状体の構造が、糸状、紐状、棒状、リボン状、コイル状及びスパイラル状からなる形状のうちのいずれか1種又はこれら形状の2種以上が組み合わされた複合形状である上記[1]又は[2]記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
[4]前記線状コラーゲン架橋多孔体を構成するコラーゲンが、線維化コラーゲンである上記[1]〜[3]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
[5]前記多孔質構造の少なくとも一部において、D周期性の横縞が観察されることによって、線維化コラーゲンの存在が確認されるものである上記[4]記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
[6]培養細胞が保持された上記[1]〜[5]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
[7]上記[1]〜[5]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を用いて作製された、組紐、織布、不織布、編物又は綿状物の構造を有する複次元コラーゲン架橋多孔体。
[8]培養細胞が保持された上記[7]記載の複次元コラーゲン架橋多孔体。
[9]上記[8]記載の複次元コラーゲン架橋多孔体であって、1本の線状コラーゲン架橋多孔体には1種類の培養細胞が保持され、且つ複次元コラーゲン架橋多孔体中の培養細胞の種類が2種類以上である、複次元コラーゲン架橋多孔体。
[10]可溶化コラーゲン溶液を線状体に成形する第一工程、凍結乾燥する第二工程、架橋処理する第三工程を含むことを特徴とする、上記[1]〜[5]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
[11]前記第一工程が、可溶化コラーゲン溶液とアルカリ金属重炭酸塩とを混合することによって生成する線維化コラーゲンゲルを線状体に成形する工程である上記[10]記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
[12]アルカリ金属重炭酸塩の適用量が、コラーゲンの分子量を30万としたときに、アルカリ金属重炭酸塩/可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲン(モル比)=3×102〜3×104の範囲である上記[11]記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
[13]前記第三工程の架橋処理が、下記(1)及び(2)のうちいずれか一方又は双方である、上記[10]〜[12]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
(1)γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、UV照射又は熱脱水によって物理的架橋する処理。
(2)水溶性化学架橋剤又は気化能を有する化学架橋剤によって化学的架橋する処理。
[14]上記[1]〜[5]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を細胞培養基材として用いる細胞培養方法であって、乾燥または脱水状態の当該多孔体に、細胞懸濁液を吸収させることによって、細胞を当該多孔体内で三次元的に分布させることを特徴とする細胞培養方法。
[15]上記[1]〜[5]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を渦巻状に巻回させたものを細胞培養基材として用いる細胞培養方法。
[16]上記[7]記載の複次元コラーゲン架橋多孔体を細胞培養基材として用いる細胞培養方法であって、乾燥または脱水状態の当該多孔体に、細胞懸濁液を吸収させることによって、細胞を当該多孔体内で三次元的に分布させることを特徴とする細胞培養方法。
[17]上記[1]〜[5]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を用いた細胞培養用材料。
[18]上記[1]〜[6]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を用いた医用材料。
[19]上記[7]記載の複次元コラーゲン架橋多孔体を用いた細胞培養用材料。
[20]上記[7]〜[9]のいずれか1項記載の複次元コラーゲン架橋多孔体を用いた医用材料。
以下、本発明の線状コラーゲン架橋多孔体(以下「線状多孔体」という)について詳細に説明する。
複次元コラーゲン架橋多孔体(以下「複次元多孔体」という)は、複数本の線状多孔体を用いて2次元的、3次元的に作製されたものであり、具体例として、組紐、織布、不織布、編物又は綿状物の構造を有するものが挙げられる。線状多孔体から複次元多孔体を作製する方法は、公知の方法を用いればよい。
線状多孔体及び複次元多孔体の用途として、例えば、細胞培養用材料、医用材料等を挙げることができる。各用途においては、線状多孔体又は複次元多孔体をそのまま当該用途用材料とする態様の他に、線状多孔体又は複次元多孔体を当該用途用材料を構成する一要素として用いる態様も含まれる。特に医用材料においては、線状多孔体又は複次元多孔体に培養細胞が保持された形態も含まれる。
再生医療用材料と移植用材料は、細胞を保持した材料が含まれることで共通しているが、その他材料として、前者には再生医療用の足場材料等が含まれ、後者には細胞を保持しない材料が含まれる。
細胞保存用材料は、輸送や凍結保存等の際に細胞を保護するための材料であり、細胞培養用の培養細胞と治療のために用いる細胞の両方において用いることができるものである。
組織の補填用材料は、欠損、陥没、穴隙等の患部に埋め込むための材料である。骨補填剤が一例である。
組織の補強用材料は、患部組織への貼付等による接触によって機能回復を図るための材料である。例えば、特定細胞を保持した平面状材料が挙げられ、当該材料を対象臓器(例えば、心臓等)に貼付することによって、当該臓器の機能回復を図る用例が挙げられる。
線状多孔体の製造方法の一例は、可溶化コラーゲン溶液を線状体に成形する第一工程、凍結乾燥する第二工程、架橋処理する第三工程を含むものである。
可溶化コラーゲン溶液として、ティラピアの鱗から製造された多木化学(株)製「セルキャンパス FD-08G」スポンジ品をpH3のHCl溶液に溶解し、コラーゲン濃度を1.1%に調製した無色透明溶液(以下、「コラーゲン溶液A」という)を用いた。
コラーゲン溶液A 9容量部に対し、0.5M重炭酸ナトリウム水溶液 1容量部を混合した。このとき、重炭酸ナトリウム/コラーゲン溶液A中のコラーゲン(モル比)=1.5×103であった。得られた線維化コラーゲンゲルを内径4mm、長さ100mmのプラスチック製チューブに充填した後、-35℃・3時間で凍結乾燥した。これをチューブ内から引き出して、線維化コラーゲンで構成されたコラーゲン多孔体(以下、「凍結乾燥多孔体1」という)を得た。尚、凍結乾燥多孔体1は複数本作製し、以下の実施例にも供試した。
内径4mm、長さ200mmのプラスチック製チューブを用いた以外は、実施例1と同様の方法で線状多孔体を得た。
凍結乾燥多孔体1を、減圧条件下で110℃・10時間で熱脱水架橋することによって、線状多孔体を得た。
凍結乾燥多孔体1を、10%グルタルアルデヒド溶液20mlを入れた5Lのデシケータ(密閉容器)に入れ、室温、8時間保持してグルタルアルデヒド蒸気に暴露した。これを3%グリシン水溶液で洗浄することによって、線状多孔体を得た。
生理食塩水にWSC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, hydrochloride)を60mMになるように溶解した。これに凍結乾燥多孔体1を30℃で5時間浸漬した。これを3%グリシン水溶液で洗浄することによって、線状多孔体を得た。
PBS中に浸漬した状態で25kGyのγ線照射を行った以外は、実施例1と同様の方法で線状多孔体を得た。
コラーゲン溶液A 9容量部と10倍濃い濃度に作製したPBS 1容量部とを混合し、得られた線維化コラーゲンゲルを内径4mm、長さ100mmのプラスチック製チューブに充填した後、-35℃・3時間で凍結乾燥して、多孔体を得た。
(細胞培養基材の調製)
実施例1の線状多孔体を、細胞培養に使用する培地が入った容器に入れて、培地に浸漬した。さらにもう1回、別の容器で培地に浸漬した。この線状多孔体を12ウェルプレートのウェルに設置したセルカルチャーインサート内に、できるだけ隙間が少なくなるように渦巻状に入れた。
培地は、まずセルカルチャーインサートの外側に入れ、続いてセルカルチャーインサート内にも入れた。これを以下のマウス由来のES-D3細胞、Balb/c 3T3細胞(以下「3T3細胞」と略す)、及びHUVECの各培養試験に用いた。
渦巻き状に入れた線状多孔体の上に、予め培養しておいたマウス由来のES-D3細胞の胚様体を1〜2個播種した。培地は、Non-Essential Amino Acid(NAA)、β-Mercaptoethanol、L-Glutamineを添加したDMEMに、予め非動化した血清を容積比20%添加したものを使用した。37℃、5% CO2環境下で、一般的な手順に従って培養したところ、1週間後には脈動が確認され、心筋への分化が認められた。継続培養したところ、30日後でも細胞が生存しており、ピンセットで引き上げることが可能な力学強度を持って線状多孔体の形態を維持していた。図8は、ピペットで吸引して引き上げたときの写真である。
更に、培養後の線状多孔体を複数本用いて組合せ、立体的な構造体を作製することが出来た(図9)。
3T3細胞株は、培地として予め非動化した血清を容積比10%添加したDMEMを用いて培養した。増殖した細胞を回収し、細胞密度が1.0×107cells/mLになるように細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を渦巻き状に入れた線状多孔体の上に滴下した。培地を添加し、37℃、5% CO2環境下で、一般的な手順に従って培養した。1週間後に観察したところ、線状多孔体内で細胞の増殖及び生存が確認された(図10)。尚、図10はギムザ染色したものである。また、ピンセットで引き上げることが可能な水準で線状多孔体の形態を維持していた。
HUVECは、培地として血管内皮細胞用基礎培地(Medium 200(Invitrogen社))と血管内皮細胞用増殖サプリメント(Invitrogen社)の混合液を用いて培養し、継代回数が5回以内のものを実験に使用した。増殖した細胞を回収し、細胞密度が1.0×106cells/mLになるように細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を渦巻き状に入れた線状多孔体の上に滴下した。培地を添加し、37℃、5% CO2環境下で、一般的な手順に従って培養した。1週間後に観察したところ、線状多孔体内で細胞の増殖及び生存が確認された。また、ピンセットで引き上げることが可能な水準で線状多孔体の形態を維持していた。
実施例1の線状多孔体をピンセットで搾って脱水し、細胞培養に使用する培地に浸漬した。その後、ピンセットを使用して線状多孔体から培地を搾り出し、脱水状態とした。この線状多孔体を12ウェルプレートのウェルにできるだけ隙間が少なくなるように渦巻状に入れた。
この細胞懸濁液を渦巻き状に入れた線状多孔体の上に滴下して、細胞懸濁液を線状多孔体に吸収させた。3時間後、培地を添加し、37℃、5% CO2環境下で、一般的な手順に従って培養した。1週間後に観察したところ、線状多孔体内で細胞の増殖及び生存が確認された。また、ピンセットで引き上げることが可能な水準で線状多孔体の形態を維持していた。
コラーゲン溶液Aを内径4mm、長さ100mmのプラスチック製チューブに充填した後、-35℃・3時間で凍結乾燥した。これをチューブ内から引き出して、多孔質のコラーゲン凍結乾燥体を得た。
Claims (3)
- 可溶化コラーゲン溶液とアルカリ金属重炭酸塩とを混合することによって生成する線維化コラーゲンゲルを、一方又は両端が開放されたチューブに充填する第一工程、
チューブに充填した状態で線維化コラーゲンゲルを凍結乾燥する第二工程、
凍結乾燥された線維化コラーゲンゲルをチューブ内から引き出して架橋処理する第三工程
を含むことを特徴とする、線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
ただし、上記線状コラーゲン架橋多孔体は、
架橋されているコラーゲン成形体であって、
当該成形体は三次元の細胞培養が可能な多孔質構造を有し、
当該成形体の外形は線状体の構造を有するものであり、
構成するコラーゲンが線維化コラーゲンである。 - アルカリ金属重炭酸塩の適用量が、コラーゲンの分子量を30万としたときに、アルカリ金属重炭酸塩/可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲン(モル比)=3×102〜3×104の範囲である請求項1記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
- 前記第三工程の架橋処理が、下記(1)及び(2)のうちいずれか一方又は双方である、請求項1又は2記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
(1)γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、UV照射又は熱脱水によって物理的架橋する処理。
(2)水溶性化学架橋剤又は気化能を有する化学架橋剤によって化学的架橋する処理。
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