JPS63196286A - 細胞培養用基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 この発明は、細胞培養用基材に関する。さらに詳細には
、動物細胞を培養するために使用される細胞培養用基材
に関するものである。。

〈従来技術及び発明が解決しようとする間順点〉近年、
生物の細胞を培養し、その細胞の代謝活動により有用な
生理活性物質、例えば、ワクチン、ホルモン、インター
フェロン等を生産する研究が活発に行われている。

このような方法において、従来、接着性動物細胞の培養
は、ガラス、プラスチック製のシャーレ−試験管、培養
ビンなどを用いて行なわれてきた。

また、最近、マイクロキャリアや中空糸を培養用基材と
して用い、より高密度の培養や、長期の培養を行なう試
みがなされつつある。接着性動物細胞を培養周基村上に
接着させ、増殖させるには、該基材表面と細胞の接着性
が良好であることと共に接着した細胞の形態、配列が、
細胞の伸展、増殖に有効な形態となっていることが必要
である。

しかしながら、従来から細胞培養用基材として用いられ
ている高分子材料は賦形性、耐久性に優れ。

るものの、上記接着性等の点に関して不適当であり、高
密度かつ長期間の細胞培養を行なうことができず、いず
れも十分な成果を上げるに至っていない。

この点を改善するため、生体高分子であるコラーゲンや
その変性物であるゼラチンを高分子材料上に塗布したも
の（特開昭５８−７１８８４号公報参照）や、高分子材
料上に可溶性フィブロインの架橋体が積層された細胞培
養床（特開昭６１−５２２８０号公報参照）が提案され
ている。

しかしながら、上記の従来技術は、高分子基材への糖や
蛋白質などの固定化が十分でなく容易に脱離してしまい
、細胞の接着性並びに接着した細胞の伸展性、増殖性お
よび活性維持が未だ十分でなく、高密度、長期間の細胞
培養ができないという問題点がある。

く目　的〉 この発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、細
胞との接着性に優れ、細胞の増殖と機能維持を行うこと
のでき、高密度、長期間の細胞培養を可能ならしめる細
胞培養用基材を提供することを目的とする。

く問題点を解決するための手段および作用〉上記の問題
点を解決すべくなされた、この発明の細胞培養用基材は
、γ線照射された高分子基材の表面上に、糖、蛋白質、
脂質およびそれらの復合化合物（以下、これらを糖蛋白
質等と称する）のいずれか１種類以上が担持されている
ことを特徴とするもの・である。

なお、上記高分子基材は、多孔質材料であるのが好まし
い。また、上記基材が中空糸であるものが好ましい。さ
らには、基材上に糖蛋白質等が部分的に担持されている
のが好ましく、特に、格子模様、縞模様、水玉模様等に
担持されているものが好ましい。

この発明は上記の構成よりなり、γ線照射された高分子
基材が用いられ、高分子基材中の電子とγ線との相互作
用でイオン化と励起が起こり２．ラジカルが生成し、基
材表面が活性化される。この活性化された基材表面に糖
蛋白質等を結合させるので、糖蛋白質等と基材の接着を
強固にすることができる。さらに、γ線は物質透過力が
大きいので、例えば多孔性材料のように複雑な凹凸表面
を有する基材にあっても表面の全てを処理することがで
きる。また、基材表面上に担持される糖蛋白質等は、細
胞との接着性に優れ、細胞が安定した形態、配置で接着
することができる。すなわち、細胞表面の細胞膜の構造
は、脂質二重層の中に、膜内粒子と呼ばれる各種の糖蛋
白質、糖脂質等が分布をもって埋めこまれており、これ
らが、上記脂質二重層の中を自由に移動でき細胞の接着
に関与している。上記糖蛋白質等は、膜内粒子とイオン
結合、疎水結合等により結合可能な部位を有するので、
細胞との接着性が高まると共に細胞を安定した形態、配
置で保持することができる。従って、本発明の細胞培養
用基材は、細胞の安定な接着を促すと共に接着した細胞
の良好な伸展および増殖を可能にすることができる。

また、上記高分子基材が、多孔質材料であるときは、多
孔質材料の孔を通じて物質代謝が容易となり長期に亘り
細胞培養することができる。特に、前記高分子基材が中
空糸であるものは、中空部内や中空糸の外側に培養液等
を潅流することにより、中空糸上に細胞を高密度に育成
、増殖させることができる。

また、基材の表面に糖蛋白質等が部分的に担持されてい
るもの、特に、格子模様、縞模様、水玉模様等に糖蛋白
質等が担持されているものにあっては、接着する細胞の
位置を調整でき、細胞が所定の間隔をもって接着するの
で、細胞との接着がさらに安定化し、細胞の伸展、増殖
をより一層増大させることができる。

以下、この発明をより詳細に説明する。

この発明の細胞培養用基材は、γ線照射された高分子基
材の表面上に、糖蛋白質等のいずれか１種類以上が担持
された構造を有する。

上記高分子基材の材料としては、賦形性、機械的強度を
有するものであればいかなるものでも使用でき、例えば
、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレン
、アイオノマー等のオレフィン系重合体、ポリテトラプ
ルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン等のフッ素系樹
脂、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、ポリメチルメタ
クリレート等のアクリル系樹脂、ポリビニルアルコール
、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアセタール、ポリアクリ
ロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポ
リカーボネート、ボリア、リレート、ポリフェニレンオ
キサイド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレン
テレフタレート等のポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、
ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、セルロース系
樹脂、シリコーン樹脂、ポリウレタンなどの種々の重合
体もしくは共重合体またはそれらのブレンド物が例示で
きる。

上記高分子材料からなる基材は、種々の形態に形成でき
、例えば、シャーレ、フラスコ等の成形品の他、フィル
ム、チューブ、中空糸、繊維、微粒子等の形態が例示で
きる。これらの形態のうち、長期に亘り細胞培養を行な
うには、物質代謝を容易にする孔を有する多孔質高分子
基材が好ましく、また、高密度培養を行なうには、チュ
ーブ、中空糸の形状が好適である。特に、物質代謝が容
易で、高密度培養を長期に亘り行なえる多孔質高分子基
材からなる中空糸が好ましい。この中空糸を用いるとき
、培養液を、中空糸の中空部または外側に潅流させ、必
要に応じて炭酸ガスや空気等を上記中空糸の中空部等に
送ることにより、細胞を中空糸上で育成し、増殖させる
ことができる。なお、前記中空糸としては、種々の”大
きさのものが使用でき、例えば、内径５０−１０００μ
ｍ程度のものが用いられる。

また、この発明の細胞培養用基材をマイクロキャリアー
法のビーズ担体として使用する場合には、前記高分子基
材は１００〜３００μｍ程度の粒径のものが用いられる
。

上記高分子基材のγ線照射処理に用いられる線源として
は、一般にコバルト６０が利用される。

照射線量は特に限定されず、基材の種類、活性化させる
程度等により適宜選択される。

上記のγ線照射を行なった後、基材上に糖蛋白質等を担
持させる。ここで用いる糖蛋白質等は、細胞と親和性が
あり、基材と細胞の接着を促進するものであればいずれ
も用いることができ、例えば、ラクトース、ガラクトー
ス等のオリゴ糖、アルブミン等の蛋白質、リン脂質等の
脂質、グロボシド、ガングリオシド等の糖と脂質との複
合体である糖脂質、細胞質や血清中に含まれる脂質と蛋
白質との複合体であるリボ蛋白質、糖と蛋白質との複合
体である糖蛋白質等が挙げられ、特にオリゴ糖、コラー
ゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、コンド
ロネクチン、ビトロネクチン、フィブリン等の糖蛋白質
が好適に用いられ、これらは２種またはそれ以上組み合
せて使用することも有用である。基材上に糖蛋白質等を
担持する方法は、従来の技術がいずれも応用できる。一
般には、真空中または空気中で、高分子基材にγ線を照
射した後、ただちに上記の糖蛋白質等の１種類または２
種類以上を含有する溶液に浸漬したり、または該溶液を
基材表面に塗布した後、乾燥することにより行われる。

この際、糖蛋白質等が変性しにくい条件で乾燥するのが
好ましい。また、γ線照射時、上記糖蛋白質等の溶液を
共存させてもよい。この場合には、糖蛋白質等のゲル状
薄膜が積層された複合体が得られる。

上記糖蛋白質等の担持は、基材表面の全面に積層しても
よいが、基材表面に部分的に、特にパターン化して担持
したものが好ましく、このようにパターン化して担持す
ることにより、基材上に接着する細胞の配置を制御でき
、ひいては細胞の接着性が安定化し、細胞の伸展、増殖
および機能発現を有利にすることができる。さらに、糖
蛋白質等を上記のように部分的に担持する場合、特に、
格子状、縞模様、水玉模様等の微細模様に担持すること
により、上記効果をさらに増進できる有用な表面を形成
することができる。基材上に糖蛋白質等をパターン化し
て担持するには、例えば、スクリーン印刷等の技術を応
用して行なうことができる。

この発明の細胞培養用基材は、種々の細胞の培養に使用
することができ、細胞の種類は特に限定されず生体由来
細胞、ハイブリドーマ−等が挙げられ、例えば、チャイ
ニーズハムスター肺由来細胞ｖ−７９、ヒト子宮癌由来
細胞ＨｅＬａ、ヒト胎児肺由来細胞ＭＲＣ−５、ヒト肝
由来細胞Ｃｈａｎｇ　Ｌｉｖｅｒ　、ヒト肺由来正二倍
体線維芽細胞ＩＲＣ−９０、ヒトリンパ腫由来ナマルバ
細胞等が例示される。

また、この発明の細胞培養用基材を用いて動物細胞を培
養する場合、培養する細胞の種類に応じて種々の培養液
が用いられ、細胞の増殖に適した至適温度、ｐＨ等の条
件で培養が行なわれる。

本発明の細胞培養用基材は、従来公知の種々のモジュー
ルにて、動物細胞の増殖に適用できる。

本発明の細胞培養基材としてフィルム状基材を用いたモ
ジュールの一例を、第１図〜第３図に基づいて説明する
と以下の通りである。

第１図に示す細胞培養器は、サポートスクリーン（２）
上に載置されたフィルム状細胞培養用基材（１）の両端
が、ポリカーボネート等からなるハウジング（３）内の
両側に設けられたスペーサ（６）により保持されている
。また、上記ハウジング（３）には、増殖させる細胞懸
濁液をハウジング（３）内に満すための孔（４）が設け
られていると共に、培養液を泡流させるための管（５）
が取付られている。なお、上記孔（４）は、細菌等が侵
入するのを防止するため、フィルタ付きの蓋（７）で被
冠されている。

上記の細胞培養器を用いて細胞を増殖させるには、上記
孔（４）から細胞懸濁液を注入して細胞を前記基材（１
）上に接着させると共に、前記孔（４）をフィルタ付き
の上記蓋（７）で被冠し、所定の培養条件の下、上記培
養液を前記管（５）を通じて所定時間濯流させることに
より行なわれる。

また、他のモジュールとして、第２図および第３図に示
されるものが例示できる。第２図に示す細胞培養器（１
１）は、所定数集束された多孔質デユープ状基材（１２
）が、細胞懸濁液を注入するための孔（１４）を有する
ポリカーボネート等からなる円筒状容器（１３）に装填
されていると共に、上記基材（１２）の両端部がシリコ
ーン接着剤（１５）等により接着固定されている。また
、上記孔（１４）は、細菌等で培養器（１１）等が汚染
されるのを防止するため、フィルタ付きのＭ　（１４ａ
）で被冠されている。上記孔（１４）より注入されて前
記基材（１２）に接着した細胞を増殖させるため、上記
円筒状容器（１３）の両端部には、培養液（１８）を供
給する供給口（１７ａ）を備えたキャップ（ｌｅａ）と
、培養液（１８）を排出する排出口（１７ｂ）を備えた
キャップ（ｌ１３ｂ）とがそれぞれ装着されており、培
養器（１１）内の前記基材（１２）に培養液（１８）を
移送できるようにしている。

上記の培養器（１１）は、例えば、第３図に示されるシ
ステムで用いられる。すなわち、新鮮な培養液（１８）
を培養器（１１）に供給するため、上記培養器（１１）
の供給口（１７ａ）には、中間にポンプ（２０）が配さ
れたパイプ（２２ａ）が接続されており、培養液容器（
１９）に収容された新鮮な培養液（１８）を上記パイプ
（２２ａ）を経て上記培養器（１１）に供給している。

また、培養器（１１）を通過した培養液（１８）は、培
養器（１１）の排出口（１７ｂ）に接続されたパイプ（
２２ｂ）を経て前記培養液容器（１９）に排出され、培
養液（１８）が上記システムを循環するように構成され
ている。なお、上記培養器（１１）等は、インキュベー
タ（１１）内に配されている。

上記の培養器（１１）およびシステムを用いて細胞を増
殖させるには、上記孔（１４）から細胞懸濁液を注入し
て細胞を前記基材（１２）上に接着させると共に、前記
孔（１４）をフィルタ付きの蓋（１４ａ）で被冠し、所
定の培養条件の下、培養液容器（１９）に収容された培
養液（１８）を前記パイプ（２２ａ）　（２２ｂ）を通
じて培養器（１１）内を所定時間循環させることにより
行なわれる。

〈実施例〉 以下、実施例に基づいてこの発明をより詳細に説明する
。

実施例１ ポリエーテルイミド（エンジニアリングプラスチック社
販売、ＵＬＴＥＭ）をＮ−メチル−２−ピロリドンに溶
解し、１８重量％溶液を調整した。

この溶液をガラス板上にドクターナイフで厚さ３００μ
ｍに流延し、一定時間放置後、ガラス板ごと温度１５℃
に保たれたＮ−メチル−２−ピロリドン５％水溶液中に
浸漬し、凝固させ多孔質フィルムを得た。この多孔質フ
ィルムを５０ｍｍφの円形に打抜き、ポリエチレン（厚
さ３０μｍ）の袋で密Ｏ 封後、　Ｃｏγ線を照射線量４Ｘ１０５ｒａｄ照射した
。このあと処置した多孔質フィルムを無菌ボックス内に
取り出し、無菌のコラーゲン溶液（タイプ１１濃度０．
３％）を縞模様に担持した。すなわちメタルスクリーン
を用いて、コラーゲンの処理幅４０μｍ１非処理幅４０
μ―の縞模様を形成した後、乾燥させて、縞模様にコラ
ーゲンを担持した。

この複合フィルムを、予めエチレンオキサイドガス滅菌
した第１図に示すポリカーボネート製細胞培養器（内径
４７關φ）に装着し、孔（４）からヒト胎児包皮由来細
胞（Ｆｌｏｗ　７０００　）のイーグルＭＥＭ（１０％
牛脂児血清添加）懸濁液（細胞数２×１０４個／　ｘｌ
　）゛を満した。孔（４）には、細菌をカットするフィ
ルター付きの蓋（７）をし、管（５）を通して新鮮なイ
ーグルＨＥＭ培地を濯流し、３７℃で１週間培養を行な
った。培養終了後、フィルムに付着している細胞数を測
定したところ、５．５×１０４個／　ｘＩに増殖してい
ることがわかっな。

比較例 実施例１と同一の条件で製膜したポリエーテルイミド多
孔質フィルムを高圧蒸気殺菌後、実施例１と同様に細胞
培養試験を行なったところ、細胞数は、２．４×１０４
個／１１であった。

実施例２ ポリフッ化ビニリデン−四弗化エチレン共重合体（ペン
ウォルト社製Ｋｙｎａｒ５２０１）のＮ−メチル−２−
ピロリドン２５％溶液を調整し、７０℃の加熱下で二重
管ノズルから中空状に押出した後、２０℃の蒸溜水中に
浸漬し、凝固させた。、８０℃の水中で溶媒の抽出を十
分に行なった後、乾燥させ外径０．８ｍｍφ、内径０．
３ｍ＋ｅφの多孔性中空糸を得た。この中空糸を６０ｃ
ｏγ線で５Ｘ１０５ｒａｄの照射を行なった。

この中空糸を用いて第２図に示される培養器を作製した
。すなわち、上記チューブ状基材である中空糸（１２）
４００本を集束し、円筒状ポリカーボネート容器（１３
）に充填し、端部をシリコン接着剤（１５）を用いて接
着固定後、円筒の軸に垂直に切断することで、中空糸（
１２）端部が全て露出した形の培養器（１１）を得た。

次にこの培養器（１１）全体を高圧蒸気で滅菌し、続い
て無菌のコラーゲン溶液（タイプ■、濃度０．３％）を
孔（１４）から注入し、内部の中空糸（１２）を十分漏
らしてから余分の液を抜きとり、２０℃で乾燥した。つ
いで培養器（１１）の両端部に培養液（１８）の供給口
（１７ａ）　、排出口（１７ｂ）のついたキャップ（ｌ
ｅａ）　（１８ｂ）を装着し、外部から培養器（１１）
の中空糸（１２）内部に培養液（１８）を移送できる形
とし、第３図に示すシステムと結合させた。

この装置を用い、ハムスター仔腎由来細胞（ＢＨＫ−２
１）の培養を行なった。細胞懸濁液（細胞数２．ｌＸ１
０４個／ν１）は、孔（１４）より注入し、培養条件は
、イーグルＨＥＭ培地に１０％牛脂児血清を添加したも
のを用い、５％炭酸ガスを含む空気雰囲気中、３７℃で
インキュベイトして１５日間培養した。細胞はチューブ
の周辺に肉眼でも確認できるほど増殖しており、トリプ
シン−ＥＤＴＡ溶液で細胞を分離し、細胞数を計算した
ところ７．７×１０５個／シｌであった。

〈発明の効果〉 以上のように、この発明の細胞培養用基材によれば、γ
線照射された高分子基材の表面上に、糖蛋白質等が担持
されているので、糖蛋白質等を基材上に強固に固定化す
ることができる。さらに、糖蛋白質等は細胞との親和性
に優れ、接着性を高めることかできると共に細胞を伸展
、増殖に適した形態、配列で接着させることができるの
で、高密度かつ長期間の細胞培養が可能になるという特
有の効果を奏する。従って、この発明の細胞培養用基材
は一動物細胞の培養によるホルモン等の有用物の生産シ
ステムに利用できる他、例えばインスリン産生細胞を基
材表面に接着、培養することにより人工膵臓が形成でき
るように人工臓器の構築に利用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の細胞培養用基材を用いた細胞培養器の
一例を示す断面図、 第２図は本発明の細胞培養用基材を用いた細胞培養器の
他の例を示す断面図、 第３図は第２図に示す細胞培養器を用いる細胞培養のフ
ローチャートである。 （１）・・・細胞培養用基材、■・・・サポートスクリ
ーン、（３）・・・ハウジング、（４）・・・孔、（５
）・・・管、（１１）・・・培養器、（１２）・・・チ
ューブ状基材、（１３）・・・円筒状容器、（１４）・
・・孔、（１８）・・・培養液。 特許出願人　　住友電気工業株式会社 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、γ線照射された高分子基材の表面上に、糖、蛋白質
   、脂質およびそれらの複合化 合物のいずれか１種類以上が担持されて いることを特徴とする細胞培養用基材。 ２、高分子基材が多孔性である上記特許請 求の範囲第１項記載の細胞培養用基材。 ３、高分子基材が中空糸である上記特許請 求の範囲第１項または第２項記載の細胞 培養用基材。 ４、高分子基材の表面上に、糖、蛋白質、 脂質およびそれらの複合化合物のいずれ か１種類以上が部分的に担持されている 上記特許請求の範囲第１項ないし第３項 のいずれかに記載の細胞培養用基材。 ５、糖、蛋白質、脂質およびそれらの複合 化合物のいずれか１種類以上が、格子模 様に担持されている上記特許請求の範囲 第４項記載の細胞培養用基材。 ６、糖、蛋白質、脂質およびそれらの複合 化合物のいずれか１種類以上が、縞模様 に担持されている上記特許請求の範囲第 ４項記載の細胞培養用基材。 ７、糖、蛋白質、脂質およびそれらの複合 化合物のいずれか１種類以上が、水玉模 様に担持されている上記特許請求の範囲 第４項記載の細胞培養用基材。