CN107208114A - 物质的产生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用细胞而产生物质的方法，其包括将细胞应用于聚酰亚胺多孔质膜而培养细胞，由细胞产生物质。

Description

物质的产生方法
【技术领域】
本发明涉及使用细胞产生物质的方法。
【背景技术】
【细胞培养和物质产生】
细胞生物在体内一般作为取三维的结构的集团存在。一方面，在人工环境中培养细胞时，一般使用细胞在培养容器底面以单层状粘着的形式二维培养的经典的平面培养法，或在细胞在液体培养液中分散的状态下培养的悬浮培养法。对于在平面培养法中使用的细胞适宜为粘接性比较高的细胞，但即使在使用适宜的细胞时，由培养环境的差异，细胞的性质有时也大大家变化。对于悬浮培养法也存在适宜的细胞和不适宜的细胞。
向疫苗、酶、激素、抗体、细胞因子等在医疗用途中使用的生物体内蛋白质等的需要提高，使用细胞培养的生物体内蛋白质等的大量产生受到关注。对于大肠杆菌等的悬浮细胞，研究了用大型培养槽大量培养的技术。在使用大型培养槽的悬浮细胞的大量培养中，大量的培养液和搅拌装置变得必要。一方面，使用附着细胞而进行物质产生的研究，也伴随使用的细胞的研究的进展，受到多的关注。在附着细胞的情况中，在经典的平面培养法中，由于细胞仅二维展开，多的培养面积变得必要。为了生物体内蛋白质等的大量产生，为更立体地培养大量的细胞，细胞培养载体和生物反应器的研究也大量进行。
作为代表性的细胞培养用载体，作为可附着培育细胞的小粒子的微载体成为广泛的研究对象(专利文献3)。各种各样的种类的微载体被研究－开发，也有不少在市售。疫苗或蛋白质的制造也有多的使用，作为还耐放大的系统，作为广泛的方法论采用。但是，在微载体培养中，由于微载体有必要充分地搅拌－扩散而不凝集，有细胞培养的量的上限。而且、当例如进行物质产生时，为了分离载体本身而有必要用区分细的粒子的滤器等分离等，方法论上烦琐的作业变得必要。同时，在微载体培养中，从形状限定于称为微载体的粒状物质，免不了形状导致的性质。
作为与微载体培养不同的方法，也发现通过使用甲基纤维素或胶凝糖胶的3维培养法继续大量培养球形形状的细胞的方法。在使用纤维素海绵的生物反应器等中，确实能培养大量的细胞。但是，作为系统成为大的封闭系统，在培养环境中无法简单地接触的等、作业上的限制也多。
为了可用趋于简便并且自动化的系统在细胞中有效产生量多的物质，希求新的系统的构建。
【聚酰亚胺多孔质膜】
聚酰亚胺是在重复单位中含酰亚胺键的高分子的总称。芳香族聚酰亚胺是指芳香族化合物直接经酰亚胺键连接的高分子。芳香族聚酰亚胺由于芳香族和芳香族经酰亚胺键具有共价结构，具有刚直且强固的分子结构，并且，由于酰亚胺键具有强的分子间力而有非常地高的水平的热的、机械的、化学性质。
聚酰亚胺多孔质膜从本发明前就作为滤器、低介电常数膜、燃料电池用电解质膜等，特别以电池关系作为中心的用途利用。专利文献6～8特别记载了气体等的物质透过性优良，空孔率高的，两表面的平滑性优良，相对强度高的，尽管高空孔率，但有多数对于向膜厚度方向的压缩应力的耐力优良的大空隙的聚酰亚胺多孔质膜。这些均是经由酰胺酸制成的聚酰亚胺多孔质膜。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：特公平6-30570
专利文献2：专利2683946
专利文献3：WO2003/054174
专利文献4：特开2009-261410
专利文献5：WO2000/068371
专利文献6：WO2010/038873
专利文献7：特开2011-219585
专利文献8：特开2011-219586
【非专利文献】
非专利文献1：Hogwood et al.,Current Opinion in Biotechnology 2014,30:153-160
非专利文献2：Kurokawa et al.,Journal of Bioscience and BioengineeringVOL.111No.5,600-604,2011
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
本发明旨在提供使用细胞而产生物质的方法、物质产生装置、试剂盒、及用途。
【解决课题的技术方案】
本发明人为了提供能在细胞中简便并且有效产生物质的方法、系统的课题的解决，锐意研究的结果，发现通过进行使用聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养，不进行特别的预处理等，将大量的细胞在限定的空间内培养，活用该高密度培养特性而可实现效率的物质产生，想到本发明。从而，本发明以使用聚酰亚胺多孔质膜培养细胞作为特征之一。
细胞活用聚酰亚胺多孔质膜所具有的能通过细胞的大口径连接孔而稳定并且立体地生长，与平面培养比较，即使成为含大量的细胞的状态，也通过确保该连接孔与培养基的接触，可稳定继续生长。在蛋白质或如病毒一样的物质产生中也贡献同样的结构特性，可对于培养基有效率地供给产生物质。再者，由聚酰亚胺多孔质膜所具有的薄膜特性－柔性特性－形状稳定性－自由形态性，使在小的单位空间共存大量的片，或积层多数的膜变得可能，且由于聚酰亚胺多孔质膜所具有的超耐热性－耐溶剂性，能用多种手段简便并且迅速地片的灭菌。再者，也期待由聚酰亚胺多孔质膜所具有的立体的支架结构，与平面培养比较时，每一个细胞的物质产生量提高的可能性。
虽不限定，但本发明优选含以下的实施方式。
[实施方式1]
使用细胞而产生物质的方法，其包括将细胞应用于聚酰亚胺多孔质膜而培养细胞，由细胞产生物质。
[实施方式2]
实施方式1所述的方法，其中上述物质选自蛋白质、糖蛋白质及病毒。
[实施方式3]
实施方式1或2所述的方法，其中在静置培养条件下培养细胞。
[实施方式4]
实施方式1或2所述的方法，其中在旋转培养或搅拌条件下培养细胞。
[实施方式5]
实施方式1或2所述的方法，其中连续培养细胞。
[实施方式6]
实施方式5所述的方法，其包括在温育器内设置细胞培养装置，培养细胞，
其中，上述细胞培养装置含
收容用于负载细胞的1个或多个聚酰亚胺多孔质膜的培养单位，其为具备培养基供给口及培养基排出口的培养单位，及
培养基供给单位，其具备培养基收纳容器、培养基供给线和经培养基供给线输送培养基的送液泵，其中培养基供给线的第一端部与培养基收纳容器内的培养基接触，培养基供给线的第二端部经培养单位的培养基供给口连通到培养单位内。
[实施方式7]
实施方式6所述的方法，其中上述细胞培养装置无空气供给口、空气排出口及氧透过膜。
[实施方式8]
实施方式1～7之任一项所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。
[实施方式9]
实施方式8所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是通过使含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上热处理得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。
[实施方式10]
实施方式8或9所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是有2个不同的表层面和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔质膜。
[实施方式11]
实施方式10所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜的膜厚是75μm以下。
[实施方式12]
实施方式1～11之任一项所述的方法，其中将上述聚酰亚胺多孔质膜
(i)折叠，
(ii)卷成轮状，
(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者，
(iv)结成绳状
而在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定。
[实施方式13]
实施方式1～12之任一项所述的方法，其中将2个以上的聚酰亚胺多孔质膜在细胞培养基中上下或左右积层而使用。
[实施方式14]
实施方式1～13之任一项所述的方法，其中细胞以表达物质的方式由基因工程学技术转化。
[实施方式15]
实施方式1～14之任一项所述的方法，其中细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌及细菌。
[实施方式16]
实施方式15所述的方法，其中动物细胞是属于脊椎动物门的动物来源的细胞。
[实施方式17]
实施方式15或16所述的方法，其中动物细胞选自中国仓鼠卵巢组织来源细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾脏来源株化细胞(Vero细胞)、人肝癌来源细胞(HepG2细胞)、狗肾脏肾小管上皮细胞来源的细胞株(MDCK细胞)及人肝癌组织来源建立细胞株(huGK-14)。
[实施方式18]
实施方式15所述的方法，其中细菌选自乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及蓝细菌。
[实施方式19]
用于在实施方式1～18之任一项所述的方法中使用的物质产生装置，其含聚酰亚胺多孔质膜。
[实施方式20]
实施方式19所述的物质产生装置，其中2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右积层。
[实施方式21]
用于在实施方式1～18之任一项所述的方法中使用的试剂盒，其含聚酰亚胺多孔质膜。
[实施方式22]
聚酰亚胺多孔质膜用于实施方式1～18之任一项所述的方法的用途。
【发明效果】
由本发明的方法、装置、试剂盒使用聚酰亚胺多孔质膜实施细胞培养，则通过以各种各样的形态使1个或多个片在限定的空间内共存，可有效培养大量的细胞。由本发明的方法，效率的并且简便的由细胞培养的物质产生变得可能。
【附图说明】
【图1】显示在人皮肤成纤维细胞的长期培养后的气相传代时的细胞数变化。
【实施方式】
【I.产生物质的方法】
本发明涉及使用细胞而产生物质的方法。本发明的方法包括将细胞应用于聚酰亚胺多孔质膜而培养细胞，由细胞产生物质。
【1.细胞】
可在本发明的方法中利用的细胞的种类不特别限定，能在任意的细胞的增殖中利用。
例如，细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌及细菌。动物细胞被大分为属于脊椎动物门的动物来源的细胞和无脊椎动物(属于脊椎动物门的动物以外的动物)来源的细胞。在本说明书中的，动物细胞的来源不特别限定。优选为，是指属于脊椎动物门的动物来源的细胞。脊椎动物门含无颌类和有颌类，有颌类含哺乳纲、鸟纲、两栖纲、爬行纲等。优选为，一般而言，称为哺乳动物的属于哺乳纲的动物来源的细胞。哺乳动物不特别限定，优选为，含小鼠、大鼠、人、猴、猪、狗、绵羊、山羊等。
虽不限定，但作为动物细胞优选，例如，动物细胞使用选自中国仓鼠卵巢组织来源细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾脏来源株化细胞(Vero细胞)、人肝癌来源细胞(HepG2细胞)、狗肾脏肾小管上皮细胞来源的细胞株(MDCK细胞)、人肝癌组织来源建立细胞株(huGK-14)、正常人成纤维细胞样滑膜细胞(HFLS细胞)及慢性类风湿性关节炎患者来源成纤维细胞样滑膜细胞(HFLS-RA细胞)的细胞。
在本说明书中的植物细胞的来源不特别限定。含苔藓植物、蕨类植物、种子植物的植物的细胞成为对象。
种子植物细胞所来源的植物含单子叶植物、双子叶植物之任何。虽不限定，但在单子叶植物中，含兰科植物、稻科植物(稻、玉米、大麦、小麦、高粱等)、莎草科植物等。在双子叶植物中，含属于菊亚纲、木兰亚纲、蔷薇亚纲等多种亚纲的植物。
藻类也可看作细胞来源生物。从作为真正细菌的蓝细菌(蓝藻)，含作为真核生物且单细胞生物的(硅藻、黄绿藻、涡鞭毛藻等)及作为多细胞生物的海藻类(红藻、褐藻、绿藻)等的不同的组。
在本说明书中的古细菌及细菌的种类也不特别限定。古细菌由甲烷菌－高度好盐菌－嗜热好酸菌－超嗜热菌等。细菌选自例如，乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及蓝细菌等。
可在本发明的方法中利用的动物细胞或植物细胞的种类虽不限定，但优选选自多能性干细胞、组织干细胞、体细胞、及生殖细胞。
在本发明中“多能性干细胞”是指有向所有的组织的细胞分化的能力(分化多能性)的干细胞的总称。虽不限定，但多能性干细胞含胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚性生殖干细胞(EG细胞)、生殖干细胞(GS细胞)等。优选为，ES细胞或iPS细胞。iPS细胞由于也无伦理的问题等的理由特别优选的。能使用作为多能性干细胞公知的任意的，例如，能使用在国际公开WO2009/123349(PCT/JP2009/057041)中记载的多能性干细胞。
“组织干细胞”是指能分化的细胞系列限定于特定的组织，但有能向多样的细胞种分化的能力(分化多能性)的干细胞。例如骨髓中的造血干细胞成为血细胞的祖先，神经干细胞向神经细胞分化。此外，有制造肝脏的肝干细胞、成为皮肤组织的皮肤干细胞等各种各样的种类。优选为，组织干细胞从间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、或者造血干细胞选择。
“体细胞”是指构成多细胞生物的细胞的中生殖细胞以外的细胞的。在有性生殖中第二代不继承。优选为，体细胞从肝细胞、胰腺细胞、肌细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、成纤维细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、或者，淋巴细胞、红细胞、白细胞、单核细胞、巨噬细胞或巨核细胞的血细胞选择。
“生殖细胞”是指具有在生殖中将遗传信息传递给第二代的作用的细胞。例如，含用于有性生殖的配偶子、即卵子、卵细胞、精子、精细胞、用于无性生殖的孢子等。
细胞也可选自肉瘤细胞、株化细胞及转化细胞。“肉瘤”是指在骨、软骨、脂肪、肌肉、血液等的非上皮性细胞来源的结缔组织细胞发生的癌，含软部肉瘤、恶性骨肿瘤等。肉瘤细胞是来源于肉瘤的细胞。“株化细胞”是指经长期间在体外维持，至具有一定的稳定的性质，半永久的传代培养变得可能的培养细胞。存在含PC12细胞(大鼠肾上腺髓质来源)、CHO细胞(中国仓鼠卵巢来源)、HEK293细胞(人胎儿肾脏来源)、HL-60细胞(人白血细胞来源)、HeLa细胞(人子宫颈癌来源)、Vero细胞(非洲绿猴肾脏上皮细胞来源)、MDCK细胞(狗肾脏肾小管上皮细胞来源)、HepG2细胞(人肝癌来源)等人的来源于各种各样的生物种的各种各样的组织的细胞株。“转化细胞”是指从细胞外部导入核酸(DNA等)，使遗传性质变化的细胞。
细胞只要是可表达期望的物质的细胞，就不特别限定。细胞内可天然表达所述物质，或者，也可以由基因工程学技术产生所述物质的方式转化。优选为细胞是以表达物质的方式由基因工程学技术转化的。对于动物细胞、植物细胞、细菌的转化公知各适宜的方法。(例如，MOLECULAR CLONING：A Laboratory Manual(Fourth Edition),Michael R Greenand Joseph Sambrook,2012,(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、MutationResearch 760(2014)36-45,Reviews in Mutation Research)
【2.物质】
可由本发明的方法在细胞中产生的物质的种类只要是可在细胞内天然地或由基因工程学技术产生的物质，就不特别限定。优选为，上述物质选自蛋白质(含多肽)、糖蛋白质及病毒。
蛋白质的例含促红细胞生成素、胰岛素、白蛋白等的生理活性蛋白质、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素等的细胞因子、凝血酶、胰蛋白酶等的酶及含抗体医药的单克隆抗体等。优选为，生理活性蛋白质、单克隆抗体。
糖蛋白质的例含胶原、纤连蛋白、透明质酸等。优选为，纤连蛋白。
病毒的例含流感病毒、腺病毒等。优选为，流感病毒。
本发明的，在特定的细胞中天然表达的物质的例含由转化细胞表达的抗体药品、由人皮肤成纤维细胞表达的人胶原或纤连蛋白。
【3.聚酰亚胺多孔质膜】
聚酰亚胺是在重复单位中含酰亚胺键的高分子的总称，通常是指芳香族化合物直接经酰亚胺键连接的芳香族聚酰亚胺。芳香族聚酰亚胺由于芳香族和芳香族经酰亚胺键具有共价结构，具有刚直且强固的分子结构，并且，由于酰亚胺键具有强的分子间力而有非常高的水平的热的、机械的、化学性质。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜是含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺(作为主要的成分)的聚酰亚胺多孔质膜，更优选为由由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺构成的聚酰亚胺多孔质膜。“作为主要的成分含”是指作为聚酰亚胺多孔质膜的构成成分，由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺以外的成分基本上不含，或者也可含，但不给由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质影响的附加的成分。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜也含通过使含从四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。
【聚酰胺酸】
聚酰胺酸通过将四羧酸成分和二胺成分聚合而得到。聚酰胺酸是可通过热亚胺化或化学亚胺化闭环而成聚酰亚胺的聚酰亚胺前体。
聚酰胺酸即使酰胺酸的一部分被亚胺化，只要是不给本发明影响的范围，就可使用。即，聚酰胺酸也可部分热亚胺化或化学亚胺化。
当使聚酰胺酸热亚胺化时，可根据需要，向聚酰胺酸溶液添加亚胺化催化剂、含有有机磷的化合物、无机微粒子、有机微粒子等的微粒子等。另外，当使聚酰胺酸化学亚胺化时，可根据需要，向聚酰胺酸溶液添加化学亚胺化剂、脱水剂、无机微粒子、有机微粒子等的微粒子等。即使向聚酰胺酸溶液配合上述成分，也优选在着色前体不析出的条件下进行的。
【着色前体】
在本发明中使用的着色前体是指由250℃以上的热处理一部分或全部碳化而生成着色化物的前体。
作为在本发明中使用的着色前体，均一地溶解或分散于聚酰胺酸溶液或聚酰亚胺溶液，由250℃以上、优选为260℃以上、再优选为280℃以上、更优选为300℃以上的热处理、优选为在空气等的氧存在下的250℃以上、优选为260℃以上、再优选为280℃以上、更优选为300℃以上的热处理热分解，优选碳化生成着色化物，更优选生成黑色系的着色化物，更优选碳系着色前体。
着色前体经加热则看起来像可见碳化物，但组织上含碳以外的异元素，含层结构、芳香族交联结构、含四面体碳的无秩序结构的。
碳系着色前体不特别限制，例如，可举出石油焦油、石油沥青、煤焦油、煤沥青等的焦油或沥青、焦炭、从含丙烯腈的单体得到的聚合物、二茂铁化合物(二茂铁及二茂铁衍生物)等。在这些之中，优选从含丙烯腈的单体得到的聚合物及/或二茂铁化合物，作为从含丙烯腈的单体得到的聚合物，优选聚丙烯酸类树脂腈。
四羧酸二酐可使用任意的四羧酸二酐，可根据期望的特性等适宜选择。作为四羧酸二酐的具体例，可举苯均四酸二酐、3,3’，4,4’-联苯基四羧酸二酐(s-BPDA)、2,3,3’，4’-联苯基四羧酸二酐(a-BPDA)等的联苯基四羧酸二酐、氧基二酞酸二酐、二苯基砜-3,4,3’，4’-四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)硫化物二无水物、2,2-双(3,4-二羧基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷二无水物、2,3,3’，4’-二苯甲酮四羧酸二酐、3,3’，4,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)甲烷二无水物、2,2-双(3,4-二羧基苯基)丙烷二无水物、p-亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、p-双亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、m-三联苯基-3,4,3’，4’-四羧酸二酐、p-三联苯基-3,4,3’，4’-四羧酸二酐、1,3-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二无水物、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二无水物、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)联苯基二无水物、2,2-双〔(3,4-二羧基苯氧基)苯基〕丙烷二无水物、2,3,6,7-萘四羧酸二酐、1,4,5,8-萘四羧酸二酐、4,4’-(2,2-六氟异亚丙基)二酞酸二酐等。另外，也优选使用2,3,3’，4’-二苯基砜四羧酸等的芳香族四羧酸。这些可单独使用，也可使2种以上组合使用。
在这些之中，也特别优选选自联苯基四羧酸二酐及苯均四酸二酐的至少一种芳香族四羧酸二酐。作为联苯基四羧酸二酐，可适宜地使用3,3’，4,4’-联苯基四羧酸二酐。
二胺可使用任意的二胺。作为二胺的具体例，可举以下的。
(1)1,4-二氨基苯(对亚苯基二胺)、1,3-二氨基苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯等的苯核1个苯二胺；
(2)4,4’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚等的二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基联苯基、2,2’-二甲基-4,4’-二氨基联苯基、2,2’-双(三氟甲基)-4,4’-二氨基联苯基、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二羧基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’，5,5’-四甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、双(4-氨基苯基)硫化物、4,4’-二氨基苯甲酰苯胺、3,3’-二氯联苯胺、3,3’-二甲基联苯胺、2,2’-二甲基联苯胺、3,3’-二甲氧基联苯胺、2,2’-二甲氧基联苯胺、3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚、3,3’-二氨基二苯基硫化物、3,4’-二氨基二苯基硫化物、4,4’-二氨基二苯基硫化物、3,3’-二氨基二苯基砜、3,4’-二氨基二苯基砜、4,4’-二氨基二苯基砜、3,3’-二氨基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二氯二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二甲氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基二苯基甲烷、3,4’-二氨基二苯基甲烷、4,4’-二氨基二苯基甲烷、2,2-双(3-氨基苯基)丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)丙烷、2,2-双(3-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、3,3’-二氨基二苯基亚砜、3,4’-二氨基二苯基亚砜、4,4’-二氨基二苯基亚砜等的苯核2个二胺；
(3)1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯、1,4-双(4-氨基苯氧基)苯、1,3-双(3-氨基苯氧基)-4-三氟甲基苯、3,3’-二氨基-4-(4-苯基)苯氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二(4-苯基苯氧基)二苯甲酮、1,3-双(3-氨基苯基硫化物)苯、1,3-双(4-氨基苯基硫化物)苯、1,4-双(4-氨基苯基硫化物)苯、1,3-双(3-氨基苯基砜)苯、1,3-双(4-氨基苯基砜)苯、1,4-双(4-氨基苯基砜)苯、1,3-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(3-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯等的苯核3个二胺；
(4)3,3’-双(3-氨基苯氧基)联苯基、3,3’-双(4-氨基苯氧基)联苯基、4,4’-双(3-氨基苯氧基)联苯基、4,4’-双(4-氨基苯氧基)联苯基、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷等的苯核4个二胺。
这些可单独使用，也可将2种以上混合使用。使用的二胺可根据期望的特性等适宜选择。
在这些之中，也优选芳香族二胺化合物，可适宜地使用3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚及对亚苯基二胺、1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯。特别是，优选选自苯二胺、二氨基二苯基醚及双(氨基苯氧基)苯基的至少一种二胺。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点来看，优选由将玻璃转移温度240℃以上，或者在300℃以上无明确的转移点的四羧酸二酐和二胺组合得到的聚酰亚胺形成的。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点来看，优选为由以下的芳香族聚酰亚胺构成的聚酰亚胺多孔质膜。
(i)由选自联苯基四羧酸单位及苯均四酸单位的至少一种四羧酸单位和芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺、
(ii)由四羧酸单位和选自苯二胺单位、二氨基二苯基醚单位及双(氨基苯氧基)苯基单位的至少一种芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺、及/或
(iii)由选自联苯基四羧酸单位及苯均四酸单位的至少一种四羧酸单位和选自苯二胺单位、二氨基二苯基醚单位及双(氨基苯氧基)苯基单位的至少一种芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺。
虽不限定，但作为聚酰亚胺多孔质膜，能在本发明中使用至少有2个表面层(A面及B面)和被所述2个表面层之间夹的大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔质膜。优选为，聚酰亚胺多孔质膜是上述大空隙层有与上述表面层(A面及B面)结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层(A面及B面)包围的膜平面方向的平均孔径是10～500μm的多个大空隙，上述的大空隙层的隔壁、以及上述表面层(A面及B面)各自是，厚度是0.01～20μm，有平均孔径0.01～100μm的多个孔，所述细孔彼此可连通，再者连通到上述大空隙而部分的或全面地有多层结构，进而，总膜厚是5～500μm，空孔率是40％以上不足95％的聚酰亚胺多孔质膜。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜的总膜厚虽不限定，但作为一实施方式，也可作为20～75μm。由膜厚的差异，可在细胞的增殖速度、细胞的形态、面内的细胞的饱和度等方面观察到差异。
在本发明中，当使用有2个不同的表面层(A面及B面)和被所述2个表面层之间夹的大空隙层的聚酰亚胺多孔质膜时，在A面存在的孔的平均孔径也可与在B面存在的孔的平均孔径有差。优选为，在A面存在的孔的平均孔径比在B面存在的孔的平均孔径小。更优选为，在A面存在的孔的平均孔径比在B面存在的孔的平均孔径小，在A面存在的孔的平均孔径是0.01～50μm、0.01μm～40μm、0.01μm～30μm、0.01μm～20μm、或者0.01μm～15μm，在B面存在的孔的平均孔径是20μm～100μm、30μm～100μm、40μm～100μm、50μm～100μm、或者60μm～100μm。特别优选为，A面是有平均孔径15μm以下的，例如0.01μm～15μm的小的孔的网结构，B面是平均孔径20μm以上的，例如20μm～100μm的大孔结构。在本发明的方法中，当使用在A面存在的孔的平均孔径比在B面存在的孔的平均孔径小的聚酰亚胺多孔质膜时，细胞可从A面接种，也可从B面接种，优选为，细胞从A面接种。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜的总膜厚的测定可用接触式的厚度计进行。
聚酰亚胺多孔质膜表面的平均孔径可由多孔质膜表面的扫描型电子显微镜照片，由对于200分以上的开孔部测定孔面积，从该孔面积的平均值根据下式(1)计算设孔的形状是正圆时的平均直径求出。
【数1】
(式中，Sa是指孔面积的平均值。)
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜的空孔率可测定切取为指定的大小的多孔质膜的膜厚及质量，从单位面积重量质量根据下式(2)求出。
【数2】
空孔率(％)＝(1-w/(S×d×D))×100(2)
(式中，S表示多孔质膜的面积、d表示总膜厚、w表示测定的质量、D表示聚酰亚胺的密度。聚酰亚胺的密度设为1.34g/cm3。)
例如，在国际公开WO2010/038873、特开2011-219585、或者特开2011-219586中记载的聚酰亚胺多孔质膜也能在本发明中使用。
在本发明的方法中，应用细胞的聚酰亚胺多孔质膜当然优选不含装填的细胞以外的生物体成分的状态、即，灭菌的。本发明的方法，优选为，包括预先灭菌聚酰亚胺多孔质膜的工序。聚酰亚胺多孔质膜耐热性极优良，且轻量，形－大小也即能自由选择，容易灭菌处理。能由干热灭菌、蒸气灭菌、乙醇等杀菌剂的灭菌、含UV或γ线的电磁波灭菌等任意的灭菌处理。
接种到聚酰亚胺多孔质膜的表面上的细胞能在膜的表面及/或内部稳定生长－增殖。细胞根据膜中的生长－增殖的位置，可取各种的不同的形态。在本发明的一实施方式中，根据细胞的种类，有时一边在聚酰亚胺多孔质膜的表面及内部移动，一边使形状变化，一边增殖。
【4.细胞向聚酰亚胺多孔质膜的应用】
细胞向聚酰亚胺多孔质膜的应用的具体的工序不特别限定。能采用在本说明书中记载的工序、或者适宜于将细胞应用于膜状的载体的任意的方法。虽不限定，但在本发明的方法中，细胞向聚酰亚胺多孔质膜的应用，例如，含如下所述的实施方式。
(A)包括向上述聚酰亚胺多孔质膜的表面接种细胞的工序的实施方式；
(B)包括如下工序的实施方式：
向上述聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面加载细胞悬浮液，
放置或移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出，或刺激表面的一部分，而使上述膜吸入细胞悬浮液，进而
在上述膜内蓄积细胞悬浮液中的细胞，水分使流出；以及，
(C)包括如下工序的实施方式：
将上述聚酰亚胺多孔质膜的一面或两面用细胞培养液或灭菌的液体润湿，
向上述润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液，进而
在上述膜内蓄积细胞悬浮液中的细胞，水分使流出。
(A)的实施方式含向聚酰亚胺多孔质膜的表面直接接种细胞、细胞块。或者，也含向细胞悬浮液中放入聚酰亚胺多孔质膜，从膜的表面浸润细胞培养液的实施方式。
接种到聚酰亚胺多孔质膜的表面上的细胞粘接到聚酰亚胺多孔质膜，进入多孔的内部。优选为，即使不特别从外部加物理的或化学的力，细胞也自发粘接到聚酰亚胺多孔质膜。接种到聚酰亚胺多孔质膜的表面上的细胞能在膜的表面及/或内部稳定生长－增殖。细胞根据生长－增殖的膜的位置，可取各种的不同的形态。
在(B)的实施方式中，向聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面加载细胞悬浮液。通过放置聚酰亚胺多孔质膜，或移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出，或刺激表面的一部分而向上述膜吸入细胞悬浮液，细胞悬浮液渗透到膜中。不被理论束缚，这被认为是由来源于聚酰亚胺多孔质膜的各表面形状等的性质的。由本实施方式，细胞被吸入接种膜的装填细胞悬浮液的位置。
或者，(C)的如实施方式一样，也可将上述聚酰亚胺多孔质膜的一面或两面的部分或整体用细胞培养液或灭菌的液体润湿，之后向润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液。此时，细胞悬浮液的通过速度大大提高。
例如，可使用以膜的飞散防止作为主目的润湿膜极一部分的方法(之后，将其记为“一分湿法”)。一分湿法是大致接近基本上不使膜润湿的干法((B)的实施方式)。但是，对于润湿的小部分被认为细胞液的膜透过变得迅速。另外，也可使用向将聚酰亚胺多孔质膜的一面或两面的整体充分地润湿的(之后，将其记为“湿膜”)装填细胞悬浮液的方法(之后，将其记为“湿膜法”)。此时，在聚酰亚胺多孔质膜的整体中，细胞悬浮液的通过速度大大提高。
在(B)及(C)的实施方式中，在上述膜内蓄积细胞悬浮液中的细胞，水分流出。由此浓缩细胞悬浮液中的细胞的浓度的，使细胞以外的不要的成分与水分一同流出的，等的处理也变得可能。
有时将(A)的实施方式称为“自然播种”，将(B)及(C)的实施方式称为“吸入播种”。
虽不限定，但优选为，在聚酰亚胺多孔质膜中活细胞选择性地停留。从而，在本发明的优选的实施方式中，活细胞在上述聚酰亚胺多孔质膜内停留，死细胞优先与水分一同流出。
在实施方式(C)中使用的灭菌的液体不特别限定，是灭菌的缓冲液或灭菌水。缓冲液是例如，(+)及(-)Dulbecco氏PBS、(+)及(-)Hank氏平衡盐溶液等。缓冲液的例示于以下的表1。
【表1】
成分 浓度(mmol/L) 浓度(g/L)
NaCl 137 8.00
KCl 2.7 0.20
Na2HPO4 10 1.44
KH2PO4 1.76 0.24
pH(-) 7.4 7.4
再者，在本发明的方法中，细胞向聚酰亚胺多孔质膜的应用也含通过使处于悬浮状态的粘接性细胞与聚酰亚胺多孔质膜悬浮共存细胞附着于膜的实施方式(附着)。例如，在本发明的细胞的方法中，也可为了将细胞应用于聚酰亚胺多孔质膜，向细胞培养容器中放入细胞培养基、细胞及1或其以上的上述聚酰亚胺多孔质膜。当细胞培养基是液体的情况中，聚酰亚胺多孔质膜是悬浮到细胞培养基中的状态。由聚酰亚胺多孔质膜的性质，细胞可粘接到聚酰亚胺多孔质膜。从而，即使是先天不适宜于悬浮培养的细胞，聚酰亚胺多孔质膜能在悬浮到细胞培养基中的状态下培养。优选为，细胞自发粘接到聚酰亚胺多孔质膜。“自发粘接”是指即使不特别从外部加物理的或化学的力，细胞也在聚酰亚胺多孔质膜的表面或内部停留。
【5.细胞的培养】
本发明包括培养应用于聚酰亚胺多孔质膜的细胞，由细胞产生物质。
对于向聚酰亚胺多孔质膜应用细胞，培养而言，如下在PCT/JP2014/070407中记载。
细胞培养可由细胞培养中的存在形态而培养细胞被分类为粘接培养系细胞和悬浮培养系细胞。粘接培养系细胞是附着于培养容器而增殖的培养细胞，在传代中进行培养基更换。悬浮培养系细胞是在培养基中在悬浮状态下增殖的培养细胞，一般而言，在传代时不进行培养基更换，进行稀释培养。悬浮培养由于能在悬浮状态、即液体中的培养，能大量培养，与仅在培养容器表面生长的附着细胞比，由于是立体的培养，有每单位空间能培养细胞数多的益处。
在本发明的方法中，在将聚酰亚胺多孔质膜悬浮于细胞培养基中的状态下使用时，也可使用2个以上的上述聚酰亚胺多孔质膜的小片。由于聚酰亚胺多孔质膜是柔性的薄膜，通过例如将该小片悬浮到培养液中而使用，一定容量的细胞培养基中保持有多个表面积的聚酰亚胺多孔质膜变得可能。通常培养的情况中，容器底面积成为能细胞培养的面积的上限，但在使用本发明的聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养中，先前带的聚酰亚胺多孔质膜的大表面积的全部成为能细胞培养的面积。由于聚酰亚胺多孔质膜使细胞培养液通过，例如在折叠的膜内营养或氧等的供给变得可能。
聚酰亚胺多孔质膜的小片的大小，形状不特别限定。形状可取圆、椭圆形、四角形、三角形、多角形、绳状等任意的形。
本发明的聚酰亚胺多孔质膜由于有柔软性，可使形状变化而使用。也可不将聚酰亚胺多孔质膜加工成平面状，而是加工成立体状形状使用。例如，也可将聚酰亚胺多孔质膜(i)折叠，(ii)卷成轮状，(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者，(iv)结成绳状，在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定。通过如(i)～(iv)一样加工形状，可与使用小片时同样地，向一定容量的细胞培养基中放入多个聚酰亚胺多孔质膜。再者，因为可以各小片作为集合体处理，使细胞体集合化移动变得可能，综合的应用性高。
作为与小片集合体同样的想法，也可将2个以上的聚酰亚胺多孔质膜在细胞培养基中上下或左右积层而使用。积层也含聚酰亚胺多孔质膜一部分重叠的实施方式。由积层培养，在窄的空间以高密度培养细胞变得可能。在细胞已经培育的膜上还积层膜而设置，还能形成与别种细胞的多层系统。积层的聚酰亚胺多孔质膜的数不特别限定。
也可将上述的细胞的培养方法使2种或更多的方法组合使用。例如，也可使用实施方式(A)～(C)的任何的方法而先向细胞应用聚酰亚胺多孔质膜，接下来，对粘接细胞的聚酰亚胺多孔质膜进行悬浮培养。或者，作为应用于聚酰亚胺多孔质膜的工序，也可将上述实施方式(A)～(C)的任何的方法使2种或更多组合使用。
在本发明的方法中，优选为，细胞在聚酰亚胺多孔质膜的表面及内部生长增殖。由本发明的方法，细胞可持续2天以上、更优选为4天以上、再优选为6天以上增殖。
在本发明的方法中，通过向聚酰亚胺多孔质膜应用细胞，培养，由于在聚酰亚胺多孔质膜所具有的内部的多面的连接多孔部分或表面，大量的细胞生长，简便地培养大量的细胞变得可能。
另外，在本发明的方法中，相比以往的方法更大幅地减在细胞培养中使用的培养基的量的同时，有效培养大量的细胞变得可能。例如，聚酰亚胺多孔质膜的一部分或整体即使是不与细胞培养基的液相接触的状态，也可培养大量的细胞。另外，对于含细胞生存域的聚酰亚胺多孔质膜体积的总和，相比以往的方法更显著地减细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积也变得可能。
通过使用本发明的方法，细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积，即使在含细胞生存域的聚酰亚胺多孔质膜体积的总和的10000倍或更少的条件下，经长期良好地培养细胞变得可能。另外，细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积，即使在含细胞生存域的聚酰亚胺多孔质膜体积的总和的1000倍或更少的条件下，可经长期良好地培养细胞。再者，细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积，即使在含细胞生存域的聚酰亚胺多孔质膜体积的总和的100倍或更少的条件下，可经长期良好地培养细胞。进而，细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积，即使在含细胞生存域的聚酰亚胺多孔质膜体积的总和的10倍或更少的条件下，可经长期良好地培养细胞。
以往，作为细胞的三维培养用基材，知作为多孔质聚苯乙烯制基材的Alvetex(注册商标)(ReproCELL公司)、作为聚己内酯制基材的3D Insert-PCL(3D Biotech公司)、作为聚苯乙烯制基材的3D Insert-PS(3D Biotech公司)等。当根据本发明的方法使用聚酰亚胺多孔质膜细胞培养时，与使用以往知的三维培养基材细胞培养时比较，每单位体积的产生物质的效率极高。
另外，在本发明的方法中，细胞不形成细胞块(球形)而在聚酰亚胺多孔质膜中培养。在这样的培养条件下，因为可不剥离细胞而长期间稳定生长，可以产生的物质作为清澄液取得。
另外，能在大量地负载细胞的状态下将聚酰亚胺多孔质膜冷冻、保存。再者，在任意时解冻所述聚酰亚胺多孔质膜，不经预培养工序，能在蛋白质的产生中使用。即使经冷冻－解冻工序，细胞的物质产生能力不降低。以往，为了使用解冻的细胞，有预培养解冻的细胞，向期望的基材或载体负载生存的细胞而培养的必要。但是，能通过使用所述聚酰亚胺多孔质膜，不经作为以往必要的解冻后的预培养工序，使细胞粘接于聚酰亚胺多孔质膜的状态下培养、冷冻、保存、解冻、进而再培养。因此，例如，如果大量地准备在负载细胞的状态下冷冻的聚酰亚胺多孔质，则不经扩大培养工序而在期望之时使用大量的细胞成为可能。这样的冷冻、保存、解冻、及培养的工序可多次重复。
【6.细胞的培养－物质产生系统及培养条件】
在本发明的方法中，细胞的培养－物质产生系统及培养条件可根据细胞的种类等适宜决定。公知适宜于动物细胞、植物细胞、及细菌的各细胞的培养方法，本领域技术人员可使用任意的公知的方法培养应用于聚酰亚胺多孔质膜的细胞。细胞培养基也可根据细胞的种类适宜调制。
动物细胞的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在LONZA公司的细胞培养基产品目录中记载。植物细胞的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在WAKO公司的植物组织培养基系列等中记载。细菌的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在BD公司的一般细菌用培养基产品目录中记载。能在本发明的方法中使用的细胞培养基也可为液体培养基、半固体培养基、固体培养基等的任何的形态。另外，也可通过将作为雾状的液体培养基喷雾到细胞培养容器中，培养基与负载细胞的聚酰亚胺多孔质膜接触。
关于使用聚酰亚胺多孔质膜的细胞的培养也可与微载体或纤维素海绵等其他悬浮型培养载体共存。
在本发明的方法中，在培养中使用的系统的形状、规模等不特别限定，能从细胞培养用的培养皿、瓶、塑料袋、试管至大型的箱适宜利用。例如，含BD Falcon公司制的细胞培养皿或Thermo Scientific公司制的Nunc细胞工厂等。再者，在本发明中，通过使用聚酰亚胺多孔质膜，对于不能先天悬浮培养的细胞也用向悬浮培养装置，进行在悬浮培养类似状态下的培养变得可能。作为悬浮培养用的装置，例如，能使用康宁公司制的旋转瓶或旋转培养等。另外，作为可实现同样的功能的环境，也能使用VERITAS公司的如FiberCell(注册商标)System一样的中空丝培养。
在本发明中，也可在静置培养条件下培养细胞。能通过间歇地更换培养基，单离产生的有用物质。使用一次性培养袋的静置培养，也通过应用聚酰亚胺多孔质膜，效率面飞跃性地提高。
在本发明中，也可在旋转培养或搅拌条件下培养细胞。通过继续摇一次性培养袋，变得都能应付非常大的规模。用旋转培养－旋转瓶的搅拌培养也同样。另外，在这些各方法中，设置连续或间歇的培养基更换系统，指向长期培养也可能。
在本发明中，也可连续培养细胞。例如，在本发明的方法中的培养能以使用向聚酰亚胺多孔质膜上连续添加培养基而回收式样的连续循环或开放型的装置，在空气中露出聚酰亚胺多孔质膜片的型式执行。
在本发明中，细胞的培养也可用从设置于细胞培养容器外的细胞培养基供给手段连续或间歇地向细胞培养容器中供给细胞培养基的系统进行。此时，可为细胞培养基在细胞培养基供给手段和细胞培养容器之间循环的系统。
本发明包括含在温育器内设置细胞培养装置，培养细胞的，实施方式。当用从设置于细胞培养容器外的细胞培养基供给手段连续或间歇地向细胞培养容器中供给细胞培养基的系统进行时，该系统可含作为细胞培养容器的培养单位和作为细胞培养基供给手段的培养基供给单位的细胞培养装置，细胞培养装置可为，其中，培养单位是收容用于负载细胞的1个或多个聚酰亚胺多孔质膜的培养单位，其为具备培养基供给口及培养基排出口的培养单位，培养基供给单位具备培养基收纳容器、培养基供给线和经培养基供给线输送培养基的送液泵，其中培养基供给线的第一端部与培养基收纳容器内的培养基接触，培养基供给线的第二端部经培养单位的培养基供给口连通到培养单位内的培养基供给单位。
另外，在上述细胞培养装置中，培养单位可为不具备空气供给口及空气排出口的培养单位，另外，也可为具备空气供给口及空气排出口的培养单位。培养单位可不具备空气供给口及空气排出口，向培养基通入对于细胞的培养必要的氧等而充分地供给于细胞。再者，在上述细胞培养装置中，培养单位还具备培养基排出线，其中培养基排出线的第一端部与培养基收纳容器连接，培养基排出线的第二端部经培养单位的培养基排出口连通到培养单位内，培养基也可能在培养基供给单位和培养单位循环。
【7.由细胞的物质的产生】
本发明通过如上所述培养细胞，产生比细胞更期望的物质。产生的物质可为在细胞内停留的物质，也可为从细胞分泌的物质。产生的物质能根据物质的种类、性质由公知的方法回收。从细胞分泌的物质的情况，可从细胞培养基回收物质。产生的物质是在细胞内停留的物质的情况中，能通过由使用细胞溶解剂等的化学处理、使用超声波处理、均浆器、破碎用Dispo管等的物理处理等的公知的方法破坏细胞，向细胞外排出物质而回收。本领域技术人员能根据细胞的种类、物质的种类等适宜应用破坏细胞的方法。
【II.物质产生装置】
本发明另外涉及含聚酰亚胺多孔质膜的，用于在本发明的方法中使用的由细胞培养产生物质的装置。在本发明的物质产生装置中，聚酰亚胺多孔质膜可固定使用，或者可悬浮到细胞培养基中使用，可置于培养基中，也可从培养基露出。在物质产生装置中，2个以上的聚酰亚胺多孔质膜也可上下或左右积层。积层的集合体或蓄积体无论是置于培养基中还是从培养基露出均可。
作为由本发明的细胞培养的物质产生装置，只要是含聚酰亚胺多孔质膜的，就可取任意的形态，能使用公知的细胞培养装置。培养装置的形状、规模等不特别限定，能从培养皿、试管至大型的箱适宜利用。例如，含BD Falcon公司制的细胞培养皿或ThermoScientific公司制的Nunc细胞工厂等。再者，在本发明中，通过使用聚酰亚胺多孔质膜，对于不能先天悬浮培养的细胞进行用向悬浮培养装置，在悬浮培养类似状态下的培养也变得可能。作为悬浮培养用的装置，例如，能使用康宁公司制的旋转瓶或旋转培养等。另外，作为可实现同样的功能的环境，也能使用VERITAS公司的如FiberCell(注册商标)System一样的中空丝培养。
由本发明的培养细胞的物质产生装置能以向网上的片连续添加培养基而回收的型式，用连续循环或开放型的装置，在空气中露出聚酰亚胺多孔质膜片的型式执行。
也可还设用于回收本发明的细胞产生的物质的手段。例如，通过使半透膜等直接连接于循环式添加培养基，一边除去乳酸等的不要物，一边追加糖质或氨基酸类，也能构建效率好的长时间培养法兼不要物除去法。
【III.试剂盒】
本发明还涉及含聚酰亚胺多孔质膜的，用于在本发明的方法中使用的试剂盒。
本发明的试剂盒除聚酰亚胺多孔质膜之外，可适宜含对于细胞培养、物质产生、物质回收必要的构成要素。例如，含应用于聚酰亚胺多孔质膜的细胞、细胞培养基、连续培养基供给装置、连续培养基循环装置、支持聚酰亚胺多孔质膜的支架或模块、细胞培养装置、用于确认物质产生的ELISA、细胞破坏手段(例如，细胞溶解剂、破碎用Dispo均浆器)、物质回收手段(例如，超滤离心管、共沉用试剂组及管、抗体等的试剂)、试剂盒的对待说明书等。
虽不限定，但作为一实施方式，在透明的袋内单独或多个保存灭菌的聚酰亚胺多孔质膜，含直接能在细胞培养中使用的形态的包装，或者，含在同袋内与聚酰亚胺多孔质膜一同封入灭菌液体，效率的吸入接种变得可能的膜－液体的一体型形态的试剂盒。
【IV.用途】
本发明还包括聚酰亚胺多孔质膜用于上述的本发明的方法的用途。
【实施例】
以下，基于实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些的实施例。本领域技术人员可基于本说明书的记载容易地向本发明加修饰－变更，它们包括在本发明的技术性范围内。之后，在不特别记述时，“聚酰亚胺多孔质膜”是指总膜厚25μm、空孔率73％的聚酰亚胺多孔质膜。所述聚酰亚胺多孔质膜有2个不同的表面层(A面及B面)和被所述2个表面层之间夹的大空隙层。在A面存在的孔的平均孔径是6μm，在B面存在的孔的平均孔径是46μm。
再者，在以下的实施例中使用的聚酰亚胺多孔质膜通过使含从作为四羧酸成分的3,3’，4,4’-联苯基四羧酸二酐(s-BPDA)和作为二胺成分的4,4’-二氨基二苯基醚(ODA)得到的聚酰胺酸溶液和作为着色前体的聚丙烯酰胺的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上热处理，调制。
<使用的细胞、材料等>
·正常人皮肤成纤维细胞(LONZA公司product code CC-2511)
·正常人成纤维细胞样滑膜细胞HFLS(CELL APPLICATIONS,INC.公司)
·慢性类风湿性关节炎患者来源成纤维细胞样滑膜细胞HFLS-RA(CELLAPPLICATIONS,INC.公司)
·HepG2(CET(Cellular ENGINEERING TECHNOLOGIES,INC.)公司、HEPG2-500)
·CHO-K1(Public Health England cat.85051005)
·CHO DP-12(ATCC CRL-12445)
·CHO-K1用培养基(和光纯药工业株式会社Ham’s F-12 087-08335)
·CHO DP-12用培养基(和光纯药工业株式会社IMDM 098-06465)
·细胞计数试剂盒8(株式会社同仁化学研究所CK04)
·不锈钢网(久宝金属株式会社60目E9117)
·2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司cat.103)
·青霉素-链霉素-两性霉素B悬浮液(X100)(和光纯药工业株式会社161-23181)
·显微镜名、使用的图像软件名
Carl Zeiss公司制LSM 700使用软件ZEN
【实施例1：由正常人皮肤成纤维细胞的自发物质产生】
在本实施例中，使用正常人皮肤成纤维细胞，进行向聚酰亚胺多孔质膜的接种而进行细胞培养之后，确认培养皿内的纤连蛋白的产生量。
向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基(2％FBS、Fibroblast Media、LONZA公司制)1ml，1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜的网结构的A面朝上而浸渍到培养基中。另行，准备每1ml培养基悬浮4.2×106个正常人皮肤成纤维细胞(其中，活细胞是4.2×106个、死细胞是4.0×104个、活细胞率99％)的正常人皮肤成纤维细胞悬浮液。每个片各添加各4×104个/cm2细胞悬浮液到上述正方形容器中的细胞培养基中，在此正方形容器中培养14天。另外，每1ml培养基悬浮3.0×106个正常人皮肤成纤维细胞(其中，活细胞是2.9×106个、死细胞是1.6×105个、活细胞率95％)的，准备正常人皮肤成纤维细胞悬浮液。向5cm2培养皿加1ml的细胞培养基，添加1.0×104个/cm2上述的细胞悬浮液而培养43天，在培养皿中进行细胞培养。
放入1个在上述细胞培养的片的5cm2培养皿及未放入在上述片而且准备细胞培养的5cm2培养皿。
废弃培养基上清，各自新加1ml细胞培养基，以5％的CO2、于37℃温育2天，回收培养基上清。将回收的上清中所含的纤连蛋白量由ELISA法定量(表2)。表2显示对于使用人皮肤成纤维细胞的纤连蛋白的自发的产生量，以聚酰亚胺多孔质膜片和培养皿作为各培养支架使用时的结果。如表2所示，使用聚酰亚胺多孔质膜片时比使用培养皿时，纤连蛋白的自发的产生量多2倍以上。
【表2】每单位面积的纤连蛋白产生量的比较(实施例1)
培养支架 纤连蛋白量(ng/cm2)
聚酰亚胺多孔质膜 3.2×103
培养皿 1.4×103
【实施例2：由正常人成纤维细胞样滑膜细胞HFLS及慢性类风湿性关节炎患者来源成纤维细胞样滑膜细胞HFLS-RA的自发物质产生】
在本实施例中，使用正常人成纤维细胞样滑膜细胞HFLS及慢性类风湿性关节炎患者来源成纤维细胞样滑膜细胞HFLS-RA，进行向聚酰亚胺多孔质膜的接种而进行细胞培养之后，确认培养皿内的IL-6的产生量。
向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基(10％FBS、Synoviocyte GrowthMedium、CELL APPLICATIONS,INC.公司制)1ml，1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜的网结构的A面朝上而浸渍到培养基中。另行，准备每1ml培养基悬浮1.5×106个HFLS细胞(其中，活细胞是1.4×106个、死细胞是2.0×104个、活细胞率99％)的HFLS细胞悬浮液。每片各添加4.0×104个/cm2细胞悬浮液到上述正方形容器中的细胞培养基中，在此正方形容器中培养13天。另外，向5cm2培养皿加1ml的细胞培养基，另行，准备每1ml培养基悬浮5.9×105个HFLS细胞(其中，活细胞是5.7×105个、死细胞是2.0×104个、活细胞率97％)的HFLS细胞悬浮液。添加7×103个/cm2细胞悬浮液而培养8天，在培养皿中进行细胞培养。
同样地，准备每1ml培养基悬浮2.2×106个HFLS-RA细胞(其中，活细胞是2.0×106个、死细胞是1.6×105个、活细胞率93％)的HFLS-RA细胞悬浮液。每片各添加4.0×104个/cm2细胞悬浮液到上述正方形容器中的细胞培养基中，在此正方形容器中培养13天。另外，向5cm2培养皿加1ml的细胞培养基，另行，准备每1ml培养基悬浮5.8×105个HFLS-RA细胞(其中，活细胞是5.6×105个、死细胞是2.0×104个、活细胞率97％)的HFLS-RA细胞悬浮液。添加7.0×103个/cm2细胞悬浮液而培养8天，在培养皿中进行细胞培养。
准备2个5cm2培养皿，各自放入1个在上述细胞培养的HFLS片、HFLS-RA片。再者，准备在上述中未放入片而细胞培养的HFLS、HFLS-RA的5cm2培养皿。
废弃培养基上清而各自新加1ml细胞培养基，5％的CO2、于37℃温育3天，回收培养基上清。将回收的上清中所含的IL-6量由ELISA法定量(表3)。在表3中，显示对于使用正常人成纤维细胞样滑膜细胞的IL-6的自发的产生量，以聚酰亚胺多孔质膜片和培养皿作为各培养支架使用时的结果。如表3所示，使用聚酰亚胺多孔质膜片时比使用培养皿时，IL-6的自发的产生量是在正常人成纤维细胞样滑膜细胞HFLS的情况中多约25倍以上、在慢性类风湿性关节炎患者来源成纤维细胞样滑膜细胞HFLS-RA的情况中多约5倍以上。
【表3】由人成纤维细胞样滑膜细胞的IL-6的产生(实施例2)
细胞和培养支架 IL-6量(pg/ml)
人成纤维细胞样滑膜细胞/聚酰亚胺多孔质膜 2.7×102
RA人成纤维细胞样滑膜细胞/聚酰亚胺多孔质膜 3.5×103
人成纤维细胞样滑膜细胞/培养皿 1.1×101
RA人成纤维细胞样滑膜细胞/培养皿 7.1×102
【实施例3：由人肝癌来源细胞株HepG2细胞的自发的白蛋白产生】
在本实施例中，向聚酰亚胺多孔质膜接种人肝癌来源细胞株HepG2细胞而进行细胞培养之后，确认在一定期间自发地向培养基中释放的白蛋白的产生量。
向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基(10％FBS、HEPG2.E.MEDIA-450、Cellular Engineering Technologies Inc公司制)1ml，1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜的网结构的A面朝上而浸渍到培养基中。另行，准备每1ml培养基悬浮1.6×106个HepG2细胞(其中，活细胞是1.4×106个、死细胞是1.3×105个、活细胞率92％)的HepG2细胞悬浮液。每片各添加2×104个/cm2细胞悬浮液到上述正方形容器中的细胞培养基中，在此正方形容器中培养21天。另外，向10cm2培养皿加2ml的细胞培养基，添加2×104个/cm2上述的细胞悬浮液而培养21天，在培养皿中进行细胞培养。
准备放入3个、1个在上述中培养细胞的片的10cm2培养皿及在上述细胞培养的10cm2培养皿。废弃培养基上清而各自新加2ml细胞培养基，5％的CO2、于37℃温育3小时，回收培养基上清。将回收的上清中所含的白蛋白量由ELISA法定量(表4、5)。表4及5显示对于使用HepG2细胞的白蛋白的自发的产生量，以聚酰亚胺多孔质膜片和培养皿作为各培养支架使用时的结果。表4显示膜的每单位面积的白蛋白产生量，进而，表5显示每1细胞的白蛋白的产生量。由于共存的膜的枚数与每细胞的白蛋白产生量无相关，每聚酰亚胺多孔质膜的产生量变得一定，预计与细胞数的升高一同，物质产生依比例进展。
【表4】由HepG2细胞的每单位面积的白蛋白的产生量(实施例3)
培养支架和细胞量 白蛋白量(ng/cm2)
聚酰亚胺多孔质膜：3个 2.8×102
聚酰亚胺多孔质膜：1个 3.2×102
培养皿 2.5×101
【表5】由HepG2细胞的每1细胞的白蛋白的产生量(实施例3)
培养支架和细胞量 白蛋白量(pg/细胞)
聚酰亚胺多孔质膜：3个 2.8×10-1
聚酰亚胺多孔质膜：1个 2.7×10-1
培养皿 9.7×10-2
【实施例4：由产生G-CSF的CHO-K1细胞株的物质产生】
在本实施例中，测定由使用产生G-CSF的CHO-K1细胞的细胞培养产生并释放到培养基中的G-CSF的量。
准备每1ml培养基4.1×106个产生G-CSF的CHO-K1细胞(其中，活细胞是3.6×106个、死细胞是4.1×105个、活细胞率90％)的悬浮液。对于8×12.5cm的长方形的聚酰亚胺多孔质膜的A面每片接种上述细胞悬浮液各4.1×104个/cm2，向10×14cm的灭菌的长方形容器加细胞培养基(1％FBS、Ham’s F-12、和光纯药工业株式会社)20ml，浸渍到培养基中。在此长方形容器中进行每周2次的培养基更换，培养7天。除去培养的片的培养基上清，新加20ml细胞培养基，5％的CO2、于37℃温育24小时，回收培养基上清。将回收的上清中所含的G-CSF量由ELISA法定量(表6)。
【表6】
培养支架 G-CSF量(pg/细胞/日)
聚酰亚胺多孔质膜 3.4×10-2
【实施例5：由产生抗人IL-8的CHO DP-12细胞的物质产生】
在本实施例中，通过测定由使用产生人抗IL-8抗体的CHO DP-12细胞的细胞培养产生并释放到培养基中的抗人IL-8抗体的量，研究使用聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养系统的效率。作为比较例，调查在通常的培养皿中的培养中的同抗体产生量。
向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基(2％FBS、IMDM、和光纯药工业株式会社)0.5ml，使网结构的A面朝上而各自浸渍灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜。向培养基内片上每1个片各自添加4×104个产生人抗IL-8的CHO DP-12细胞悬浮液，以每1周2次的比例进行培养基更换，继续实施细胞培养。85天细胞培养之后，使用CCK8而测定细胞数。向各1个10cm2培养皿放入2个细胞培养的片，各自加2ml细胞培养基，5％的CO2、于37℃温育24小时，回收培养基上清。将回收的上清中所含的抗人IL-8抗体量由ELISA法定量(表7的聚酰亚胺多孔质膜1及聚酰亚胺多孔质膜2)。
另外，向60cm2培养皿加12ml的细胞培养基，准备每1ml培养基5.3×106个产生人抗IL-8的CHO DP-12细胞(其中，活细胞是5.3×106个、死细胞是2.8×105个、活细胞率95％)的悬浮液，各接种2.0×104个/cm2。在培养24小时后回收培养基上清。将回收的上清中所含的人抗IL-8抗体量由ELISA法定量(表7的培养皿1及培养皿2)。
【表7】
培养支架 人抗IL-8抗体量(pg/细胞/日)
聚酰亚胺多孔质膜1 16.2
聚酰亚胺多孔质膜2 19.3
培养皿1 5.4
培养皿2 4.6
令人惊讶地，当作为培养支架使用聚酰亚胺多孔质膜时，与使用培养皿时比较，CHO-K1细胞的每1细胞的物质产生量增大3倍以上。
【实施例6：由产生抗人IL-8的CHO DP-12细胞的物质产生】
在本实施例中，在使用产生人抗IL-8抗体的CHO DP-12细胞的细胞培养中，每聚酰亚胺多孔质膜片冷冻培养细胞，再次融解之后，研究培养时，在持续通常的培养时产生并释放到培养基中的抗人IL-8抗体量和变化发生与否。
向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基(2％FBS、IMDM、和光纯药工业株式会社)0.5ml，使网结构的A面朝上而各自浸渍灭菌的6个1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜。向培养基内片上每1个片各自添加4×104个产生人抗IL-8的CHO DP-12细胞悬浮液，以每1周2次的比例进行培养基更换，继续实施细胞培养。78天细胞培养之后，使用CCK8而测定细胞数。其后，向各1个10cm2培养皿放入由细胞培养负载细胞的聚酰亚胺多孔质膜片6个之中2个，各自加2ml细胞培养基，5％的CO2、于37℃温育24小时，回收培养基上清。将回收的上清中所含的抗人IL-8抗体量由ELISA法定量(表8的非冷冻片1及非冷冻片2)。
另外，在灭菌条件下向冷冻保存袋移由细胞培养负载细胞的聚酰亚胺多孔质膜片6个之中4个，向其中加3ml作为细胞冷冻保存液的CELLBANKER。用程序冷冻器用2条件(每1分钟1℃、或者每10分钟1℃)于-80℃冷冻后，于-80℃保存24小时，向液氮中移动。3天后，将袋于37℃加温而融解内容物，放入培养基2ml而在温育器内放置24小时之后，向2cm×2cm的灭菌的正方形容器移片，加1ml细胞培养基而培养3天。其后，向10cm2培养皿放入各1个片，各自加2ml细胞培养基，5％的CO2、于37℃温育24小时，回收培养基上清。将回收的上清中所含的抗人IL-8抗体量由ELISA法定量(表8的冷冻片1～4)。确认不到随冷冻的抗IL-8产生量的变化。
【表8】
人抗IL-8抗体量(pg/细胞/日)
冷冻片1 26.4
冷冻片2 18.0
冷冻片3 24.0
冷冻片4 28.7
非冷冻片1 16.2
非冷冻片2 19.3
【实施例7：由人皮肤成纤维细胞长期培养时的气相传代的增殖确认】
向直径6cm的培养皿加2ml的培养基，向灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜的网结构的A面每1个片接种4×104个人皮肤成纤维细胞，1个月培养。其后，将片切断成4分之1，再继续培养而合计培养230天。其后，在3.5cm皿中央重复设置3个1.4cm见方的不锈钢网，在其上置上述聚酰亚胺多孔质膜，用灭菌的1.4cm见方的空的聚酰亚胺多孔质膜2个夹。在该状态下加培养基1ml，则培养基与片成同样的高度。在此状态下向CO2温育器内移动，以每1周2次的比例进行培养基更换而继续实施细胞培养。
培养7天后，将各片分为各1个，作为单一的片继续培养。在7天、10日、16天、21日、28天、42日、56天后使用CCK8测量细胞数，对于原来的片和后接地的空的聚酰亚胺多孔质膜，将细胞的增殖行为使用用CCK8的染色法观察。观察到从长期间培养人皮肤成纤维细胞的聚酰亚胺多孔质膜有效率地向空的聚酰亚胺多孔质膜移动细胞，继续增殖的行为。结果示于图1。
对于不经气相传代而在聚酰亚胺多孔质膜上继续长期培养294天的人皮肤成纤维细胞培养片及将气相传代经第230天同期间培养的基盘片及由气相培养传代后培养56天的上下2个片，将生息的人皮肤成纤维细胞产生的纤连蛋白用ELISA测定，用向培养片的培养基中经24小时释放的纤连蛋白的量比较。不影响培养期间及气相传代，确认稳定的纤连蛋白的产生。结果示于表9。作为比较对象，并记从在聚酰亚胺多孔质膜上培养13天的片2个产生的纤连蛋白量。
【表9】
【实施例8：人皮肤成纤维细胞的冷冻及物质产生】
向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基0.5ml，使用不网结构的A面朝上而各自浸渍灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜。向培养基内片上每1个片各自添加4×104个人皮肤成纤维细胞悬浮液，在CO2温育器内开始培养。以每1周2次的比例进行培养基更换而继续实施细胞培养，49天细胞培养之后，当使用CCK8测定细胞数时，是9.1×104个。
向加了CELLBANKER3ml的冷冻保存袋之中放入此细胞生长的片，用程序冷冻器以每10分钟降低1℃冷冻至-80℃后，于-80℃保存24小时，向液氮中移动。5天后，将袋于37℃加温而融解内容物，放入培养基2ml而在温育器内放置24小时。在24小时后，5天后，8天后，13天后，21天后，29天后及35天后使用CCK8测定细胞数。24小时后，8天后，21天后及35天后的比活性是34％、91％、105％及152％。培养35天后，将在同片生长的人皮肤成纤维细胞的纤连蛋白产生量由ELISA法测定。结果示于表10。再者，作为比较对象，并记从不冷冻而在聚酰亚胺多孔质膜上培养13天的片2个产生的纤连蛋白量。确认不受冷冻导致的损伤，物质产生继续。
【表10】

Claims (22)

1.使用细胞而产生物质的方法，其包括将细胞应用于聚酰亚胺多孔质膜而培养细胞，由细胞产生物质。
2.权利要求1所述的方法，其中上述物质选自蛋白质、糖蛋白质及病毒。
3.权利要求1或2所述的方法，其中在静置培养条件下培养细胞。
4.权利要求1或2所述的方法，其中在旋转培养或搅拌条件下培养细胞。
5.权利要求1或2所述的方法，其中连续培养细胞。
6.权利要求5所述的方法，其包括在温育器内设置细胞培养装置，培养细胞，
其中，上述细胞培养装置含：
收容用于负载细胞的1个或多个聚酰亚胺多孔质膜的培养单位，其为具备培养基供给口及培养基排出口的培养单位，和
培养基供给单位，其具备培养基收纳容器、培养基供给线和经培养基供给线输送培养基的送液泵，其中培养基供给线的第一端部与培养基收纳容器内的培养基接触，培养基供给线的第二端部经培养单位的培养基供给口连通到培养单位内。
7.权利要求6所述的方法，其中上述细胞培养装置无空气供给口、空气排出口及氧透过膜。
8.权利要求1～7之任一项所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。
9.权利要求8所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是通过使含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上热处理得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。
10.权利要求8或9所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是有2个不同的表层面和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔质膜。
11.权利要求10所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜的膜厚是75μm以下。
12.权利要求1～11之任一项所述的方法，其中将上述聚酰亚胺多孔质膜
(i)折叠，
(ii)卷成轮状，
(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者
(iv)结成绳状，
而在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定。
13.权利要求1～12之任一项所述的方法，其中将2个以上的聚酰亚胺多孔质膜在细胞培养基中上下或左右积层而使用。
14.权利要求1～13之任一项所述的方法，其中细胞以表达物质的方式由基因工程学技术转化。
15.权利要求1～14之任一项所述的方法，其中细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌及细菌。
16.权利要求15所述的方法，其中动物细胞是属于脊椎动物门的动物来源的细胞。
17.权利要求15或16所述的方法，其中动物细胞选自中国仓鼠卵巢组织来源细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾脏来源株化细胞(Vero细胞)、人肝癌来源细胞(HepG2细胞)、狗肾脏肾小管上皮细胞来源的细胞株(MDCK细胞)及人肝癌组织来源建立细胞株(huGK-14)。
18.权利要求15所述的方法，其中细菌选自乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及蓝细菌。
19.用于在权利要求1～18之任一项所述的方法中使用的物质产生装置，其含聚酰亚胺多孔质膜。
20.权利要求19所述的物质产生装置，其中2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右积层。
21.用于在权利要求1～18之任一项所述的方法中使用的试剂盒，其含聚酰亚胺多孔质膜。
22.聚酰亚胺多孔质膜用于权利要求1～18之任一项所述的方法的用途。
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