CN113142187B - 使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的长期培养及冷冻保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的长期培养方法，细胞培养装置和试剂盒。本发明还涉及使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的冷冻保存方法和试剂盒。

Description

使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的长期培养及冷冻保存方法

本申请是2016年1月26日提交的发明名称为“使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的长期培养、与使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的冷冻保存方法”的发明专利申请201680007125.4的分案申请。

【技术领域】

本发明涉及，细胞的长期培养方法、细胞培养装置和试剂盒。详细地说，涉及使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的长期培养方法，细胞培养装置和试剂盒。此外，本发明涉及细胞的冷冻保存方法和试剂盒。具体而言，涉及使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的冷冻保存方法和试剂盒。

【背景技术】

【细胞培养】

细胞在体内一般作为三维群体存在，在经典的平面培养中，细胞以粘到容器的形式单层培养。在附着细胞的培养中，长期以来，不同的培养方法已通过培养皿等被开发。通过这种培养皿等进行培养的情况下，培养细胞持续增殖，成为被称为“铺满”的无法再增殖更多的情况下，增殖停止。虽然也取决于细胞类型，在不传代的情况下如果继续这种铺满状态，那么在一定的时间段后，开始自发地剥落，细胞不能传代的情况也在许多细胞中被发现。

随着再生医疗中对由细胞移植与细胞的物质生产得到更多关注，附着细胞的培养方法不断增长的需求。迄今，利用微载体等的载体的疑似悬浮培养或使用工作表面的球状体培养或使用中空纤维作为细胞培养场所的中空纤维培养等，如各种立体培养和载体培养等已被开发。中空纤维培养在被保护在牢固的中空纤维的环境下，作为将细胞恒定和长期培养的方法论而进行处理，此外，微载体培养、通过空气升液法或以连续培养为目的的装置的设计的长期培养也已经被尝试过很多。

这些方法的特点是通过向应用载体的生长空间赋予三维环境而扩大增殖场所，在这种大的生长场所中通过装置设计和方法设计使得载体其自身在牢固环境中得到保护，目的是使得培养期间延长。在另一方面，在这些方法中使用的系统，是那些需要复杂的装置或大容量装置的，或一旦培养开始，成为难以干预培养环境本身的封闭系统的情况多见。因此，虽然将细胞长期培养、而且可以方便处理系统的方法论被需求，但是，恰当的方法论还没有被开创。

在另一方面，如非专利文献1和2中所示，关于模仿体内器官的长期细胞培养方法，已经报道使用立体载体的研究例子。这些都是胰脏的胰岛的重建活体包埋实验或试验管内的骨髓细胞长期培养等，旨在部位选择性重建的研究成果事例。虽然存在针对长期培养课题3维立体环境中的细胞培养物的意义和价值被示出的重要成就，各个载体对每个用途具有高度特异性，所用的材料是生物相容性材料的纤维状结构体和通过绘图构成的高级结构体，因此，缺乏通用性，处理也缺乏一般性。更简单和可适用于多样化状态的方法论的发展已经被期望。

细胞通过其生存形式的特征，主要分为附着细胞和悬浮细胞两种。任何细胞在进行人工培养的情况下，通过细胞接种、培养、增殖、传代、经由冷冻保存这样的周期。

近来，随着使用培养细胞的疫苗，酶，激素，抗体，细胞因子等的体内蛋白质等的生产和或再生医疗中细胞移植得到更多关注，将大量的细胞有效地并且简单地培养的方法正在被开发。特别地，使用载体的细胞培养方法，由于效率方面的吸引力和通用性而得到多方面注意，有各种各样的方法正在开发。一般地，这些细胞培养涉及与细胞冷冻保存有关的技术，也从许多方面进校研究。存在以下报道：脱离经典冷冻法，尝试更容易地通过培养板本身的细胞冷冻的技术和(专利文献4)，使用立体载体、旨在改善冷冻方面细胞生存率的方法(专利文献5)，或者，通过使用纤维性载体，改进培养细胞的冷冻保存特性的实例(专利文献6)，检验干细胞的生存效率的实例(非专利文献3)等的报道。

然而，作为冷冻保存介质，被限制为具有独特结构的纤维性材料，但这种材料，虽然具有作为冷冻保存介质的机能，但是不是作为细胞培养载体原样可以使用的材料，只能作为暂时保持体而被利用。简便且有效地，从冷冻保存到的细胞(细胞唤醒)解冻、从使用到再冷冻可以自始至终地实施的/新方法论的构建是被期望的。

【聚酰亚胺多孔膜】

该聚酰亚胺是包含在重复单元中具有酰亚胺键的高分子(聚合物)的总称。芳族聚酰亚胺是指芳族化合物通过直接酰亚胺键被连接的高分子(聚合物)。由于芳族聚酰亚胺具有芳族和芳族通过酰亚胺键的共轭结构，具有刚性和牢固的分子结构，并且由于酰亚胺键具有强的分子间力，具有非常高的水平的热的，机械的，化学的性质。

聚酰亚胺多孔膜过滤器在本发明前更多地用于滤器，低介电常数膜，燃料电池电解质膜，特别地以电池关系中心的用途。专利文献7-9中记载了，特别是在气体等物质透过性中是优异的，孔隙率高，两个表面的平滑性优异，相对强度高，孔隙率高，但是对于膜厚度方向的压缩应力耐力优良的具有大量大孔隙的聚酰亚胺多孔膜。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：特开平5-123168

专利文献2：特开平10-108673

专利文献3：特公平6-30570

专利文献4：特开2002-34551

专利文献5：特许第5140155号

专利文献6：特开2003-47464

专利文献7：WO2010/038873

专利文献8：特开2011-219585

专利文献9：特开2011-219586

【非专利文献】

非专利文献1：Mortera-Blanco et al.,Biomaterials 32(2011)9263-9270

非专利文献2：Daoud et al.,Biomaterials 32(2011)1536-1542

非专利文献3：A.Bissoyi et al./Cryobiology 68(2014)332-342

【发明概述】

【发明要解决的课题】

本发明的目的是提供，适应所要求的条件和形式，能够简便且稳定地长期培养细胞，针对在培养中的变化也能够容易应对的细胞培养方法，并且，提供用于在培养方法中使用的细胞培养装置和试剂盒。

此外，本发明的目的是提供，简便且有效地，从细胞的冷冻保存到细胞的解冻(细胞唤醒)，从使用到重新冷冻，可以自始至终地实施的细胞的冷冻方法。

【用于解决课题的手段】

本发明人等发现，通过使用聚酰亚胺多孔膜进行细胞培养，可以将细胞效率良好地在长期间内培养。

本发明优选包括，但不限于，以下的方式。

[实施方式1]

细胞的长期培养方法，其是包括

(1)将细胞播种到聚酰亚胺多孔膜，和

(2)将播种了细胞的聚酰亚胺多孔膜由细胞培养基润湿，将细胞培养30天以上的方法。

[实施方式2]

实施方式1所述的方法，在工序(2)中，培养细胞60天以上。

[实施方式3]

实施方式1所述的方法，在工序(2)中，培养细胞120天以上。

[实施方式4]

实施方式1-3之任一项所述的方法，两种以上的聚酰亚胺多孔膜上下或左右地层叠在细胞培养基中。

[实施方式5]

实施方式1-4之任一项所述的方法，将聚酰亚胺多孔膜

(i)折叠，

(ii)卷成卷状，

(iii)将片材或小片通过丝状结构体连接，或

(iv)系成绳状

悬浮或固定在细胞培养容器中的细胞培养基中。

[实施方式6]

实施方式1-5之任一项所述的方法，在工序(2)的培养中，聚酰亚胺多孔膜的部分或全部不与细胞培养基的液相接触。

[实施方式7]

实施方式1-6之任一项所述的方法，在工序(2)的培养中，在细胞培养容器中包含的细胞培养基的总体积是，包括细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜体积总和的10000倍或比其更少。

[实施方式8]

实施方式1-7之任一项所述的方法，在工序(2)的培养中，在细胞培养容器中包含的细胞培养基的总体积是，包括细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜体积总和的100倍或比其更少。

[实施方式9]

实施方式1-8之任一项所述的方法，工序(2)的培养，通过从细胞培养容器外设置的细胞培养基供给器件、连续或间歇地将细胞培养基供给至细胞培养容器中的系统进行。

[实施方式10]

实施方式9所述的方法，细胞培养基在细胞培养基供给器件和细胞培养容器中之间循环。

[实施方式11]

实施方式9或10所述的方法，其中前述系统是细胞培养装置，其包括作为细胞培养容器的培养单元以及作为细胞培养基供给器件的培养基供给单元、此处

培养单元是容纳用于承载细胞的一个或多个聚酰亚胺多孔膜的培养单元，是具有培养基供给口和培养基排出口的培养单元，

培养基供给单元具备培养基收纳容器，培养基供给线，以及用于通过所述培养基供给线连续地或间歇地将培养基送液的送液泵，此处培养基供给线的第一端部与培养基收纳容器内的培养基接触，培养基供给线的第二端部通过培养单元的培养基供给口与培养单元内连通。

[实施方式12]

实施方式13所述的方法，培养单元是不具备空气供给口，空气排出口，和氧交换膜的培养单元。

[实施方式13]

实施方式11或12所述的方法，培养单元还具备培养基排出线，其中，培养基排出线的第一端部连接到培养基收纳容器，培养基排出线第二端部经由培养单元的培养基排出口，连通至培养单元内，培养基可以在培养基供给单元以及培养单元之间循环。

[实施方式14]

实施方式1-13之任一项所述的方法，细胞选自：动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母菌和细菌。

[实施方式15]

实施方式14所述的方法，动物细胞是来自属于脊椎动物的动物的细胞。

[实施方式16]

实施方式15所述的方法，细胞选自：CHO细胞，CHO-K1细胞株，CHODP-12细胞株，CHO细胞关联株，Vero细胞，和MDCK细胞。

[实施方式17]

实施方式1～16之任一项所述的方法，聚酰亚胺多孔膜是包括从四羧酸二酐和二胺所获得的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜。

[实施方式18]

实施方式17所述的方法，聚酰亚胺多孔膜是，使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后、在250℃以上进行热处理、由此得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。

[实施方式19]

用于在实施方式1～18所述的方法中使用的细胞培养装置，含有聚酰亚胺多孔膜。

[实施方式20]

实施方式19所述的细胞培养装置，2个以上的聚酰亚胺多孔膜上下或左右地层叠。

[实施方式21]

用于实施方式1～实施方式13之任一项所述的方法中使用的试剂盒，含有聚酰亚胺多孔膜。

[实施方式22]

聚酰亚胺多孔膜在细胞的长期培养方法中的用途。

[实施方式23]

细胞的冷冻保存方法，其包括：

(1)将细胞承载至聚酰亚胺多孔膜的工序，

(2)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜放置在冷冻细胞的条件下，由此冷冻由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞的工序，和

(3)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜以保持冷冻状态的条件保存的工序。

[实施方式24]

实施方式23所述的方法，在工序(1)中，通过在聚酰亚胺多孔膜接种细胞，使细胞承载于聚酰亚胺多孔膜。

[实施方式25]

实施方式23所述的方法，在工序(1)中，通过将细胞接种到聚酰亚胺多孔膜而培养，使细胞承载于聚酰亚胺多孔膜。

[实施方式26]

实施方式23-25之任一项所述的方法，工序(3)之后，还包括

(4)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜在解冻细胞的条件下放置，由此使由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞解冻。

[实施方式27]

实施方式26所述的方法，工序(4)之后，还包括

(5)将细胞解冻的聚酰亚胺多孔膜由细胞培养基润湿而培养细胞的工序。

[实施方式28]

实施方式27所述的方法，在工序(5)中，培养细胞直到培养的细胞在聚酰亚胺多孔膜外也增殖。

[实施方式29]

实施方式27或28所述的方法，在工序(5)中，与细胞解冻的聚酰亚胺多孔膜一同、将不承载细胞的另外一个或多个聚酰亚胺多孔膜由细胞培养基润湿并培养，由此，使细胞承载于另外一个或多个聚酰亚胺多孔膜。

[实施方式30]

实施方式27～29之任一项所述的方法，工序(5)之后，还包括

(6)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜的部分或全部，在冷冻细胞的条件下放置，由此冷冻由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞的工序，和

(7)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜以保持冷冻状态的条件保存的工序。

[实施方式31]

实施方式30所述的方法，工序(1)至(7)重复多次。

[实施方式32]

实施方式23～31之任一项所述的方法，细胞选自：动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母菌和细菌。

[实施方式33]

实施方式32所述的方法，动物细胞是来自属于脊椎动物的动物的细胞。

[实施方式34]

实施方式32或33所述的方法，细胞是附着细胞。

[实施方式35]

实施方式32或33所述的方法，细胞是悬浮细胞。

[实施方式36]

实施方式23～35之任一项所述的方法，聚酰亚胺多孔膜是，包括从四羧酸二酐和二胺获得的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜。

[实施方式37]

实施方式36所述的方法，聚酰亚胺多孔膜是，使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后、在250℃以上进行热处理、由此得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。

[实施方式38]

实施方式36或37所述的方法，聚酰亚胺多孔膜是具有两个不同的表面层和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔膜。

[实施方式39]

聚酰亚胺多孔膜，用于细胞的冷冻保存。

[实施方式40]

用于在实施方式23～28之任一项所述的方法中使用的聚酰亚胺多孔膜。

[实施方式41]

用于在实施方式23～38之任一项所述的方法中使用的试剂盒，含有聚酰亚胺多孔膜。

[实施方式42]

聚酰亚胺多孔膜在实施方式23～38的任一项所述的方法中的用途。

【发明的效果】

本发明，通过使用聚酰亚胺多孔膜，能够将细胞简便且稳定地进行长期间培养。在本发明中，成为培养载体的聚酰亚胺多孔膜具有，细胞能够通过的大口径的连接孔，因此，即使非常大量的细胞在其空间中生长，最后三维空间也得到了保障。因此，经典平面培养中如铺满的状态发生的情况的培养期间的限制难以发生。此外，在本发明中，当细胞培养时，不需要特别将聚酰亚胺多孔膜通过胶原进行预处理。此外，因为聚酰亚胺多孔膜是柔性的薄膜材料，其可以简便地以自由的形状弯曲、折叠或切割。因此，通过培养，任何时候如果必要的话，除去含有细胞的聚酰亚胺多孔膜，可以经受处理和测量等。此外，它也可以适用于细胞培养自动化。此外，由于聚酰亚胺多孔膜是极其耐热的极好的材料，如灭菌等的操作也可以非常容易实施。

通过使用聚酰亚胺多孔膜冷冻细胞，可以有效冷冻保存大量的细胞，并且是有效地操作细胞。从冷冻状态到解冻后，在保持原样的聚酰亚胺多孔膜上也可以继续细胞培养。另外，将继续细胞培养的聚酰亚胺多孔膜与细胞未生长的聚酰亚胺多孔膜等的其它载体接触，或放置在所述其它载体附近，可以使细胞移动、增殖。细胞移动完成后，取出原始聚酰亚胺多孔膜、将其再冷冻，可以被保存直到下次使用。通过这种方式，从细胞唤醒到使用和冷冻的一系列的操作可以通过相同的材料进行。在这些作业中，胰蛋白酶等的细胞剥离操作，胶原蛋白涂层等的繁杂作业是特别没有必要的，因此，如，作业是简便和有效的，快速的操作是可能的。此外，本发明的方法也适合于应用到包括自动化工序的用途。另外，在效率方面，由于在至少25微米的非常薄的膜中可以生长大量细胞，每单位体积的效率变得前所未有的高。例如，使用有前途(被期望)的细胞株等进行物质生产时，除了长期间使用，还能够原样冷冻、保存细胞，在必要时重新使用。有前途(被期望)的细胞株的库化等也可以容易地进行。

【附图的简要说明】

[图1]图1是示出了使用聚酰亚胺多孔膜的细胞培养的模型图。

[图2]图2示出了细胞培养装置的一个实例。

[图3]图3示出了人皮肤成纤维细胞的使用聚酰亚胺多孔膜的长期培养的结果。

[图4]图4示出了人皮肤成纤维细胞的使用聚酰亚胺多孔膜的长期培养的结果。

[图5]图5示出了Vero细胞的使用聚酰亚胺多孔膜的长期培养的结果。

[图6]图6示出了使用聚酰亚胺多孔膜的细胞冷冻和解冻的工程概念图。与细胞悬浮液的冷冻、解冻过程不同，通过聚酰亚胺多孔膜可以处理直接的细胞聚集体，因此如离心分离等的工序被引人注目地删去。

[图7]图7是聚酰亚胺多孔膜，涉及悬浮细胞的冷冻、解冻细胞和操作的概念图。活用悬浮细胞在增殖过程中从聚酰亚胺多孔膜溢出的特性，与作为样品重复使用的相关的优点被示出。

[图8]图8示出了人皮肤成纤维细胞的使用聚酰亚胺多孔膜的长期培养的结果。

[图9]图9示出了人皮肤成纤维细胞的使用聚酰亚胺多孔膜的长期培养的结果。

[图10]图10显示了使用聚酰亚胺多孔膜冷冻CHO DP-12细胞后，解冻、培养的结果进行。

[图11]图11显示使用聚酰亚胺多孔膜冷冻人皮肤成纤维细胞后，解冻、培养的结果。

【用于实施发明的方式】

【I.培养细胞的方法】

本发明涉及细胞的长期培养方法。顺便提及，国际申请号PCT/JP2014/070407的全部内容，通过引用并入本文。

本发明的细胞的培养方法包括将细胞播种到聚酰亚胺多孔膜并培养。本发明人已发现，聚酰亚胺多孔膜适合于细胞粘附、培养，并想到了本发明。本发明的方法特征在于，将细胞播种到向聚酰亚胺多孔膜，在聚酰亚胺膜的表面或内部培养细胞。

【1.细胞播种到聚酰亚胺多孔膜】

细胞播种到聚酰亚胺多孔膜的具体工序没有特别的限制。本说明书所述的工序，或者适合用于将细胞播种至膜状载体的任何方法均可以采用。在本发明的方法中将细胞播种到聚酰亚胺多孔膜包括，但不限于，例如，以下方式。

(A)包括将细胞接种到前述聚酰亚胺多孔膜的表面的工序的方式；

(B)包括使聚酰亚胺多孔膜干燥的表面承载细胞悬浮液、

放置，或者通过移动聚酰亚胺多孔膜，以促进液体的流出，或刺激表面的一部分，使细胞悬浮液被吸入至前述膜，并且，

使细胞悬浮液中的细胞停留在前述膜内，使水分流出

的工序的方式；而且，

(C)包括将前述聚酰亚胺多孔膜的一个面或两个面用细胞培养物或经灭菌的液体润湿，

将细胞悬浮液装填到前述经润湿的聚酰亚胺多孔膜，并且，

使细胞悬浮液中的细胞停留在前述膜内，使水分流出，

的工序的方式。

(A)的方式，包括在聚酰亚胺多孔膜的表面上直接接种细胞，细胞块。或者，还包括将聚酰亚胺多孔膜放置在细胞悬浮液中，从而使细胞培养液浸润膜的表面的方式。

接种于聚酰亚胺多孔膜的表面的细胞附着到聚酰亚胺多孔膜，进入多孔的内部。优选地，不添加特别是来自外部的物理的或化学的力，所述细胞自发地附着到聚酰亚胺多孔膜。接种于聚酰亚胺多孔膜的表面的细胞在膜的表面和/或内部可稳定地生长和增殖。根据细胞生长和增殖的膜的位置，可以采取各种不同的形式。

(B)的方式中，在聚酰亚胺多孔膜的经干燥的表面承载细胞悬浮液。放置聚酰亚胺多孔膜，或通过移动前述聚酰亚胺多孔膜、以促进液体的流出，或刺激表面的一部分，使细胞悬浮液被吸入前述膜，通过前述而使细胞悬浮液渗透到膜中。不受理论的束缚，但是据信这是由于来自聚酰亚胺多孔膜的各表面形状等的性质所决定的。本方式中，将在膜的细胞填装的位置吸入细胞悬浮液、从而接种。

或者，如在(C)的实施例中，其中将前述聚酰亚胺多孔膜的一个面或两个面的部分或全体用细胞培养液或经灭菌的液体润湿，从而在经润湿的聚酰亚胺多孔膜中填装细胞悬浮也可。在这种情况下，细胞悬液的通过速度大大提高。

例如，以防膜的飞散为主要目的、润湿膜端一部分(膜極一部)的方法(在下文中，这被称为“单点湿法”)可以使用。单点湿法，非常接近那些基本上不润湿膜的干法((B)的方式)。但是认为，关于被润湿的小部分，细胞液的膜渗透很快。此外，在聚酰亚胺多孔膜的一个面或两个面的整体被充分润湿的膜(在下文中，这被称为“湿膜”)装填细胞悬浮液的方法(在下文中的方法，这被描述为“湿膜法”)可以使用。在这种情况下，在整个聚酰亚胺多孔膜中，将细胞悬液的通过速度大大提高。

在(B)和(C)的方式中，使细胞悬浮液中的细胞停留在前述膜内，使水分流出。由此浓缩细胞悬浮液中的细胞的浓度，使细胞以外的不需要的成分与水分一起流出等的处理也是可能的。

有时将(A)方式称为“自然接种”，将方式(B)和(C)称为“吸入接种”。

虽然不受限制，但是优选地，在聚酰亚胺多孔膜中活细胞选择性地停留。因此，在本发明的一个优选实施方案中，活细胞停留在前述聚酰亚胺多孔膜内，死细胞优先与水分一起流出。

在本实施方式(C)中使用的经灭菌的液体没有特别的限定，是经灭菌的缓冲液或无菌水。缓冲液为，例如，(+)和(-)Dulbecco PBS(Dulbecco’s PBS)、(+)和(-)Hank氏平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution)等。缓冲液的例子在下面的表1中显示。

【表1】

成分	浓度(mmol/L)	浓度(g/L)
			NaCl	137	8.00
KCl	2.7	0.20
			Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	10	1.44
KH<sup>2</sup>PO<sub>4</sub>	1.76	0.24
			pH(-)	7.4	7.4

此外，在本发明的方法中，将细胞播种到聚酰亚胺多孔膜、通过使悬浮状态粘附性细胞与聚酰亚胺多孔膜以悬浮状态共存而将细胞附着到膜(缠绕起来)的方式也被包括在内。例如，在本发明的细胞培养方法中，为了将细胞播种到聚酰亚胺多孔膜，在细胞培养容器中，也可以加入细胞培养基、细胞和一种或多种(一个或多个)前述聚酰亚胺多孔膜。如果细胞培养基是液体，那么聚酰亚胺多孔膜处于悬浮在细胞培养基中的状态。根据聚酰亚胺多孔膜的性质，细胞可以附着到聚酰亚胺多孔膜。因此，即使天生不适合悬浮培养的细胞，也可以通过聚酰亚胺多孔膜悬浮在细胞培养基中的状态而进行培养。优选地，细胞自发地附着到聚酰亚胺多孔膜。“自发地附着”意味着，尤其是在不添加外部的物理力或化学力的情况下，细胞也停留在聚酰亚胺多孔膜的表面或内部。

细胞培养，通过在细胞培养中的存在形态、培养细胞可分为附着培养系细胞和悬浮培养系细胞。附着培养系细胞是附着于培养容器、增殖的培养细胞，传代时进行培养基交换。悬浮培养系细胞是在培养基中以悬浮状态增殖的培养细胞，一般在传代时不进行培养基交换，而进行稀释培养。悬浮培养存在以下的优势：因为悬浮培养通过悬浮状态、即在液体中能够培养，使得能够大量培养，相比于只在培养容器表面生长的附着细胞，因为立体培养，每单位空间可能培养细胞的数量有很多。

在本发明的长期培养方法中，聚酰亚胺多孔膜以在细胞培养基中悬浮的状态使用时，可以使用两个(两种)以上的前述聚酰亚胺多孔膜的小片。聚酰亚胺多孔膜是柔性膜，因此，例如通过使其小片悬浮在培养基中而使用，由此在一定容量的细胞培养基中可以带入具有许多表面积的聚酰亚胺多孔膜。对于通常的培养，容器底面积是细胞培养可能的面积的上限，但是，使用本发明的聚酰亚胺多孔膜的细胞培养，先前带入的聚酰亚胺多孔膜的大表面积的整体成为细胞培养可能的面积。由于聚酰亚胺多孔膜使得细胞培养液通过，例如在折叠的膜内也可以供给营养，氧等。

聚酰亚胺多孔膜的小片的尺寸，形状没有特别的限制。形状可以采用圆形，椭圆形，四边形，三角形，多边形，带状等任何形状。

本发明的聚酰亚胺多孔膜因为柔性可以通过改变形状来使用。的聚酰亚胺多孔膜不采用平面状，也可以在将形状加工成立体状来使用。例如，将聚酰亚胺多孔膜，(i)折叠，(ii)卷成卷状，(iii)将片材或小片通过丝状结构体连接，或(iv)系成绳状，在细胞培养容器的细胞培养基中悬浮或固定。通过如(i)～(iv)加工形状，与使用小片的情况同样地，在一定容量的细胞培养基中，可以放入大量聚酰亚胺多孔膜。此外，有可能将各小片作为集合体而处理，因此，能够将细胞集合化而移动，综合性的适用性高。

作为与小片集合体相同的看法，2个以上聚酰亚胺多孔膜可以在细胞培养基中上下或左右地层叠。层叠还包括重叠聚酰亚胺多孔膜部分的方式。通过层叠培养，在狭窄的空间也能够以高密度培养细胞。另外，也可以在细胞已经生长的膜上进一步层叠膜而放置膜，从而形成与其它种类细胞的多层系统。层叠的聚酰亚胺多孔膜的数目没有特别的限制。

上述本发明的细胞的培养方法可以将两种或多种方法组合使用。例如，使用方式(A)～(C)任一项的方法中先将细胞播种至聚酰亚胺多孔膜，然后使细胞附着的聚酰亚胺多孔膜进行悬浮培养，这也是可以的。或者，作为播种至聚酰亚胺多孔膜的工序，也可以将上述方式(A)～(C)之任一项的方法中两种或更多种组合使用。

在本发明的长期培养方法中，优选，所述细胞在聚酰亚胺多孔膜表面和内部生长、增殖。通过本发明的长期培养方法，不用进行对细胞进行如以往的胰蛋白酶处理等的传代操作，历经30天以上，60天或以上，120天以上，200天以上，或300天以上的长期、可以进行培养。此外，通过本发明的培养方法，在以往的平面培养中可以培养期间以上，例如，平面培养期间的1.5倍以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上的期间，可以培养细胞。根据本发明，而不造成培养皿等的平面培养中长期间细胞培养物中发生的细胞剥离或死灭，在没有休眠状态的情况下，可以长期间维持动态生命。此外，根据本发明，细胞即使是长期培养的细胞，其细胞活力或细胞性质(例如，分化诱导效率，细胞表面标志物的表达水平等)，与长期培养前的细胞相比，几乎没有改变。此外，根据本发明，由于细胞在聚酰亚胺多孔膜中三维地增殖，接触抑制是不可能的，以往的平面培养发现的培养领域的限制和平面环境造成的接触抑制难以发生，因此细胞在长期间生长的培养是有可能的。此外，根据本发明，通过将细胞附着的聚酰亚胺多孔膜与其它聚酰亚胺多孔膜接触，能够任意地增加细胞培养可能的空间，在不执行以往伴随胰蛋白酶处理的传代操作的情况下，同时避免接触抑制引起的铺满状态，能够进行在长期间生长的培养。此外，根据本发明，也提供了，在不进行细胞冷冻等的情况下，以活的原样长期间保存的新的保存方法。

【2.细胞】

可在本发明的方法中可以利用细胞的种类没有特别的限制，可用于任何细胞的增殖。

例如，细胞选自由动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母菌和细菌组成的组中。动物细胞大致分为，来源于属于脊椎动物门的细胞和来源于无脊椎动物(属于脊椎动物动物门的动物以外的动物)的细胞。在本说明书中，动物细胞的来源没有特别的限制。优选地，意味着来源于属于脊椎动物门的动物的细胞。脊椎动物门包括无颚纲和有颔纲，有颔纲包括哺乳纲，鸟纲，两栖纲，爬行纲等。优选地，在一般情况下，是来源于属于称为哺乳动物的哺乳纲的动物的细胞。哺乳动物包括，但不特别限于，优选小鼠，大鼠，人，猴，猪，狗，绵羊，山羊等。

在本说明书中植物细胞的来源没有特别的限制。包括苔藓植物，蕨类植物，种子植物的植物的细胞成为对象。植物种子细胞来源的植物包括，单子叶植物、双子叶植物的任一种。单子叶植物中包括，但不限于，兰科植物，禾本科植物(稻，玉米，大麦，小麦，高粱等)，莎草科植物等等。在双子叶植物中，包括属于菊亚纲，木兰亚纲，蔷薇亚纲等的多种亚纲的植物。

藻类，可视为细胞来源生物。从是真细菌的蓝细菌(蓝绿藻(蓝藻))，在真核生物中是单细胞生物的(硅藻，黄绿藻，涡鞭藻甲藻等)和是多细胞生物的海藻类(红藻，褐藻，绿藻)等的不同组被包括。

在本说明书中的古细菌和细菌种类没有特别限制。古细菌包括产甲烷菌，极度嗜盐菌，嗜热嗜酸菌，超嗜热菌等。细菌选自：例如，乳酸菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和蓝细菌。

可以在本发明的方法使用的动物细胞或植物细胞的种类选、但不限于自由以下组成的组：优选地，多能干细胞，组织干细胞，体细胞，和生殖细胞。

在本发明中术语“多能干细胞”意指具有分化成所有组织细胞的能力(分化多能性)细胞的总称。多能干细胞包括，但不限于，胚胎干细胞(ES细胞)，人工多能干细胞(诱导多能干细胞)(iPS细胞)，胚胎生殖干细胞(EG细胞)，生殖干细胞(GS细胞)等。优选的是，ES细胞或iPS细胞。iPS细胞是特别优选的，其原因是不存在伦理问题等的理由。作为多能干细胞可以使用任何已知的，例如，可以使用在国际公开WO2009/123349(PCT/JP2009/057041)所述的多能干细胞。

作为“组织干细胞”，可分化细胞株列已经限定于特定的组织，这意味着有可向多种细胞种类分化的能力(分化多能性)的干细胞。例如，在骨髓中的造血干细胞成为血细胞的来源，神经干细胞分化为神经细胞。除此之外，存在构造肝脏的肝干细胞，成为皮肤组织的皮肤干细胞等的不同的类型。优选地，组织干细胞选自，间质干细胞，肝干细胞，胰干细胞，神经干细胞，皮肤干细胞，或造血干细胞。

作为“体细胞”，意指构成多细胞生物的细胞中除生殖细胞以外的细胞。在有性繁殖中没有被下一代继承。优选地，体细胞选自，肝细胞，胰细胞，肌细胞，骨细胞，成骨细胞，破骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，皮肤细胞，成纤维细胞，胰细胞，肾细胞，肺细胞，或淋巴细胞，红细胞，白细胞，单核细胞，巨噬细胞或巨核细胞的血细胞。

“生殖细胞”指的是具有在生殖中将遗传信息传递给下一代的作用的细胞。例如，包括用于有性生殖的配子、即卵子、卵细胞、精子、精子细胞，用于无性繁殖的孢子。

细胞也可以选自由以下组成的组:肉瘤细胞，确立细胞和转化的细胞。作为“肉瘤”，包括骨、软骨、脂肪、肌肉、血液等非上皮细胞来源的结缔组织细胞中发生的癌症，软组织肉瘤，恶性骨肿瘤等。肉瘤细胞是肉瘤来源的细胞。“确立细胞”是指，长期间在体内外保持的、具有一定稳定的性质、可以半永久性传代培养的培养细胞。PC12细胞(来自大鼠肾上腺髓质)，CHO细胞(来自中国仓鼠卵巢)，HEK293细胞(来自人胎儿肾脏)，HL-60细胞(来自人白细胞)，HeLa细胞(来自人宫颈癌)，Vero细胞(来自非洲绿猴肾上皮细胞)，MDCK细胞(来自犬肾小管上皮细胞)，HepG2细胞(来自人肝癌)等的包括人类的不同物种的各种组织来源的细胞株存在。“转化的细胞”意味着，从细胞外部导入核酸(DNA等)，改变遗传性质的细胞。对于动物细胞、植物细胞、细菌的转化，各个适合的方法是公知的。

【3.聚酰亚胺多孔膜】

聚酰亚胺是在重复单元中包含酰亚胺键的高分子(聚合物)的总称，通常是指芳族化合物通过直接酰亚胺键连接的芳族聚酰亚胺。芳族聚酰亚胺具有芳族和芳族通过酰亚胺键的共轭结构，具有刚硬、牢固的分子结构，并且酰亚胺键具有强的分子间力，因此，具有非常高水平的热的、机械的、化学的性质。

在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜是，包括由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺(作为主要成分)的聚酰亚胺多孔膜，更优选为由通过四羧酸二酐和二胺所得到的聚酰亚胺形成的聚酰亚胺多孔膜。所述“作为主要组分包括”意指，作为聚酰亚胺多孔膜的构成成分，从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺以外的成分是基本上不被包含的，或者即使被包含，也是不影响由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质的另外的成分。

包括从四羧酸成分和二胺组分得到的聚酰胺酸溶液与着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后，在250℃以上仅限热处理，由此得到的聚酰亚胺多孔膜也被包括。

【聚酰胺酸】

聚酰胺酸是通过聚合四羧酸成分和二胺成分而获得。聚酰胺酸是，通过热酰亚胺化或化学酰亚胺化的闭环、可以成为聚酰亚胺的聚酰亚胺前体。

聚酰胺酸，即使酰胺酸的部分被酰亚胺化，只要它不影响本发明，也可以使用。即，聚酰胺酸的一部分可以被热酰亚胺化或者化学酰亚胺化。

在将聚酰胺酸热酰亚胺化的情况下，根据需要，酰亚胺化催化剂，有机含磷化合物，无机微粒，有机微粒等的微粒等可被添加到聚酰胺酸溶液。此外，如果将聚酰胺酸化学酰亚胺化，根据需要，化学酰亚胺化剂，脱水剂，无机微粒，有机微粒等的微粒等可被添加到聚酰胺酸溶液。聚酰胺酸溶液中即使混合前述成分、在着色前体不析出的条件下进行也是优选的。

【着色前体】

在本发明中着色前体是指，通过250℃以上的热处理、部分或完全碳化、以产生着色化物的前体。

作为本发明中使用的着色前体，在聚酰胺酸溶液或聚酰亚胺溶液中均匀地溶解或分散，通过250℃以上、优选260℃以上、更优选280℃以上、更优选300℃以上的热处理，优选在空气等的氧存在下的250℃以上、优选260℃以上、更优选280℃以上、更优选300℃以上的热处理而热分解，碳化，从而产生着色化物的前体是优选的，产生黑色系的着色化物的前体是更优选的，碳系着色前体是更优选的。

着色前体如果进行加热则变得可以一下就看到碳化物，但是，在组织(结构)中包括除碳之外的不同元素，包括层结构，芳族交联结构，含有四面体碳的无序结构。

碳系着色前体，没有特别限定，可以列举，例如，石油焦油、石油沥青、煤焦油、煤沥青等的焦油、或沥青、焦炭、从含有丙烯腈的单体而得到的聚合物、二茂铁化合物(二茂铁和二茂铁衍生物)等。其中，从含有丙烯腈的单体得到的聚合物和/或二茂铁化合物是优选的，作为由含有丙烯腈的单体得到的聚合物，聚丙烯腈是优选的。

四羧酸二酐可以使用任何四羧酸二酐，可以根据所期望的性质来适当地选择。作为四羧酸二酐的具体例子，可以列举苯均四酸二酐、3,3’,4,4’-联苯四羧酸二酐(s-BPDA)、2,3,3’,4’-联苯四羧酸二酐(a-BPDA)等的联苯四羧酸二酐、氧双邻苯二甲酸二酐、二苯砜-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)硫化物二酐、2,2-双(3,4-二羧基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷二酐、2,3,3’,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、3,3’,4,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)甲烷二酐、2,2-双(3,4-二羧基苯基)丙烷二酐、p-苯撑双(偏苯三酸单酯酸酐)、p-双苯撑双(偏苯三酸单酯酸酐)、m-三联苯基-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、p-三联苯基-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、1,3-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二酐、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二酐、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)双苯基二酐、2,2-双[(3,4-二羧基苯氧基)苯基]丙烷二酐、2,3,6,7-萘四羧酸二酐、1,4,5,8-萘四羧酸二酐、4,4’-(2,2-六氟亚异丙基)二苯二甲酸二酐等。此外，优选使用2,3,3’,4’-二苯砜四羧酸等的芳香族四羧酸。前述这些可以单独使用，也可以两种以上组合使用。

在这些中，特别优选的是，从由联苯四羧酸二酐和均苯四羧酸二酐组成的组中选择的至少一种芳族四羧酸二酐。作为联苯四羧酸二酐，可以适当地使用3,3’,4,4’-联苯四羧酸二酐。

二胺可以使用任何二胺。作为二胺的具体例子，可以举出以下。

(1)1,4-二氨基苯(对苯撑二胺)、1,3-二氨基苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯等的苯核1个的苯二胺；

(2)4,4’-二氨基二苯醚、3,4’-二氨基二苯醚等的二氨基二苯醚、4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基联苯，2,2’-二甲基-4,4’-二氨基联苯，2,2’-双(三氟甲基)-4,4’-二氨基联苯，3,3’-二甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二羧基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’,5,5’-四甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、双(4-氨基苯基)硫化物、4,4’-二氨基苯甲酰苯胺、3,3’-二氯联苯胺、3,3’-二甲基联苯胺、2,2’-二甲基联苯胺、3,3’-二甲氧基联苯胺、2,2’-二甲氧基联苯胺、3,3’-二氨基二苯醚、3,4’-二氨基二苯醚、4,4’-二氨基二苯醚、3,3’-二氨基二苯基硫化物、3,4’-二氨基二苯基硫化物、4,4’-二氨基二苯基硫化物、3,3’-二氨基二苯砜、3,4’-二氨基二苯砜、4,4’-二氨基二苯砜、3,3’-二氨基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二氯二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二甲氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基二苯基甲烷、3,4’-二氨基二苯基甲烷、4,4’-二氨基二苯基甲烷、2,2-双(3-氨基苯基)丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)丙烷、2,2-双(3-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、3,3’-二氨基二苯基亚砜、3,4’-二氨基二苯基亚砜、4,4’-二氨基二苯基亚砜等的苯核2个的二胺；

(3)1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯、1,4-双(4-氨基苯氧基)苯、1,3-双(3-氨基苯氧基)-4-三氟甲基苯、3,3’-二氨基-4-(4-苯基)苯氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二(4-苯基苯氧基)二苯甲酮、1,3-双(3-氨基苯基硫化物)苯、1,3-双(4-氨基苯基硫化物)苯、1,4-双(4-氨基苯基硫化物)苯、1,3-双(3-氨基苯基砜)苯、1,3-双(4-氨基苯基砜)苯、1,4-双(4-氨基苯基砜)苯、1,3-双[2-(4-氨基苯基)异丙基]苯、1,4-双[2-(3-氨基苯基)异丙基]苯、1,4-双[2-(4-氨基苯基)异丙基]苯等的苯核3个的二胺；

(4)3,3’-双(3-氨基苯氧基)联苯，3,3’-双(4-氨基苯氧基)联苯，4,4’-双(3-氨基苯氧基)联苯，4,4’-双(4-氨基苯氧基)联苯，双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]醚、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]醚、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]醚、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]醚、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]酮、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]酮、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]酮、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]酮、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]硫化物、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]硫化物、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]硫化物、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]硫化物、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]砜、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]砜、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]砜、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]砜、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]甲烷、2,2-双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2,2-双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2,2-双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2,2-双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2,2-双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷等的苯核4个的二胺。

前述这些可以单独施用，也可以两种以上混合使用。使用的二胺可以根据所期望的特性适当地选择。在这些中，芳族二胺化合物是优选的，3,3’-二氨基二苯醚、3,4’-二氨基二苯醚、4,4’-二氨基二苯醚以及对苯撑二胺、1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯可以适当地使用。特别是，从苯二胺，二氨基二苯醚和双(氨基苯氧基)苯基组成的组中选择的至少一种二胺是优选的。

聚酰亚胺多孔膜，从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点来看，从组合玻璃化转变温度是240℃以上、或300℃以上的没有明确的转变温度的四羧酸二酐和二胺而获得的聚酰亚胺形成是优选的。

本发明的聚酰亚胺多孔膜，从耐热性，高温下的尺寸稳定性的观点考虑，优选是由以下芳族聚酰亚胺形成的聚酰亚胺多孔膜。

(i)由选自联苯基四羧酸单元和均苯四酸单元组成的组中选择的至少一种四羧酸单元与，芳族二胺单元形成的芳香族聚酰亚胺、

(ii)由四羧酸单元与，从苯二胺单元、二氨基二苯基醚单元和双(氨基苯氧基)苯基单元组成的组中选择的至少一种芳族二胺单元形成的芳族聚酰亚胺、

和/或，

(iii)由选自联苯四羧酸单元和均苯四酸单元组成的组中的至少一种四羧酸单元与，从苯二胺单元、二氨基二苯基醚单元和双(氨基苯氧基)苯基单元组成的组中选择的至少一种芳族二胺单元形成的芳族聚酰亚胺。

虽然没有限制，作为聚酰亚胺多孔膜，在本发明的方法中可以使用至少具有两个表面层和(A面和B面)，和夹在这两个表面层之间的大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔膜。优选地，聚酰亚胺多孔膜具有以下多层结构，前述大空隙层具有，结合到前述表面层(A面和B面)的隔壁(隔板、隔膜)，由所述隔壁(隔板、隔膜)和前述表面层(A面和B面)所包围的、膜平面方向的平均孔径是10～500μm的多个大空隙，前述大空隙层的隔壁(隔板、隔膜)和前述表面层(A面和B面)各自厚度是0.01～20μm，具有多个具有0.01～100μm的平均孔直径的孔，所述细孔(微孔)可以相互连通，还可以与前述大空隙部分或完全连通的多层结构，并且总的膜厚度为5～500μm，孔隙率为40％以上而小于95％，的聚酰亚胺多孔膜。

在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜的总厚度包括但不限于，可以是20～75μm的一个方式。根据膜厚度的差异，细胞的增殖速度，细胞形态，面内的细胞饱和度等的差异可被观察到。

在本发明中，在具有两个不同的表面层(A面和B面)、所述两个表面层之间夹的大空隙层的聚酰亚胺多孔膜被使用的情况下，A面中存在的孔的平均孔径，与B面中存在的孔的平均孔径可以存在差异。优选地，A面中存在的孔的平均孔径，小于B面中存在的孔的平均孔径。更优选地，A面中存在的孔的平均孔径，小于B面中存在的孔的平均孔径，A面中存在的孔的平均孔径为0.01～50μm、0.01～40μm、0.01～30μm、0.01～20μm或0.01～15μm，B面中存在的孔的平均孔径为20～100μm、30～100μm、40～100μm、50～100μm或60～100μm。特别优选地，聚酰亚胺多孔膜的A面为具有平均孔径15μm以下，例如0.01～15μm的小孔的网状结构，B面为具有平均孔径20μm或更大的孔的表面上，例如在20～100μm的大孔结构。

在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜的总厚度的测定通过接触式的厚度计进行。聚酰亚胺多孔膜表面的平均孔径可以如下求得，通过多孔膜表面的扫描式电子显微照片，测定200点以上的开孔部的孔面积，根据所述孔面积按照下式(1)计算孔形状为正圆时的平均直径。

[数学公式1]

(式中、Sa指孔面积的平均值。)

本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜的孔隙率可以如下求得，测量切割成预定尺寸的多孔膜的厚度和质量，从观察到的质量根据下式(2)来求得。

[数学公式2]

孔隙率(％)＝(1-w/(S×d×D))×100(2)

(式中分别地、S意指多孔膜的面积，d意指总的膜厚度，w意指所测定的质量，D意指聚酰亚胺的密度。聚酰亚胺的密度为1.34g/cm³。)

例如，国际公开WO2010/038873，特开2011-219585，或特开2011-219586所述的聚酰亚胺多孔膜也可以在本发明的方法中使用。

接种于聚酰亚胺多孔膜的表面的细胞在膜的表面和/或内部可稳定地生长和增殖。细胞根据在膜中生长、增殖的位置，可以采取各种不同的形式。在本发明的一个方式中，取决于细胞种类，一边移动聚酰亚胺多孔膜的表面和内部，一边改变形状而进行增殖的情况也存在。

在本发明的方法中播种细胞的聚酰亚胺多孔膜，当然优选，不含播种以外的细胞的状态，即，优选是无菌的。本发明的方法优选包括将聚酰亚胺多孔膜预先灭菌的工序。聚酰亚胺多孔膜的耐热性非常优异，重量轻，形状和尺寸也可自由选择，容易进行灭菌处理。干热灭菌，蒸汽灭菌，通过乙醇等消毒剂灭菌，紫外线或γ射线等的电磁波灭菌等任意的灭菌处理都是可能的。

【4.细胞培养和培养体积】

使用聚酰亚胺多孔膜的细胞培养的模型图在图1中显示。通过本发明的方法，细胞培养中使用的培养基的量，与以往方法相比，大幅减少，同时也能够培养大量的细胞。例如，聚酰亚胺多孔膜的部分或整体即使在不与细胞培养基的液相接触的状态，也可以长期培养大量细胞。此外，对于包括细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜体积的总和，细胞培养容器中包含的细胞培养基的总体积能够显著减少。

在本说明书中，不含细胞的聚酰亚胺多孔膜也包括其的内部间隙的体积、在空间中占据的体积被称为“表观聚酰亚胺多孔膜体积”(图1的左的状态)。然后，将细胞播种到聚酰亚胺多孔膜，聚酰亚胺多孔膜的表面和内部承载细胞的状态中，聚酰亚胺多孔膜、细胞、和浸润至聚酰亚胺多孔膜内部的培养基作为一个整体在空间中占据的体积被称为“包括细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜体积”(图1的右的状态)。在膜厚为25微米的聚酰亚胺多孔膜的情况下，包括细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜体积，与表观聚酰亚胺多孔膜体积相比，成为最大约50％左右的大的值。在本发明的方法中，可以在一个细胞培养容器中容纳多个聚酰亚胺多孔膜而进行培养，在此情况下，对于承载细胞的多个聚酰亚胺多孔膜的各个的包括细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜体积总和，简单地记载为“包括细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜体积的总和”。

通过使用本发明的方法，在细胞培养容器中包含的细胞培养基的总体积为包括细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜的体积的总和的10000倍或比其少的条件下，也可以长期良好地培养细胞。此外，在细胞培养容器中包含的细胞培养基的总体积为含有细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜的体积的总和的1000倍或比其更小的条件下，也可以长期良好地培养细胞。此外，在细胞培养容器中包含的细胞培养基的总体积为在含有细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜的体积的总和的100倍或比其更小的条件下，也可以长期良好地培养细胞。然后，在细胞培养容器中包含的细胞培养基的总体积为在含有细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜的体积的总和的10倍或比其更小的条件下，也可以长期良好地培养细胞。

也就是说，本发明，与以往进行二维培养的细胞培养装置相比，能够将细胞培养空间(容器)小型化到极点。此外，如果要提高培养细胞的数量，则通过增加层叠在聚酰亚胺多孔膜的枚数(张数，片数)等简单的操作，能够柔性地增加细胞培养的体积。通过具有本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜的细胞培养装置，可以将用于保存用于培养细胞的空间(容器)与储藏细胞培养基的空间(容器)分离，取决于培养的细胞物数，能够准备必要的量的细胞培养基。储藏细胞培养基的空间(容器)取决于目的可以大型化或小型化，或可以是可更换的容器，而没有特别的限制。整合的概念是，在冷冻中也是重要的，在极小空间中冷冻保存大量的细胞是可能的。

此外，作为培养中或培养后测定细胞的数目的方法，可以使用各种公知的方法。例如，对于在用聚酰亚胺多孔膜培养后细胞培养容器中包含的细胞的数，使细胞完全均匀分散在细胞培养容器中包含的所有细胞培养基中而进行测量方法，可以适当地使用公知的方法。例如，如在实施例1中使用的方法，使用CCK8的细胞数计数法可以适当地使用。具体而言，Cell Countinig Kit8；同仁化学实验所制溶液试剂(在下文中记载为“CCK8”)被使用，测量不使用聚酰亚胺多孔膜的通常培养的细胞数，求出吸光度和实际细胞数的相关系数。然后播种细胞，经培养的聚酰亚胺多孔膜转移到含有CCK 8的培养基中，并保存在培养箱1-3小时，提取出上清液，在480nm的波长测量吸光度，通过预先求出的相关系数计算细胞数。

【3.细胞培养系统和培养条件】

在本发明的方法中，细胞的培养系统和培养条件可以根据诸如细胞种类等适当地确定。适用于动物细胞、植物细胞、和细菌的各细胞的培养方法是公知的，本领域技术人员可以使用任何已知的方法、将播种到聚酰亚胺多孔膜的细胞进行培养。可以根据细胞培养基和细胞类型进行适当制备。

动物细胞的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在朗达公司细胞培养基产品目录中记载。植物细胞的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在WAKO公司植物组织培养基系列等中记载。细菌的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在BD公司一般细菌用培养基目录中记载。本发明方法中使用的细胞培养基可以是液体培养基，半固体培养基，固体培养基中的任一形式。此外，通过将液滴状液体培养基喷雾在细胞培养容器中，可以使承载细胞的聚酰亚胺多孔膜接触培养基。

对于使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的培养，微载体、纤维素海绵等、其他悬浮型培养载体可以一起存在。在本发明的方法中，培养中使用的系统的形状、规模等没有特别的限制，从细胞培养用的培养皿、烧瓶、塑料袋、试管到大型的罐都可适当利用。例如，BD Falcon公司制的细胞培养皿、Thermo Scientific公司制的Nunc细胞工厂等被包括。顺便提及，通过在本发明中使用聚酰亚胺多孔膜，即使对于生来不可能悬浮培养的细胞，在靶向悬浮培养的装置中，也可能以悬浮培养类似的状态下进行培养。作为悬浮培养装置，可用例如，康宁公司制的旋转瓶或旋转培养等。此外，作为可以提供相同的功能的环境，VERITAS公司的FiberCell(注册商标)System这样的中空纤维培养也可以使用。

在本发明的方法中的培养，使用在聚酰亚胺多孔膜上连续加入培养基并回收的连续循环或开放式装置，通过将聚酰亚胺多孔膜片材露出在空气中的形式也可以实施。

在本发明中，细胞的培养也可从在细胞培养容器外设置的细胞培养基供给器件连续或间歇地将细胞培养基供给到细胞培养容器中。这个时候，可以存在细胞培养基在细胞培养基供给器件和细胞培养容器之间循环的系统。

在细胞的培养通过从在细胞培养容器外设置的细胞培养基供给器件连续或间歇地将细胞培养基供给到细胞培养容器中的系统而进行的情况下，该系统可以是细胞培养装置，其包括作为细胞培养容器的培养单元以及作为细胞培养基供给器件的培养基供给单元，此处培养单元是容纳用于承载细胞的一个或多个聚酰亚胺多孔膜的培养单元，是具有培养基供给口和培养基排出口的培养单元，培养基供给单元是，具备培养基供给线、经由培养基供给线连续地或间歇地将培养基送液的送液泵，其中，培养基供给线的第一端部与在培养液收纳容器内的培养基接触，培养基供给线的第二端部经由所述培养单元的培养基供给口与培养单元内连通的培养单元可以是细胞培养装置。

此外，在该细胞培养装置中，培养单元可以是不具有空气供给口、空气排出口和氧交换膜的培养单元，此外可以是具备空气供给口和空气排出口、或氧交换膜的培养单元。培养单元可以是不具有空气供给口和空气排出口，以及氧交换膜的培养单元，将细胞培养必要的氧等通入培养基而充分地供给至细胞。此外，在上述细胞培养装置中，进一步具备培养单元的培养基排出线，此处培养基排出线的第一端部连接到培养基收纳容器，培养基排出线的第二端部经由培养单元的培养基排出口与培养单元内连通，培养基可以在培养基供给单元和培养单元之间循环。

是上述细胞的培养系统的一个例子的细胞培养装置的实例被示出在图2中，为了本发明的目的而使用的细胞的培养系统并不限于此。

【II.细胞培养装置】

本发明还涉及，含有聚酰亚胺多孔膜的，用于在本发明的培养方法中使用的细胞培养装置。在本发明的细胞培养装置中，聚酰亚胺多孔膜可以被固定而使用，或聚酰亚胺多孔膜可以在细胞培养基中被悬浮而使用，可以被放置在培养基中，也可以从培养基露出。在细胞培养装置中，2个以上聚酰亚胺多孔膜可以上下或左右地层叠。层叠的集合体和集成体可以被放置在培养基中，也可以从培养基中露出。

作为本发明的细胞培养装置，可以采取含有聚酰亚胺多孔膜的任何形式。例如，在上述本发明的长期培养方法中使用的细胞的培养系统之任一项都可以被用作本发明的细胞培养装置。

【III.用于在培养细胞的方法中使用的试剂盒】

本发明还涉及，包含聚酰亚胺多孔膜的、在细胞的培养方法中使用的试剂盒。

本发明的试剂盒中，除了聚酰亚胺多孔膜，可适当包括细胞培养必需的构成要素。例如，试剂盒包括，播种到聚酰亚胺多孔膜的细胞，细胞培养基，连续培养基供给器件，连续培养基循环装置，用于支撑聚酰亚胺多孔膜的支架或模块，细胞培养装置，以及试剂盒的使用说明书。

不存在限制，作为一个方式，包括在透明的袋内保存单独或多个经灭菌的聚酰亚胺多孔膜，保持其原样地在细胞培养中可使用形式的包装，或在相同袋内封入聚酰亚胺多孔膜与灭菌液体，使得有效地吸式接种成为可能的膜-液体集成形式的试剂盒。

【IV.用途】

本发明还涉及，聚酰亚胺多孔膜在细胞的长期培养方法中的用途。此外，也涉及上述的细胞培养装置在细胞的长期培养方法中的用途。

【V.细胞的冷冻保存方法】

本发明涉及，细胞的冷冻保存方法，其包括

(1)将细胞承载至聚酰亚胺多孔膜的工序，

(2)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜放置在冷冻细胞的条件下，由此冷冻由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞的工序，

(3)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜以保持冷冻状态的条件保存的工序。根据本发明，有可能在高密度地使培养的细胞被承载的状态而冷冻聚酰亚胺多孔膜，与以往的以非附着状态冷冻的细胞的冷冻方法相比较，压倒性地在高密度状态下冷冻细胞成为可能。

【1.细胞】

可在本发明的方法中可以利用细胞的种类没有特别限定，上述的任何细胞都可以利用。

【2.将细胞承载至聚酰亚胺多孔膜的工序】

本发明的方法包括在聚酰亚胺多孔膜支持细胞的工序。作为使聚酰亚胺多孔膜承载细胞的方法，可以使用任何方法，但可以使用如以下的方法。

(A)包括将细胞接种到前述聚酰亚胺多孔膜的表面的工序的方式；

(B)包括使聚酰亚胺多孔膜干燥的表面承载细胞悬浮液、

放置，或者通过移动前述聚酰亚胺多孔膜，以促进液体的流出，或刺激表面的一部分，使细胞悬浮液被吸入至前述膜，并且，

使细胞悬浮液中的细胞停留在前述膜内，使水分流出的工序的方式；以及，

(C)包括将前述聚酰亚胺多孔膜的一个面或两个面用细胞培养物或经灭菌的液体润湿，

将细胞悬浮液装填到前述经润湿的聚酰亚胺多孔膜，并且，

使细胞悬浮液中的细胞停留在前述膜内，使水分流出的工序的方式。

接种于聚酰亚胺多孔膜的表面的细胞附着到聚酰亚胺多孔膜，进入多孔的内部。优选地，即使在不特别添加来自外部的物理力或化学力的情况下，所述细胞也自发地附着到聚酰亚胺多孔膜。接种于聚酰亚胺多孔膜的表面的细胞在膜的表面和/或内部可稳定地生长和增殖。根据细胞生长和增殖的膜的位置，可以采取各种不同的形式。

需要说明的是，将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜与，不承载细胞的其他一个或多个聚酰亚胺多孔膜播种到相同的细胞培养基中进行培养，由此，也可以使所述其他一个或多个聚酰亚胺多孔膜承载细胞。此时，承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜与，不承载细胞的其他一个或多个聚酰亚胺多孔膜，可以通过层叠等彼此接触，也可以简单地在相同的细胞培养基中被设置。

【3.将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜，在细胞冷冻条件下放置，由此冷冻聚酰亚胺多孔膜所承载的细胞的工序】

作为冷冻细胞的条件，只要是聚酰亚胺多孔膜所承载的细胞的一部分或全部在冷冻后被解冻时能保持生命机能的条件，就可以适当地设定。此外，用于进入聚酰亚胺多孔膜的冷冻用管或冷冻罐等可以使用销售的制品。

例如，可以将聚酰亚胺多孔膜浸渍在细胞冷冻保存液中，将其在第一低温条件下冷冻后，转移到比第一低温条件低的第二低温条件下，进行冷冻。作为第一低温条件，例如，能够使用零下20至25℃左右的条件，作为第二低温条件，可使用零下80至90℃左右的条件。

第一低温条件下的工序可以省略。向比第一低温条件低的第二低温的过渡可以采取线性的，逐步的(分阶段的)，曲线的或立即的形式中的任何形式。提供第一低温条件的装置与，提供第二低温条件的装置可以不同，或者可以是相同的。提供第一低温条件的装置与，提供第二低温条件的装置不同的情况下，例如，可以列举的是，提供第一低温条件的装置是通常的冷冻器，提供第二低温条件的装置是深度冷冻器的情况，但不限于此。此外，提供第一低温条件的装置与，提供第二低温条件的装置相同的情况下，可以列举的是，能以一定的速度降低温度的程序冷冻器(例如Nepagene株式会社制的程序冷冻器等)，但不限于此。

作为细胞冷冻保存溶液，可以适当地使用公知的。例如，可以适当地使用:在细胞培养液中添加DMSO至约5％至20％而获得的，以便在细胞培养基中，在细胞培养液中添加甘油至约5％至20％而获得的，如在ZENOAQ公司产品目录所述的各种CellBanker的可商购的细胞冷冻保存溶液。

【4.将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜以保持冷冻状态的条件保存的工序】

本发明的方法，如上所述，包括将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜，在保持冷冻状态的条件下保存的工序。作为保持冷冻状态的条件，可以列举，在上述第二冷的条件下保持原样地保存的条件，以及在比第二低温条件更低的第三低温条件下保存的条件。作为第三低温条件，可以列举，例如，可以放在液氮中的情况下，但不限于此。

根据本发明的方法，不仅附着细胞而且悬浮细胞，无论细胞的种类，均能够令人满意地冷冻保存。如果由本发明的方法冷冻保存悬浮细胞，则在保持球形的情况下，在聚酰亚胺多孔膜的立体结构中容纳细胞并保存。此外，如果由本发明的方法冷冻保存附着细胞，则在保持与在聚酰亚胺多孔膜内生长并增殖时同样的非球形状态的情况下，在聚酰亚胺多孔膜的立体结构内容纳细胞并保存。

在本发明的方法中承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜，当然优选，不含承载以外的其它细胞的状态，即，是经灭菌的。本发明的方法优选包括将聚酰亚胺多孔膜预先灭菌的工序。聚酰亚胺多孔膜的耐热性非常优异，重量轻，形状和尺寸也可自由选择，容易灭菌处理。干热灭菌，蒸汽灭菌，用乙醇等消毒剂的灭菌，紫外线或γ射线等的电磁波灭菌等任意的灭菌处理是可能的。

【5.聚酰亚胺多孔膜所承载的细胞的解冻工序】

在本发明的方法中，能够将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜在冷冻保存后解冻。作为将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜解冻的方法，可以列举，将冷冻保存的聚酰亚胺多孔膜从保存容器的外部升温，解冻的方法。作为升温的方法，可以适当地使用如下方法，在约37℃的恒温热水中浸入容器。

【6.将细胞解冻的聚酰亚胺多孔膜播种到细胞培养基，培养细胞的工序】

在本发明的方法中，通过将细胞解冻的聚酰亚胺多孔膜在保持原样的情况下播种至细胞培养基，能够将解冻的细胞在相同的聚酰亚胺多孔膜上进行培养。

此时，也可以培养细胞直到培养的细胞即使在聚酰亚胺多孔膜外也增殖。对于悬浮细胞，其从聚酰亚胺多孔膜内向细胞培养基中转移的悬浮细胞能够保持原样地在培养基中增殖。对于附着细胞，虽然有许多停留在聚酰亚胺多孔膜内或表面，但是，能够将一部分细胞转移至与聚酰亚胺多孔膜接触的培养容器或，转移至没有承载细胞的不同培养载体。

因此，与细胞解冻的聚酰亚胺多孔膜一同，将另外不承载细胞的一个或多个聚酰亚胺多孔膜由细胞培养基润湿、培养，由此，使得另外一个或多个聚酰亚胺多孔膜承载细胞，如果需要继续培养是可能的。

在这种情况下，将细胞解冻的聚酰亚胺多孔膜，和新承载细胞的另外聚酰亚胺多孔膜中一部分或全部在细胞冷冻的条件下放置，由此能够使聚酰亚胺多孔膜承载的细胞冷冻，保存。

如上所述冷冻，保存，解冻和培养工序能够重复多次。根据本发明，将大量承载细胞状态下的聚酰亚胺多孔膜冷冻、保存是可能的，在任何时间解冻，未经预培养工序，能够用于所期望的用途(例如，蛋白产生等)。以往，为了使用解冻的细胞，将解冻的细胞预培养，使活细胞培养承载至所希望的基材或载体上而进行培养是必须的。然而，根据本发明，无需经过以往必要的解冻后的预培养工序，能够在将保持细胞附着于聚酰亚胺多孔膜的情况下进行培养，冷冻，保存，和解冻以及再培养。因此，例如，如果承载细胞的状态被冷冻的聚酰亚胺多孔膜被大量制备，在没有通过扩增培养工序的情况下，在期望时能使用大量的细胞。

【VI.用于细胞的冷冻保存的聚酰亚胺多孔膜】

本发明也涉及聚酰亚胺多孔膜，其用于细胞的冷冻保存。本发明的，用于细胞的制冷保存的聚酰亚胺多孔膜，也可以是用于上述细胞的冷冻保存方法的聚酰亚胺多孔膜。

【VII.试剂盒】

本发明也涉及含有聚酰亚胺多孔膜的用于细胞冷冻保存的试剂盒。本发明的试剂盒中，除了聚酰亚胺多孔膜，可适当包括细胞培养必需的构成要素。例如，聚酰亚胺多孔膜，细胞冷冻保存液，冷冻用管，冷冻用棒和试剂盒的使用说明书等被包括。

尽管没有限制，但是，作为一个方式，透明的袋中保存单独或多个灭菌的聚酰亚胺多孔膜，在保持原样的情况下在细胞冷冻中可用形式的包装或，同一袋内与聚酰亚胺多孔膜一同的细胞冷冻保存液被封闭，可能快速使用的膜-液体的集成形式的试剂盒被包括。

以下、基于实施例对本发明更具体地描述。本发明不限于这些实施例。本领域技术人员基于本说明书中的描述可以容易地对本发明添加修改和改变，它们被包括在本发明的技术范围内。此后，当没有特别描述时，“聚酰亚胺多孔膜”是指，总厚度25μm，孔隙率73％的聚酰亚胺多孔膜。所述聚酰亚胺多孔膜具有，两个不同的表面层(A面和B面)，夹在两个表面层之间的大空隙层。存在于A面的孔的平均孔径为6μm，存在于在B面的孔的平均孔径为46μm。

顺便说一下，在以下实施例中使用的聚酰亚胺多孔膜如下制成，包括从为四羧酸成分的3,3’,4,4’-联苯四羧酸二酐(s-BPDA)与为二胺成分的二胺成分的4,4’-二氨基二苯醚(ODA)得到的聚酰胺酸溶液以及是着色前体的聚丙烯酰胺的聚酰胺酸溶液组合物成形后，在250℃以上进行加热处理，由此进行制备。

＜使用的细胞，材料等＞

·人类成纤维细胞(LONZA社product code CC-2511)

·Vero细胞(DSPharmaBiomedical公司(社)，cat.DSIU002)

·CHO-K1(Public Health England cat.85051005)

·CHO DP-12(Summit Pharmaceuticals Intl CRL-12445)

·人成纤维细胞培养基(LONZA社product code CC-3132)

·Vero细胞培养基(和光纯药工业株式会社E-MEM 051-07615)

·CHO-K1用培养基(和光纯药工业株式会社Ham’s F-12 087-08335)

·CHO DP-12用培养基(和光纯药工业株式会社IMDM，-06465)

·3.5cm培养皿(Falcon社cat.353001)

·Cell Counting Kit 8(株式会社同仁化学研究所CCK8 CK04)

·冻存管(Thermo Fisher Scientific社1.8mlcat.377267)

·2cm×2cm的无菌方形容器(Thermo Fisher Scientific社cat.103)

·细胞库(日本全药工业株式会社(日本全薬工業株式会社)CEllBANKER 1Pluscat.CB021)

·显微镜名称，使用图像处理软件名称(Carl Zeiss公司制LSM 700使用软件ZEN

【实施例1：使用人类皮肤成纤维细胞的聚酰亚胺多孔膜的长期培养】

2cm×2cm的无菌方形容器中加入细胞培养基0.5毫升，将灭菌的1.4cm角的正方形聚酰亚胺多孔膜分别浸渍在网结构的A面或大孔结构的B面之上。每1个片材5×10⁴个人类皮肤成纤维细胞和，每1个片材3×10⁵个人皮肤成纤维细胞悬浮液被分别加入，以每周两次的比例更换培养基，持续地实施细胞培养。将这些片材各自制备5片，转到20cm²的培养皿，加入培养基4毫升，连续培养中。4天，7天，13天，31天，56天，84天后使用CCK8测定细胞的数目，观察到增殖行为。结果示于图3。作为参考例，通过平面培养(接种密度：3.5×10³个细胞/cm²)到14天的经过情况给也被一起示出。

【实施例2：使用人类皮肤成纤维细胞的聚酰亚胺多孔膜的长期培养】

2cm×2cm经灭菌的方形容器中添加细胞培养基0.5毫升，将灭菌的1.4cm角的正方形聚酰亚胺多孔膜分别浸渍在网结构的A面或大孔结构的B面之上。接种每1个片材的4×10⁴个细胞，在CO₂培养箱中进行连续培养。每周两次更换培养基(1ml)。培养开始后，89天，118天，127天，139天后使用CCK 8测定细胞的数目，观察到细胞生长行为。整个观察期间，每1cm²观察到1.5×10⁵个以上的细胞数目。结果示在图4中。

【实施例3：使用Vero细胞的聚酰亚胺多孔膜的长期培养】

2cm×2cm经灭菌的方形容器中添加细胞培养基1毫升，灭菌的1.4cm角的正方形聚酰亚胺多孔膜分别浸渍在网结构的A面或大孔结构的B面之上。接种每1个片材4×10⁴个和1×10⁵个细胞，在CO₂培养箱中连续进行培养。此时，除了通常使用的厚度为25μm的聚酰亚胺多孔膜，使用75μm的聚酰亚胺多孔膜。此外，FBS量相对于培养基以10％或5％的量使用。每周两次更换培养基(1ml)，并继续培养。在140天周期中，使用CCK8间歇地测量细胞数，观察到细胞的生长行为。观察到稳定的细胞的生长。将其结果示于图5。

【实施例4】

2cm×2cm经灭菌的方形容器中添加细胞培养基1毫升，将灭菌的1.4cm角的正方形聚酰亚胺多孔膜浸渍在网结构A面之上。每1个片材4×10⁴个CHO-K1株细胞被添加，细胞培养20天后，使用CCK8测定细胞数，发现在片材上的细胞数为7.7×10⁶个。

将这种细胞生长的片材切割为3个细长片，加入培养基，在5℃保存20小时后，将聚酰亚胺多孔膜取出，并加入添加了CELLBANKER 1ml的冻存管，在-20℃保存24小时后，进一步地在-80℃保存24小时，被转移到液氮中。20天后，将管升温至37℃以熔融内容物，在培养箱中放置16小时。使用CCK8测定细胞数，发现片材上的细胞数为4.6×10⁶个。

【实施例5】

2cm×2cm经灭菌的方形容器中添加细胞培养基1毫升，将灭菌的1.4cm角的正方形聚酰亚胺多孔膜浸渍在网结构A面之上。每1个材片4×10⁴个人皮肤成纤维细胞被添加，细胞培养5天后，使用CCK8测定细胞数，发现在片材上的细胞数为7.7×10⁶个。

将这种细胞生长的片材切割为3个细长片，加入培养基，在5℃保存8小时后，将聚酰亚胺多孔膜取出，并放入添加了CELLBANKER1ml的低温管(冷冻管)，在-80℃保存24小时，转移至液态氮中。两天后，将管升温至37℃以融解内容物，移动至培养箱内培养条件下。3天后和5天后，通过用CCK8，由吸光度测定比活性，第3天、第5天比活性为36％和64％。

【实施例6：人类皮肤成纤维细胞长期培养】

【人类皮肤成纤维细胞的使用聚酰亚胺多孔膜的长期培养】

2cm×2cm经灭菌的方形容器中添加2％FBS人细胞培养基0.5毫升，将灭菌的1.4cm角正方形聚酰亚胺多孔膜分别浸渍于网结构的A面之上。每1个片材4×10⁴个人皮肤成纤维细胞悬浮液分别加入，以每周两次的比例更换培养基，持续实施细胞培养。231天，261天，294天，324天，365天，401天，471天后使用CCK8测定细胞的数目，观察到生长行为。结果示于图8。通过培养时期，稳定的活细胞数被确认。

【实施例7：人皮肤成纤维细胞长期培养时的气相传代导致的增殖确认】

2％FBS人培养基2毫升加入到直径6cm的培养皿，将每1个片材4×10⁴个人皮肤成纤维细胞接种于1.4cm边长的正方形聚酰亚胺多孔膜网结构A面，培养一个月。之后，将片材切割为4分之1，进一步培养继续，总培养230天。此后，在3.5cm盘中心，将1.4cm角的不锈钢网重叠3个并放置，在其上将前述聚酰亚胺多孔膜放置，并且通过灭菌的1.4cm角的空的聚酰亚胺多孔膜2个材夹住。在该状态下添加培养基1ml，培养基达到与片材相同的高度。在该状态下向CO₂培养箱中移动，以每周2次的比例更换培养基，持续进行细胞培养。7天培养后，各片材各自分出1个，作为单一片材继续培养。7天，10天，16天，21天，28天，42天，56天后使用CCK8测定细胞数目，对于原始片材和其后接地的空的聚酰亚胺多孔膜，利用CCK8染色法，对细胞的增殖行进行观察。从长期间培养人皮肤成纤维细胞的聚酰亚胺多孔膜，细胞有效地迁移到空的聚酰亚胺多孔膜，连续增殖的行为被观察到。结果示在图9中。

【实施例8：使用CHO DP-12细胞的细胞培养和将冷冻以及物质生产】

2cm×2cm经灭菌的方形容器中添加细胞培养基(2％FBS，IMDM，和光纯药工业株式会社(和光純薬工業株式会社))0.5毫升，将灭菌的1.4cm角的正方形聚酰亚胺多孔膜分别浸渍于网结构A面之上。将每1个片材4×10⁴个人抗IL-8产生CHO DP-12细胞悬浮液分别添加到培养基内片材上，以每周两次的比例更换培养基，持续进行细胞培养。细胞培养78天后，使用CCK8测定细胞数。

将这种片材4个在无菌条件下向4个冷冻保存袋以1袋1个材的方式转移，将每袋CELLBANKER 3毫升加入每个袋子。通过程序冷冻器在在2条件(每分钟1℃，或者，每10分钟1℃)冷冻到-80℃后，在-80℃下保存24小时，向液氮中移动。在3天之后，将袋升温到37℃以融解内容物，并向提前准备好的填充有培养基2毫升的10cm²培养皿4个中，转移前述各个片材，并将其放置于培养箱内24小时。此后，向2cm×2cm经灭菌的方形容器中转移片材，添加细胞培养基1毫升，另外培养3天。24小时后，2天后，3天后，4天后使用CCK8测定细胞数。结果示在图10中。

将如上所述培养细胞的冷冻片材4个与同样如上所述同时接种、继续培养的非冷冻片材2个各自1个放入10cm²培养皿，各自加入细胞培养基2毫升，在5％CO₂，37℃下温育24小时，收集培养上清液。在所收集的上清液中抗人IL-8抗体含量通过ELISA法定量。如表2所示，没有观察到抗由于冷冻的IL-8产生量的变化。结果示于表2中。

【表2】

	人抗IL-8抗体量(pg/细胞/天)
		冷冻片材①	26.4
冷冻片材②	18.0
		冷冻片材③	24.0
冷冻片材④	28.7
		非冷冻片材①	16.2
非冷冻片材②	19.3

【实施例9：人皮肤成纤维细胞的冷冻和物质产生】

2cm×2cm经灭菌的方形容器中添加细胞培养基0.5毫升，将灭菌的1.4cm角的正方形聚酰亚胺多孔膜分别浸渍于在网结构A面之上。每1个片材4×10⁴个人皮肤成纤维细胞悬浮液分别添加至培养基内片材上，在培养CO₂培养箱内开始培养。以每周两次的比例更换培养基，以继续实施细胞培养，细胞培养49天后，使用CCK 8测定细胞数，其是9.1×10⁴个。

将这种细胞生长的片材从培养基中取出，转移至先前制备的、加入CELLBANKER 3毫升的冷冻保存袋，通过程序冷冻器每10分钟降低1℃，冷冻至-80℃后，在-80℃保存24小时，并保存在液氮中。5天后，将袋温热至37℃以使内容物融解，向预先制备的、填充有培养基2毫升的10cm²培养皿转移片材，并在CO₂培养箱中继续培养。培养基更换是以每周两次的速度进行。24小时后，5天后，8天后，13天后，21天后，29天后和35天后使用CCK8测定片材中生长的细胞数。结果示于图11。24小时后，8天后，21天后和35天后的比活性，分别为34％，91％，105％和152％。35天培养后，相同的片材中生长的人皮肤成纤维细胞的纤连蛋白的产生量通过ELISA法测量。结果示于下表。在没有由冷冻产生的损伤的情况下、物质生产继续进行的情况被证实。结果示于表3。

【表3】

项目(培养天数与状况)	每面积的纤连蛋白产生量(ng/cm<sup>2</sup>/天)
		聚酰亚胺多孔膜培养通常培养第13天(运行1)	480
聚酰亚胺多孔膜培养通常培养第13天(运行2)	376
		冷冻、解冻后培养35天的片材	685

本说明书还包括下列内容：

1.细胞的长期培养方法，其包括：

(1)将细胞播种到聚酰亚胺多孔膜，和

(2)将播种了细胞的聚酰亚胺多孔膜由细胞培养基润湿，将细胞培养30天以上。

2.实施方式1所述的方法，在工序(2)中，培养细胞60天以上。

3.实施方式1所述的方法，在工序(2)中，培养细胞120天以上。

4.实施方式1～3之任一项所述的方法，将2个以上的聚酰亚胺多孔膜，在细胞培养基中上下或左右地层叠。

5.实施方式1～4之任一项所述的方法，将聚酰亚胺多孔膜

(i)折叠，

(ii)卷成卷状，

(iii)将片材或小片通过丝状结构体连接，或

(iv)系成绳状

悬浮或固定在细胞培养容器中的细胞培养基中。

6.实施方式1～5之任一项所述的方法，在工序(2)的培养中，聚酰亚胺多孔膜的部分或全部不与细胞培养基的液相接触。

7.实施方式1～6之任一项所述的方法，在工序(2)的培养中，在细胞培养容器中包含的细胞培养基的总体积是，包括细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜体积总和的10000倍或比其更少。

8.实施方式1～7之任一项所述的方法，在工序(2)的培养中，在细胞培养容器中包含的细胞培养基的总体积是，包括细胞生存区的聚酰亚胺多孔膜体积总和的100倍或比其更少。

9.实施方式1～8之任一项所述的方法，工序(2)的培养，通过从细胞培养容器外设置的细胞培养基供给器件、连续或间歇地将细胞培养基供给至细胞培养容器中的系统进行。

10.实施方式9所述的方法，细胞培养基在细胞培养基供给器件和细胞培养容器中之间循环。

11.实施方式9或10所述的方法，其中前述系统是细胞培养装置，其包括作为细胞培养容器的培养单元以及作为细胞培养基供给器件的培养基供给单元、此处

培养单元是容纳用于承载细胞的一个或多个聚酰亚胺多孔膜的培养单元，是具有培养基供给口和培养基排出口的培养单元，

培养基供给单元具备培养基收纳容器，培养基供给线，以及用于通过所述培养基供给线连续地或间歇地将培养基送液的送液泵，此处培养基供给线的第一端部与培养基收纳容器内的培养基接触，培养基供给线的第二端部通过培养单元的培养基供给口与培养单元内连通。

12.实施方式13所述的方法，培养单元是不具备空气供给口，空气排出口，和氧交换膜的培养单元。

13.实施方式11或12所述的方法，培养单元还具备培养基排出线，其中，培养基排出线的第一端部连接到培养基收纳容器，培养基排出线第二端部经由培养单元的培养基排出口，连通至培养单元内，培养基能在培养基供给单元以及培养单元之间循环。

14.实施方式1～13之任一项所述的方法，细胞选自：动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母菌和细菌。

15.实施方式14所述的方法，动物细胞是来自属于脊椎动物的动物的细胞。

16.实施方式15所述的方法，细胞选自：CHO细胞，CHO-K1细胞株，CHODP-12细胞株，CHO细胞关联株，Vero细胞，和MDCK细胞。

17.实施方式1～16之任一项所述的方法，聚酰亚胺多孔膜是包括从四羧酸二酐和二胺所获得的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜。

18.实施方式17所述的方法，聚酰亚胺多孔膜是，使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后、在250℃以上进行热处理、由此得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。

19.用于在实施方式1～18之任一项所述的方法中使用的细胞培养装置，含有聚酰亚胺多孔膜。

20.实施方式19所述的细胞培养装置，2个以上的聚酰亚胺多孔膜上下或左右地层叠。

21.用于实施方式1～13之任一项所述的方法中使用的试剂盒，含有聚酰亚胺多孔膜。

22.聚酰亚胺多孔膜在细胞的长期培养方法中的用途。

23.细胞的冷冻保存方法，其包括以下工序：

(1)将细胞承载至聚酰亚胺多孔膜的工序，

(2)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜放置在冷冻细胞的条件下，由此冷冻由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞的工序，和

(3)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜以保持冷冻状态的条件保存的工序。

24.实施方式23所述的方法，其中在工序(1)中，通过在聚酰亚胺多孔膜接种细胞，使细胞承载于聚酰亚胺多孔膜。

25.实施方式23所述的方法，其中在工序(1)中，通过将细胞接种到聚酰亚胺多孔膜而培养，使细胞承载于聚酰亚胺多孔膜。

26.实施方式23～25之任一项所述的方法，其中在工序(3)之后还包括：

(4)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜在解冻细胞的条件下放置，由此使由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞解冻。

27.实施方式26所述的方法，其中在工序(4)之后还包括：

(5)将细胞解冻的聚酰亚胺多孔膜由细胞培养基润湿而培养细胞的工序。

28.实施方式27所述的方法，其中在工序(5)中，培养细胞直到培养的细胞在聚酰亚胺多孔膜外也增殖。

29.实施方式27或28所述的方法，其中在工序(5)中，与细胞解冻的聚酰亚胺多孔膜一同、将不承载细胞的另外一个或多个聚酰亚胺多孔膜由细胞培养基润湿并培养，由此，使细胞承载于另外一个或多个聚酰亚胺多孔膜。

30.实施方式27～29之任一项所述的方法，其中在工序(5)之后还包括：

(6)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜的部分或全部，在冷冻细胞的条件下放置，由此冷冻由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞的工序，和

(7)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜以保持冷冻状态的条件保存的工序。

31.实施方式30所述的方法，其中所述工序(1)至(7)重复多次。

32.实施方式23～31之任一项所述的方法，其中所述细胞选自：动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母菌和细菌。

33.实施方式32所述的方法，其中所述动物细胞是来自属于脊椎动物的动物的细胞。

34.实施方式32或33所述的方法，其中所述细胞是附着细胞。

35.实施方式32或33所述的方法，其中所述细胞是悬浮细胞。

36.实施方式23～25之任一项所述的方法，其中所述聚酰亚胺多孔膜是包括从四羧酸二酐和二胺获得的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜。

37.实施方式36所述的方法，其中所述聚酰亚胺多孔膜是使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后、在250℃以上进行热处理、由此得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。

38.实施方式36或37所述的方法，其中所述聚酰亚胺多孔膜是具有两个不同的表面层和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔膜。

39.聚酰亚胺多孔膜，其用于细胞的冷冻保存。

40.聚酰亚胺多孔膜，其用于在实施方式23～38之任一项所述的方法中使用。

41.用于在实施方式23～38之任一项所述的方法中使用的试剂盒，其含有聚酰亚胺多孔膜。

42.聚酰亚胺多孔膜在实施方式23～38之任一项所述的方法中的用途。

Claims (17)

1.细胞的冷冻保存方法，其包括以下工序：

(1)将细胞承载至聚酰亚胺多孔膜的工序，

(2)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜放置在冷冻细胞的条件下，由此冷冻由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞的工序，和

(3)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜以保持冷冻状态的条件保存的工序，

其中，

所述聚酰亚胺多孔膜具有多层结构，所述多层结构至少具有：

两个表面层A面和B面、和

夹在所述两个表面层A面和B面之间的大空隙层，

所述A面中存在的孔的平均孔径小于所述B面中存在的孔的平均孔径，

所述大空隙层具有：

结合到表面层A面和B面的隔壁、以及

由所述隔壁和所述表面层A面和B面所包围的多个大空隙。

2.权利要求1所述的方法，其中在工序(1)中，通过在聚酰亚胺多孔膜接种细胞，使细胞承载于聚酰亚胺多孔膜。

3.权利要求1所述的方法，其中在工序(1)中，通过将细胞接种到聚酰亚胺多孔膜而培养，使细胞承载于聚酰亚胺多孔膜。

4.权利要求1所述的方法，其中在工序(3)之后还包括：

(4)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜在解冻细胞的条件下放置，由此使由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞解冻。

5.权利要求4所述的方法，其中在工序(4)之后还包括：

(5)将细胞解冻的聚酰亚胺多孔膜由细胞培养基润湿而培养细胞的工序。

6.权利要求5所述的方法，其中在工序(5)中，培养细胞直到培养的细胞在聚酰亚胺多孔膜外也增殖。

7.权利要求5所述的方法，其中在工序(5)中，与细胞解冻的聚酰亚胺多孔膜一同、将不承载细胞的另外一个或多个聚酰亚胺多孔膜由细胞培养基润湿并培养，由此，使细胞承载于另外一个或多个聚酰亚胺多孔膜。

8.权利要求5所述的方法，其中在工序(5)之后还包括：

(6)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜的部分或全部，在冷冻细胞的条件下放置，由此冷冻由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞的工序，和

(7)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜以保持冷冻状态的条件保存的工序。

9.权利要求8所述的方法，其中所述工序(1)至(7)重复多次。

10.权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自：动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母菌和细菌。

11.权利要求10所述的方法，其中所述动物细胞是来自属于脊椎动物的动物的细胞。

12.权利要求10或11所述的方法，其中所述细胞是附着细胞。

13.权利要求10或11所述的方法，其中所述细胞是悬浮细胞。

14.权利要求1所述的方法，其中所述聚酰亚胺多孔膜是包括从四羧酸二酐和二胺获得的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜。

15.权利要求14所述的方法，其中所述聚酰亚胺多孔膜是使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后、在250℃以上进行热处理、由此得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。

16.用于在权利要求1所述的方法中使用的试剂盒，其含有聚酰亚胺多孔膜和细胞冷冻保存液，其中

所述聚酰亚胺多孔膜具有多层结构，所述多层结构至少具有：

两个表面层A面和B面、和

夹在所述两个表面层A面和B面之间的大空隙层，

所述A面中存在的孔的平均孔径小于所述B面中存在的孔的平均孔径，

所述大空隙层具有：

结合到表面层A面和B面的隔壁、以及

由所述隔壁和所述表面层A面和B面所包围的多个大空隙。

17.聚酰亚胺多孔膜在权利要求1所述的方法中的用途，其中

所述聚酰亚胺多孔膜具有多层结构，所述多层结构至少具有：

两个表面层A面和B面、和

夹在所述两个表面层A面和B面之间的大空隙层，

所述A面中存在的孔的平均孔径小于所述B面中存在的孔的平均孔径，

所述大空隙层具有：

结合到表面层A面和B面的隔壁、以及

由所述隔壁和所述表面层A面和B面所包围的多个大空隙。

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