JPH05123168A - 細胞長期培養方法 - Google Patents
細胞長期培養方法Info
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- JPH05123168A JPH05123168A JP3314111A JP31411191A JPH05123168A JP H05123168 A JPH05123168 A JP H05123168A JP 3314111 A JP3314111 A JP 3314111A JP 31411191 A JP31411191 A JP 31411191A JP H05123168 A JPH05123168 A JP H05123168A
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- JP
- Japan
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- culture
- cells
- cell culture
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/06—Nozzles; Sprayers; Spargers; Diffusers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
- C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
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- Wood Science & Technology (AREA)
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- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 培養容器内に電極を持たず、可動部分が攪拌
装置のみである細胞培養装置を使用して、細胞を非増殖
的に培養することを特徴とする細胞長期培養方法に関す
る。当該培養方法においては、細胞の非増殖的培養条件
が培地として無血清培地を使用し、且つ細胞として付着
性細胞を使用することを特徴とし、液相へ緩和な発泡状
態にて通気を行う。 【効果】 本発明の培養方法により、長期間にわたって
安定な細胞培養が可能となる。
装置のみである細胞培養装置を使用して、細胞を非増殖
的に培養することを特徴とする細胞長期培養方法に関す
る。当該培養方法においては、細胞の非増殖的培養条件
が培地として無血清培地を使用し、且つ細胞として付着
性細胞を使用することを特徴とし、液相へ緩和な発泡状
態にて通気を行う。 【効果】 本発明の培養方法により、長期間にわたって
安定な細胞培養が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、長期間の、就中、３ヵ
月以上〜数年間におよぶ培養が可能な細胞長期培養方法
に関する。
月以上〜数年間におよぶ培養が可能な細胞長期培養方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】大量の細胞を長期間にわたって安定に培
養することは、近年各種の生化学上、医学上および製薬
上重要な手法となってきている。特に、ヒト胎児腎由来
株化細胞によるプロウロキナーゼの生産、ＣＨＯ細胞に
よる生理活性物質の生産等、細胞培養による有用医薬の
生産にとってきわめて重要な手法となっている。
養することは、近年各種の生化学上、医学上および製薬
上重要な手法となってきている。特に、ヒト胎児腎由来
株化細胞によるプロウロキナーゼの生産、ＣＨＯ細胞に
よる生理活性物質の生産等、細胞培養による有用医薬の
生産にとってきわめて重要な手法となっている。
【０００３】しかしながら、通常の培養装置において
は、培養槽内に昇温および恒温維持のための電極、消泡
電極、ｐＨ電極、溶存酸素電極、酸化還元電極等の電極
類が存在し、これらの電極への蛋白の付着、雑菌汚染、
内部液の消失による電極の劣化などが発生しやすい。従
って、少なくとも３〜６カ月の間隔でそれらの取替えが
必要となり、培養を中断しなければならない。
は、培養槽内に昇温および恒温維持のための電極、消泡
電極、ｐＨ電極、溶存酸素電極、酸化還元電極等の電極
類が存在し、これらの電極への蛋白の付着、雑菌汚染、
内部液の消失による電極の劣化などが発生しやすい。従
って、少なくとも３〜６カ月の間隔でそれらの取替えが
必要となり、培養を中断しなければならない。
【０００４】また、培養槽、就中、通気攪拌槽は、攪拌
装置に加え、温度、ｐＨ、溶存酸素等の測定のためのセ
ンサー類、ｐＨや溶存酸素などを一定に維持するための
制御装置などが加わり、その内部構造が複雑であるた
め、これらが蛋白質の付着等によって汚染されるので、
その洗浄のために培養を中断しなければならず、この点
でも長期培養が不可能となる。
装置に加え、温度、ｐＨ、溶存酸素等の測定のためのセ
ンサー類、ｐＨや溶存酸素などを一定に維持するための
制御装置などが加わり、その内部構造が複雑であるた
め、これらが蛋白質の付着等によって汚染されるので、
その洗浄のために培養を中断しなければならず、この点
でも長期培養が不可能となる。
【０００５】さらに、血清培地を使用すると発泡が起こ
るため、機械的に破泡するための装置や、消泡電極と消
泡剤の自動添加装置を付置する必要が生じるが、これら
も蛋白質の付着等によって汚染されるので、その洗浄の
ために培養を中断しなければならない。また、発泡をな
くするために、気相への通気のみを行った場合には、液
相への溶存酸素量が不十分となり、細胞の培養に重大な
影響を与えることとなる。従って、液相への通気を行う
ことが好ましいが、この通気を行うためのチューブも蛋
白質の付着等によって汚染される。
るため、機械的に破泡するための装置や、消泡電極と消
泡剤の自動添加装置を付置する必要が生じるが、これら
も蛋白質の付着等によって汚染されるので、その洗浄の
ために培養を中断しなければならない。また、発泡をな
くするために、気相への通気のみを行った場合には、液
相への溶存酸素量が不十分となり、細胞の培養に重大な
影響を与えることとなる。従って、液相への通気を行う
ことが好ましいが、この通気を行うためのチューブも蛋
白質の付着等によって汚染される。
【０００６】かかる事情により、１年以上の長期培養を
安定に行うことを報告した例は知られていない。
安定に行うことを報告した例は知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、長期間にわたって安定に細胞を培養可能な培養方法
を提供することにある。
は、長期間にわたって安定に細胞を培養可能な培養方法
を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題は、本発明、即
ち以下の発明によって達成される。 培養容器内に電極を持たず、可動部分が攪拌装置のみ
である細胞培養装置を使用して、細胞を非増殖的に培養
することを特徴とする細胞長期培養方法。 細胞の非増殖的培養条件が培地として無血清培地を使
用し、且つ細胞として付着性細胞を使用することを特徴
とする上記記載の細胞長期培養方法。 液相へ緩和な発泡状態にて通気を行うことを特徴とす
る上記記載の細胞長期培養方法。
ち以下の発明によって達成される。 培養容器内に電極を持たず、可動部分が攪拌装置のみ
である細胞培養装置を使用して、細胞を非増殖的に培養
することを特徴とする細胞長期培養方法。 細胞の非増殖的培養条件が培地として無血清培地を使
用し、且つ細胞として付着性細胞を使用することを特徴
とする上記記載の細胞長期培養方法。 液相へ緩和な発泡状態にて通気を行うことを特徴とす
る上記記載の細胞長期培養方法。
【０００９】〔Ｉ〕 本発明の培養方法に使用する装置
システムを以下に説明する。 （１）培養容器 本発明の培養容器に使用される材質としては、ガラス
（パイレックス）、ステンレス等が例示される。培養容
器の容量としては、十〜数千リットルのものを使用し、
培養液量は培養器容量の約半量使用することが好まし
い。培養容器には、培養液注入出用管、エアーレーショ
ン用管（気相）、エアーレーション用管（液相）、サン
プリング用管、排気用管、インペラーアッセンブリ（攪
拌装置）を装着する。本発明の培養装置組立て図を図１
に示す。
システムを以下に説明する。 （１）培養容器 本発明の培養容器に使用される材質としては、ガラス
（パイレックス）、ステンレス等が例示される。培養容
器の容量としては、十〜数千リットルのものを使用し、
培養液量は培養器容量の約半量使用することが好まし
い。培養容器には、培養液注入出用管、エアーレーショ
ン用管（気相）、エアーレーション用管（液相）、サン
プリング用管、排気用管、インペラーアッセンブリ（攪
拌装置）を装着する。本発明の培養装置組立て図を図１
に示す。
【００１０】（２）エアーレーション エアーレーションラインは、大量培養を行う時、培養液
中の溶存酸素量及びＣＯ2 濃度を一定に保ち、細胞の増
殖性を高めるのに必須な装置である。エアーレーション
に用いるガス組成としては、Ｎ2 、Ｏ2 、ＣＯ2 、空気
などが例示され、本ガスは除菌濾過フィルターを通過さ
せ、完全無菌ガスとして使用する。エアーレーションの
条件は、例えば４０Ｌ容の培養容器の場合、気相に約０
ml/min〜1000ml/min、好ましくは約500ml/min 、液相に
０ml/min〜1000ml/min、好ましくは約400ml/min の流量
を保って通気するよう流量計のバルブを調整する。本発
明の培養装置に係わるエアーレーション系統の概略を図
２に示す。
中の溶存酸素量及びＣＯ2 濃度を一定に保ち、細胞の増
殖性を高めるのに必須な装置である。エアーレーション
に用いるガス組成としては、Ｎ2 、Ｏ2 、ＣＯ2 、空気
などが例示され、本ガスは除菌濾過フィルターを通過さ
せ、完全無菌ガスとして使用する。エアーレーションの
条件は、例えば４０Ｌ容の培養容器の場合、気相に約０
ml/min〜1000ml/min、好ましくは約500ml/min 、液相に
０ml/min〜1000ml/min、好ましくは約400ml/min の流量
を保って通気するよう流量計のバルブを調整する。本発
明の培養装置に係わるエアーレーション系統の概略を図
２に示す。
【００１１】（３）加温装置 加温装置には、恒温水槽、ベルトヒーター、ジャケット
システム等がある。例えば、恒温水槽は、長期間連続し
て培養液を36〜37℃(30 〜40℃に設定可能）に正確に保
つ装置であり、使用する加温器は恒温水槽を長期間温度
制御（36〜37℃）出来ると共に、攪拌が行えるものであ
る。恒温水槽は、使用する培養容器に合わせ、アクリル
樹脂またはステンレス製のものを使用する。恒温水槽は
過熱と過冷を防ぐため、加温器には、サーミスターを、
恒温水槽には温度センサーを取り付け警報器と連結させ
る。マグネチックスターラー(20 〜25rpm に維持) 、加
温器、恒温水槽、サーモポンプを図３に示すように、ス
ピンナー台上に設置する。
システム等がある。例えば、恒温水槽は、長期間連続し
て培養液を36〜37℃(30 〜40℃に設定可能）に正確に保
つ装置であり、使用する加温器は恒温水槽を長期間温度
制御（36〜37℃）出来ると共に、攪拌が行えるものであ
る。恒温水槽は、使用する培養容器に合わせ、アクリル
樹脂またはステンレス製のものを使用する。恒温水槽は
過熱と過冷を防ぐため、加温器には、サーミスターを、
恒温水槽には温度センサーを取り付け警報器と連結させ
る。マグネチックスターラー(20 〜25rpm に維持) 、加
温器、恒温水槽、サーモポンプを図３に示すように、ス
ピンナー台上に設置する。
【００１２】〔II〕 本発明の培養方法を以下に説明す
る。
る。
【００１３】本発明おいては、通常無血清培地が使用さ
れるが、当該培地の例としては、ダルベッコの変法イー
グル培地（ＤＭＥ）、Waymouth's MB 752/1 、Medium 1
99 (Gibco 社製) を基本に微量のヒト血清アルブミン、
トランスフェリン、インシュリン等の血清成分及びEGF
等の増殖因子を加えたものが使用される。市販品として
は、ＡＳＦ３０１(RITC 807G) （味の素（株）製）が例
示される。なお、本発明にいう無血清培地とは、全く血
清のない培地のみならず、実質的に無血清の培地をも包
含するものである。ここに実質的に無血清の培地とは、
培養に影響を及ぼさない発泡しかおこらない程度に血清
を含むものをも包含するものである。
れるが、当該培地の例としては、ダルベッコの変法イー
グル培地（ＤＭＥ）、Waymouth's MB 752/1 、Medium 1
99 (Gibco 社製) を基本に微量のヒト血清アルブミン、
トランスフェリン、インシュリン等の血清成分及びEGF
等の増殖因子を加えたものが使用される。市販品として
は、ＡＳＦ３０１(RITC 807G) （味の素（株）製）が例
示される。なお、本発明にいう無血清培地とは、全く血
清のない培地のみならず、実質的に無血清の培地をも包
含するものである。ここに実質的に無血清の培地とは、
培養に影響を及ぼさない発泡しかおこらない程度に血清
を含むものをも包含するものである。
【００１４】本発明において、使用される付着性細胞と
は、適当な担体に付着して単層状に細胞層を形成しなけ
れば増殖できない、いわゆる接着依存性細胞である。接
着依存性細胞では、その接着面積を多くするような工夫
が必要である。代表的な例としては、緩い攪拌下でも培
養液中に浮遊する程度の比重をもつ微小な樹脂性ビーズ
（マイクロキャリアー）の表面に細胞を接着させる方法
がある。かかる付着性細胞の例としては、ヒト胎児腎由
来株化細胞、チャイニーズハムスターオバリー細胞（Ｃ
ＨＯ細胞）、ヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞等が例示さ
れる。
は、適当な担体に付着して単層状に細胞層を形成しなけ
れば増殖できない、いわゆる接着依存性細胞である。接
着依存性細胞では、その接着面積を多くするような工夫
が必要である。代表的な例としては、緩い攪拌下でも培
養液中に浮遊する程度の比重をもつ微小な樹脂性ビーズ
（マイクロキャリアー）の表面に細胞を接着させる方法
がある。かかる付着性細胞の例としては、ヒト胎児腎由
来株化細胞、チャイニーズハムスターオバリー細胞（Ｃ
ＨＯ細胞）、ヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞等が例示さ
れる。
【００１５】付着性細胞の接着に用いるマイクロキャリ
アービーズは、培養液１Ｌ当たり３〜10ｇ量を予め培養
容器に入れておく。付着は通常一般的に行われている方
法、すなわち細胞とマイクロキャリアービーズをスピン
ナーフラスコの中に入れ、少量の培養液中で攪拌、静置
の操作を数回繰り返すことにより行われる。
アービーズは、培養液１Ｌ当たり３〜10ｇ量を予め培養
容器に入れておく。付着は通常一般的に行われている方
法、すなわち細胞とマイクロキャリアービーズをスピン
ナーフラスコの中に入れ、少量の培養液中で攪拌、静置
の操作を数回繰り返すことにより行われる。
【００１６】
【発明の効果】本発明の培養方法は、培養容器内に電極
等を持たず、培養容器内部構造が簡単であるので、培養
容器内の装置への蛋白等の付着が極めて少なく、雑菌汚
染されにくいので、長期間にわたって培養を中断するよ
うな洗浄を行う必要がない。従って、本発明の方法によ
れば、培養容器の洗浄のために培養の途中で培養を中断
する必要がない。また、無血清培地と付着性細胞との組
み合わせにより、細胞の非増殖性条件下で細胞培養が行
われるため細胞数が一定であるので、培養条件の変更な
どのコントロールを行う必要がない。さらには液相へ緩
和な発泡状態にて通気を行うことによって通気チューブ
への蛋白等の付着が極めて少なくなる。以上のことか
ら、本発明においては一度培養条件を特定すればその条
件を保つことで十分であり、且つ培養装置について培養
を中断するような洗浄を必要としないので、長期にわた
って培養を行うことが可能である。よって、本発明の培
養方法により、５ヵ月以上〜数年、例えば３年という長
期にわたる培養が可能となる。
等を持たず、培養容器内部構造が簡単であるので、培養
容器内の装置への蛋白等の付着が極めて少なく、雑菌汚
染されにくいので、長期間にわたって培養を中断するよ
うな洗浄を行う必要がない。従って、本発明の方法によ
れば、培養容器の洗浄のために培養の途中で培養を中断
する必要がない。また、無血清培地と付着性細胞との組
み合わせにより、細胞の非増殖性条件下で細胞培養が行
われるため細胞数が一定であるので、培養条件の変更な
どのコントロールを行う必要がない。さらには液相へ緩
和な発泡状態にて通気を行うことによって通気チューブ
への蛋白等の付着が極めて少なくなる。以上のことか
ら、本発明においては一度培養条件を特定すればその条
件を保つことで十分であり、且つ培養装置について培養
を中断するような洗浄を必要としないので、長期にわた
って培養を行うことが可能である。よって、本発明の培
養方法により、５ヵ月以上〜数年、例えば３年という長
期にわたる培養が可能となる。
【００１７】
実施例１ (1) 増殖培養 製造用のバンク細胞（ヒト胎児腎由来株化細胞, 3.2 ×
109cells/10L スピナー) を、牛胎児血清（以下、ＦＣ
Ｓ）を１〜１０（ｖ／ｖ）％の割合で添加したウェイマ
ス培養液を用いて３６〜３７℃で培養して増殖させた
後、あらかじめマイクロキャリアービースを入れておい
た製造用スピンナーフラスコの中で、同じ培養液を用
い、３６〜３７℃で攪拌培養して更に増殖させて増殖培
養を終了する。 (2) 生産培養 増殖培養を終了した製造用スピンナーフラスコについ
て、ＦＣＳの代わりにヒト血清アルブミンを0.01〜0.2
(w/v)% となるように添加したウェイマス培養液と交換
し、以後２〜３日毎に培養上清の約３／４量を同培養液
と交換し、培養液中に生産させたプロウロキナーゼを得
る。その産生量は80U/ml（ウロキナーゼ変換時）であっ
た。培養は３年以上可能であった。本培養期間中におけ
る細胞数の推移の一例を、図４に示した。
109cells/10L スピナー) を、牛胎児血清（以下、ＦＣ
Ｓ）を１〜１０（ｖ／ｖ）％の割合で添加したウェイマ
ス培養液を用いて３６〜３７℃で培養して増殖させた
後、あらかじめマイクロキャリアービースを入れておい
た製造用スピンナーフラスコの中で、同じ培養液を用
い、３６〜３７℃で攪拌培養して更に増殖させて増殖培
養を終了する。 (2) 生産培養 増殖培養を終了した製造用スピンナーフラスコについ
て、ＦＣＳの代わりにヒト血清アルブミンを0.01〜0.2
(w/v)% となるように添加したウェイマス培養液と交換
し、以後２〜３日毎に培養上清の約３／４量を同培養液
と交換し、培養液中に生産させたプロウロキナーゼを得
る。その産生量は80U/ml（ウロキナーゼ変換時）であっ
た。培養は３年以上可能であった。本培養期間中におけ
る細胞数の推移の一例を、図４に示した。
【図１】本発明の培養装置組立て図を示す。
【図２】本発明の培養装置に係わるエアーレーション系
統の概略を示す。
統の概略を示す。
【図３】本発明の培養装置に係わる恒温水槽の概略図を
示す。
示す。
【図４】細胞培養期間中における細胞数の推移の一例を
示す。
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/08 (72)発明者 有村 博文 大阪府大阪市中央区今橋１丁目３番３号 株式会社ミドリ十字内
Claims (3)
- 【請求項１】 培養容器内に電極を持たず、可動部分が
攪拌装置のみである細胞培養装置を使用して、細胞を非
増殖的に培養することを特徴とする細胞長期培養方法。 - 【請求項２】 細胞の非増殖的培養条件が培地として無
血清培地を使用し、且つ細胞として付着性細胞を使用す
ることを特徴とする請求項１記載の細胞長期培養方法。 - 【請求項３】 液相へ緩和な発泡状態にて通気を行うこ
とを特徴とする請求項２記載の細胞長期培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3314111A JPH05123168A (ja) | 1991-10-30 | 1991-10-30 | 細胞長期培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3314111A JPH05123168A (ja) | 1991-10-30 | 1991-10-30 | 細胞長期培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05123168A true JPH05123168A (ja) | 1993-05-21 |
Family
ID=18049380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3314111A Pending JPH05123168A (ja) | 1991-10-30 | 1991-10-30 | 細胞長期培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05123168A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7312025B2 (en) | 2002-07-12 | 2007-12-25 | University Of Washington | Methods and systems for extended in vitro culture of neuronal cells |
| KR20170093250A (ko) | 2015-01-26 | 2017-08-14 | 우베 고산 가부시키가이샤 | 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 장기 배양, 및 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 동결 보존 방법 |
-
1991
- 1991-10-30 JP JP3314111A patent/JPH05123168A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7312025B2 (en) | 2002-07-12 | 2007-12-25 | University Of Washington | Methods and systems for extended in vitro culture of neuronal cells |
| KR20170093250A (ko) | 2015-01-26 | 2017-08-14 | 우베 고산 가부시키가이샤 | 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 장기 배양, 및 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 동결 보존 방법 |
| EP3406707A1 (en) | 2015-01-26 | 2018-11-28 | Ube Industries, Ltd. | Long-term cell-cultivation using polyimide porous membrane and cell-cryopreservation method using polyimide porous membrane |
| US10443037B2 (en) | 2015-01-26 | 2019-10-15 | Ube Industries, Ltd. | Long-term cell-cultivation using polyimide porous membrane and cell-cryopreservation method using polyimide porous membrane |
| US10626365B2 (en) | 2015-01-26 | 2020-04-21 | Ube Industries, Ltd. | Long-term cell-cultivation using polyimide porous membrane and cell-cryopreservation method using polyimide porous membrane |
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