JPS59118080A - 静的細胞培養維持方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は細胞培養の方法および装置に関するものであり
、特に、静的細胞培養維持システムに関する。

種々の蛋白質、ペゾチＶ、ホルモン、発育因子およびそ
の他の生物学上活性な物質を生産するために動物細胞の
試験管内培養が広く研究されている。

有意義な生物医学的興味を有する重要な生物分子を分泌
せしめるために非常に多くの動物細胞が細胞培養に利用
されてきた。例えば、下垂体細胞を試験管内で培養して
成長ホルモンを生産した；腎臓細胞を培養してプラスミ
ノーゲン活性化因子を生産した；また、培養された肝蔵
細胞中でＡ型肝炎抗原を生産した。その他の細胞を特別
に培養して種々のウィルスワクチンや抗体を生産した。

このように、種々の動物細胞の試験管内培養によってイ
ンターフェロン、インシュリン、アンジオジェニック（
ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ　）因子、フィブロネクチンおよ
びその他の多数の生物分子が生産されている。

興味ある生物分子を試験管内細胞培養で生産するために
は、非常に多様な手法および装置が従来使用されている
。成る比較的簡単なシステムにおいては、ティッシュ（
ｔｉｓｓｕｅ　）フラスコやローラーびん内で適切な栄
養素培地の存在下で細胞が増殖されて集合する。もつと
複雑なシステムは表面支持体として及び栄養素培地を細
胞に供給する手段として毛細中空繊維膜を使用している
。後者のシステムでは、米国特許第３．８２１．０８７
号。

第４．２２０．７２５号、および第４．１８４．９２２
号に記載されているように長い束状構造に配列された中
空繊維の内腔を通して栄養素培地を吸い上げることがで
きる；または、米国特許第３，９９７．６９６号に開示
されているように好気状態を維持するため中空繊維膜を
通して酸素を供給することができる。

中空繊維膜細胞培養技術をさらに改善したものは米国特
許第４．０８７．３２７号および第４．２０１．８４５
号から明らかなように繊維ベラＶを横切って比較的短い
流路で栄養素培地を供給するフラットベッド配置である
。フラットベッド配置は中空繊維膜の長（・カート１，
１ッジ即ち束状構造配置によって生ずる望ましくない栄
養勾配を減少させる。

その他の細胞培養システムは例えば米国特許第４．０５
９，４８５号、第４．１６６．７６８号。

第４，１７８．２０９号および第４，１８４，９１６号
に記載されているように特に大規模操作用の攪拌液体懸
濁培養で細胞を増殖させるものである。表面支持体を必
要とする細胞の場合には、支持体手段としてミクロ千ヤ
リャが懸濁培地中に使用されている。このようなミクロ
キャリヤは例えば米国特許第３．７１７．５５１号、第
４．０３６．６９３号。

第４，１８９．５３４号、第４．２０３．８０１号。

第４，２３７．’０３３号、第４，２３７，２１８号。

第４．２６６，０３２号、第４，２８９，８５４号。

第４．２９３，６５４号、および第４．３３５．２１５
号に例示されている。

さらに、ミクロキャリヤ培養における動物細胞の産生に
関する従来の培養条件についての背景情報はクラークと
ヒルテンシュタインの最近の論文Ａｎｎ、ＮＹＡｃａｄ
、Ｓｃｉ、３６９．３３〜４’５　（１９８１）が参考
になる。

上記の試験管内細胞培養システムの大部分は、数の多い
細胞の増殖を刺激する手段または極めて少なし・数の非
増殖性細胞の分化作用の検討を強調するものであった。

いくつかの分泌生物分子は高増殖中に産生されることも
あるが、このような輸出生物分子は抑制された分化され
た状態で効率良く産生される。さらに、いくつかの生体
内分泌細胞は非常に低い増殖速度を有している。従って
、極めて多数の細胞を低増畑状態でしかも連続産生物分
泌状態に維持できる試験管内細胞培養システムは大きな
価値を有する。

発明の概要 本発明によれば、 （ａｌ細胞培養反応器の室内に配置されそして流体栄養
素培地の通過のための隙間を有する半硬質マトリックス
の中に動物細胞を懸濁し、 （ｂ）該細胞のために新鮮な栄養素培地を反応器の外部
流入口から、実質的に該マトリックスの広が）全体にわ
たって該室内に配置されている少なくとも１個の第一多
孔管の内腔中へ送シぞして該多孔管の壁を通して該栄養
素培地を該マトリックス中へ潅流することによって供給
し、 （Ｃ）該マトリックスから使用済栄養素培地と細胞産生
物を、実質的に該マトリックスの広がシ全体にわたって
該室内に配置されている少なくとも１個の第二多孔管の
壁を通して潅流しそして該使用済栄養素培地と細胞産生
物を該反応器の外部流出口を通して送多出すことによっ
て回収し、但し、該第二多孔管は該第−多孔管の孔径よ
シ大きい孔径を有している、 そして （ｄ）該細胞のために酸素添加気体媒質を、実質的に該
マトリックスの広がり全体にわたって該室内気体の入口
および出口用の開口を有している）の壁を通して該マト
リックス中へ潅流することによって供給すること を特徴とするシステムによって、動物細胞は実質的に増
殖を抑制された状態で細胞産生物の連続分泌を伴って試
験管内に維持される。

この細胞維持システムに使用される装置は、ノ１ウジン
グ；流体培地の通過のための隙間を有する半硬質マトリ
ックス中の細胞を収容するための該ハウジング内の室；
該ノ・ウジングの壁に設けられた外部培地流入口および
流出口手段、但し該流入口手段は実質的に該室の広がり
全体にわたって配置されている少なくとも１個の比較的
低多孔度管と流体連絡しておシ、そして該流出口手段は
実質的に該室の広がシ全体にわたって配置されている少
なくとも１個の比較的高多孔度管と流体連絡している；
該ハウジングの壁に設けられた外部気体流入口および流
出口手段、但し該手段は実質的に該室の広がシ全体にわ
たって配置されている選択透過膜と気体連絡している；
からなり、該比較的低多孔度管および高多孔度管は外部
培地流入口および流出口手段に遠い末端部で閉鎖されて
（・ることを特徴とする。

発明の詳細 な説明測置は本発明を形成するものと考えられる要件を
特に指摘して明瞭に記載した特許請求の範囲をもって締
めくくっているが、図面を参考にした下記の好ましい態
様の記載から本発明はよりよく理解されるであろう。

まず、第１図および第２図に示されて℃・る態様を特に
参照しながら説明する。符号１０は捕乳動物およびその
他の動物の細胞の静的維持に使用できる細胞培養反応器
を総括的に示している。反応器の外殻は好ましくは透明
ガラスまたは無毒硬質シラスチック材料からつくられる
が、生物適合性のある金属例えはステンレス鋼からつく
ることも可能である。この反応器は側壁１１と両端１２
および１３の開口軒を有する概して円筒の外殻を有する
ことが示されている。円筒側壁はワイヤ（図示されてな
し・）または反応器支持もしくは閉鎖保持を目的とする
その他手段を収容するためにフレア端部１４および１５
を有していてもよい。この円筒容器の端部は弾性栓１６
および１７で閉鎖されていることが示されている。栓１
６は液体培地および気体の流入口および流出口として作
用する硬質の供給管および排出管を一端で反ｆ器内へ配
設せしめるために４個の穴を有している。矢印は反応器
稼動時のこれ等流入口および流出口からの好ましいフロ
一方向を表わす。反応器の他端１３は永久的に閉じられ
ていてもよいが第１図では装置の停止時間中に反応室１
８へ適宜到達できるように栓付き開口になっている。端
１３が永久的に閉じられている場合には、最初に反応室
へマトリックスおよび細胞を充填するための代用開口（
端１２以外のところの）を設けることが好ましい。

反応器の稼働中には、端１３は当然閉鎖される。

反応器１０はその内部室１８内に、細胞の保持および液
体栄養素培地の通過のための隙間を有する半硬質マトリ
ックスが収容されるような構造になっている。栄養素培
地を細胞に供給するために基部に近い方の端部で開口し
そして外部流入口２１と液体連絡している第一多孔管１
９は、実質的にマトリックス帯域の全長にわたって該帯
域の中心に配置されている。多孔管１９は遠い方の端部
２０で閉鎖されているがこの閉鎖は管１９の側壁と同じ
多孔度を有していてもよい。管１９の孔径は栄養素培地
が多孔壁からマトリックス中へ潅流し得るようなもので
なければならない、多孔性ａｆｆｔ、多孔性セルロース
、ポルテトラフルオロエチレン、またはポリスルホン中
空毛細膜管、−ｉ：たは約０．２μ〜約５μの比較的小
さな孔径を有するようなその他多孔管は、培地分布の均
一性を向上せしめるために管壁を介しての圧力降下を達
成できるので好ましい。約０．０１μ程の小さな孔径も
使用できるが、かかる孔径より大きな粒状物が供給栄養
素培地中に存在する場合に詰まり易いので好ましくない
。

多孔管１９を包囲する同心の第二多孔管２２は実質的に
マトリックス帯域の全長にわたって配置されている。管
２２は遠い方の端部で閉じていてもよいが、先に述べた
ように装置の停止時間中に反応器端部１３かもマトリッ
クス帯域に適宜到達できるように開いている方が好まし
い。管２２の外径は反応器外殻の内径よりもやや小さい
ので使用済の培地と細胞産生物を外部流出口２４へ送る
ための環状溝２１が形成される。管２２の孔径は管１９
の孔径よシ大きくすべきであり、そして好ましくは反応
器からの使用済培地と生物分子細胞産生物の除去を促進
するために大きな表面積を有する。多孔磁製管または約
１０μ〜約１５０μの比較的大きな孔径を有するような
その他多孔管が好ましい。このよシ大きな孔径および表
面積はこの排出管による圧力降下を小さくする。マトリ
ックスの半硬質構造および栄養素培地の比較的低流量維
持は高多孔度管２２を通しての細胞の移行を防止する傾
向がある。

第−および第二多孔管の相対位置を逆にして第二多孔管
２２が低多孔度管であυそして第一多孔管１９が高多孔
度管であるようにしてもよいと云うことは明らかであろ
う。かかる配置の場合、口２４は液体培地流入口となり
、そして口２１は液体培地流出口となる。

維持反応器１０は一般に水平位置で操作し、そして流出
液出口２４が反応器の上面近くに位置することが好まし
い。第１図では、反応器の長さが直径に比゛して長く延
びているので本発明の明瞭な図解のため、図面シートが
縦に綴じられている場合には、反応器は一般に垂直方向
に示されて（・る、酸素添加された気体媒質を細胞に供
給するため、選択透過性チューブ状膜２５が実質的にマ
）　１７ツクス帯域の全長にわたって配置されている。

膜２５は気体透過性であり、そして実質的に液体不透過
性でなければならない：このような性質はシリコーンゴ
ムチューブ、例えはダウ−コーニング５ｉｌａｓｔｉｃ
■医療級チューブによって達成できる。

内径約１ｍｍおよび外径的２　ｍｍのシリコーンゴムチ
ューブが好ましく使用される。第１図および第２図に示
されている態様においては、一本の長いチューブ状膜２
５が多孔管１９にまきつけられている。チューブ状膜２
５はその両端で硬質管２６および２７に結合しているこ
とが示されておシ、該硬質管はそれぞれに栓１６を貫通
する気体流入口および流出口を構成する。

反応器内で多孔管１９および２２、および管状膜２５を
望複しい間隔で支持するために、反応器縁部１２の近く
で栓１６の内側にシリコーンゴム隔壁２８が配置されて
いる。隔壁２８は栓１６の４個の穴に一致する４個の穴
を設けられている。

隔壁の外周に設けられたノツチ２９は環状溝２３からの
流出液が外部流出口２４を介して回収されることを促進
する。隔壁の周辺のフランジ部分は環状溝の中心側端部
３０と多孔管２２を受けるようにつくられている。さら
に、隔壁は外部流出液と内部マトリックス帯域の間に液
体シール関係を生ぜしめる。

さらに、多孔管１９の支持は、栓１６の外部流入口２１
から挿入されて管１９内に長さ方向に配置すれたステン
レス鋼管３１によっても行われる。

反応器内部へ延びる管３１の長さは、流入栄養素培地が
管３１の遠方端部のまわりに流れて同心多孔管１９の内
周全体に達し得るように、管１９よリモ短くすべきであ
る。管１９のスペーシングは管３１に管１９を近端部３
２でシールすることによって維持できる。管２２の遠方
端部と弾性栓１７の間に弾性０−リングシール３３を配
置することによって、内部室１８．環状溝２３および栓
１７の間に液体シール関係が付与される。このような液
体シール関係をさらに促進するためにフレア端部１５お
よび栓１７のまわｐＫワイヤ（図示されてない）または
その他のかかる保持手段を装備してもよい。

半硬質マトリックスは動物細胞を反応器内部の比較的静
的または固定位置に維持するために反応室内へ充填する
ことが可能であシ且つマトリックス中での液体栄養素培
地の通過を許す間隙を生ずるような微細な無毒性固体材
料であればよい。ガラスまたはシリカビーズ、重合体ｒ
ルろ過ビーズ例工ば５ｅｐｈａａｅｘ■架橋デキストラ
ンおよびＢｉｏ　−Ｇｅｌ■ポリアクリルアミドビーズ
、および細胞培養ミクロキャリヤビーズ例えばＤＥＡＥ
　−５ｅｐｈａｄｅｘ。

Ｃｙｔｏｄｅ連負荷デキストラン、およびＢｉｏ　−Ｃ
ａｒｒ−ｉｅｒ■アクリルアミｒビーズは市販の適する
マトリックス材料の例である。先に、本発明の背景の項
で引用した米国特許は本発明での使用に適する周知のそ
の他のミクロキャリヤを記載している。

好ましいミクロキャリヤは直径約６０μ〜約４００μの
直径を有する概して球形の重合体粒子である。

第１図および第２図に示されている態様によって表わさ
れる本発明の方法においては、栄養素培地は外部流入口
２１かも多孔管１９内腔中へ供給される。栄養素培地は
所望の新鮮培地貯蔵槽（図示されていない）から適宜汲
み上げることができる。新鮮な培地は比較的低多孔管１
９の多孔壁を通して、ミクロキャリヤまたはその他の微
細なマトリックス形成材料の間に点在した所望の動物細
胞を含有する半硬質マトリックス中へ潅流する。

このような手段によって、全ての栄養素培地は多孔管２
２および流出口２４を通って反応室の外へ出る前に細胞
と接触する。これは従来のフロー・スルー中空繊維膜装
置と区別される：従来装置においては、栄養素培地の一
部分だけが膜壁を通して拡散して細胞に達するが、残り
は連続中空繊維内腔を通って装置の他端の流出口へ流れ
てしまう。

細胞とミクロキャリヤは最初に栓１７をとって端部１３
かも反応器の内部室１８中へ装填することができる。本
発明の細胞培養維持反応器内へ導入する前に、別の細胞
増殖システムにおける懸濁培養またはミクロキャリヤ接
着懸濁培養のような従来手段によって細胞を増殖する。

個々の細胞またはミクロキャリヤに接着した細胞を濃縮
し、マトリックス材料と混合し、それから本発明の静的
維持反応器内へ導入する。

細胞の酸素添加または空気添加は選択透過性膜２５全通
しで酸素、空気またはその他の酸素添加気体媒質を循環
させることによって達成される。

て潅流し、環状溝２３中を移送し、そして外部流出口２
４から回収することによって使用済培地と細胞生物分子
産生物は反応器の外に出る。使用済培地は適宜に流出液
溜め（図示されて℃・ない）Ｋ回収され、細胞産生物は
吸着、抽出、イオン交換クロマトグラフィー、免疫親和
性クロマトグラフィー、デルろ過および電気泳動のよう
な従来手段によって使用済培地から単離・精製される。

第６図〜第５図は別の態様の静的細胞培養維持反応器を
示す。第１図およ２び第２図の態様とは区別されるよう
に、この第６図〜第５図の反応器は複数の第一多孔管と
複数の第二多孔管を有する。

従って、この態様は概して先の態様よシも大規模操作に
適する。

第６図〜第５図における符号３５は、側壁３６゜端壁３
７および着脱可能な円盤状端板３８を具備した概して円
筒の外殻を有する静的細胞培養維持反応器を総括的に示
す。この反応器３５はその内部室３９の内に、細胞の保
持および流体栄養素培地の通過のための隙間を有する半
硬質マド１）ツクスを収容する。細胞に新鮮な栄養素培
地を供給するため、１２本の比較的低多孔度管４（ｌ設
ゆられている。使用済培地と細胞産生物を除去するため
、９本の比較的高多孔度管４１が設けられて〜・る。こ
れ等管は遠い（端板３ＢＫ遠（・）方の端部が閉じてい
る。これ等は実質的に互（・に平行関係をもってマトリ
ックス帯域中に配置されてオ６シ、好ましくは使用済培
地用管は各新鮮培地用管力・ら横に約２Ｇ以内の間隔の
処に配置されて（・る。マトリックス容積の大部分が新
鮮培地用管から横に約２０７１Ｌの距離内にあるように
十分多数の新鮮培地用管を設けることが好ましい。径約
１００〜１０００μの中空繊維膜のような中空毛細膜を
多孔管として使用する場合には新鮮培地用管と使用済培
地用管の横間隔がもつと小さし・（２儒未満）方が好ま
い＋。多孔管は実質的にマトリックスの長さくまたは、
室長さより太き（・室直径を有する反応器の場合には巾
）全体に広がって配置されていなげればならない。

細胞の酸素添加または空気添加を行うため、長い選択イ
過膜チューブ４２が多孔性の新鮮培地管と使用済培地管
のまわりに入りくんでまきつけられている。この管の流
入口と流出口＆−ｉそれぞれ４３と４４で図示されて℃
・る。平明にするため、図には数回のまきつけが示され
て（・るにすぎな（・。

実際には、反応器の長さ１フイート当シ２００直線フイ
ートのシリコーンゴムチューブを使用している。酸素ま
たは空気は約り〜約２　Ｑ　１ｂ　／　１ｎｒ−ジ（０
〜約１．５　Ｋ　／　ｃｍ”）の圧力下でシ１）：ｌ−
ンゴムチューブ内を流れ、そしてチューブの壁を通して
周囲のマトリックス帯域中へ拡散する。好ましくは、マ
トリックス帯域中にｋｉ酸素供給管力）らの間隔が約２
ｃｍより太き（・地点レマ存在せず、より好ましくは約
１ｃｍ未満である。

反応容器３５の内部への細胞およびマド１ノツクス材料
の導入は容器の底部近くに位置したマド１ノックス人口
４５かも行うことができる。容器の頂上部近くにマトリ
ックスオーｌぐ−フローロ４６７％設けられている。ま
た、この口をま、最初に入口４５から導入した材料の沈
降後に追加のマトリックス材料を導入するために使用す
ることも可能である。

反応容器の着脱可能な端板３８は、反応容器をそのつば
端部４８でとシ囲むスプリットリングブラケット、およ
び周辺から等距離のところに位置するブラケットの穴５
ｏと端板周辺の穴５１を貫通する−揃い締結具（例えば
、図示されているようなナツトとボルト集合物）によっ
て適宜反応容器へ取シ看けられる。例示の態様における
金属ブラケットのシール圧によってガラス反応器壁が破
壊されないようにブラケットと反応容器の間に環状繊維
クッション５２を配置することが図示されている。反応
器のっぽ端部４８のリップと端板３８のくぼみの間に配
置された弾性。−リングシール５３は締結具を閉めた時
に端板と反応器内部の間に液体シール関係を付与する。

気泡を除去するために側壁３１１Ｃ任意の口５４を設け
てもよい。

第５図は一対の多孔管４ｏおよび４１の細部を拡大して
示したものである。矢印は反応器稼働時のこれ等管およ
びマ）　ＩＪソックス域を通る栄養素培地の液体フロー
の好ましい方向を示す。この拡大図において、多孔管４
ｏおよび４１はそれぞれ硬質管５５および５６によって
支持されていることが示されている。硬質管はステンレ
ス鋼またはその他の硬質材料からつくることができる。

これ等硬質管は端板３８の開口から挿入されて多孔管中
に長さ方向に配置される。硬質管の遠方端部のまわシに
新鮮培地および使用済培地がフローできるようにするた
め、反応器内部へ延びた管５５および５６の長さは管４
ｏおよび４１よシも短い。

高多孔度管４１と硬質管５６の整合はシリコーンゴムス
ペーサー５７によって容易になる。このスペーサーは培
地の通過を可能にするため切込みが入っている。多孔管
を硬質管５５および５６にシールするためにシリコーン
ゴムシール５８および５９が使用されている。また、管
４ｏおよび４１の末端にそれぞれシリコーンゴムシール
６ｏおよび６１を配備してそれ等管を閉鎖している。代
９に、これ等封鎖は管４０および４１と同じ多孔度を有
していてもよい。硬質管５５および５６を封鎖するため
、および反応器を便利な組立体にするため、それぞれＳ
ｗａｇｅｌｏｋ■ユニオン６２および６３が端板３８に
接合されていることが図示されている。

第３図〜第５図の反応容器の操作を説明するため、まず
細胞を別の容器または細胞培養システム例えば米国特許
第４．２８９．８５４号および第４，３３５．２１５号
に示されている細胞培養容器およびシステムで増殖させ
る。細胞はミクロキャリヤに付着させてもよい（例えば
、ＦＳ−４またはＡＧ　１５２６細胞のようなヒト二倍
体線維芽細胞）、またはミクロキャリヤを使用しなくと
もよい（例えば、ＳＫ　−ＨＥＰ　−１ヒト肝臓細胞ま
たはバイブＩＪ　ｓ−マ細胞）。それから、これ等細胞
を高濃度（例えば、パンク細胞１０〜２　Ｄ　Ｄ　ｍｌ
ｌ　／Ａりでマトリックス材料（例えば５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　（）　−１０。

Ｇ−２５またはＧ−５０ビーズ）と混合する。それから
、細胞−マトリックスのスラリを人口４５から反応容器
３５中へ汲み入れて反応器の内部室３９を完全に充填す
る。過剰の流体を低多孔度潅流管４０から注ぎ、そして
捨ててもよい。反応器内部を満たすに十分な細胞−マト
リックスのスラリーが得られなかった場合には、追加の
マ）　ＩＪラックスラリを上部入口４６から反応容器内
へ注入してもよい。マトリックスの充填および沈降後に
、再び追加マトリックスを入口４６から注入して反応器
を完全に充填する。

維持反応器の正常稼働を開示する前に、好ましくは入口
４５を細胞−マトリックス供給源から断絶しそして高多
孔度管４１かも低多孔度管４０への新鮮培地の逆流を起
して高多孔度管のすぐ近くから非付着細胞を除去する。

維持反応容器の稼動中に、新鮮培地貯蔵槽（図示されて
いない）から直接またはマニホルＶを介して新鮮培地を
低多孔度管４０中へ汲み入れる。この新鮮培地フローに
よって生ずる低多孔度管曲後の圧力降下は反応器全体の
潅流の均一性を推進する。流出産生物は細胞−マトリッ
クスから高多孔度管４１中へそして産生物／流出液貯蔵
槽（図示されていない）へと流れる。反応器稼働中の培
地の汲入れは反応器内に維持されている具体的細胞の生
存に必要な栄養素を供給するに十分な且つ細胞産生物を
除去するに十分な流量で連続的に又は間欠的に行われる
。

細胞は使用済培地から連続して産生物を収穫することに
よって長時間このシステム中に維持できる。長さ１５．
２４ｃｘ、直径１５．２４に７７１の円筒反応容器にお
いては、従来の懸濁培養の細胞１００〜４００ノを維持
できる。長さ８１．２８ｃＩｒＬ、直径１５．２４ＣＴ
Ｌの円筒反応容器にお（・ては、従来の懸濁培養の細胞
５００〜２０００１を維持できる。

反応容器の水平配列は潅流パラメーターを変動させずに
長さを長くすることを可能にするが、他のシステム配置
も利用できる。例えばシリンダーは非常に大きな直径と
比較的短い長さくまたは巾）であってもよいが垂直に立
てて使用する。培地潅流の不均一性を防止するように潅
流管の静水圧効果を最小にすることが好ましい。

本発明の装置はさらに補助的特徴例えば、ＰＨおよび溶
解酸素検出電極、サンプリング口、直列エアフィルター
等の細胞培養システム的特徴を備えていてもよい。

次に詳細な実施例によって上記静的細胞培養維持システ
ムの使用をさらに説明するが、本発明が特定の実施例に
制限されるものではないことは理解できるであろう。

実施例１ 第１図および第２図に示されているようなミクロ−静的
維持反応器（Ｍ　−ＳＭＲ）を組み立てた。

この反応器はおおよそ長さ１６５．１　ｍｍで外径２５
．４　ｍｍのＰｙｒｅｘ＠円筒外殻からなシ、その内に
単一の高多孔度管と低多孔度管を有していた。高多孔度
管はおおよそ長さ１２７　ｍｍで外径１７．５ｍｍ、肉
厚３．１８　ｍｍであった。この管は公称孔径２０μを
有していた（カイナー多孔プラスチック管；入手先：ポ
ルテックス・チクノロシーズ社ガラスロック部門メジカ
ルサービス、７エアパーン、ＧＡ　３０２１３　）。こ
の高多孔度管の内に、外径０．５５５Ｃ７ｒＬで肉厚０
．０７９４ｃｍの低多孔度管を収容させた。この微孔質
の磁器製管は公称０．８μの孔を有しており、セラス社
フロトロニクス部門（）ｌ、ンチンゲバレー、ＰＡ１９
０．０６）からカタログ番号１０５７７９−０４をもっ
て購入した。この内側の多孔管に医療縁のシリコーンゴ
ムチューブ（内径１ｍｍ、外径２　ｍｍ　）約６０．９
６ｃｍを巻きつげた。このイムチューブはバッター拳プ
ロダクツ社（ビーバートン、ＭＴ　４８６１２　）から
カタログ番号５１８−１４５をもって購入した。内側多
孔管と外側多孔管の間のこの反応器の稼働容積は約１０
　ｍＡであった。

この実験に使用した細胞はモンサント社のＲＫｉｍｅｓ
とＪ、　０１ａｎｄｓｒによって開発された１−１５２
Ｆ９で表わされるアンコラ−ジ−インディペンデント　
ハイプリドーマ細胞系であった。このマウス−マウス　
ハイプリＶ−マはヒト肝癌細胞系（ＳＫ　−ＨＥＰ　−
１）に関係した抗原に対してＩｇ（）単クローン抗体を
産生ずる。例示のＳＫ　−ＨｇＰ　−１細胞系に関する
背景情報は米国特許第４．２０９．５８７が参考になる
。このハイプリｐ−マ培養株を従来のスピナー５００　
＋ｎＡ？中で細胞数１０６／　ｍｌに増殖し、そして２
０　Ｏｒｐｍの低速遠心分離によってマトリックス材料
中に回収した。このマトリックス材料は５ｅｐｈａｄｅ
ｘ■Ｃ）−５０クロマトグラフイービーズからなり、燐
酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ　）中でオートクレーブ滅菌し
、そしてこの実施例で潅流用に使用する栄養素培地によ
って洗浄したものであった。６％ウシ胎児血清を付加し
たＤｕｌｂｅｃｃｏ改良ＭＥＭ培地４．５ｇ／ＩＩｃゲ
ルコール）を抗生物質無しで使用した。上澄を吸引した
後の遠心ボトルの円錐部には細胞とクロマトグラフィー
ビーズのペレットが残った。それから、細胞とビーズの
稠密スラリをピペットでＭ　−ＳＭＲ装置へ移し、ビー
ズを含有しない流出液を除去した。この細胞含有流出液
はビーズスラリをさらに洗浄するために使用したもので
ある。高多孔度管の孔径はノ・イプリＶ−マ細胞の平均
サイズよシも大きいので、これ等細胞の一部が接種手続
中に高多孔度管の壁から流出液中に移行した。しかしな
がら、反応器を密封して栄養素培地の潅流を開始してか
らは、ノ・イブリドーマ細胞は比較的殆んど失われなか
った。

細胞接種物の正確な値の測定は遠心分離中の及び高多孔
度管からのロス故に不可能であるが、反応器の稼働容積
１０ｍＡ！中には２　Ｘ　１０”’〜５　ｘ　１　［］
’細胞数が保有されているものと推定される。これ等細
胞の生活力は色素排除テストによって約８０％であると
推定された。培地を約２　ｍ１ｌｓ　／　ｈｒの速度で
反応器中を潅流させ、そして気体混合物を１〜２　ｍｌ
ｓ　／　ｍｉｎの速度でシリコーンゴム中に流した。こ
の気体混合物は二酸化炭素、酸素および空気からなり、
その流入気体の平均濃度は二酸化炭素６７±ｉ　２ｍｍ
Ｈｇおよび酸素６１０±４６ｍｍＨｇであった。これ等
濃度はＩＬ血液−ガス分析機（インスツルメンテーショ
ン・ラボラトリーズ製）で測定した。この反応器を２週
間運転する間に、１〜６日毎にＰＨおよび溶解された気
体濃度を測定し、さらに抗体レベルを測定した。運転中
の平均ＰＨ値は７．１３±０．１１であシ、溶解ＣＯ２
は５８．７±１４　ｍｍＨｇであシ、そして酸素レベル
は１１６±１３　ｍｍＨｇであった。これ等結果は培養
パラメーターが全生長期間を通して望丘しい操作範囲に
維持されたことは示している（望ましい…は約６．９〜
Ｚ６；望ましい酸素は約２０　ｍｍＨｇ〜１６０　ｍｍ
Ｈｇ　；そして、望ましＬ−’Ｃｏ２は約６５ｍｍＨｇ
　〜Ｉ　Ｄ　ＯｍｍＨｇ　）。

さらに、反応器から取シ出されたサンプルを２種のＥＬ
ＩＳＡ検定法（酵素結合免疫吸着剤検定法）によって単
クローン抗体の存在についてテストした。第一の検定法
はマウス免疫グロブリンの存在を検出するものであり、
次のように行う：非標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンを
ミクロタイタープレートに一晩４℃で結合させた。この
プレートラ洗浄してからウシ血清アルブミンの１％溶液
中に遮断して非特異結合を減少させた。さらに洗浄して
から、サンプルを添加して２時間室温で保温した。洗浄
後、標識ヤギ抗マウス免疫グロデリン（アルカリ性ホス
ファターゼで標識）を添加してさらに２時間保温した。

後者の材料を洗い落としてから、ｐ−ニトロフェニルホ
スフェートを基質として添加しそして６０分間室温で保
温した。着色反応物の光学濃度をミクロタイター光学リ
ーダーで４１０　ｎｍで読み取る。第二の検定法はこの
ノ・イデリｒ−マの調製のためにマウスが免疫性を与え
られたヒト肝癌抗原の特異な認識を含む。この場合、肝
癌抗原をミクロタイタープレートに一晩４℃で結合させ
てから後の工程は全て上記と同じに行う。どちらの検定
法によっても、反応器からの流出培地中にはかなシの量
の単クローン性抗体が検出された。この量はノ・イブリ
ドーマ細胞の従来ノ培養からコンディショニングされた
培地中に見い出される量と同等またはそれ以上であるこ
とを示していた。これ等結果は、Ｍ　−ＳＭＲシステム
における高濃度に維持された細胞による特殊な単クロー
ン抗体の長期持続産生を表わしている。運転の最後に、
約２　Ｘ　１０”の活性細胞が回収された。

実施例２ 第６図から第５図に示されているような約２１の稼働容
積を有する大規模静的持続反応器（Ｓ＋ＶＲ）を用いて
アンコラ−ジ−ディペンデント細胞系を約２ケ月間維持
した。この反応器外殻は長さ１５．２４ｃｒＩＬ、直径
１５．２４ｃＩｒＬの円筒Ｐｙｔｅｘガラスパイプエン
Ｖキャツ７°（コーニングナ７２−６４００）から構成
された。高多孔度管と低多孔度管は実施例１で用いたも
のと同じ材料および直径を有しておシ、その低多孔度管
１２本と高多孔度管９本のアレイから構成された。これ
等多孔管に実施例１で用いたものと同じようなシリコー
ンゴムチューブ３３．５２８ｍ〜５６．５７６　ｍをラ
ンダムに巻きつげた。操作中に約１０　ｍ／ｓのガス／
分の流量を確保するためにこのシリコーンゴムチューブ
を介する約０．１５　ｋＦｉ　／　ｃｒｒＬ２の圧力降
下を用いた。

この実施例に使用したＡＧ　１５２３ヒト包皮線維芽細
胞系はインスチチュート・フォー・メジカル・リサーチ
（カムデン、ＮＪ州）からパッセージ６で得た。これ等
細胞を米国特許第４，２７３，８７１号に記載されてい
る手順に従ってＴフラスコおよびローラーびん内で成長
させた。もつと多くの数の細胞が米国特許第４．３３５
，２１５号記載の４１ミクロキャリヤ反応システム中で
産生された。細胞濃度がＺＯ±０．６Ｘ１０６細胞数／
　ｍｌになった後で、ミクロキャリヤ（ポリアクリルア
ミ）ＦＢｉｏ−Ｃａｒｒｉｅｒｓ■；入手先：２′オラ
−・ラボラトリーズ、リツチモンｒ、ｃＡ州）に接着し
たままの細胞を追加のＢｉｏ　−Ｃａｒｒｉｅｒｓと混
合して全体の沈降体積を約ｉ　ｓ　ｏ　ｏ　ｍｌにした
。この濃厚スラリをポンプで静的維持反応器の底部へ汲
み入れながら、反応器の上部から空気を抜いた。反応器
を完全に満たすために５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０ク
ロマトグラフイービーズかもなる追加のマトリックス材
料を使用した。充填操作中に、過剰の液体を低多孔度管
から培地供給マニホルｒ中へ流し、そして廃棄容器へ排
出させた。約２．８　ｘ　１０１Ｏ（ＩＭの細胞を含有
するマトリックス材料で反応室内全体を固形′充填した
後、上部に圧力オーパーンロー容器を取シ付げ、そして
５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５Ｑ−ｒトリックススラリで
一部充填した。この容器を０．４　ｋｇ／　ｃｒｆＬ２
の逆止め弁で密閉して反応器の過圧化を防止した。それ
から、培地フローを反応器内中で高多孔度管から低多孔
度管へと、そしてＩＮ（）ＯＬＤ　ｐＨ電極含有外部マ
ニホールｒから外の流出液収容器内へと確立した。最初
に、約４１の新鮮培地を２時間かけて汲み上げてマトリ
ックスと細胞の全体に新鮮培地を含浸させた。６％ウシ
胎児血清を付加したゲルコース１１当Ｄ　４．５９のＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ改質ＭＥＭ培地を抗生物質無しで使用し
た。６２日間の運転期間中、液体培地の流量上５〜６ｍ
１ｓ　／　ｍｉｎを用いた。

２日毎のサンプリングで測定した平均液体流量は２．１
８±０．３８　ｍＡ？ｓ　／　ｍｉｎであった。気体中
の酸素および二酸化炭素の濃度を反応器への流入前と、
３５．５２８〜３６．５７６ｍのシリコーンゴム管通過
後に測定した。ＳＭＲ運転期間中、反応器を介した圧力
降下を約０．１５　ｋｇ／　ｃｙｒｔ２にしながら気体
流量を約１０　ｍｌ／　ｍｉｎに維持した。気体サンプ
ルをＩＬ血液−ガス分析機で読み取ったところ、運転期
間中連続して酸素の消耗とＣＯ２増加を示した。

気体流量１０　ｍｌｌ　／　ｍｉｎおよび培地流量約２
”’／ｍｉｎから測定した反応系の酸素消費は平均して
酸素２．１±０．８　Ｘ　１０−５モル／分であった。

二酸化炭素に対する同様の計算は、反応系を介してＰＨ
の変動を伴う重炭酸塩緩衝液からのｃｏ２発生故に、不
可能であった。しかしながら、ＣＯ２濃度は流入気体に
おける約４５　ｍｍＨｇから反応器通過後の６０〜７０
　ｍｍＨｇまでの範囲にあった。流入気体のレベルはお
およそ４０〜４５　ｍｍＨｇの二酸化炭素および２５０
〜３００　ｍｍＨｇの酸素であった。最初の血清含有培
地１８７を反応器中に約６．５日間かけて潅流させてか
ら、０．５〜／ｍｌウシ血清アルブミン、Ｏ１５μｊ！
　／　ｍｌＪインシュリンおよび０．５μ＆　／　ｍｌ
ヒトのトランスフェリン、および５ｎｌ／　ｍ１ＩＪル
イン酸を付加した無血清培地を使用した。この無血清培
地を２４日間潅流し；最後の６２日間には、６％ウシ胎
児血清付加培地を使用した。２ケ月間を通して、酸素消
耗および００２発生、並びにＰＨレベルは実質的に一定
に保たれた。

２ケ月の運転中に、サンプルを取シ出してアンジオジエ
ネシス因子およびプラスミノ−ｒン活性化因子を検定し
た。アンジオゾエネシス因子の検定はＪ、　Ｖ、　０１
ａｎｄｅｒ　、　Ｊ、　Ｃ，Ｍａｒａｓａ　、　Ｒ，Ｃ
，Ｋｉｍｅｓ。

Ｇ、　Ｍ、　ＪｏｈｎｓｔｏｎおよびＪ、　Ｆｅｄｅｒ
の論文［−培養されたヒト腫瘍細胞由来の発育因子によ
るウシ内皮細胞の数タイプの刺激を測定する検定法（Ａ
ｎ　ＡｓｓａｙＭｅａｓｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｓｔｉｍ
ｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｅｖｅｒａｌ　Ｔｙｐｅｓｏ
ｆ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌ
ｓ　ｂｙ　Ｇｒｏｗｔｈ　ＦａｃｔｏｒｓＤｅｒｉｖｅ
ｄ　ｆｒｏｍ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍ
ｏｒ　Ｃｅ１ｌｓ　）　Ｊ、ＩｎＶｉｔｒｏ　１８　、
９９〜１０７　（１９８２）に記載されているように内
皮細胞成長の刺激によって行った。運転中ずつと、かな
りのレベルの内皮細胞成長刺激活性度が観察され、血清
付加培地の再導入後に最高値を生じた。維持期間中に対
照培地（細胞にさらされなかった新鮮な増殖培地）に比
較して内皮細胞数が２倍〜５倍に増加した。

プラスミノ−ｒン活性化因子（ＰＡ　）の活性度はＡｒ
５ｔｒｕｐ　（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、　４０　＋６６４〜３５１（１９５２）］の
フフィブリンプレート法、およびその変形方法（例えば
米国特許第３．７７８．３５２号に記載されている）に
よって測定できる。この一般的方法において、サンプル
中のプラスミノーデン活性化因子はケゞル中の既知量の
クロケラト化フイプリノーデンのフイプリン溶解によっ
て生ずるデルプレートまたは皿の透明な放射拡散域の直
径を測定することによって求められる。このような透明
化域検定法を用いて上記実験のサンプル中のデラスミノ
ーケゞン活性化因子を次のように検出した：シープラー
クアがロースをフイプリノーケゞン、トロンビンおよび
プラスミノーゲンと混合し、それから大きなペトリ皿に
注いで一晩ケル化させた。トロンビンとフイブリノーゲ
ンの間の反応によってアがロースケゞル中にフィブリン
マトリックスが生じた。このゲルに、静的維持反応器運
転によってコンディショニングされた培地のサンプル５
μｌで、並びに種々の既知濃度のウロキナーゼ標準溶液
で、斑点をつけた。

このデルを一晩６７°Ｃで保温した。サンプ０ル中のプ
ラスミノーゲン活性化因子が存在すると、それはデル中
に含有されたプラスミノーゲンからのプラスミンの産生
を触媒する。そしてプラスミンはフィブリンマトリック
スを溶解してサンプル斑点のまわシに円形の透明域を形
成する。保温後、デルを７０％エタノール、１０％酢酸
、２０％水の溶液中で０．１％アミノプラックによって
室温で２時間染色し、それから同一溶剤中で１日間脱色
した。サンプル斑点のまわシの透明円形ゾーンの直径と
既知濃度のウロキナーゼのまわシの同様のゾーンを比較
した。２４日間の血清無し潅流の間はプラスミノーゲン
活性化因子のかなシのレベルの活性度が観察されたが、
ウシ胎児血清が存在する期間に検出されたレベルは概し
て低かった。ウシ胎児血清はＰＡ活性度に対する抑制剤
を含有しているので、その分だけ低い応答を示す原因と
なる。

プラスミノ−ｒン活性化因子の活性度はさらに、Ｆｅｄ
ｅｒ等によってＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ
ｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

８３（３）、１１６４〜１１７０（１９７８）に記載さ
れているような改良フィブリン皿検定法において１２５
■−フィブリンの放出を測定することによって確認した
。

成長のウシ胎児血清含有部分と反応器運転の無血清部分
の両方からコンディショニングされた培地をＡｍ　ｉ　
ｃ　ｏ　ｎ中空繊維システムで濃縮して分子量１０．０
００以上の材料を保留せしめた。これ等濃縮物はさらに
種々のその他の活性度を検定できる。

こうして、これ等濃縮物はＤｖｏｒａｋ等によってψＪ
、Ｉｍｍｕｎａ１．１２２（１）　、　１６６〜１７３
　（１９７９）に記載された方法に従って血管透過性因
子に対して正の活性度を有することが判明した。

本発明の方法および装置によって全てのタイプの動物細
胞、例えば、哺乳動物、両生類およびニワトリの細胞を
維持できると云うことが解るはずである。上記実施例で
示した細胞の他に、その他の細胞が使用できる：例えば
、ノ・イブリーーマ、正常および腫瘍細胞の一次培養株
、形質転換および非形質転換動物細胞系、例えばヒト肺
線維芽（ＷＩ　−、”）　８　）細胞、池すル腎（’　
ＭＫ　−２’）細胞、頚部癌（ＨｅＬａ　）細胞、ノ・
ムスター乳児腎（ＢＨＫ−２１）細胞、シミアンウィル
ス４０形質転換６Ｔ６マウス胚線維芽（ＳＶ　３　Ｔ　
３　）細胞、ニワトリ胚線維芽細胞等である。また、本
発明の装置および方法は従来の細胞栄養素培地例えばＥ
ａｇｌｅ基礎培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良ＭＥＭ　（最
小必須培地）、培地１９９、ＲＰＭＩ　１６４０培地等
と一緒に使用できる。

本願の開示を読んだ後では、当業者であれば本発明の思
想および範囲から逸脱せずに本発明の別の態様および実
施例が明らかになるであろう。そしてそのような別の態
様および実施例が本発明の請求の範囲に包含されると云
うことは理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の静的細胞培養反応器の一態様の正面図
を部分断面図として表わしたものである。 第２図は第１図の２−２線に沿って切断した断面図であ
る。 第６図は本発明の静的細胞培養反応器の別の態様の正面
図を部分断面図として表わしたものである。 第４図は第６図に示されている態様の側面図である。 第５図は第３図の培養反応器の一部分である一対の流入
および排Ｗ、多孔管の細部を示す拡大正面図を部分断面
図として表わしたものである。 反応器・・・１０，３５、反応室・・・１８，３９、第
−低多孔度管・・・１９．４０、第二高多孔度管・・・
２２．４１、支持管・・・３１，５５，５６、選択透過
膜チューブ・・・２５．４２ 代理人　浅　村　　皓 鷲予別 ４９ 席＋旧 １ 手続補正書（睦） 昭和５９年　１　月θθ日 特許庁長官殿。 ■、小事件表示 昭和５８　年持ごｒにヅ１第２３１２２０　　弓２、発
明の名称 静的細胞培養維持方法および装置 ３、補正をする者 事１牛との関係　！ｌ！Ｒ′［出願人 ４、代理人 ５、補ｉ［Ｅ命令の日付 昭和　　年　　月　　日 ８、補正の内容　　別紙のとおり 明細書の浄書（内容に変更なしン −柘

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　（ａ）細胞培養反応器の室内に配置されそして
   流体栄養素培地の通過のための隙間を有する半硬質マト
   リックスの中に動物細胞を懸濁し、 （ｂ）該細胞のために新鮮な栄養素培地を反応器の外部
   流入口から、実質的に該マトリックスの広がり全体にわ
   たって該室内に配置されている少なくとも１個の第一多
   孔管の内腔中へ送シそして核多孔管の壁を通して該栄養
   素培地を該マ）　ＩＪソクス中へ潅流することによって
   供給シ、 （Ｃ）該マトリックスから使用済栄養素培地と細胞産生
   物を、実質的に該マトリックスの広がシ全体にわたって
   該室内に配置されている少なくとも１個の第二多孔管の
   壁を通して潅流しそして該使用済栄養素培地と細胞産生
   物を該反応器の外部流出口を通して送シ出すことによっ
   て回収し、但し、該第二多孔管は該第−多孔管の孔径よ
   シ大きい孔径を有している、 および （ｄ）該細胞のために酸素添加気体媒質を、実質的に該
   マトリックスの広がｐ全体にわたって該室内に配置され
   ている少なくとも１個の選択透過性チューブ状膜（その
   内腔の両端に該反応器外から外への該気体の入口および
   出口用の開口を有している）の壁を通して該マトリック
   ス中へ潅流することによって供給すること を特徴とする、細胞産生物の連続分泌を伴う実質的に増
   殖を抑制された状態に試験管内の動物細胞を維持する方
   法。 （２）該第二多孔管が該第−多孔管と同心である、特許
   請求の範囲第１項の方法。 （３）複数の第一多孔管と複数の第二多孔管が実質的に
   平行関係をもって該マトリックス中に配置されている、
   特許請求の範囲箱１項の方法。 （４）第一多孔管の孔径が０．２μ〜５μでり、６、そ
   して第二多孔管の孔径が１０μ〜１５０μである、特許
   請求の範囲第１項の方法。 （５）第一多孔管の孔径が０．２μ〜５μであシ、そし
   て第二多孔管の孔径が１０μ〜１５０μである、特許請
   求の範囲第６項の方法。 （６）半硬質マトリックスが粒径６０μ〜４００μを有
   する概して球形の重合体ミクロキャリヤの充填容積から
   なる、特許請求の範囲第１項の方法。 （力　動物細胞が哺乳動物の）・イデリシーマ細胞であ
   シ、そして細胞産生物が該細胞によって産生された単ク
   ローン性抗体である、特許請求の範囲第１項の方法。 （８）動物細胞が哺乳動物の線維芽細胞であシ、そして
   細胞産生物がアンジオジェニックまたはプラスミノーゲ
   ン活性化因子活性を有する、特許請求の範囲第１項の方
   法。 （９）ハウジング；流体培地の通過のための隙間を有す
   る半硬質マトリックス中の細胞を収容するための該ハウ
   ジング内の室；該ハウジングの壁に設けられた外部培地
   流入口および流出口手段、但し該流入口手段は実質的に
   該室の広がシ全体にわたって配置されている少なくとも
   １個の比較的低多孔度管と流体連絡しておシ、そして該
   流出口手段は実質的に該室の広がり全体にわたって配置
   されている少なくとも１個の比較的高多孔度管と流体連
   絡している；該ハウジングの壁に設けられた外部気体流
   入口および流出口手段、但し該手段は実質的に該室の広
   が９全体にわたって配置されている選択透過膜と気体連
   絡している；からなシ、該比較的低多孔度管および高多
   孔度管は外部培地流入口および流出口手段に遠い末端部
   で閉鎖されていることを特徴とする、細胞並生物の連続
   分泌を伴う実質的に増殖を抑制された状態に試験管内の
   動物細胞を維持する装置。 ００）該比較的高多孔度管が該比較的低多孔度管と同心
   である、特許請求の範囲第９項の装置。 （１υ　複数の比較的高多孔度管と複数の比較的低多孔
   度管が実質的に平行関係をもって該マｌ−ＩＪラックス
   中配置されている、特許請求の範囲第９項の装置。 （１２）比較的高多孔度管の孔径が１０μ〜１５０μで
   あり、そして比較的低多孔度管の孔径が０．２μ〜５μ
   である、特許請求の範囲第９項の装置。 α３）比較的高多孔度管の孔径が１０μ〜１５０μであ
   り、そして比較的低多孔度管の孔径が０．２μ〜５μで
   ある、特許請求の範囲第１１項の装置。