CN102712886A - 用于处理和储存细胞培养物的方法及模块设备 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于处理和储存细胞培养物的方法及模块设备。本发明包括以斗式输送机的形式，位于生物反应器(1)中的小室链列(6)，所述小室链列通过一组双转子(8和9)连续移动，有助于保持其中稳定和均一的湿度/温度条件。每个小室(7)含有一个或多个培养床(12)。该培养物由允许采用电磁、气或辐射方式注射及灭菌的部件(18)供给，所述部件通过可控的离心机来离心，其中由离心力(27)起动捕集。本发明也可包括捕获图像的显微镜模块(28)，和连接至数据处理单元和/或外部单元的远程信息处理服务器/客户端配置。使用一个或多个模块列部件(6)、离心机(27)和显微镜(28)是可能的。

Description

用于处理和储存细胞培养物的方法及模块设备
技术部分
在本专利申请中保护的发明是用于处理和储存用于培养物实施、诊断过程、细胞和生物组织的测试及维持的细胞培养物的方法及模块设备。
因此，其是允许用于在医疗(疾病的分子诊断和预后、细胞治疗和组织工程、遗传学、基因治疗和疫苗基因、组织和器官重建的再生医疗)、药理学(药物)、食品(转基因食品(GM food)、发酵饮料、强化的或过敏，等等)领域的生物技术应用的生物材料的控制和管理的方法及设备，对于与基因组学、蛋白质组学及系统生物，也称为“生物信息学”相关的基础和应用科学研究非常有用。
总之，该方法和培养设备有助于任何技术领域——能源、健康、农业和林业、牲畜、食品等等——中与生物技术相关的科研及工业应用的生物材料的诊断和保存，并且它们能够在每个数以百计的可进行的细胞接种中同时进行四个以上的实验。
背景技术
生物材料的培养物培养、诊断以及保存的用途是已知的，并且随着多种技术扩展。然而，这些多种技术和程序根据技术及其应用而变化。为了此目的，本发明通过由于其功能和操作特性而优于已知设备的管理和控制生物材料的设备来实现，所述功能和操作特性为了其配置的模块化和通用性根据它们应用的特征而定。
从1877年用移液管在皮氏培养皿中的最初培养物和初步的生物材料——细胞和组织——直到现在，出现了多种常规技术，我们将对此进行讨论。
组织培养可以被分为两大类技术：器官培养和细胞培养。器官培养是在体外维持组织或整个器官的小碎片，而细胞培养则包括在玻璃或塑料上以悬浮或单层形式繁殖分散的细胞(M.REINA和CARMEAULADELL，“Concepts Basic cell culture”/University of Barcelona)。
本研究的首要目的在于实现细胞生长的必需和适合的细胞生长培养。为此，BURROWS(1910)采用鸡血浆，随后补充胚胎提取物。CARREL和BURROWS获得了哺乳细胞培养物，但是尽管如此，他们遇到了纯粹由操作引起的收获物污染的问题。CARRELL自己(1913)通过其被称为“Carrel烧瓶细胞培养”的设备维持了延长的时间段。
必需营养物的开发手段，以及合适的无菌条件是组织培养初期的主要挑战。
目前，有三种类型可以被归为组织培养：器官培养、原代外植体和细胞培养。
器官培养，在“体内”维持组织的特性，但保持原点组织至多在边界的有限扩展，。然而，原代外植体培养则趋向于在组织的外植体或碎片的细胞增殖的特定表面生产收获物。最后，细胞培养，无论是手动或自动，以酶促或机械方式——均有细胞破裂，便于其用于传代的扩展以及细胞团培养。
细胞培养以均一和同质群体的高度扩展为特征，使得实现其表征、定量、维持和复制样品。
目前，为了开发这些培养技术，以及尤其是细胞培养物和组织已经是已知的，并使用了多种方法和装置。但是它们都有操作上及功能上的缺点，特别是其在变化的细胞生长或环境条件中容易形成污染带，以及组织细胞增殖，或低生产率。与所提供的本发明相比，它们总都包含一些缺陷。因此，它们以装置，与特定技术手段相关的发明来被了解。
例如，为了维持细胞培养物，美国专利4537860 MONSANTOCOMPANY(1985)公开了带有管的静态的或格栅式便携细胞培养物，以及欧洲专利EP0046681 MONSANTO COMPANY(1982)强调持续搅拌收获物的需要，或也如EP0182926(1986)PERSONALDIAGNOSTIC公开了自动培养箱。
它们也是已知技术的结合，也即一次完成多种功能，如关于自动培养和诊断的美国专利公开号5424209 KEARNEY G.(1995)，或关于来自国际专利W9609770US的生物细胞的维持与生长的设备和程序的西班牙专利ES2162081 AASTROM BIOSCIENCES(2001)。
专利AASTROM BIOSCIENCES反映了基本提供了允许在生物材料的培养、诊断以及维持中的自动化和模块化的机构。被设计为小规模工业化的临时使用。
在不同的应用领域或部门提高科学和产业效率的水平，需要寻求细胞培养物的自动化控制及管理。
因此，BIOCRYSTAL的美国专利6673595(2004)结合了培养、诊断和保存的功能。然而，该创造性概念被其自身构造储存所限制，因为培养床在垂直塔中，其对于生物反应器中的温度或环境条件改变是脆弱的，特别是，由于收获物的堆叠高度可能引起环境状态不均一或不同质，其可能影响或妨碍一些培养装置。除此设计之外，使得以模块化方式进行细胞培养物和生物组织状态的有效及快速分析的过程成为可能。
技术问题
在加入单个机器或设备多功能方面——细胞和组织生长、表征及保存——的道路上主要障碍之一在于促进和维持均一地贯穿室的最佳条件以及适宜的生长条件，在所述室中对细胞和组织沉淀用于培养，以及表征和保存。除了作为封闭室，培养物培养应该是物理、化学和生物稳定及可控的，所述培养物培养对于变化非常敏感和易受影响，特别是与湿度和温度有关的变化，这也就是为什么机器装备众多传感器来控制整个生物反应器中所有这些变量。
许多收获物应以一定速度持续地搅拌和不断地运动来制备和维持，以获得与接触的整个表面(平板、平皿、手提生物反应器等等)相匹配的收获物床。因此，获得搅拌的准确控制在许多工业试验或生物材料的生长中变得重要。这个系统完全遵守科学界采用的细胞培养科学流程，特别是由翻转(flipping)引起的持续搅拌。
最后，为了增加促进科学和工业实施的细胞培养物的数量，需要在每个收获物上成本有效的技术手段，该事实通过其工作的性能以及添加额外模块的可能性证明。
技术方案
本发明在一紧凑设备中集合了可操作的培养、表征和维持，获得贯穿生物反应器的内部的环境稳定性和均一性，培养床受控和持续的搅拌，以及精确且容易培养的床的操作。同时，由不计其数的数量，所设计的设备有助于在培养床中一个或多件小室链的模块化布置，实现了通过使用单个技术设备，也能进行管理控制，并且有助于同时实施大量实验。
这有助于提供结果，以及突出引入本发明的应用，其不存在于已知的现有技术中。
有益效果
本发明中可被突出的优点可以包括：
-培养床(平皿、平板或培养瓶小板)的布置，其成组附着在小室形式的成串床中生长的细胞，储存并可能适于在监测和管理它们的设备中的链的线性平行柱中培养，并由此得到许多收获物。不需要通过机械元件或电子操作，来给所有空间提供受控的气压以及对于床有害效果的可能风险。
-模块化设计有助于在收获物的床中使设备整合平行排列的小室链列，比如对每一排或列的培养、表征和储存的技术方案(部件离心机、显微镜等等)。
-通过其在相同的特征和环境参数——特别是湿度和温度——的生物反应器中的连续运行，培养床中小室列的构造获得培养物的持续搅拌，其不会发生在堆叠的构造或小塔中。
-相同构造的链床收获物小室，促进了收获物的表征或诊断，以最小的影响处理并储存数据，因为这是作为用于所有功能的垂直旋转的固定轮的接合处。可以很好地提高模块或测试设备或程序的数量。
-指导系统包括特殊缓冲器，其阻止不必要的床活动，可能承受垂直的、水平的或任何种类的振动。这有助于所述床更好的稳定性，以及阻止其中可能的损害或伤害。
-在垂直工作流上相同的构造可以削弱或弥补温度梯度，以便以热量转移至所述床的方式实现完全的均质化。
附图说明
为了更好地理解上述的一般特征，本发明随附了几张附图，以下为具体说明：
图1：具有生物反应器(1)、装载床和已使用的床的卸载区(2)、培养物和试剂的供给区(3)、泵送和离心区(4)、以及含有微处理器和废物存储器的计算机数据处理区(5)，用于生物细胞和组织的生长、诊断与保存的装置的正视示意图。
图2：具有生物反应器(1)、装载床和已使用的床的卸载区(2)、培养物和试剂的供给区(3)、泵送和离心区(4)、以及含有微处理器和废物存储器的计算机数据处理区(5)，门打开的用于生物细胞和组织的生长、诊断与保存的装置的正视示意图。
图3：具有其列脚(11)、连接链或带系小室(strap cell)(10)、可含有一个或多个床(12)的小室(7)、转子-发动机(8)、旋转转子(9)、床的驱动部件(24)以及床的控制杆(25)的位于生物反应器(1)内部的小室链列(6)的正视图，。
图4：位于装载床和已使用的床的卸载区(2)的床(12)、待使用的床的托架(13)、传送导板(16)、分别操作进入或出去而水平移动的传送支撑物(17)、输出托架(14)，以及所述托架的开口(15)的正视图。
图5：位于生物反应器(1)内部底面上的注射和灭菌部件(18)的正视图，具有培养床(12)、用于注入压缩空气的导管(19)、可注射液体的导管(20)、预注射室(21)、注射器(22)以及消毒器(23)的一面。
图6：位于生物反应器(1)内部底面上的组件的侧视图，并且包括注射和灭菌部件(18)、属于小室链列中的小室、驱动部件床(24)、驱动控制杆床(25)以及用于横向滚动的部件驱动床的移动基底(26)。
图7：位于生物反应器(1)内部底面上的离心机(27)的视图。
图8：位于生物反应器(1)内部底面上的显微镜(28)的视图，由照明器(29)、滤光器支托物(30)、滑动散光器(31)、光圈(32)、调焦器(33)、聚光器(34)、样品支托物支撑物(35)、透镜(36)、数码相机(37)以及一组三坐标轴——Y(38)、X(39)和Z(40)——形成。
发明方式
用于处理和储存细胞培养物的模块设备可以如下所示实施和布置：
设备由几个基本模块空间或区组成：生物反应器(1)、装载床和已使用的床的卸载区(2)、培养物和试剂的供给区(3)、泵送和离心区(4)，以及含有微处理器——中央处理器(CPU)——和废物及废料储存区的数据处理计算机区(5)。
可以采用一个或多个模块部件在生物反应器(1)内布置，例如小室的链列——含有在床上的培养物或细胞培养物的物理单元(6)、离心机(27)，以及根据设备的尺寸而定的显微镜(28)，设备运转或需要运转的工作空间。
保留生物反应器(1)和离心机(4)，装载床和卸载已使用的床的区(2)，培养物和试剂供给区(3)，含有能根据操作需要开启或关闭的门。
设备操作由床(12)的布置开始——附图4——在待使用的床的收纳箱中(13)。发动机或其它推进的方法推动所述待使用的床(12)，将其置于移动通过传送导板(16)朝向位于生物反应器(1)中的小室链(6)的传送支撑物(17)上。
生物反应器(1)的内部、以及封闭腔室、可利用的——附图3——一个或数个小室链列(6)，具有其列脚(11)和连接链或带系小室(10)，为了传送所述链或带系小室的移动，可以在所述链(8)或(9)的顶部或底部的其中一个转子上使用发动机，或者在所述小室一致结合在一起的情况下，传送移动到所有链，或其它已知的传送方法，它们可以作为传送的方法。
注意包含减轻床(12)的振动的小室(7)的阻尼系统。每个小室(7)可能含有一个或多个床(12)平板-类型、小板或小袋——例如，最常见可商购的Autoflask、OptiCell、Petak G2等——其每一个的尺寸和堆叠狭槽根据台的类型而变化。
位于所述小室(7)狭槽中的空床(12)移到注入或提取和灭菌部件(18)的位置，所述位置位于所述生物反应器(1)内部底面上，或者从小室链(6)可进入的地方。一旦所述床(12)置于床(24)的推进器的相对位置，后者通过床驱动控制杆(25)以及驱动床部件的移动基底(26)，横向滚动执行机动或离开床到流体的注射区。
当所述床(12)置于注射和灭菌的部件(18)上时，通过经预注射室(21)引入压缩空气以及经注射流体导管(20)引入培养流体，能够采用给定的细胞培养物、试剂或营养培养基来进行处理。液体营养培养物或注射物贮存在培养物的供给处(3)，并且在泵送及离心处(4)通过蠕动泵或其它任何卸载方式指引向注射模块。
在预注射腔室(21)中实施经喷嘴(22)的口注射进所述床(12)的流体或培养培养物的添加及混合。此保证通过电磁类型——磁电管——或，可替代地，通过热、辐射或其它方式的灭菌设备(23)，在无菌条件下实施。
培养基或液体再一次在床(12)中被分配，采用与用于模块注射(18)的输入相似的系统，回到容纳于小室(7)中相同的位置。
此过程预先设计重复来逐渐引入，并处理小室链(6)中的每个任务。
小室链列(6)因此处于持续翻转运动中，并且没有任何振动或震动，停止以操作处理收获物，以及在生物反应器(1)中无菌、稳定和均一的环境条件，或者每个收获物处理可能需要的不同程度的温度或压力。因此，贮存在处理单元中的小室(7)中每个床(12)的位置总是受控的。
随后，通过驱动床(24)的部件移除床，我们进行带有培养物的已使用床(2)的卸载，以及经由沿着传送导板(16)移动到所述输出托架的传送支撑物(17)，将它们布置在输出托架(14)中。这个过程通过在输出托架(14)中放置床的控制杆发生，该输出托架从可以由使用者可以直接利用的开口(15)进入。
可以在细胞培养中进行的多种任务之一是所述床(12)的离心，以便在这些中分离目标物。
离心机部件以2000rpm旋转一定时间，所述时间多于由从控制任务的程序而来的使用者决定的时间。系统进行由床的驱动器(24)到注射模块(18)，移除小室链(6)的床，并留下之前的在进入离心机模块的队列中停留的位置。线性驱动其进入离心机模块(27)。
对于所述提取床(12)，柔性系统推动所述床(12)从所述离心机模块(27)到所述之前在队列中停留的位置。通过爬上另一驱动线的凸缘的方式，床(12)回到小室链(6)。
所述离心机(27)模块作为收集装置，由其旋转引起的离心力起动。其也允许一个或多个床同时旋转。在输入和输出队列中，可提供培养床贮存缓冲器(12)作为离心机模块(27)和小室链(6)之间的中间步骤。
为了分布式监测在床(12)中的收获物，可以有一个或多个显微镜模块(28)，其捕获相同的画面来进行计算和细胞计数，以及获得细胞培养物样品的高分辨率图片。由使用者根据你想要监测和/或计算什么来定义可以由显微镜完成这些以及其它可能的过程，并且可以选择扫描的分辨率。
显微镜安装在三线性轴——X、Y、Z——(39、38和40)上，其由中央处理器(5)来控制。所述X和Y的位置可以是连续或不连续的，但Z轴的位置必须是最后的。在培养的床(12)上放置了光标后，首先看X和Y决定焦点和目标Z的位置，都通过中央处理器(5)来控制。除了使方法生效外，Z轴运动具有计算画面处理。因此每一次拍照，你就知道死亡或存活细胞的数量。
通过与预注射模块(18)的床的推动器(24)相当的系统，从小室链(6)取出床(12)，并且将其置于信息(cookie)扫描器上，检查ID编码床(12)。一旦确认，在中央处理器——CPU(5)——的控制下开始监测。
所有的设备均由聚焦处理器(5)控制和监测。该系统与客户-服务器配置一起工作，所述配置允许你控制所述设备的所有参数(在生物反应器中的环境条件、在小室中的床位置、执行任务、次数等等)。不管通过其控制屏幕是否物理位置在设备前面，但是与连接至网络的其它任何计算机类似。

Claims (9)

1.用于处理和储存细胞培养物的方法及模块设备，其特征在于在待使用床的收纳箱(13)中的床(12)的布置。发动机驱动待使用的位点(12)，将其置于传送支撑物(17)上，所述传送支撑物移动通过传送导板(16)朝向位于生物反应器(1)内的小室链(6)。在生物反应器(1)中有小室的链列(6)，带有其列脚(11)和链(10)。为了传送链的移动，采用位于链顶部的转子-发动机(8)将所有链移动传送到进行持续翻转动作的旋转转子(9)。每个小室(7)由振动阻尼器组成，可含有一个或多个床(12)。位于所述小室(7)的狭槽中的空床(12)移动到注射和灭菌的部件(18)所在的位置，所述注射和灭菌的部件位于生物反应器(1)内部的底部或者可从小室链(6)接近的任何位置。一旦床(12)面对床的驱动器(24)，通过驱动床的控制杆(25)以及驱动床的部件的移动基底(26)横向滚动操纵部件或离开床到流体的注射区。当床(12)被置于注射和灭菌的部件(18)上时，通过经预注射室(21)引入压缩空气以及经由管注射流体(20)提供液体培养物，用给定的细胞培养物、试剂或营养培养基处理床。所述注射的液体营养培养物或被储存在培养物的供给处(3)以及经由泵送和离心机(4)中的蠕动泵被引向注射模块。在该预注射室(21)中实施上述经由喷嘴(22)的口注射进入床(12)的流体或培养物的添加和混合。在无菌条件下的所有操作均通过电磁类型——磁电管——的灭菌设备(23)。一旦流体或培养基已分配在床(12)中，则采用与用于输入注射模块(18)的相似系统返回置于小室(7)中的相同位置。随后，通过驱动部件(24)移除床，进行已使用的床(2)的卸载，以及经由沿着传送导板(16)移动到所述输出托架的传送支撑物(17)，将其放置在输出托架(14)中。这个过程通过在输出托架(14)中堆积床的控制杆发生，该输出托架从可以由使用者可以直接利用的开口(15)进入。接着引入液体培养基或部件离心机在1500和2000rpm之间旋转，离心时间由设计控制任务的使用者决定。与使所述床的驱动器(24)到注射模块(18)相同和相当的系统，移除小室链(6)的床并且留出离心机模块之前的空间。线性驱动其进入所述离心机模块(27)。为了取出床(12)，柔性系统推动床(12)从离心机模块(27)到之前停留的位置。通过爬至另一驱动线上的凸缘，床(12)返回小室链(6)。离心机的模块(27)充当收集机械装置，由于其旋转，其由本身的离心力起动。为了分布式监测在床(12)中的收获物，可以具有显微镜模块(28)，其捕获图片来进行计算和细胞计数，以及获得细胞培养物样品的高分辨率照片。这些和其它可能的过程可通过由使用者根据你想监测和/或计算什么，选择什么扫描分辨率定义的显微镜来进行。显微镜以三线性轴——X、Y、Z——(39、38和40)安置，控制其不被内插。X和Y的位置可以是连续或不连续的，但是Z轴的位置必须是最后的。在培养物床(12)上放置光标后，首先看X和Y决定焦点，并指示目标Z的位置，所有这些都由中央处理器(5)来控制。除了作用之外，焦点的Z轴移动具有常见的计算机化图片识别。通过与预注射模块(18)的床的推动器(24)相当的系统，床(12)从小室链(6)中移除，并且将其放置在信息扫描器上，检查ID编码床(12)。一旦确认，开始由中央处理器控制的监测。
2.根据权利要求1所述的用于处理和模块储存细胞培养物的方法及设备，其特征在于生物反应器(1)、装载床和已使用床的卸载区(2)、培养物和试剂的供给区(3)、泵送和离心区(4)，和含有微处理器——中央处理器(CPU)——的计算机数据处理区，以及废物和废料的储存区(5)。
3.根据权利要求1和2所述的用于处理和储存细胞培养物的方法及模块设备，其特征在于泵送和离心区(4)、装载床和已使用床的卸载区(2)以及培养物和试剂的供给区(3)，含有可根据操作需要开启或关闭的门。
4.根据权利要求1和2所述的用于处理和储存细胞培养物的方法及模块设备，其特征在于与小室(10)相连的链被带有小室的带或一致结合在一起的小室本身所替代，来充当传送机构。
5.根据权利要求1和2所述的用于处理和储存细胞培养物的方法及模块设备，其特征在于为了传送中心小室链(6)的移动，将转子-发动机(8)提供在列的底部，在小室列(11)的附近，旋转转子(9)置于顶部。
6.根据权利要求1和2所述的用于处理和储存细胞培养物的方法及模块设备，其特征在于在离心机模块(27)和小室链(6)之间有缓冲储存器床(12)。
7.根据权利要求1和2所述的用于处理和储存细胞培养物的方法及模块设备，其特征在于在生物反应器(1)内可以使用一或多件模块小室链列(6)、离心机(27)和显微镜(28)。
8.根据权利要求1和2所述的用于处理和储存细胞培养物的方法及模块设备，其特征在于其中灭菌设备(23)利用热力机构和/或辐射。
9.根据权利要求1和2所述的用于处理和储存细胞培养物的方法及模块设备，其特征在于具有连接至数据处理单元和/或外部驱动器的客户-服务器配置远程信息处理控制屏幕。
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