CN108779424A - 使用搅拌槽生物反应器的多能干细胞扩增和传代 - Google Patents

Abstract

本文提供包含干细胞和/或分化的细胞的细胞聚集体的扩增和传代的新方法，所述方法包括使用在搅拌槽生物反应器中的封闭系统。本发明的方法允许具有相关的多能标记和分化潜能的多能干细胞和/或其子代的封闭系统连续传代扩增。

Description

使用搅拌槽生物反应器的多能干细胞扩增和传代

背景

本公开内容一般涉及使用搅拌槽生物反应器使细胞和/或细胞聚集体扩增和传代。

对于在多能干细胞建库(如，对于诱导的多能干细胞)、细胞(如，GE的CytivaTM心肌细胞)的商业生产和用于临床试验的细胞扩增中的应用，对大规模多能干细胞培养的需求正逐渐显现出来。无饲养细胞的多能干细胞培养的进展使得在烧瓶中，在生物反应器中的微载体(直径150-250微米)或宏载体(直径~6 mm)上的大规模细胞扩增成为可能。使用悬浮液培养避免在传统微载体上培养多能细胞时出现的一些难题，包括无效率的接种和从载体释放细胞，在收获期间微载体和细胞的物理分离，和可导致细胞表型改变的细胞-载体结块的形成。通常地，灌注被用于在生物反应器中的悬浮液培养。

然而，灌注/悬浮液培养中的一个难题是如何在生物反应器中保留细胞。现有技术提供一些基本的分离技术：1) 过滤，2) 重力沉降，和3) 离心。过滤方法需要一些方式来防止过滤器在需要的数周操作中堵塞。重力沉降的问题是不同细胞的变化的沉降特性，扩大到工业系统的困难，和维持无菌性的困难。类似地，在开放细胞培养中常规使用离心，但已发现由于关于无菌性的顾虑导致在完全封闭系统细胞培养中有限的应用。

本领域需要在培养细胞，包括多能干细胞和/或分化的人细胞的过程中减少人为干预和交叉污染的技术。

发明简述

本文描述了用于培养细胞，包括多能干细胞和/或分化的人细胞的改进的方法。

本文提供了在封闭系统中扩增细胞聚集体的方法，其包括

细胞培养容器；

在容器中形成聚集体；

在容器中自动灌注细胞聚集体；

在灌注过程中重力沉降细胞聚集体；和

在封闭系统中收获聚集体和传代。

本文还提供在使用本文描述的方法扩增细胞聚集体中使用的封闭系统。

附图

当参考附图阅读以下详细描述时，本发明的这些和其它特征、方面和优点将变得更好理解，其中在整个附图中相同的字符代表相同的部件，其中：

图1显示了搅拌槽生物反应器中用于重力沉降和培养基交换的管道组件的图，其中用过的培养基以垂直方向从生物反应器中移除。

图2显示了搅拌槽生物反应器中用于重力沉降和培养基交换的管道组件的图，其中新鲜培养基以垂直方向被加入到生物反应器中。

图3显示了搅拌槽生物反应器中用于重力沉降和培养基交换的管道组件的图，其中用过的培养基以倾斜的方向从生物反应器中移除。

图4显示了搅拌槽生物反应器中用于重力沉降和培养基交换的管道组件的图，其中新鲜培养基以倾斜的方向被加入到生物反应器中。

图5显示具有100um-300 um厚度的10 mm切片机网格结构的图。

图6显示在壁之间间隔100um和具有30 um壁厚的方形网格切片机的图。

图7显示在壁之间间隔100um和具有30 um壁厚的六边形网格切片机的图。

图8显示通过切片机对聚集体进行封闭系统处理的方法图。由泵驱动的循环回路和在线锥形袋悬浮和分布聚集体。导向切片机的管道连接到主循环回路，和一部分细胞聚集体通过以较低速度运行的第二个泵被传递到切片机。

图9显示CT2人胚胎干细胞的切开的聚集体的形态学图像。

图10显示以4x10^5个细胞/mL接种的CT2人胚胎干细胞聚集体在酶促传代或用切片机进行机械传代后的扩增率比较。

图11显示以1.5x10^6个细胞/mL接种的CT2人胚胎干细胞聚集体在酶促传代或用切片机进行机械传代后的扩增率比较。(1) 用Accutase® + ROCK抑制剂传代的CT-2；(2)用方形网格 + ROCK抑制剂传代的CT-2；(3) 用六边形网格 + ROCK抑制剂传代的CT-2；(4)用方形网格 + ROCK抑制剂传代的CT-2；(5) 用六边形网格 + ROCK抑制剂传代的CT-2。

图12显示在搅拌槽反应器中的CT2人胚胎干细胞聚集体形态学。

详细描述

"a"或"an"在此意指一个或超过一个；至少一个。当在此使用复数形式时，通常包括单数。

如本文所用的“灌注”指通过不断用新鲜的培养基供养细胞和移除已用过的培养基，同时保持细胞在培养中来保持培养细胞为活着的过程。

"聚集体"指细胞的缔合，其中所述缔合由细胞-细胞相互作用而不是与基质的粘着引起。在聚集体中，两个或更多个细胞通过彼此的生物附接而相互缔合。这可通过表面蛋白，例如细胞外基质蛋白进行。在一个实施方案中，细胞可初始生长在基质上，其中一些细胞与基质缔合(粘着)，但进一步的生长形成细胞-细胞缔合(聚集)，其不取决于进一步生长的细胞与基质的缔合(粘着)。在另一个实施方案中，细胞在悬浮液中自发地缔合，以形成独立于对表面的任何粘着的细胞-细胞附接。细胞饲养层也被认为是基质。因此，细胞与饲养层的附接也是一种贴壁培养(不是聚集体)的形式，因为细胞彼此没有附接，而是与饲养层中的细胞附接。

"扩增"指有或没有分化的细胞增殖，并可包括无传代、一次传代或一次以上的传代和/或连续传代。在一个实施方案中，扩增指没有分化的细胞增殖，并包括一次或一次以上的传代和/或连续传代。

"干细胞"意指能经历自我更新(即，具有相同分化潜力的子代)并且还产生分化潜力更受限制的子代细胞的细胞。在本公开内容的上下文中，干细胞还将涵盖更分化的细胞，其已经例如，通过核转移，通过与更原始的干细胞融合，通过引入特定的转录因子，或通过在特定的条件下培养而去分化。“多能干细胞”可能潜在地产生身体需要其以自我修复的任何细胞或组织。多能干细胞也能够自我更新，并可永久产生更多的自身拷贝。多能干细胞包括诱导的多能干细胞(iPSCs)和胚胎干细胞(ESCs)。

“培养容器”包括一次性和非一次性塑料制品、袋和/或容器和/或生物反应器。该术语包括单次使用的塑料制品、袋和/或容器和/或生物反应器和多次使用的塑料制品、袋和/或容器和/或生物反应器。

“封闭系统”指已预先灭菌同时密闭和/或密封并保持完整性和/或无菌性的培养容器和辅助组件。容器和组件在没有破坏系统的完整性的情况下使用，在保持无菌的同时允许液体移进和/或移出，并可连接于其它封闭系统而不失去完整性。封闭系统生物反应器和/或容器指其中在不破坏系统的完整性(如，通过打开管的盖子或将盖子从细胞培养板或培养皿上取下)的情况下，细胞、细胞培养基、化学品和试剂被无菌添加、移动和/或操作的系统。在封闭系统中单次使用或多次使用的袋和/或容器和/或生物反应器例如通过在容器或生物反应器的部位进行无菌管道焊接，被加到封闭系统上或至封闭系统中。

"受试者"是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括，但不限于，人、农场动物、运动动物和宠物。需要用本发明的方法治疗的受试者包括因物理或疾病相关损害而患有功能丧失的那些受试者。

术语"治疗有效量"指经测定在哺乳动物中产生任何治疗反应的量。例如，有效量的治疗性细胞或细胞-相关试剂可延长患者的存活能力。或者，所述治疗可以是预防性的，和预防和/或抑制明显的临床症状。在本文所用的术语的意义内治疗有效的治疗，包括改善受试者的生活质量(即使它们没有改善疾病结果本身)的治疗。本领域普通技术人员通过常规应用于受试者群体，例如在临床和临床前试验中，确认这样的治疗有效量。因此，"治疗"意指递送这样的量。

"治疗(treat、treating或treatment)"在涉及本发明时被广泛地使用，且每个这样的术语尤其涵盖改善、抑制或治愈缺陷、功能障碍、疾病或其它有害的过程，包括干扰疗法和/或因疗法导致的那些。

大规模多能干细胞培养为多能干细胞建库(如，对于诱导的多能干细胞)、细胞(如，GE的CytivaTM心肌细胞)的商业生产和/或用于临床试验的细胞扩增所需要。多能干细胞可以是诱导的多能细胞(iPS细胞)、源自胚胎的“真正的”胚胎干细胞(ES细胞)、通过体细胞核转移制得的胚胎干细胞(ntES细胞)或来自未受精卵的胚胎干细胞(单性生殖胚胎干细胞，或pES细胞)。在烧瓶中的大规模无饲养细胞的胚胎干细胞扩增是劳力密集型的，空间限制和分离的群体可能表现为表型漂移。因此，在本领域已尝试开发大规模多能干细胞培养的替代办法；如，CellSTACK® (Corning)、Cell Factory (Nunc®)和生物反应器(微载体或悬浮液培养)。

有许多类型的用于细胞培养的生物反应器，包括但不限于搅拌槽反应器、旋转瓶、轨道摇动器、摇摆运动和桨轮。本领域技术人员将认识到，对于生物反应器中的细胞培养，也有替代方法。

已证实叶轮式搅拌槽生物反应器系统中的多能干细胞的悬浮液聚集体培养(Chen, VC et.al, Stem Cell Res. 2012 May; 8(3): 388-402)，其避免了生物反应器培养中对任何基质或载体的需求。在用于从悬浮液培养中传代细胞的Chen方法中，通过离心收获聚集体。相比之下，本文提供的方法允许在封闭系统中，使用搅拌槽生物反应器的多能干细胞和/或多能干细胞聚集体的封闭系统扩增(包括接种、灌注、传代和收获)。此外，本文描述的方法还允许多能干细胞在封闭系统中的悬浮液和/或非-贴壁培养，而不使用膜滤器和/或离心和/或酶消化，这允许在封闭系统中维持无菌性，减少成本(如，对于安装离心机)并且还减少人为干预，其有助于减少交叉污染。本发明的方法与细胞或细胞聚集体的额外传代的联合使用也被涵盖在本文提出的实施方案的范围内，所述额外传代可包括使用膜滤器和/或离心等并可包括使用酶消化以离解在细胞或细胞聚集体的额外传代中的聚集体。

先前描述的用于在搅拌槽生物反应器中扩增多能干细胞的方法(如，Niebrueggeet al., Tissue Engineering: Part A, 2008, 第14册, 第10期, 第1591-1601页)公开了小鼠干细胞的扩增。此外，这样的先前描述的方法集中在维持干细胞培养足够长的时间，以及一般而言，随之发生的干细胞分化。相比之下，本文描述的方法允许人干细胞的扩增，接着使聚集体离解和使离解的细胞传代，使得细胞通过扩增和连续传代保持它们的多能性。此外，本文描述的扩增和传代的方法在确保生产过程中的无菌性的封闭系统中进行。通常地，先前描述的干细胞扩增方法利用Rho-相关蛋白激酶抑制剂(ROCK抑制剂)，以在酶促传代期间维持细胞培养。采用ROCK抑制剂以供干细胞扩增和传代的缺点是ROCK抑制剂影响染色体稳定性，可能引发干细胞的核型异常和遗传漂移。相比之下，本文描述的干细胞的扩增和传代在ROCK抑制剂的不存在下进行，从而在干细胞传代过程中减少核型异常和遗传漂移并允许保留多能性。

本文描述的方法依赖封闭系统中的重力沉降与自动灌注的结合。此外，在一些实施方案中，本文描述的方法包括切片机的使用，从而允许细胞聚集体在细胞的连续传代之间的无酶离解。某些先前描述的层状重力沉降槽要求细胞或细胞聚集体沿倾斜的平面/管滚下。用于悬浮液聚集体应用的此类层状重力沉降槽的缺点包括：细胞聚集体经历剪应力，其减少扩增过程的效率，由于不完全的沉降效率导致大的细胞损失，和聚集体缔合/粘着于重力沉降槽。层状重力沉降槽已被用来从细胞群分离和丢弃细胞聚集体。相比之下，本文描述的方法分离和丢弃单个细胞(低成活力干细胞)，而保留聚集体用于随后的传代。

其它先前描述的用于培养基交换的方法暂时停止搅拌，从而允许聚集体在搅拌槽生物反应器中重力沉降。聚集体沉降后，一部分已用过的培养基可从生物反应器去除并用新鲜培养基替换。这种方法的风险是当聚集体在底部表面浓集在一起时聚集体成团的可能性。

因此，本文描述了在搅拌槽生物反应器中细胞聚集体扩增(包括人多能干细胞扩增)的方法。培养液的连续或不连续搅拌提供混合和换气，导致细胞生长的可靠环境。该方法利用不同大小的培养容器，提供操作方便和防止交叉污染的保护。传感器可用于连续监测溶解氧、pH和培养基组分例如乳酸盐和葡萄糖，伴有实时控制和数据存储。平台软件提供在封闭系统中进行连续或不连续灌注/培养基交换的能力。

通常地，在灌注期间，有不同的方法以保持细胞在培养中，同时去除用过的培养基。一个方法是通过使用具有小于细胞大小的孔径的毛细管纤维或膜，使细胞保持在生物反应器中。另一种方法是利用使细胞保持在生物反应器中同时允许培养基被去除的“百合垫(lily pad)”浮动滤器。另一种方法是使用离心以分离细胞并使它们返回到生物反应器中。又一种方法使用物理方法，例如在细胞培养容器或相关的管道内捕获细胞同时去除用过的培养基的声学方法。

相比之下，本文描述的方法依赖细胞聚集体的重力沉降，其允许去除用过的培养基，而不使用通常用来使细胞保持在生物反应器中同时允许去除培养基的过滤系统。这种方法的优点是失去了在多能干细胞培养中主要是无活力的单个细胞，并维持聚集体，从而增加培养物的整体质量和成活力。

通过连续去除用过的培养基并将其用新的培养基替换，保持最佳生长条件的营养水平，并去除细胞废物以避免毒性。当使用本文描述的方法在封闭系统中执行灌注时，污染的可能性减少。有利地，本文描述的封闭系统和细胞培养方法利用细胞聚集体的重力-沉降，从而允许少膜灌注，其允许减少由于细胞粘附于滤膜导致的损失和/或由于在过滤过程中剪切导致的细胞损伤。

本文描述的方法优选地用于封闭系统以最大限度地减少培养物污染和细胞交叉-污染的风险，并允许有把握地达到高成活力和高细胞密度。本文描述的方法是为了便于使用和可靠性而设计的。

本文提供了方法，其描述多能干细胞作为悬浮液聚集体在搅拌槽系统中以连续传代进行扩增。本文还提供了实施例，其显示搅拌槽反应器与切片机联合用于传代，有利于在统一封闭系统中多能干细胞的扩增和连续传代，尤其是减少时间、试剂和劳动力。

本文还提供一种连接到培养容器(如，搅拌槽生物反应器)的特定管道组件，其与电脑控制的蠕动泵相互作用以驱动自动培养基交换。在一个实施方案中，管道的形状像T形，伴有一段较低的垂直管道、分叉点和在分叉点连接的两个额外长度的管道。该额外的管道被放置在由软件控制的蠕动泵上。利用缓慢的收获率来抽出培养基。管道的垂直性质允许聚集体以超过被移除的培养基的流速的速率重力沉降。净效果是在培养基去除步骤期间聚集体保持在容器(如，搅拌槽生物反应器)中的最佳细胞培养条件下。培养基去除可持续例如，长达8小时、长达4小时等，但培养基去除可以在更短或更长的时间内进行。培养基去除步骤后，将新鲜培养基经数秒至数分数或经任何合适的时间长度快速加入到容器(如，搅拌槽生物反应器)中。培养基去除/快速培养基添加的循环重复进行所需的细胞培养时长。在可选的情况下，灌注可以是不连续的，并且这样的实施方案也预期在本文提出的实施方案的范围内。

本文描述的自动灌注设计在本质上是低成本的，与培养容器(包括搅拌槽反应器)完全相容，可调整为与任何其它培养容器完全相容，且不需要可增加成本和增加污垢风险且降低性能的任何滤器。此外，本文描述的自动灌注不包含会增加复杂性、成本和失败风险的移动部件或电子产品。

本文提供一种在封闭系统中扩增细胞聚集体的方法，其包括

提供细胞培养容器；

在容器中形成聚集体；

在容器中自动灌注细胞聚集体；

在灌注过程中重力沉降细胞聚集体；和

在封闭系统中收获聚集体和传代。

在一些实施方案中，在封闭系统中传代在Rho-相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂的存在下进行(如，在容器中的细胞培养基中的ROCK抑制剂的浓度是约10微摩尔)。在上述方法的其它实施方案中，在封闭系统中传代基本上在维持传代的、单分散的或解聚的多能细胞的成活力的试剂不存在下进行。在一些这样的实施方案中，维持多能细胞的成活力的试剂是Rho-相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂。在上述方法的一些实施方案中，在封闭系统中传代在ROCK抑制剂的不存在下进行。在一些这样的实施方案中，ROCK抑制剂是Y27632。如本文所用的，在一个实施方案中，“基本上在维持传代的、单分散的或解聚的多能细胞的成活力的试剂不存在下”意指没有试剂加入到细胞培养基中以维持传代的、单分散的或解聚的多能细胞的成活力。在另一个实施方案中，“基本上在维持传代的、单分散的或解聚的多能细胞的成活力的试剂不存在下”意指存在于容器中的细胞培养基中的试剂浓度少于1微摩尔，或少于5微摩尔或少于10微摩尔。

在一些实施方案中，扩增的细胞聚集体具有植物、动物、昆虫或微生物来源。在一些实施方案中，扩增的细胞聚集体包含人多能干细胞或分化的人细胞或其组合。在一些实施方案中，扩增的细胞聚集体包含人多能干细胞。

在一些实施方案中，细胞培养容器是搅拌槽生物反应器。在一些实施方案中，所述自动灌注在没有人为干预的情况下在封闭系统中进行。

在一些实施方案中，重力沉降室的长度是至少1 cm且以驱动细胞聚集体的重力沉降的方向定位。

在一些实施方案中，自动灌注以允许约100微米-约800微米直径的细胞聚集体重力沉降的速率进行。

在一些实施方案中，上述方法还包括通过执行连续传代，细胞聚集体和/或其子代的一次或多次额外的扩增。在一些这样的实施方案中，细胞聚集体和/或其子代的一次或多次额外的扩增，通过传代至具有膜滤器的第二容器中执行。

在一些实施方案中，上述方法包括细胞聚集体和/或其子代的一次或多次额外的扩增，其中一次或多次额外的传代在相同的容器中执行。在其它实施方案中，上述方法包括细胞聚集体和/或其子代的一次或多次额外的扩增，其中一次或多次额外的传代在培养容器中无膜滤器的情况下(如，通过细胞聚集体的重力沉降)在第二容器中执行。在其它情况下，上述方法包括细胞聚集体和/或其子代的一次或多次额外的扩增，其中一次或多次额外的传代在具有膜滤器(如，浮膜滤器)的第二容器中执行。

在这样的实施方案中，额外的扩增和/或传代可以任何顺序进行。举例来说，初始传代可在无膜条件下(如，通过细胞聚集体的重力沉降)在培养容器中进行，接着在具有膜滤器的培养容器中进行一次或多次额外的扩增。作为一个备选的例子，一次或多次初始扩增和/或传代可在包含膜滤器的培养容器中进行，接着在无膜过滤条件下(如，通过细胞聚集体的重力沉降)进行随后的扩增和/或传代。因此，包括膜-过滤或无膜过滤的扩增和/或传代的任何顺序均在本文描述的实施方案的范围内考虑，其中所述顺序包括在本发明的无膜条件下(如，通过细胞聚集体的重力沉降)的至少一次扩增。

在一些实施方案中，细胞聚集体的连续传代能够在封闭系统中使用切片机网格通过无酶传代进行。在一些这样的实施方案中，细胞聚集体用具有约20-约500微米距离分开的刀片的切片机网格离解。在一些其它实施方案中，细胞聚集体用具有约100微米距离分开的刀片的切片机网格离解。在一些这样的实施方案中，细胞聚集体用对齐管道的切片机网格和用于混合细胞聚集体的装置离解。换言之，在一些实施方案中，细胞聚集体在用切片机离解前在例如图8中所示的锥形袋中混合，并且通常将混合袋置于封闭系统中的培养容器和切片机之间。

用来通过切片机的细胞聚集体浓度影响高成活力的切开的细胞聚集体的回收率。出乎意料的是，已发现使用图5-7中所示的切片机几何形状，低于约3 x 10^6个细胞/mL的细胞聚集体浓度的切割比大于约3 x 10^6个细胞/mL的细胞浓度以更高的回收率产生更高成活力的样本。本领域技术人员将认识到，可选的切片机几何形状将修改阈值浓度，其提供相对更高的成活力和回收率。通过例如使用图8中所示的混合装置保持流动液流中聚集体的均匀悬浮液，使污染减少到最低限度，导致更高的细胞成活力和回收率。有利地，切片机的使用消除了在切开的多能干细胞聚集体的扩增期间对Y27632 ROCK抑制剂的需求，与通常需要试剂例如Y27632 ROCK抑制剂来维持单个多能细胞的成活力的酶促传代的多能干细胞聚集体不同。

在一组实施方案中，切片机用疏水性材料涂布。在一些实施方案中，切片机包含疏水性材料。

也构思了某些其它实施方案，其中细胞聚集体的连续传代能够在酶的存在下，通过在封闭系统容器中细胞聚集体的离解而进行。在这样的实施方案中，额外的扩增或传代可在ROCK抑制剂的存在下进行。

在上述方法的一些实施方案中，在扩增和/或传代期间，每个扩增的细胞聚集体的平均直径大小不超过约800微米。在上述方法的一些实施方案中，在扩增和/或传代期间，每个扩增的细胞聚集体的平均直径大小不超过约500微米。在上述方法的一些实施方案中，在扩增和/或传代期间，每个扩增的细胞聚集体的平均直径大小不超过约400微米。在上述方法的一些实施方案中，在扩增和/或传代期间，每个扩增的细胞聚集体的平均直径大小不超过约300微米。

在一些实施方案中，培养容器的体积是约50 mL-约100 L。在一些实施方案中，培养容器的体积是约50 mL-约50 L。在一些实施方案中，培养容器的体积是约100 mL-约10L。在一些实施方案中，培养容器的体积是约100 mL-约5 L。在一些实施方案中，培养容器的体积是约150 mL-约1 L。在一些实施方案中，培养容器的体积是约50 mL-约20 L。在一些实施方案中，培养容器的体积是约200 mL-约2 L或大于2 L。

本文还提供一种传代细胞聚集体的方法，其中细胞聚集体通过在封闭系统中与生物反应器联合的切片机网格减少尺寸。在用于本文描述的任何方法的一组实施方案中，细胞聚集体在超过100 mL的体积中传代。换言之，传代通常在较小体积的培养基中并用较低的细胞计数进行。相比之下，本发明的方法允许在封闭系统中使用大体积的培养基，从而允许细胞聚集体在生物反应器中和/或在工业规模上的传代。在封闭系统中，切片机网格与生物反应器联合用于大体积例如，超过100 mL的细胞聚集体传代在本公开内容之前，在本领域中并未公开。在另一个实施方案中，细胞聚集体在超过250 mL、500 mL、1L、2L或5L的体积中传代。在一个实施方案中，切片机网格是一种多边形切片机网格。在一个例子中，所述体积超过100 mL的细胞聚集体的传代在不向培养基添加ROCK抑制剂(如，Y27632)的情况下执行。

在上述用于传代细胞的方法的一些实施方案中，细胞聚集体用具有约20-约500微米距离隔开的刀片的切片机网格离解。在上述用于传代细胞的方法的一些实施方案中，细胞聚集体用具有约100微米距离隔开的刀片的切片机网格离解。在一些这样的实施方案中，细胞聚集体用对齐管道的切片机网格和用于混合细胞聚集体的装置离解。在某些情况中，切片机用疏水性材料涂布。在其它情况下，切片机包含疏水性材料。

在上述用于传代细胞的方法的一些实施方案中，在传代前的每个细胞聚集体的平均直径大小不超过约800微米。在上述用于传代细胞的方法的一些实施方案中，在传代前的每个细胞聚集体的平均直径大小不超过约500微米。在上述用于传代细胞的方法的一些实施方案中，在传代前的每个细胞聚集体的平均直径大小不超过约400微米。在上述用于传代细胞的方法的一些实施方案中，在传代前的每个细胞聚集体的平均直径大小不超过约300微米。

在另一方面，本文提供一种在封闭系统中扩增细胞聚集体的方法，该方法包括

提供搅拌槽生物反应器容器；

在容器中形成聚集体；

在容器中自动灌注细胞聚集体；

在灌注过程中重力沉降细胞聚集体；

聚集体收获和细胞聚集体的无酶切割；和

在封闭系统中传代。

在上述方法的一些实施方案中，在封闭系统中的传代在ROCK抑制剂(如，在容器中的细胞培养基中的ROCK抑制剂浓度是约10微摩尔)的存在下进行。在上述方法的其它实施方案中，在封闭系统中的传代基本上在维持传代的、单分散的或解聚的多能细胞的成活力的试剂不存在下进行。在一些这样的实施方案中，维持多能细胞的成活力的试剂是Rho-相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂。在上述方法的一些实施方案中，在封闭系统中的传代在ROCK抑制剂的不存在下进行。在一些这样的实施方案中，ROCK抑制剂是Y27632。如本文所用的，在一个实施方案中，“基本上在维持传代的、单分散的或解聚的多能细胞的成活力的试剂不存在下”意指没有试剂加入到细胞培养基中，以维持传代的、单分散的或解聚的多能细胞的成活力。在另一个实施方案中，“基本上在维持传代的、单分散的或解聚的多能细胞的成活力的试剂不存在下”意指存在于容器中的细胞培养基中的试剂浓度少于1微摩尔，或少于5微摩尔或少于10微摩尔。

因此，本文提供的方法使数个工作流成为可能，所述工作流包括且不限于(1) 在生物反应器中的聚集体形成，包括来自这些来源：酶法离解的聚集体(如，AccutaseTM)、冷冻保存的原料和/或机械切开的聚集体(如，多边形切片机网格)；(2) 在搅拌系统中的扩增方法：具有用于重力沉降的管道组件的非-灌注生物反应器，和/或灌注生物反应器；和(3)连续传代：加入细胞培养容器中的聚集体的酶(如，在生物反应器中的AccutaseTM)，加入细胞培养容器外部的聚集体的酶和/或使用多边形切片机网格的机械传代。

此外，本文描述的方法适用于已用于细胞的悬浮液培养的各种生物反应器，其包括且不限于搅拌悬浮液生物反应器、摇摆运动生物反应器、旋转瓶、轨道运动生物反应器、旋转运动生物反应器和切向流体流动生物反应器。本文描述的方法，包括用于灌注的无滤器重力沉降和使用切片机的无酶传代，与所有的此类生物反应器系统相容并使在这样的生物反应器中的封闭系统聚集体形成、灌注、扩增、收获和传代成为可能。

在本文提供的实施方案的范围内构思了本文描述的方法用于生成细胞库、用于生成扩增的细胞聚集体以供研究应用、用于治疗和/或诊断试验(如，在临床试验中的药物试验、毒理学或质量控制分析)，和/或用于治疗患者的用途。本文提供包括给予有需要的受试者包含药学上可接受的载体和从本文描述的方法获得的至少一个细胞和/或细胞聚集体的药物组合物的方法。

本文还提供一种通过施用治疗有效量的上述方法生产的细胞和/或聚集体给有需要的受试者，在需要治疗的受试者中治疗疾病的方法。所述方法还包括通过给予治疗有效量的包含药学上可接受的载体和上述方法生产的细胞和/或聚集体的药物组合物，在需要治疗的受试者中治疗疾病的方法。应该理解本文描述的方法适用于多能干细胞以及分化的细胞。

在一些实施方案中，从本文描述的方法获得和/或用于给予受试者的扩增细胞的纯度和/或同质性是约100% (基本上均质的)。在其它实施方案中，从本文描述的方法获得和/或用于给予受试者的扩增细胞的纯度和/或同质性是95%-100%。在一些实施方案中，从本文描述的方法获得和/或用于给予受试者的扩增细胞的纯度和/或同质性是85%-95%。在与其它细胞的混合物的情况下，百分率可以是约10%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%、35%-40%、40%-45%、45%-50%、60%-70%、70%-80%、80%-90%，或90%-95%。

为给定应用给予细胞的制剂的选择将取决于多种因素。其中最突出的将是受试者的物种、要治疗的病症的性质、其在受试者中的阶段和分布、正给予的其它疗法和药物的性质、最佳给药途径、通过该途径的生存性、剂量方案，和对本领域技术人员而言将是显而易见的其它因素。例如，合适的载体和其它添加剂的选择将取决于准确的给药途径和特定剂型的性质。细胞/培养基的水性悬浮液的最终制剂将通常包括调节悬浮液的离子强度至等渗性(即，约0.1-0.2)和至生理pH (即，约pH 6.8-7.5)。最终制剂通常还包含流体润滑剂。

在一些实施方案中，细胞被配制为单位剂量可注射形式，例如溶液、混悬液或乳液。适合于注射细胞的药物制剂通常是无菌水性溶液和分散液。用于可注射制剂的载体可以是溶剂或分散介质，包括例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)，及其合适的混合物。技术人员可容易地确定在本发明的方法中要给予的组合物中的细胞的量和任选的添加剂、媒介和/或载体。

组合物可按剂量并通过医学和兽医领域的技术人员熟知的技术，考虑因素例如具体患者的年龄、性别、体重和病症，和将给予的制剂(如，固体对比液体)给予。

要意识到单剂量可一次全部、分批或在一段时间内连续递送。全部剂量也可递送至单一位置或分批在数个位置散布。

在多个实施方案中，细胞可以初始剂量给予，此后通过进一步给予维持。细胞可通过一种方法初步给予，此后通过相同的方法或一种或多种不同的方法给予。可通过持续给予细胞来维持水平。各个实施方案通过静脉内注射，初始给予细胞，或者给予细胞以维持其在受试者中的水平，或二者。在多个实施方案中，采用其它给药形式，取决于患者的病症和在本文别处讨论的其它因素。用于初始给予和进一步的剂量或用于顺序给予的合适的方案可都是相同的或可以是变化的。适宜的方案可由熟练的技术人员从本公开内容、本文引用的文件和本领域的知识来确定。治疗的剂量、频率和持续时间将取决于许多因素，包括疾病的性质、受试者和可共同给予的其它疗法。在本文描述的任何实施方案中，细胞可以是分化的或未-分化的。在本文描述的任何实施方案中，细胞可以是离解的，或聚集。在本文描述的任何实施方案中，细胞和/或细胞聚集体可包含多能干细胞及其子代的组合。

实施例

材料和方法

材料：在图3-4所示的GE原型搅拌槽反应器中培养聚集体。使用Hyclone Labtainer袋来保存新鲜的培养基作为进料，以及收集用过的培养基。AccutaseTM购自MP Biomedical(CA, USA)；mTeSRTM1培养基购自STEMCELLTM Technology Inc. (Vancouver, BC,Canada)。Y-27632 (ROCK抑制剂)购自Sigma Aldrich (St. Louis, MO)。CT2 hESC从康乃狄克大学健康中心(University of Connecticut Health Center)的Ren-He Xu获得。传代使用的多边形网格切片机和用于重力沉降的管道组件专门为这种应用而生产，且不是通过商业供应商购买的。

方法：在搅拌槽反应器实验之前，人胚胎干细胞经大于5次传代从MatrigelTM改造为悬浮液聚集体。原料细胞被证实是核型正常的。使用AccutaseTM进行连续传代以将聚集体减少为小集群和单个细胞，其在接种后再形成悬浮液聚集体。细胞计数和成活力使用Nucleocounter® NC-200™ (Chemometec, Denmark)测定。

人胚胎干细胞系CT2是在生物反应器培养前从无饲养细胞的细胞原料改造并小规模维持至少5次传代的悬浮液。使用AccutaseTM的酶促传代产生单个细胞和小(<5个细胞)集群的群体。在添加单个细胞/小团块至容器后2-12小时形成聚集体。细胞形成在约50和200 um之间的直径的聚集体。获得在聚集体平均直径上下50 um的聚集体直径的分布是正常的。大多数聚集体落入该尺寸范围内，然而偶尔有一些较大的大约200-400 um的聚集体形成。有利于较小聚集体的条件是优选的，因为在较大的聚集体中营养素可获得性可能是有限的，且较小的聚集体在培养中提供较大的相对扩增。

优选的条件提供具有最小结块的球状聚集体。重要的是平衡生物反应器中的搅拌水平，因为太多的搅拌会导致剪切，包括聚集体变形并产生过多数量的非-聚集的单个细胞。太少的搅拌会导致聚集体的结块。

不是所有的多能细胞系都喜欢相同的培养条件。以下参数用于PSC扩增，本领域技术人员将认识到其它条件也将提供PSC在类似的容器中的扩增：温度37摄氏度、CO₂水平5%、环境O2 (~21%)或减少的O₂水平、40 rpm的连续或非连续的搅拌速度。

用于重力沉降的管道组件和在非-灌注袋中的培养基交换：

搅拌槽生物反应器上的管道组件的概念构造示于图1-4中。所述组件提供以下功能，包括但不限于以下：(1) 去除细胞/细胞培养基混合物，(2) 细胞聚集体与流出的细胞培养基分离，(3) 添加细胞培养基，和(4) 去除细胞培养基。

细胞聚集体/细胞培养基混合物的去除通过使用汲取管(dip tube)完成。汲取管应具有足够的长度/方向，以致在它被安装并投入运行时细胞/培养基可从生物反应器去除。从流出培养基分离细胞聚集体通过引入具有足够的长度(高度)和直径的重力沉降室以在培养基去除期间确保足够的重力沉降实现。这个室的设计不限于大直径管；对于令人满意的细胞聚集体分离，如果需要的话，也可以将曲折的路径整合。一个或一个以上的平行运行的管道组件可与生物反应器相关联，以增加培养基去除/添加的速率。用于流体添加/去除的管道需要具有足够的长度以确保实现与培养基/废物容器的连接。流体去除通过抽出培养基经过流体去除途径，同时保持流体添加途径关闭来实现。流体添加通过注入新鲜培养基经过流体添加途径，同时保持流体去除途径关闭来实现。图1-4的概念设计描述了不连续灌注方法，其中有交替的培养基去除和培养基添加。所述概念的另一个实施方案是一种连续的灌注方法，其中单独的管道用于无滤器培养基去除和培养基添加。

对于不连续灌注，软件控制调节特定量的用过的培养基的去除和新鲜培养基的添加。这种方法通常独立于容器重量。优选地，根据预定的进料进度表，除去预定体积的用过的培养基，接着推注添加一定体积的新鲜培养基。例如，进料进度表可以设定为每2小时除去50 mL用过的培养基，接着添加50 mL新鲜培养基。

自搅拌槽生物反应器的无滤器灌注。CT2人胚胎干细胞按每mL约600,000个细胞(约97%成活力)在GE原型搅拌槽生物反应器中以250 mL作为悬浮液聚集体培养，并以约40rpm搅拌。在其它实验中，悬浮液聚集体以40-75 rpm搅拌。生物反应器中的聚集体尺寸范围在约100 um-约300 um (图12)。重力沉降室以约45度角倾斜并沿着生物反应器的内部边缘运行。管道内径是3/32”。无滤器灌注组件的设计如图3和4中所述，并使用过的培养基去除和新鲜的培养基添加成为可能。相同的管道中的新鲜培养基添加将管道内保留的任何聚集体转移返回主要生物反应器室。使用0.2ml/min-0.4 mL/min的流速从生物反应器除去培养基和8 mL/min的流速添加新鲜培养基来交换约150 mL/天。培养基交换不是连续的；而是交换30 mL，每天5次。在培养结束时，在废物中以45%成活力仅发现一千三百万个细胞(主要为单细胞)，表明废物中几乎没有细胞损失。

切片机设计：

切片机可由多种生物相容材料组成。材料必须易于消毒，并具有使其经受细胞样本流动过程中经历的应力的机械强度。对多能干细胞聚集体传代测试的两种材料是镍合金和硅。本领域技术人员将认识到其它材料具有对于聚集体传代使所需的切片机性能成为可能的性质。切片机被设计具有多边形网格状图案，例如方形或六边形网格，网格壁之间的间隔为50微米-400微米。在一些实验中，切片机用疏水性材料涂布以减少剪切和污染。对于下述的多能干细胞聚集体传代实验，使用具有100 um间隔的方形和六边形网格。在封闭系统中切片机与管道对齐安装，这允许聚集体的无菌流通过管道和穿越切片机。切片机可通过各种紧固机制整合到封闭系统中，所述紧固机制包括但不限于粘合剂、熔化聚合物流或夹紧。在一个优选的方法中，聚集体通过由泵驱动的循环回路和在线锥形袋被维持于悬浮液中(图8)。导向切片机的管道被连接到主循环回路，该循环回路中的一部分细胞聚集体通过以低于控制该循环回路的泵的速度运行的第二个泵递送到切片机。切开的聚集体可收集在一个单独的容器中，或重新引入同一个容器。

在细胞聚集体传代期间的切片机性能：

聚集体以由100 mL-1L体积组成的流动液流通过切片机。与酶促传代的比较，切片机的益处是减少时间、劳动力和试剂。通过以单向或双向流一次或多次穿过切片机，实现降至大约100um尺寸的成功切割。控制流速以最大限度地减少剪切。在以15-150 mL/min的流速通过切片机的多能干细胞聚集体上证实用于减少尺寸、维持细胞成活力和随后扩增的聚集体切割性能。本领域技术人员将认识到良好的性能也可以其它流速获得。确定用来通过切片机的细胞聚集体浓度影响切割的高成活力细胞聚集体的回收率。切片机的污染可导致细胞回收率和成活力下降。确定与大于约3 x 10^6个细胞/mL的细胞浓度相比，低于约3 x 10^6个细胞/mL的细胞聚集体浓度的切割以更高回收率产生更高成活力的样本。通过例如使用在图8中所示的混合装置，维持在流动液流中均匀的聚集体悬浮液最大限度地减少污染，导致更高的细胞成活力和回收率。切开的聚集体的样本图像示于图9中。切割后的聚集体形态学包括不规则的形状、立方体形状和球形。对于100 um切片机，聚集体的至少一个维度减少至大约100um直径。切开的聚集体在mTeSR1和任选地1-10 uM Y27632 ROCK抑制剂中培养并允许扩增。与通常需要试剂例如Y27632 ROCK抑制剂以维持单个多能细胞的成活力的酶促传代的多能干细胞聚集体不同，对于切开的多能干细胞聚集体的扩增并不需要Y27632ROCK抑制剂。切开的聚集体的形态学在培养条件下快速再形成球形。切开的聚集体的扩增率类似于酶促传代的细胞的扩增率(图10和11)。聚集体可通过切片机传代，无需对于酶促传代所需的PBS洗涤，因此通过切割传代耗费比酶促传代更少的时间和更少的总体劳动。本领域技术人员将认识到，切片机功能和性能不依赖于Xuri Cellbag生物反应器平台，与其它类型的生物反应器包括但不限于其它摇摆运动、旋转运动或轨道运动平台或搅拌槽生物反应器相容。

虽然仅本发明的某些特征在此得到说明和描述，但本领域技术人员将会想到许多修饰和变化。因此，要理解打算使所附的权利要求书覆盖所有这样的落入本发明真正精神范围内的修饰和变化。

Claims (18)

1.一种在封闭系统中扩增细胞聚集体的方法，其包括

提供细胞培养容器；

在容器中形成聚集体；

在容器中自动灌注细胞聚集体；

在灌注过程中重力沉降细胞聚集体；和

在封闭系统中收获聚集体和传代。

2.权利要求1的方法，其中在封闭系统中传代在Rho-相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂的存在下进行。

3.权利要求1的方法，其中在封闭系统中传代基本上在维持传代的、单分散的或解聚的多能细胞的成活力的试剂不存在下进行。

4.权利要求3的方法，其中维持多能细胞的成活力的试剂是Rho-相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂。

5.以上权利要求的一项或多项的方法，其中扩增的细胞聚集体包含人多能干细胞。

6.以上权利要求的一项或多项的方法，其中细胞培养容器是搅拌槽生物反应器。

7.以上权利要求的一项或多项的方法，其中所述自动灌注在封闭系统中在没有人为干预的情况下进行。

8. 以上权利要求的一项或多项的方法，其中重力沉降室的长度是至少1 cm且定位在驱动细胞聚集体的重力沉降的方向。

9.以上权利要求的一项或多项的方法，其中自动灌注以允许约100微米-约800微米直径的细胞聚集体重力沉降的速率进行。

10.以上权利要求的一项或多项的方法，其还包括通过执行连续传代，对细胞聚集体或其子代进行一次或多次额外扩增。

11.以上权利要求的一项或多项的方法，其中细胞聚集体的连续传代能够在封闭系统中使用切片机网格，通过无酶传代进行。

12.权利要求11的方法，其中细胞聚集体用具有刀片的切片机网格离解，所述刀片分隔约20-约500微米的距离，例如约100微米的距离。

13.权利要求11或12的方法，其中细胞聚集体用对齐管道的切片机网格和用于混合细胞聚集体的装置离解。

14.权利要求11、12或13的方法，其中切片机用疏水性材料涂布或包含疏水性材料。

15.以上权利要求的一项或多项的方法，其中每个扩增的细胞聚集体的平均直径大小不超过约800微米，例如大小不超过约500微米。

16. 以上权利要求的一项或多项的方法，其中培养容器的体积是约50 mL-约100 L。

17.一种在封闭系统中扩增细胞聚集体的方法，其包括

提供搅拌槽生物反应器容器；

在容器中形成聚集体；

在容器中自动灌注细胞聚集体；

在灌注过程中重力沉降细胞聚集体；

收获聚集体和无酶切割细胞聚集体；和

在封闭系统中传代。

18.权利要求17的方法，其中在封闭系统中传代基本上在维持传代的、单分散的或解聚的多能细胞的成活力的试剂不存在下进行。