WO2020189417A1 - 培養システム及び培養方法 - Google Patents

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WO2020189417A1
WO2020189417A1 PCT/JP2020/010322 JP2020010322W WO2020189417A1 WO 2020189417 A1 WO2020189417 A1 WO 2020189417A1 JP 2020010322 W JP2020010322 W JP 2020010322W WO 2020189417 A1 WO2020189417 A1 WO 2020189417A1
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WO
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culture
valve
separation tank
tank
solution
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/010322
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
石川周太郎
新井進
林大輔
志村祐作
Original Assignee
エイブル株式会社
住友ベークライト株式会社
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Publication date
Application filed by エイブル株式会社, 住友ベークライト株式会社 filed Critical エイブル株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology

Definitions

  • the present invention relates to a technique for culturing cells by perfusion culture.
  • Fed batch culture is known as a mainstream method for producing products by cells such as pharmaceuticals for antibodies.
  • cells are cultured in a medium containing cell nutrients, and specific components in the medium or medium are added to optimize proliferation and maintain productivity by diluting waste products. This is the culture method to be performed.
  • perfusion culture has attracted attention because it has a higher running cost than fed-batch culture, but can increase the cell density in the medium and increase the productivity of products.
  • Perfusion culture is a culture method in which cells are cultured in a culture tank containing a culture medium containing a medium, and the culture medium is perfused to extract products produced by the cells from the culture medium.
  • membrane separation such as TFF (Tangential Flow Filtration) and ATF (Alternating Tangential Flow), and AWS (Acoustic Wave Separation) using ultrasonic waves are used. ), Centrifugal separation, etc.
  • WO 2014/051503 discloses a tangential flow perfusion system equipped with a filter unit for filtration in which a plurality of membranes define a holding liquid side and a permeate side. Has been done.
  • the filter unit separates the cells that are returned to the culture tank from the substances that are taken out of the culture medium.
  • a device for cell culture provided with a culture tank and an acoustic standing wave cell separator.
  • the acoustic standing wave cell separator has an ultrasonic piezoelectric tone reducer that generates an acoustic standing wave and an acoustic resonance chamber.
  • the culture medium containing the cells passes through the acoustic resonance chamber, the cells are held by the nodes of the acoustic standing wave, and the culture medium from which the cells have been removed can be taken out from the acoustic chamber.
  • a rotating device is provided in the separation device, and cells are separated by the density difference of substances using centrifugal force.
  • membrane separation can have high separation ability by selecting an appropriate membrane.
  • the membrane when cells are cultured for a long period of time, the membrane may be clogged, maintenance is required in a relatively short period of time, and replacement of the membrane may result in high cost. Centrifugation using the difference in the density of substances can efficiently separate cells in a short time, but the structure of the separation device tends to be complicated. In addition, AWS using ultrasonic waves tends to increase the cost of the culture system.
  • a culture tank containing a medium and a culture solution containing the cells and culturing the cells, and the culture solution are allowed to stand.
  • a separation tank that separates the culture solution into a supernatant solution and a precipitate solution containing the cells by gravity sedimentation, a first connection path and a second connection path connecting the culture tank and the separation tank, and the separation tank.
  • a recovery path for collecting the supernatant liquid, and a control unit for controlling the flow of the culture solution, the supernatant liquid, and the precipitate liquid are provided, and the control unit is provided from the culture tank to the control unit.
  • the culture solution is allowed to flow into the separation tank through the first connection path, and after the culture solution is allowed to stand, the supernatant solution is discharged from the separation tank through the recovery path, and then the precipitate solution is poured. It is returned from the separation tank to the culture tank through the second connecting path.
  • the upper supernatant liquid is first discharged from the separation tank, and then the lower precipitate liquid is discharged.
  • the lower precipitate liquid is drained first, so that the supernatant liquid and the precipitate liquid are precipitated even though the culture solution is allowed to stand to separate the supernatant liquid and the precipitate liquid. Some may mix with the liquid.
  • the upper supernatant is discharged first, the lower precipitate is relatively difficult to flow. Therefore, the supernatant and the precipitate can be appropriately discharged from the separation tank independently.
  • the recovery path has an opening that is arranged in the separation tank and is open upward in the vertical direction rather than the horizontal direction.
  • the opening is open downward, a partial flow of the culture solution from the bottom to the top is finally generated in the process of the culture solution flowing into the recovery path in the separation tank. Therefore, the sediment liquid below the separation tank may flow upward along the flow and flow out from the recovery path.
  • the opening is opened upward in the vertical direction rather than the horizontal direction, a part of the culture solution flowing from the upper side to the lower side in the separation tank is directly sent to the collection path. Inflow. Therefore, the supernatant can be discharged from the recovery path without being mixed with the precipitate.
  • the recovery path has such an opening
  • the recovery path has a main portion arranged in the separation tank and a bent portion bent from the main portion, and the opening. It is preferable that the portion is provided at the tip of the bent portion.
  • the opening is provided at the tip of the bent portion bent from the main portion of the recovery path and the suction force from the tip of the recovery path or the pressing force from the separation tank does not act, the supernatant liquid Is difficult to distribute through the collection route. Therefore, the supernatant can be appropriately drained from the separation tank after the culture solution has been sufficiently allowed to stand.
  • the recovery path has a main portion, a bent portion bent from the main portion, and an opening provided at the tip of the bent portion in the separation tank, and the opening has an opening.
  • the bent portion is formed in a hook shape.
  • the hook shape is bent so that the extending direction of the main portion inside the separation tank and the opening direction of the opening are approximately 180 ° (between greater than 90 ° and less than 270 °).
  • the shape is.
  • the shape is not limited to a shape that bends at an angle, but also includes a shape that bends with an arc.
  • the culture system determines the connection state between the separation tank and the recovery path, the atmospheric pressure pump that adjusts the internal pressure of the separation tank, the first valve that switches the connection state between the separation tank and the first connection path, and the connection state between the separation tank and the recovery path.
  • a second valve for switching and a third valve for switching the connection state between the separation tank and the second connection path are further provided, and the control unit includes the atmospheric pressure pump, the first valve, the second valve, and the control unit. It is preferable to control the flow of the culture solution, the supernatant solution, and the precipitate solution by controlling the third valve.
  • the internal pressure of the separation tank is adjusted by the atmospheric pressure pump, so that the culture solution flows into the separation tank and is above the separation tank.
  • the outflow of clean liquid and the outflow of sediment from the separation tank are controlled. That is, the structure of the culture system is smaller than the structure in which the fluid pumps are provided in each of the first connection path, the second connection path, and the recovery path.
  • the control unit reduces the internal pressure of the separation tank by the atmospheric pressure pump in a state where the first valve is opened and the second valve and the third valve are closed to separate the culture tank from the culture tank.
  • the internal pressure of the separation tank is increased by the atmospheric pressure pump to increase the internal pressure of the separation tank from the separation tank.
  • the third valve being opened, and the first valve and the second valve being closed, the internal pressure of the separation tank is increased by the atmospheric pressure pump to raise the separation tank. It is preferable to let the precipitate liquid flow out from the culture tank.
  • the culture solution can flow only through the first connection path.
  • the culture solution (supernatant solution) can flow only through the recovery path.
  • the culture solution (precipitate solution) can flow only through the second connection path.
  • the first valve, the second valve, and the third valve are common switching valves in which any two are in the closed state and the other one is in the open state.
  • the configuration of the culture system becomes smaller than the case where independent first valve, second valve, and third valve are provided.
  • first connection path and the second connection path are one common connection path, and the culture system adjusts the internal pressure of the separation tank, the separation tank and the above.
  • a first valve for switching the connection state with the connection path and a second valve for switching the connection state between the separation tank and the recovery path are further provided, and the control unit comprises the atmospheric pressure pump, the first valve, and the first valve. It is preferable to control the flow of the culture solution, the supernatant solution, and the precipitate solution by controlling the second valve.
  • the first connection path and the second connection path are flow paths that connect the culture tank and the separation tank, although the flow directions of the culture solution (including the precipitate solution) are different. Therefore, by making the first connection path and the second connection path a common connection path, the configuration of the culture system can be reduced in scale.
  • the first valve and the second valve and adjusting the internal pressure of the separation tank by the atmospheric pressure pump by cooperating with the first valve and the second valve and adjusting the internal pressure of the separation tank by the atmospheric pressure pump, the inflow of the culture solution into the separation tank, the outflow of the supernatant liquid from the separation tank, and the outflow of the supernatant liquid from the separation tank The outflow of the sediment is controlled. That is, the structure of the culture system is smaller than the structure in which the fluid pumps are provided in each of the connecting path and the recovery path.
  • control unit reduces the internal pressure of the separation tank by the atmospheric pressure pump in a state where the first valve is opened and the second valve is closed, and the culture solution is transferred from the culture tank to the separation tank.
  • the internal pressure of the separation tank is increased by the atmospheric pressure pump to allow the supernatant liquid to flow out from the separation tank to the recovery path.
  • the internal pressure of the separation tank is increased by the atmospheric pressure pump to allow the precipitate liquid to flow out from the separation tank to the culture tank in a state where the first valve is opened and the second valve is closed. ..
  • the culture solution (including the precipitate solution) can flow only through the connecting path.
  • the culture solution (supernatant solution) can flow only through the recovery path.
  • the culture solution can be appropriately passed through the one flow path.
  • the culture solution can be circulated.
  • the distribution direction can be switched by controlling the internal pressure of the separation tank with an atmospheric pressure pump. As described above, according to this configuration, the culture solution can be appropriately distributed by simple control.
  • first valve and the second valve are common switching valves that complementarily enter the closed state and the open state.
  • the configuration of the culture system becomes smaller than the case where the first valve and the second valve are provided independently.
  • the various technical features of the culture system described above can also be applied to the culture method.
  • a typical embodiment thereof is illustrated below.
  • the culturing method can have various steps having the characteristics of the culturing system described above.
  • these culture methods can also exert the effects of the above-mentioned culture system.
  • the various additional features described above can also be incorporated into the culture method, and the culture method can also exert actions and effects corresponding to the respective additional features.
  • the culturing method includes a culture tank containing a culture solution containing a medium and cells and culturing the cells, and the supernatant solution and the cells by gravity sedimentation while the culture solution is allowed to stand.
  • a separation tank that separates the culture solution from the sediment, a first connection path and a second connection path that connect the culture tank and the separation tank, and the supernatant are connected to the separation tank to collect the supernatant.
  • a culture method in which the cells are cultured by perfusion culture using a culture apparatus provided with a recovery path, wherein the culture solution is allowed to flow from the culture tank through the first connecting path into the separation tank.
  • the first step Following the first step, the first step, the second step of allowing the culture solution to stand, and the second step, the third step of flowing out the supernatant from the separation tank through the recovery path. And a fourth step of returning the precipitate liquid from the separation tank to the culture tank through the second connection path, following the third step.
  • the upper supernatant is discharged from the separation tank, and then the lower precipitate is discharged.
  • the lower precipitate liquid also flows, so that the supernatant liquid and the precipitate liquid are precipitated even though the culture solution is allowed to stand to separate the supernatant liquid and the precipitate liquid. Some may mix with the liquid.
  • the upper supernatant is discharged first, the lower precipitate is relatively difficult to flow. Therefore, the supernatant and the precipitate can be appropriately discharged from the separation tank independently. Further, when returning the precipitate solution from the separation tank to the culture tank, all the culture solutions remaining in the separation tank can be returned.
  • Block diagram schematically showing an example of a culture system Block diagram schematically showing another example of the culture system The figure which shows typically the structure of the separation tank and the recovery path in a separation tank.
  • FIGS. 1 and 2 are block diagrams schematically showing an example of a culture system
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing a separation tank and a configuration of a recovery path in the separation tank.
  • the culture system 100 cultures cells by perfusion culture and recovers the products produced by the cells.
  • Perfusion culture is a culture method in which a culture solution containing cells and a medium is circulated outside the culture tank, products produced by the cells are extracted in the middle, and the cells are returned to the culture tank.
  • the objects to be extracted are, for example, antibodies against pathogens (products to be used), waste products due to cell activity (products to be discarded), dead cells, and the like.
  • the culture system 100 includes a culture medium storage tank 5, a culture tank 3, a separation tank 4, a processing device 6, and a control unit 7.
  • the culture solution containing the cells and the medium is circulated outside the culture tank, and the products produced by the cells are extracted in the middle of the culture, and the cells are returned to the culture tank.
  • the culture system 100 illustrated in FIG. 1 the first culture system 101 when distinguished from FIG. 2
  • the culture tank 3 the first connection path 1A, the separation tank 4, the second connection path 1B, and the culture tank 3
  • the culture solution 30 circulates in the route.
  • the product or the like is extracted from the separation tank 4 through the recovery path 2 in the middle of the route.
  • the culture system 100 exemplified in FIG. 2 second culture system 102 when distinguished from FIG.
  • the culture solution is routed through the culture tank 3, the connection path 1, the separation tank 4, the connection path 1, and the culture tank 3. 30 circulates.
  • the product and the like are extracted from the separation tank 4 in the middle of the route via the recovery path 2 in the same manner as in the first culture system 101.
  • the culture tank 3 contains the cells to be cultured and the culture solution 30 containing the medium 50 having the nutrients necessary for culturing the cells, and cultivates the cells.
  • a small culture system such as that used in a laboratory or a laboratory, for example, a flask, a culture bag, a bioreactor, or the like can be used as the culture tank 3.
  • the culture solution 30 is allowed to stand and the culture solution 30 is separated into the supernatant solution 41 and the precipitation solution 42 containing cells by gravity sedimentation.
  • the supernatant solution 41 is the culture solution 30 in which the density of cells contained in the solution is relatively low
  • the precipitate solution 42 is the cells contained in the solution.
  • 30 is a culture solution having a relatively high density of. Therefore, the supernatant 41 does not necessarily contain cells at all, and the supernatant 41 may contain cells.
  • a dead cell ruptures and exists as debris (cell debris) with respect to a living cell.
  • cell products antibodies, waste products, etc.
  • the sedimentation rate of the substance in the liquid tends to increase as the diameter of the particle increases. That is, the living cells to be returned to the culture tank 3 and reused settle in the culture medium 30 at a higher sedimentation rate than the cell debris and products of the dead cells. Therefore, by appropriately controlling the standing time of the culture solution 30 in the separation tank 4, the precipitate solution 42 containing a large amount of living cells and the living cells containing a large amount of cell debris and products of dead cells.
  • the culture solution 30 can be separated from the supernatant solution 41 having a small amount of water.
  • Gravity sedimentation refers to a method of separating substances in a fluid by utilizing sedimentation rates that differ depending on the substance.
  • the culture tank 3 and the separation tank 4 are connected by the first connection path 1A and the second connection path 1B.
  • the culture tank 3 and the separation tank 4 are connected by a connection path 1.
  • a recovery path 2 for collecting the supernatant 41 is connected to the separation tank 4.
  • the recovery path 2 is connected to the processing device 6, and the culture tank 3 is connected to the medium storage tank 5 via the fluid pump 15.
  • the processing device 6 is a processing device that extracts a product to be used, such as an antibody against a pathogen, from the supernatant 41 extracted from the culture solution 30. Waste products and dead cells due to cell activity are discarded.
  • the medium storage tank 5 stores the fresh medium 50.
  • the medium 50 contained in the culture solution 30 in the culture tank 3 is consumed by feeding the cells with nutrients. Therefore, the fresh medium 50 is replenished from the medium storage tank 5, and the amount of the culture solution 30 in the culture tank 3 and the nutrients necessary for culturing the cells are maintained.
  • the processing device 6 may simply be a container for storing the supernatant liquid 41.
  • a peristaltic pump for example, a peristaltic pump (peristaltic pump, tube pump, roller pump) that sends a fluid by peristalticizing a tube with a roller can be used.
  • a magnetic levitation type pump magnet pump
  • the impeller of the pump is housed in a closed case and magnetism is applied from the outside of the closed case to rotate the impeller in a non-contact manner. Is.
  • the control unit 7 is configured with, for example, a microcomputer as the core, and controls the flow of the culture solution 30, the supernatant solution 41, the precipitate solution 42, and the medium 50.
  • the control unit 7 is realized by the cooperation between hardware such as a microcomputer and software such as programs and parameters.
  • the first culture system 101 will be described. As described above, in the first culture system 101, the culture tank 3 and the separation tank 4 are connected by the first connection path 1A and the second connection path 1B.
  • the control unit 7 causes the culture solution 30 to flow from the culture tank 3 through the first connection path 1A into the separation tank 4, and after allowing the culture solution 30 to stand, the supernatant solution 41 passes through the recovery path 2 from the separation tank 4. Is then controlled so that the sediment 42 is returned from the separation tank 4 to the culture tank 3 through the second connecting path 1B. That is, in the first culture system 101, the following four steps (first step # 1 to fourth step # 4) are mainly carried out.
  • the first step # 1 is a step of inflowing the culture solution 30 from the culture tank 3 into the separation tank 4 through the first connection path 1A.
  • the second step # 2 is a step following the first step # 1 in which the culture solution 30 is allowed to stand in the separation tank 4 for a predetermined time (for example, 30 minutes to 120 minutes).
  • the third step # 3 is a step following the second step # 2 in which the supernatant 41 is discharged from the separation tank 4 through the recovery path 2.
  • the fourth step # 4 is a step of returning the precipitate liquid 42 from the separation tank 4 to the culture tank 3 through the second connection path 1B, following the third step # 3.
  • the fifth step # 5 of replenishing the culture medium 50 from the medium storage tank 5 to the culture tank 3 may be carried out.
  • the first culture system 101 is connected to the separation tank 4 via a gas flow path 8, a pressure pump 18 for adjusting the internal pressure of the separation tank 4, and the separation tank 4 and the first connection path 1A.
  • the first valve 11 that switches the connection state with the separation tank 4, the second valve 12 that switches the connection state between the separation tank 4 and the recovery path 2, and the third valve 13 that switches the connection state between the separation tank 4 and the second connection path 1B.
  • the control unit 7 controls the flow of the culture solution 30, the supernatant solution 41, and the precipitate solution 42 by controlling the barometric pressure pump 18, the first valve 11, the second valve 12, and the third valve 13.
  • the control unit 7 applies the internal pressure of the separation tank 4 by the atmospheric pressure pump 18 in a state where the first valve 11 is opened and the second valve 12 and the third valve 13 are closed.
  • the culture solution 30 is lowered from the culture tank 3 to the separation tank 4.
  • the atmospheric pressure pump 18 is also stopped, and the culture solution 30 is allowed to stand in the separation tank 4. (As will be described later, since the atmospheric pressure pump 18 is stopped, all three valves do not necessarily have to be in the closed state).
  • the internal pressure of the separation tank 4 is increased by the atmospheric pressure pump 18, and the recovery path 2 is taken from the separation tank 4.
  • the supernatant 41 is drained to the water.
  • the fourth step # 4 with the third valve 13 being opened and the first valve 11 and the second valve 12 being closed, the internal pressure of the separation tank 4 is increased by the atmospheric pressure pump 18, and the separation tank 4 to the culture tank 3 are used.
  • the sediment 42 is allowed to flow out.
  • the culture solution 30 can be circulated through the path. That is, the culture solution 30 can be appropriately distributed by simple control.
  • first valve 11, the second valve 12, and the third valve 13 are not opened at the same time, and one of them is opened and the other two are opened.
  • the first valve 11, the second valve 12, and the third valve 13 are common first switching valves 10A (switching valves 10) in which any two are in the closed state and the other one is in the open state. be able to.
  • the first switching valve 10A may be in a state of being completely closed.
  • the 1 switching valve 10A does not necessarily have to be in a state in which all of the switching valves 10A are closed.
  • the second step # 2 can also be carried out in a state where all three valves are not blocked. Specifically, with at least one of the first valve 11, the second valve 12, and the third valve 13 closed, the atmospheric pressure pump 18 is also stopped, and the culture solution 30 is allowed to stand in the separation tank 4. You may. For example, the first valve 11 and the third valve 13 connecting the culture tank 3 and the separation tank 4 may be closed, and the second valve 12 connecting the separation tank 4 and the recovery path 2 may be opened. In the second step, since the atmospheric pressure pump 18 is stopped, the culture solution 30 (supernatant solution 41) does not flow out from the separation tank 4 to the recovery path 2 even if the second valve 12 is opened.
  • the state in which the first valve 11 and the third valve 13 are closed and the second valve 12 is open is the state of the valve in the third step # 3
  • the process from the second step # 2 to the third step # 3 Control at the time of transition can be simplified.
  • the state of the valve in the second step # 2 may be set according to the structure of the culture system 100. For example, when the first valve 11 and the third valve 13 are provided below the separation tank 4 and the recovery path 2 is provided above the separation tank 4, the culture solution 30 is easily moved by gravity. The valve 11 and the third valve 13 may be closed, and the second valve 12 in which the culture solution 30 is difficult to move due to gravity may be opened.
  • the second culture system 102 will be described.
  • the culture tank 3 and the separation tank 4 are connected by one connection path 1.
  • the control unit 7 causes the culture solution 30 to flow from the culture tank 3 through the connection path 1 into the separation tank 4, and after the culture solution 30 is allowed to stand, the supernatant solution 41 flows out from the separation tank 4 through the recovery path 2.
  • the precipitate solution 42 is controlled to be returned from the separation tank 4 to the culture tank 3 through the connecting path 1. That is, in the second culture system 102, the following four steps (first step # 1 to fourth step # 4) are mainly carried out.
  • the names and codes of the steps are the same as those of the first culture system 101.
  • the first step # 1 is a step of flowing the culture solution 30 from the culture tank 3 into the separation tank 4 through the connecting path 1.
  • the second step # 2 is a step following the first step # 1 in which the culture solution 30 is allowed to stand in the separation tank 4 for a predetermined time (for example, 30 minutes to 120 minutes).
  • the third step # 3 is a step following the second step # 2 in which the supernatant 41 is discharged from the separation tank 4 through the recovery path 2.
  • the fourth step # 4 is a step of returning the precipitate liquid 42 from the separation tank 4 to the culture tank 3 through the connecting path 1 following the third step # 3.
  • the fifth step # 5 of replenishing the culture medium 50 from the medium storage tank 5 to the culture tank 3 may be carried out.
  • the second culture system 102 is connected to the separation tank 4 via the gas flow path 8, and the atmospheric pressure pump 18 for adjusting the internal pressure of the separation tank 4 and the separation tank 4 and the connection path 1 are connected to each other.
  • a first valve 11 for switching the connection state and a second valve 12 for switching the connection state between the separation tank 4 and the recovery path 2 are provided.
  • the control unit 7 controls the flow of the culture solution 30, the supernatant solution 41, and the precipitate solution 42 by controlling the atmospheric pressure pump 18, the first valve 11, and the second valve 12.
  • the first valve 11 of the first culture system 101 and the first valve 11 of the second culture system are the same. It may be. However, in the case of having a function of regulating the flow direction such as a check valve, the first valve 11 of the first culture system 101 and the first valve 11 of the second culture system may be different. .. In such a case, the first valve 11 of the first culture system 101 is referred to as the first valve 11A of the first culture system, and the first valve 11 of the second culture system 102 is referred to as the second culture system first. It is referred to as valve 11B. In this case, the second culture system first valve 11B has both the first culture system first valve 11A and the third valve 13. Regarding the second valve 12, in any case, the same valve may be used in the first culture system 101 and the second culture system 102.
  • the culture tank 3 and the separation tank 4 are connected by two flow paths (first connection path 1A and second connection path 1B). It differs in that it is connected by one flow path (connection path 1). That is, in the second culture system 102, the first connection path 1A and the second connection path 1B in the first culture system 101 are one common connection path 1. Further, for this reason, the first culture system 101 includes three valves (first valve 11, second valve 12, and third valve 13), whereas the second culture system 102 has two valves (first valve). 11. Only the second valve 12) is provided. Therefore, the system configuration of the second culture system 102 is smaller than that of the first culture system 101.
  • the control unit 7 reduces the internal pressure of the separation tank 4 by the atmospheric pressure pump 18 in a state where the first valve 11 is opened and the second valve 12 is closed, and the connection path 1 is connected to the culture tank 3.
  • the culture solution is allowed to flow into the separation tank 4 through the separation tank 4.
  • the atmospheric pressure pump 18 is also stopped, and the culture solution 30 is allowed to stand in the separation tank 4 (as described later).
  • the culture solution 30 can be circulated through the path. That is, the culture solution 30 can be appropriately distributed by simple control.
  • the first valve 11 and the second valve 12 have a common second switching valve 10B (switching valve 10) in which one of them is in the closed state and the other is in the open state, that is, in a complementary closed state and It can be a common second switching valve 10B that is in an open state.
  • the second switching valve 10B may be in a state in which both are closed.
  • valve 10B does not necessarily have to be in a state in which both sides are closed.
  • the second step # 2 can also be carried out in a state where both valves are not blocked. Specifically, the pressure pump 18 may be stopped and the culture solution 30 may be allowed to stand in the separation tank 4 with at least one of the first valve 11 and the second valve 12 closed. For example, the first valve 11 connecting the culture tank 3 and the separation tank 4 may be closed, and the second valve 12 connecting the separation tank 4 and the recovery path 2 may be opened. In the second step, since the atmospheric pressure pump 18 is stopped, the culture solution 30 (supernatant solution 41) does not flow out from the separation tank 4 to the recovery path 2 even if the second valve 12 is opened.
  • the state in which the first valve 11 is closed and the second valve 12 is open is the state of the valve in the third step # 3
  • control when transitioning from the second step # 2 to the third step # 3 is performed. Can be simplified.
  • the state of the valve in the second step # 2 may be set according to the structure of the culture system 100. For example, when the first valve 11 is provided below the separation tank 4 and the recovery path 2 is provided above the separation tank 4, the first valve 11 where the culture solution 30 can easily move is blocked by gravity. The second valve 12, which is difficult for the culture solution 30 to move due to gravity, may be opened.
  • the separation tank 4 is a closed airtight container. is there.
  • the airtightness means a state in which air is maintained so as not to flow between the inside and the outside of the separation tank 4 if the internal pressure or the external pressure of the separation tank 4 is within a predetermined value.
  • the predetermined value at this time is preferably a pressure at which the culture solution 30 can be circulated through the flow path.
  • the recovery path 2 is provided in the main section 2a and the main section 2a in the separation tank 4. It is preferable to have a bent portion 2b bent from the ground and an opening 2c provided at the tip of the bent portion. Then, as shown in FIG. 3, it is preferable that the opening 2c is opened in the vertical direction Y above the horizontal direction X. As a matter of course, the structure in which the recovery path 2 is not bent in this way is not hindered, and the opening 2c in the separation tank 4 of the recovery path 2 is open downward in the vertical direction Y. It doesn't interfere. Further, in FIG.
  • the culture solution 30 finally flows in the recovery path 2 in the separation tank 4 and is finally cultured along the downward direction.
  • a flow of liquid 30 occurs partially. Therefore, the precipitate liquid 42 located below the separation tank 4 may flow upward along the flow, and a part of the separated supernatant liquid 41 and the precipitate liquid 42 may be mixed. Then, a part of the precipitate liquid 42 may flow out from the recovery path 2.
  • the opening 2c is opened upward, a part of the culture solution 30 flowing in the direction from the upper side to the lower side in the separation tank 4 flows into the recovery path 2 as it is. ..
  • the supernatant liquid 41 can be discharged from the recovery path 2 without being mixed with the precipitate liquid 42. Further, when the opening 2c is provided at the tip of the bent portion 2b bent from the main portion 2a of the recovery path 2, the suction force from the tip of the recovery path 2 or the pressing force from the separation tank 4 acts. Otherwise, the supernatant 41 will not easily flow through the recovery path 2. Therefore, the supernatant solution 41 can be appropriately discharged from the separation tank after the culture solution 30 is sufficiently allowed to stand.
  • the bent portion 2b of the recovery path 2 is formed in a hook shape.
  • the hook shape means that the extending direction of the main portion 2a inside the separation tank 4 and the opening direction of the opening 2c are approximately 180 ° (between greater than 90 ° and less than 270 °). It has a bent shape.
  • the shape of the bent portion 2b is not limited to the shape of being bent at an angle as shown in the schematic block diagram of FIGS. 1 and 2, but also the shape of being bent with an arc as shown in FIG. Including.
  • the supernatant liquid 41 When the bent portion 2b is formed in a hook shape in this way, as described above, if the suction force from the tip of the recovery path 2 or the pressing force from the separation tank does not act, the supernatant liquid 41 will be It is difficult to distribute the collection path 2. Therefore, the supernatant solution 41 can be appropriately drained from the separation tank 4 after the culture solution 30 is sufficiently allowed to stand.
  • the position of the opening 2c in the vertical direction Y is preferably 10 to 60% of the length along the vertical direction Y from the liquid level when the culture solution 30 is allowed to stand to the bottom of the separation tank 4. It is preferable that the position is 20 to 50% lower than the liquid level.
  • the supernatant liquid 41 can be discharged through the recovery path 2 until the height at which the opening 2c is located reaches the liquid level. Therefore, it is preferable that the opening 2c is set at the boundary position where it is considered that the supernatant liquid 41 and the precipitate liquid 42 can be sufficiently separated by the second step # 2 described above.
  • the separation tank 4 is installed so as to be inclined with respect to the vertical direction Y.
  • the inclination angle ⁇ (angle with respect to the horizontal direction X) at this time is, for example, 45 ° to 60 °.
  • the separation tank 4 is inclined in this way, the cells settle toward the inclined surface 4a along the vertical direction Y and easily move downward in the vertical direction Y along the inclined surface 4a. Therefore, the cells can be precipitated in a shorter time, and the culture solution 30 can be efficiently separated into the precipitate solution 42 and the supernatant solution 41.
  • connection path 1 connecting the culture tank 3 and the separation tank 4 in the second culture system 102 and the flow path connecting the culture tank 3 and the separation tank 4 in the first culture system 101.
  • second connection path 1B for flowing the sediment 42 from 4 to the culture tank 3 is connected to the lower part (preferably the lowermost part) of the separation tank 4.
  • the precipitate solution 42 in which the cells have settled can be appropriately distributed to the culture tank 3.
  • Connection path 1A First connection path 1B: Second connection path 2: Recovery path 2a: Main section 2b: Bending section 2c: Opening 3: Culture tank 4: Separation tank 7: Control section 10: Switching valve 10A : 1st switching valve (switching valve) 10B: Second switching valve (switching valve) 11: 1st valve 11A: 1st culture system 1st valve (1st valve) 11B: 2nd culture system 1st valve (1st valve) 12: 2nd valve 13: 3rd valve 18: Atmospheric pressure pump 30: Culture solution 41: supernatant solution 42: Precipitate solution 50: Medium 100: Culture system 101: First culture system (culture system) 102: Second culture system (culture system) X: Horizontal direction Y: Vertical direction

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Abstract

培養システム（１００）は、細胞を培養する培養槽（３）と、重力沈降によって上清液（４１）と細胞を含む沈殿液（４２）とに培養液（３０）を分離させる分離槽（４）と、培養槽（３）と分離槽（４）とを接続する第１接続路（１Ａ）及び第２接続路（１Ｂ）と、分離槽（４）に接続されて上清液（４１）を回収する回収路（２）と、培養液（３０）、上清液（４１）、沈殿液（４２）の流れを制御する制御部（７）とを備える。制御部（７）は、培養槽（３）から第１接続路（１Ａ）を通って分離槽（４）に培養液（３０）を流入させ、培養液（３０）の静置後、分離槽（４）から回収路（２）を通って上清液（４１）を流出させ、その後、沈殿液（４２）を分離槽（４）から第２接続路（１Ｂ）を通って培養槽（３）に戻す。

Description

培養システム及び培養方法
　本発明は、灌流培養によって細胞を培養する技術に関する。
　抗体用の医薬品など、細胞による産生物を生成する主流の方式として、フェドバッチ培養（fed batch culture）が知られている。フェドバッチ培養は、細胞の栄養を含む培地を用いて細胞を培養中に、培地や培地中の特定の成分を添加し、増殖性の最適化や、老廃物等の希釈による生産性の維持などを行う培養方法である。近年、フェドバッチ培養よりも、ランニングコストは高くなるが、培地中の細胞密度を高くすることができ、産生物の生産性も高くすることができる灌流培養（perfusion culture）が注目されている。灌流培養は、培地を含む培養液を収容する培養槽の中で細胞を培養し、培養液を灌流させて培養液の中から細胞が産生する産生物を取り出す培養方法である。そして、灌流される培養液から産生物や細胞の老廃物などを分離する方法としては、ＴＦＦ（Tangential Flow Filtration）やＡＴＦ（Alternating Tangential Flow）などの膜分離、超音波を用いるＡＷＳ（Acoustic Wave Separation）、遠心分離などがある。
　例えば、膜分離の一例として、国際公開第２０１４／０５１５０３号には、複数の膜が保持液側と透過液側とを画定している濾過用のフィルタユニットを備えたタンジェンシャルフロー灌流システムが開示されている。この灌流システムでは、フィルタユニットによって、培養槽に戻す細胞と、培養液から取り出す物質とを分離している。
　また、ＡＷＳの一例として、国際公開第２０１５／１０２５２８号には、培養槽と、音響定在波細胞分離器とを備えた細胞培養用の装置が開示されている。音響定在波細胞分離器は、音響定在波を発生させる超音波圧電トーンスデューサと、音響共鳴チャンバーとを有する。細胞を含む培養液が音響共鳴チャンバーを通る際に、細胞は、音響定在波の節によって保持され、音響チャンバーからは細胞が除かれた培養液を取り出すことができる。また、例示は省略するが、遠心分離では、分離装置に回転装置を備えて、遠心力を利用して物質の密度差により細胞を分離する。
国際公開第２０１４／０５１５０３号 国際公開第２０１５／１０２５２８号
　ところで、膜分離は、適切な膜を選択することにより高い分離能力を持たせることができる。一方、細胞を長期間培養した場合には、膜が目詰まりするおそれがあり、比較的短期間でのメンテナンスを要し、膜の交換などで高コストとなる場合がある。物質の密度差を利用した遠心分離は、短時間で効率良く細胞を分離することができるが、分離装置の構造が複雑化する傾向がある。また、超音波を用いるＡＷＳは、培養システムが高コスト化する傾向がある。
　上記に鑑みて、メンテナンス性に優れ、低コストで効率良く細胞を分離することのできる培養技術の提供が望まれる。
　上記に鑑みた、灌流培養によって細胞を培養する培養システムは、１つの態様として、培地及び前記細胞を含む培養液を収容して前記細胞を培養する培養槽と、前記培養液を静置して重力沈降によって上清液と前記細胞を含む沈殿液とに前記培養液を分離させる分離槽と、前記培養槽と前記分離槽とを接続する第１接続路及び第２接続路と、前記分離槽に接続されて前記上清液を回収する回収路と、前記培養液、前記上清液、及び前記沈殿液の流れを制御する制御部と、を備え、前記制御部が、前記培養槽から前記第１接続路を通って前記分離槽に前記培養液を流入させ、前記培養液の静置後、前記分離槽から前記回収路を通って前記上清液を流出させ、その後、前記沈殿液を前記分離槽から前記第２接続路を通って前記培養槽に戻す。
　この構成によれば、分離槽において培養液を静置した後、まず、上方の上清液を分離槽から流出させた後に、下方の沈殿液を流出させる。例えば、先に下方の沈殿液を流出させると、上方の上清液も流動するため、培養液を静置して上清液と沈殿液とを分離したにも拘わらず、上清液と沈殿液との一部が混じり合う可能性がある。しかし、先に上方の上清液を流出させた場合には、相対的に下方の沈殿液は流動しにくい。従って、適切に上清液及び沈殿液をそれぞれ独立して分離槽から流出させることができる。また、分離槽から培養槽へ沈殿液を戻す際には、分離槽に残っている全ての培養液を戻すこともできる。従って、全ての細胞を培養槽に戻して再利用することができ、培養効率を高くすることができる。また、この構成によれば、培養液を静置して上清液と沈殿液とに分離するので、分離膜など、交換の必要な部材の利用が低減され、部材コストが削減されると共にメンテナンスの機会も減少する。このように、本構成によれば、メンテナンス性に優れ、低コストで効率良く細胞を分離することのできる培養システムを提供することができる。
　ここで、前記回収路は、前記分離槽の中に配置される、水平方向よりも鉛直方向の上方に向けて開口している開口部を有すると好適である。
　例えば、開口部が下方に向けて開口していると、分離槽内において培養液が回収路へと流入する過程で、最終的に下方から上方へ向かう培養液の流れが部分的に生じる。このため、分離槽の下方の沈殿液が当該流れに沿って上方に流れ、回収路から流出する可能性がある。これに対して、開口部が水平方向よりも鉛直方向の上方に向けて開口していると、分離槽内において上方から下方へ向かう方向に沿って流れる培養液の一部が、そのまま回収路へと流入する。従って、沈殿液が混じることなく上清液を回収路から流出させることができる。
　前記回収路がそのような前記開口部を有する場合、前記回収路は、前記分離槽の中に配置される、本管部と、前記本管部から屈曲した屈曲部とを有し、前記開口部は前記屈曲部の先端に設けられていると好適である。
　開口部が、回収路の本管部から屈曲した屈曲部の先端に設けられていることで、回収路の先からの吸引力、又は分離槽からの押圧力が作用しなければ、上清液は回収路を流通しにくい。従って、培養液を充分に静置した上で、適切に上清液を分離槽から流出させることができる。
　また、前記回収路が、前記分離槽の中に、本管部と、前記本管部から屈曲した屈曲部と、前記屈曲部の先端に設けられた開口部とを有し、前記開口部は、水平方向よりも鉛直方向の上方に向けて開口している場合、前記屈曲部は、鉤状に形成されていると好適である。
　ここで、鉤状とは、分離槽の内部における本管部の延伸方向と、開口部の開口方向とが、概ね１８０°（９０°より大きく２７０°未満の間）となるように屈曲している形状である。また、角ばって屈曲する形状に限らず、円弧を伴って屈曲している形状も含む。このように、屈曲部が鉤状に形成されていると、上述したように、回収路の先からの吸引力、又は分離槽から押圧力が作用しなければ、上清液は回収路を流通しにくい。従って、培養液を充分に静置した上で、適切に上清液を分離槽から流出させることができる。
　また、培養システムが、前記分離槽の内圧を調整する気圧ポンプと、前記分離槽と前記第１接続路との接続状態を切り替える第１弁と、前記分離槽と前記回収路との接続状態を切り替える第２弁と、前記分離槽と前記第２接続路との接続状態を切り替える第３弁と、をさらに備え、前記制御部は、前記気圧ポンプ、前記第１弁、前記第２弁、及び前記第３弁を制御することで、前記培養液、前記上清液、及び前記沈殿液の流れを制御すると好適である。
　この構成によれば、第１弁、第２弁、第３弁と協働し、気圧ポンプにより分離槽の内圧が調整されることによって、分離槽への培養液の流入、分離槽からの上清液の流出、分離槽からの沈殿液の流出が制御される。つまり、第１接続路、第２接続路、回収路のそれぞれに流体ポンプを設ける構成に比べて、培養システムの構成が小規模となる。
　ここで、前記制御部は、前記第１弁を開放すると共に前記第２弁及び前記第３弁を閉塞した状態で、前記気圧ポンプにより前記分離槽の内圧を低下させて前記培養槽から前記分離槽に前記培養液を流入させ、前記第１弁及び前記第３弁を閉塞すると共に前記第２弁を開放した状態で、前記気圧ポンプにより前記分離槽の内圧を上昇させて前記分離槽から前記回収路に前記上清液を流出させ、前記第３弁を開放すると共に前記第１弁及び前記第２弁を閉塞した状態で、前記気圧ポンプにより前記分離槽の内圧を上昇させて前記分離槽から前記培養槽に前記沈殿液を流出させると好適である。
　３つの弁の内、第１弁のみが開放されている状態では、培養液は第１接続路のみを流通可能である。３つの弁の内、第２弁のみが開放されている状態では、培養液（上清液）は回収路のみを流通可能である。３つの弁の内、第３弁のみが開放されている状態では、培養液（沈殿液）は第２接続路のみを流通可能である。このように分離槽に接続された流路の内、何れか１つのみを培養液が流通可能な状態で、分離槽の内圧を制御することで、適切に当該１つの流路を介して培養液を流通させることができる。つまり、簡単な制御によって適切に培養液を流通させることができる。
　ここで、前記第１弁、前記第２弁、及び前記第３弁は、何れか２つが閉塞状態となり、他の１つが開放状態となる共通の切替え弁であると好適である。
　この構成によれば、それぞれ独立した第１弁、第２弁、第３弁を設ける場合に比べて、培養システムの構成が小規模になる。
　また、別の態様として、前記第１接続路及び前記第２接続路が、共通の１つの接続路であり、培養システムが、前記分離槽の内圧を調整する気圧ポンプと、前記分離槽と前記接続路との接続状態を切り替える第１弁と、前記分離槽と前記回収路との接続状態を切り替える第２弁と、をさらに備え、前記制御部が、前記気圧ポンプ、前記第１弁、及び前記第２弁を制御することで、前記培養液、前記上清液、及び前記沈殿液の流れを制御すると好適である。
　第１接続路及び第２接続路は、培養液（沈殿液を含む）の流通方向は異なるが、共に培養槽と分離槽とを接続する流路である。従って、第１接続路及び第２接続路を共通の接続路とすることによって、培養システムの構成を小規模にすることができる。また、第１弁、第２弁と協働し、気圧ポンプにより分離槽の内圧が調整されることによって、分離槽への培養液の流入、分離槽からの上清液の流出、分離槽からの沈殿液の流出が制御される。
つまり、接続路、回収路のそれぞれに流体ポンプを設ける構成に比べて、培養システムの構成が小規模となる。
　ここで、前記制御部は、前記第１弁を開放すると共に前記第２弁を閉塞した状態で、前記気圧ポンプにより前記分離槽の内圧を低下させて前記培養槽から前記分離槽に前記培養液を流入させ、前記第１弁を閉塞すると共に前記第２弁を開放した状態で、前記気圧ポンプにより前記分離槽の内圧を上昇させて前記分離槽から前記回収路に前記上清液を流出させ、前記第１弁を開放すると共に前記第２弁を閉塞した状態で、前記気圧ポンプにより前記分離槽の内圧を上昇させて前記分離槽から前記培養槽に前記沈殿液を流出させると好適である。
　２つの弁の内、第１弁のみが開放されている状態では、培養液（沈殿液を含む）は接続路のみを流通可能である。２つの弁の内、第２弁のみが開放されている状態では、培養液（上清液）は回収路のみを流通可能である。このように分離槽に接続された２つの流路の内、何れか一方のみを培養液が流通可能な状態で、分離槽の内圧を制御することで、適切に当該１つの流路を介して培養液を流通させることができる。特に、接続路においては、気圧ポンプによる分離槽の内圧の制御によって流通方向も切り替えることができる。このように、本構成によれば、簡単な制御によって適切に培養液を流通させることができる。
　ここで、前記第１弁及び前記第２弁は、相補的に閉塞状態及び開放状態となる共通の切替え弁であると好適である。
　この構成によれば、それぞれ独立した第１弁、第２弁を設ける場合に比べて、培養システムの構成が小規模になる。
　上述した培養システムの種々の技術的特徴は、培養方法にも適用可能である。以下にその代表的な態様を例示する。例えば、培養方法は、上述した培養システムの特徴を備えた各種の工程を有することができる。当然ながらこれらの培養方法も、上述した培養システムの作用効果を奏することができる。さらに、培養システムの好適な態様として、上述した種々の付加的特徴も、培養方法に組み込むことが可能であり、当該培養方法はそれぞれの付加的特徴に対応する作用効果も奏することができる。
　１つの好適な態様として、培養方法は、培地及び細胞を含む培養液を収容して前記細胞を培養する培養槽と、前記培養液を静置して重力沈降によって上清液と前記細胞を含む沈殿液とに前記培養液を分離させる分離槽と、前記培養槽と前記分離槽とを接続する第１接続路及び第２接続路と、前記分離槽に接続されて前記上清液を回収する回収路と、を備えた培養装置を用いて、灌流培養によって前記細胞を培養する培養方法であって、前記培養槽から前記第１接続路を通って前記分離槽に前記培養液を流入させる第１工程と、前記第１工程に続き、前記培養液を静置する第２工程と、前記第２工程に続き、前記分離槽から前記回収路を通って前記上清液を流出させる第３工程と、前記第３工程に続き、前記沈殿液を前記分離槽から前記第２接続路を通って前記培養槽に戻す第４工程と、を有する。
　この方法によれば、分離槽において培養液を静置した後、まず、上方の上清液を分離槽から流出させた後に、下方の沈殿液を流出させる。例えば、先に下方の沈殿液を流出させると、上方の上清液も流動するため、培養液を静置して上清液と沈殿液とを分離したにも拘わらず、上清液と沈殿液との一部が混じり合う可能性がある。しかし、先に上方の上清液を流出させた場合には、相対的に下方の沈殿液は流動しにくい。従って、適切に上清液及び沈殿液をそれぞれ独立して分離槽から流出させることができる。また、分離槽から培養槽へ沈殿液を戻す際には、分離槽に残っている全ての培養液を戻すこともできる。従って、全ての細胞を培養槽に戻して再利用することができ、培養効率を高くすることができる。また、この方法によれば、培養液を静置して上清液と沈殿液とに分離するので、分離膜など、交換の必要な部材の利用が低減され、部材コストが削減されると共にメンテナンスの機会も減少する。このように、本方法によれば、メンテナンス性に優れ、低コストで効率良く細胞を分離することのできる培養方法を実現することができる。
　培養システム及び培養方法のさらなる特徴と利点は、図面を参照して説明する実施形態についての以下の記載から明確となる。
培養システムの一例を模式的に示すブロック図 培養システムの他の例を模式的に示すブロック図 分離槽及び分離槽内の回収路の構成を模式的に示す図
　以下、培養システム及び培養方法の実施形態を図面に基づいて説明する。図１及び図２は、培養システムの一例を模式的に示すブロック図であり、図３は、分離槽及び分離槽内の回収路の構成を模式的に示す図である。図１及び図２に示すように、培養システム１００は、灌流培養によって細胞を培養し、細胞による産生物を回収する。灌流培養は、細胞及び培地を含む培養液を、培養槽の外部で循環させ、その途中で細胞による産生物等を抜き出し、細胞を培養槽に戻す培養方法である。抜き出される対象となるのは、例えば病原体に対する抗体（利用対象の産生物）、細胞の活動による老廃物（廃棄対象の産生物）、死亡した細胞などである。図１及び図２に示すように、培養システム１００は、培地貯留槽５と、培養槽３と、分離槽４と、処理装置６と、制御部７とを備えている。
　上述したように、灌流培養では、細胞及び培地を含む培養液を培養槽の外部で循環させ、その途中で細胞による産生物等を抜き出し、細胞を培養槽に戻している。例えば、図１に例示する培養システム１００（図２と区別する場合は第１培養システム１０１）では、培養槽３、第１接続路１Ａ、分離槽４、第２接続路１Ｂ、培養槽３の経路で培養液３０が循環する。また、産生物等は、当該経路の途中、ここでは分離槽４から回収路２を介して抜き出される。また、図２に例示する培養システム１００（図１と区別する場合は第２培養システム１０２）では、培養槽３、接続路１、分離槽４、接続路１、培養槽３の経路で培養液３０が循環する。産生物等は、第１培養システム１０１と同様に、当該経路の途中の分離槽４から回収路２を介して抜き出される。
　培養槽３は、培養対象の細胞、及び当該細胞の培養に必要な栄養分を有する培地５０を含む培養液３０を収容して、当該細胞を培養する。実験室や検査室等で用いるような小型の培養システムでは、培養槽３として例えばフラスコや培養バッグ、バイオリアクターなどを用いることもできる。分離槽４は、培養液３０を静置して重力沈降によって、上清液４１と、細胞を含む沈殿液４２とに培養液３０を分離する。尚、液中に含まれる細胞の密度の観点では、上清液４１は、液中に含まれる細胞の密度が相対的に低い培養液３０であり、沈殿液４２は、液中に含まれる細胞の密度が相対的に高い培養液３０である。従って、上清液４１に細胞が全く含まれていないとは限らず、上清液４１に細胞が含まれていても良い。
　ここで、重力沈降の原理について説明する。例えば、生きている細胞に対して死亡した細胞は、破裂して破片（細胞デブリ）として存在している。また、細胞の産生物（抗体や老廃物など）は母体である細胞よりも小さい。そして、液体中における物質の沈降速度は、物体が球体状の粒子の場合、その径が大きいほど早くなる傾向がある。つまり、培養槽３に戻して再利用するべき生きている細胞は、培養液３０中において、死亡した細胞の細胞デブリや産生物に比べて速い沈降速度で沈降する。従って、分離槽４における培養液３０の静置時間を適切に管理することによって、生きている細胞を多く含む沈殿液４２と、死亡した細胞の細胞デブリや産生物を多く含み且つ生きている細胞が少ない上清液４１とに、培養液３０を分離することができる。重力沈降とは、このように、物質によって異なる沈降速度を利用して流体中の物質を分離する方式をいう。
　第１培養システム１０１では、培養槽３と分離槽４とが、第１接続路１Ａ及び第２接続路１Ｂにより接続されている。第２培養システム１０２では、培養槽３と分離槽４とが、接続路１により接続されている。第１培養システム１０１及び第２培養システム１０２に共通して、分離槽４には、上清液４１を回収する回収路２が接続されている。回収路２は、処理装置６に接続され、培養槽３は、流体ポンプ１５を介して培地貯留槽５に接続されている。
　処理装置６は、培養液３０から抜き出された上清液４１から、例えば病原体に対する抗体などの利用対象の産生物を取り出す処理装置である。細胞の活動による老廃物や死亡した細胞などは廃棄される。培地貯留槽５は、新鮮な培地５０を貯留している。培養槽３中の培養液３０に含まれる培地５０は細胞に栄養分を与えることによって消耗する。このため、新鮮な培地５０が培地貯留槽５から補充され、培養槽３中の培養液３０の液量と細胞の培養に必要な栄養分とが維持される。尚、処理装置６は、単純に上清液４１を貯蔵する容器であってもよい。
　培地５０を供給するための流体ポンプ１５としては、例えば、ローラーによってチューブを蠕動させることによって流体を送る蠕動型のポンプ（ペリスタルティックポンプ、チューブポンプ、ローラポンプ）を利用することができる。或いは、流体ポンプ１５として、ポンプのインペラを密閉ケース内に収容し、当該密閉ケースの外部から磁気を作用させて非接触でインペラを回転させる磁気浮上型のポンプ（マグネットポンプ）を用いることも好適である。
　制御部７は、例えば、マイクロコンピュータなどを中核として構成され、培養液３０、上清液４１、沈殿液４２、培地５０の流れを制御する。制御部７は、マイクロコンピュータなどのハードウェアと、プログラムやパラメータなどのソフトウェアとの協働によって実現される。以下、第１培養システム１０１と第２培養システム１０２とのそれぞれについて詳細に説明する。
　はじめに、第１培養システム１０１について説明する。上述したように、第１培養システム１０１では、培養槽３と分離槽４とは、第１接続路１Ａ及び第２接続路１Ｂにより接続されている。制御部７は、培養槽３から第１接続路１Ａを通って分離槽４に培養液３０を流入させ、培養液３０の静置後、分離槽４から回収路２を通って上清液４１を流出させ、その後、沈殿液４２を分離槽４から第２接続路１Ｂを通って培養槽３に戻すように制御する。即ち、第１培養システム１０１では、主に以下の４つの工程（第１工程＃１～第４工程＃４）が実施される。第１工程＃１は、培養槽３から第１接続路１Ａを通って分離槽４に培養液３０を流入させる工程である。第２工程＃２は、第１工程＃１に続き、分離槽４において培養液３０を所定時間（例えば３０分～１２０分）静置する工程である。第３工程＃３は、第２工程＃２に続き、分離槽４から回収路２を通って上清液４１を流出させる工程である。第４工程＃４は、第３工程＃３に続き、沈殿液４２を分離槽４から第２接続路１Ｂを通って培養槽３に戻す工程である。この他、第４工程＃４に続き、培地貯留槽５から培養槽３に培地５０を補充する第５工程＃５が実施されてもよい。
　図１に示すように、第１培養システム１０１は、気体流路８を介して分離槽４と接続され、分離槽４の内圧を調整する気圧ポンプ１８と、分離槽４と第１接続路１Ａとの接続状態を切り替える第１弁１１と、分離槽４と回収路２との接続状態を切り替える第２弁１２と、分離槽４と第２接続路１Ｂとの接続状態を切り替える第３弁１３とを備えている。制御部７は、気圧ポンプ１８、第１弁１１、第２弁１２、第３弁１３を制御することで、培養液３０、上清液４１、沈殿液４２の流れを制御する。
　具体的には、制御部７は、第１工程＃１において、第１弁１１を開放すると共に第２弁１２及び第３弁１３を閉塞した状態で、気圧ポンプ１８により分離槽４の内圧を低下させて培養槽３から分離槽４に培養液３０を流入させる。第２工程＃２では、１つの態様として、第１弁１１、第２弁１２、第３弁１３を閉塞した状態で、気圧ポンプ１８も停止させ、分離槽４内で培養液３０を静置する（後述するように、気圧ポンプ１８が停止しているため、必ずしも３つ全ての弁が閉塞状態でなくてもよい。）。第３工程＃３では、第１弁１１及び第３弁１３を閉塞すると共に第２弁１２を開放した状態で、気圧ポンプ１８により分離槽４の内圧を上昇させて分離槽４から回収路２に上清液４１を流出させる。第４工程＃４では、第３弁１３を開放すると共に第１弁１１及び第２弁１２を閉塞した状態で、気圧ポンプ１８により分離槽４の内圧を上昇させて分離槽４から培養槽３に沈殿液４２を流出させる。
　このように分離槽４に接続された３つの流路の内、何れか１つのみを培養液３０が流通可能な状態で、分離槽４の内圧を制御することで、適切に当該１つの流路を介して培養液３０を流通させることができる。つまり、簡単な制御によって適切に培養液３０を流通させることができる。
　第１培養システム１０１の上述した形態では、第１弁１１、第２弁１２、第３弁１３は、同時に２つ以上が開放状態となることはなく、何れか１つが開放されて他の２つが閉塞された状態、或いは、全てが閉塞された状態に制御されている。従って、例えば、第１弁１１、第２弁１２、第３弁１３は、何れか２つが閉塞状態となり、他の１つが開放状態となる共通の第１切替え弁１０Ａ（切替え弁１０）とすることができる。好適には、当該第１切替え弁１０Ａは、全てが閉塞された状態も採り得るとよい。但し、何れか１つの弁が開放状態であっても、気圧ポンプ１８が作動せず、分離槽４の内圧が維持されていれば、培養液３０は何れの流路も流通しないので、当該第１切替え弁１０Ａは、必ずしも全てが閉塞された状態を採り得るものである必要はない。
　第２工程＃２も、３つの弁の全てが閉塞されない状態で実施することができる。具体的には、第１弁１１、第２弁１２、第３弁１３の内の少なくとも１つを閉塞した状態で、気圧ポンプ１８も停止させ、分離槽４内で培養液３０を静置してもよい。例えば、培養槽３と分離槽４とを接続する第１弁１１及び第３弁１３を閉塞し、分離槽４と回収路２とを接続する第２弁１２が開放されていてもよい。第２工程では、気圧ポンプ１８が停止しているため、第２弁１２が開放されていても、分離槽４から回収路２へ培養液３０（上清液４１）は流出しない。第１弁１１及び第３弁１３が閉塞され、第２弁１２が開放されている状態は、第３工程＃３における弁の状態であるから、第２工程＃２から第３工程＃３へ遷移する際の制御が簡略化できる。また、第２工程＃２における弁の状態は、培養システム１００の構造に応じて設定されてもよい。例えば、第１弁１１及び第３弁１３が分離槽４の下方に設けられ、回収路２が分離槽４の上方に設けられているような場合、重力によって培養液３０が移動し易い第１弁１１及び第３弁１３が閉塞され、重力により培養液３０が移動し難い第２弁１２が開放されるような形態であってもよい。
　次に、第２培養システム１０２について説明する。上述したように、第２培養システム１０２では、培養槽３と分離槽４とは、１つの接続路１により接続されている。制御部７は、培養槽３から接続路１を通って分離槽４に培養液３０を流入させ、培養液３０の静置後、分離槽４から回収路２を通って上清液４１を流出させ、その後、沈殿液４２を分離槽４から接続路１を通って培養槽３に戻すように制御する。即ち、第２培養システム１０２では、主に以下の４つの工程（第１工程＃１～第４工程＃４）が実施される。尚、工程の名称及び符号については、第１培養システム１０１と同様としている。
　第１工程＃１は、培養槽３から接続路１を通って分離槽４に培養液３０を流入させる工程である。第２工程＃２は、第１工程＃１に続き、分離槽４において培養液３０を所定時間（例えば３０分～１２０分）静置する工程である。第３工程＃３は、第２工程＃２に続き、分離槽４から回収路２を通って上清液４１を流出させる工程である。第４工程＃４は、第３工程＃３に続き、沈殿液４２を分離槽４から接続路１を通って培養槽３に戻す工程である。この他、第４工程＃４に続き、培地貯留槽５から培養槽３に培地５０を補充する第５工程＃５が実施されてもよい。
　図２に示すように、第２培養システム１０２は、気体流路８を介して分離槽４と接続され、分離槽４の内圧を調整する気圧ポンプ１８と、分離槽４と接続路１との接続状態を切り替える第１弁１１と、分離槽４と回収路２との接続状態を切り替える第２弁１２とを備えている。制御部７は、気圧ポンプ１８、第１弁１１、第２弁１２を制御することで、培養液３０、上清液４１、沈殿液４２の流れを制御する。
　尚、単純に流路を閉塞するか開放するかの制御を行う機能を有する場合には、第１培養システム１０１の第１弁１１と、第２培養システムの第１弁１１とは、同じものであってよい。但し、逆止弁のように通流方向を規制する機能を有する場合などでは、第１培養システム１０１の第１弁１１と、第２培養システムの第１弁１１とが異なるものであってよい。そのような場合には、第１培養システム１０１の第１弁１１については、第１培養システム第１弁１１Ａと称し、第２培養システム１０２の第１弁１１については、第２培養システム第１弁１１Ｂと称する。この場合、第２培養システム第１弁１１Ｂは、第１培養システム第１弁１１Ａと、第３弁１３とを兼ね備えたものである。第２弁１２については、何れの場合であっても、第１培養システム１０１と第２培養システム１０２とで、同一の弁を使用してよい。
　即ち、第１培養システム１０１と第２培養システム１０２とは、構成上は、培養槽３と分離槽４とが、２つの流路（第１接続路１Ａ及び第２接続路１Ｂ）により接続されているか、１つの流路（接続路１）により接続されているかという点で相違している。つまり、第２培養システム１０２では、第１培養システム１０１における第１接続路１Ａ及び第２接続路１Ｂが、共通の１つの接続路１となっている。また、このため、第１培養システム１０１が３つの弁（第１弁１１、第２弁１２、第３弁１３）を備えるのに対して、第２培養システム１０２は２つの弁（第１弁１１、第２弁１２）のみを備える。従って、第１培養システム１０１に比べて、第２培養システム１０２は、システム構成が小規模となる。
　制御部７は、第１工程＃１において、第１弁１１を開放すると共に第２弁１２を閉塞した状態で、気圧ポンプ１８により分離槽４の内圧を低下させて培養槽３から接続路１を通って分離槽４に培養液を流入させる。第２工程＃２では、１つの態様として、第１弁１１及び第２弁１２を閉塞した状態で、気圧ポンプ１８も停止させ、分離槽４内で培養液３０を静置する（後述するように、気圧ポンプ１８が停止しているため、必ずしも２つの弁が共に閉塞状態でなくてもよい。）。第３工程＃３では、第１弁１１を閉塞すると共に第２弁１２を開放した状態で、気圧ポンプ１８により分離槽４の内圧を上昇させて分離槽４から回収路２に上清液４１を流出させる。第４工程＃４では、第１弁１１を開放すると共に第２弁１２を閉塞した状態で、気圧ポンプ１８により分離槽４の内圧を上昇させて分離槽４から接続路１を通って培養槽３に沈殿液４２を流出させる。
　このように分離槽４に接続された２つの流路の内、何れか一方のみを培養液３０が流通可能な状態で、分離槽４の内圧を制御することで、適切に何れか一方の流路を介して培養液３０を流通させることができる。つまり、簡単な制御によって適切に培養液３０を流通させることができる。
　第２培養システム１０２の上述した形態では、第１弁１１、第２弁１２は、同時に２つ以上が開放状態となることはなく、何れか一方が開放されて他方が閉塞された状態、或いは、双方が閉塞された状態に制御されている。従って、例えば、第１弁１１、第２弁１２は、何れか一方が閉塞状態となり、他方が開放状態となる共通の第２切替え弁１０Ｂ（切替え弁１０）、即ち、相補的に閉塞状態及び開放状態となる共通の第２切替え弁１０Ｂとすることができる。好適には、当該第２切替え弁１０Ｂは、双方が閉塞された状態も採り得るとよい。但し、一方の弁が開放状態であっても、気圧ポンプ１８が作動せず、分離槽４の内圧が維持されていれば、培養液３０は何れの流路も流通しないので、当該第２切替え弁１０Ｂは、必ずしも双方が閉塞された状態を採り得るものである必要はない。
　第２工程＃２も、２つの弁が共に閉塞されない状態で実施することができる。具体的には、第１弁１１及び第２弁１２の内の少なくとも一方を閉塞した状態で、気圧ポンプ１８も停止させ、分離槽４内で培養液３０を静置してもよい。例えば、培養槽３と分離槽４とを接続する第１弁１１を閉塞し、分離槽４と回収路２とを接続する第２弁１２が開放されていてもよい。第２工程では、気圧ポンプ１８が停止しているため、第２弁１２が開放されていても、分離槽４から回収路２へ培養液３０（上清液４１）は流出しない。第１弁１１が閉塞され、第２弁１２が開放されている状態は、第３工程＃３における弁の状態であるから、第２工程＃２から第３工程＃３へ遷移する際の制御が簡略化できる。また、第２工程＃２における弁の状態は、培養システム１００の構造に応じて設定されてもよい。例えば、第１弁１１が分離槽４の下方に設けられ、回収路２が分離槽４の上方に設けられているような場合、重力によって培養液３０が移動し易い第１弁１１が閉塞され、重力により培養液３０が移動し難い第２弁１２が開放されるような形態であってもよい。
　尚、第１培養システム１０１及び第２培養システム１０２に共通して、気圧ポンプ１８を用いて分離槽４の内圧を制御する上では、分離槽４は、密閉された気密容器であると好適である。例えば、図３に示すように、分離槽４の上部が封止部材９により封止されていると好適である。尚、密閉（気密）とは、分離槽４の内圧或いは外圧が所定値以内であれば、分離槽４の中と外との間で空気が流通しないように維持される状態をいう。また、この際の所定値は、流路を介して培養液３０を流通させることが可能な圧力であると好適である。
　ところで、図１及び図２に示すように、第１培養システム１０１及び第２培養システム１０２に共通して、回収路２は、分離槽４の中に、本管部２ａと、本管部２ａから屈曲した屈曲部２ｂと、屈曲部の先端に設けられた開口部２ｃとを有すると好適である。そして、図３に示すように、この開口部２ｃは、水平方向Ｘよりも鉛直方向Ｙの上方に向けて開口していると好適である。当然ながら、回収路２がこのように屈曲していない構成を妨げるものではなく、また、回収路２の分離槽４内における開口部２ｃが鉛直方向Ｙの下方に向けて開口している構成を妨げるものでもない。また、図３においては、回収路２が分離槽４の上方から下方へと延びるように配置されている形態を例示しているが、この形態に限らず、回収路２が分離槽４の側面や下部に設けられる形態を妨げるものではない。
　例えば、開口部２ｃが鉛直方向Ｙの下方に向けて開口していると、分離槽４内において培養液３０が回収路２へ流入する過程で、最終的に下方から上方へ向かう方向に沿う培養液３０の流れが部分的に生じる。このため、分離槽４の下方に位置する沈殿液４２が当該流れに沿って上方に流れ、分離された上清液４１と沈殿液４２との一部が混ざり合う可能性がある。そして、沈殿液４２の一部が、回収路２から流出する可能性がある。これに対して、開口部２ｃが上方に向けて開口していると、分離槽４内において上方から下方へ向かう方向に沿って流れる培養液３０の一部が、そのまま回収路２へと流入する。従って、沈殿液４２が混じることなく上清液４１を回収路２から流出させることができる。また、開口部２ｃが、回収路２の本管部２ａから屈曲した屈曲部２ｂの先端に設けられていると、回収路２の先からの吸引力、又は分離槽４からの押圧力が作用しなければ、上清液４１は回収路２を流通しにくい。従って、培養液３０を充分に静置した上で、適切に上清液４１を分離槽から流出させることができる。
　また、図１から図３に示すように、回収路２の屈曲部２ｂは、鉤状に形成されていると好適である。ここで、鉤状とは、分離槽４の内部における本管部２ａの延伸方向と、開口部２ｃの開口方向とが、概ね１８０°（９０°より大きく２７０°未満の間）となるように屈曲している形状である。また、屈曲部２ｂの形状は、図１や図２の模式的なブロック図に示すような角ばって屈曲する形状に限らず、図３に示すように円弧を伴って屈曲している形状も含む。このように、屈曲部２ｂが鉤状に形成されていると、上述したように、回収路２の先からの吸引力、又は分離槽からの押圧力が作用しなければ、上清液４１は回収路２を流通しにくい。従って、培養液３０を充分に静置した上で、適切に上清液４１を分離槽４から流出させることができる。
　尚、開口部２ｃの鉛直方向Ｙにおける位置は、培養液３０が静置される際の液面から分離槽４の底までの鉛直方向Ｙに沿った長さの１０～６０％分、好ましくは２０～５０％分、液面から低い位置であると好適である。上清液４１は、開口部２ｃが位置する高さが液面となるまで回収路２を介して流出させることができる。従って、上述した第２工程＃２により充分に上清液４１と沈殿液４２とが分離できていると考えられる境界位置に、開口部２ｃが設定されると好適である。
　また、図３に示すように、分離槽４は、鉛直方向Ｙに対して傾斜するように設置されると好適である。この際の傾斜角θ（水平方向Ｘに対する角度）は、例えば、４５°から６０°である。分離槽４がこのように傾斜していると、細胞は、鉛直方向Ｙに沿って傾斜面４ａに向かって沈降すると共に、傾斜面４ａに沿って鉛直方向Ｙの下方に移動し易い。従って、より短時間で細胞を沈降させて効率的に沈殿液４２と上清液４１とに培養液３０を分離することができる。また、第２培養システム１０２において培養槽３と分離槽４とを接続する接続路１、及び、第１培養システム１０１において培養槽３と分離槽４とを接続する流路の内、少なくとも分離槽４から培養槽３へ沈殿液４２を流通させる第２接続路１Ｂは、分離槽４の下部（好ましくは最下部）に接続されていると好適である。細胞が沈降した沈殿液４２を適切に培養槽３へ流通させることができる。
１　　　：接続路
１Ａ　　：第１接続路
１Ｂ　　：第２接続路
２　　　：回収路
２ａ　　：本管部
２ｂ　　：屈曲部
２ｃ　　：開口部
３　　　：培養槽
４　　　：分離槽
７　　　：制御部
１０　　：切替え弁
１０Ａ　：第１切替え弁（切替え弁）
１０Ｂ　：第２切替え弁（切替え弁）
１１　　：第１弁
１１Ａ　：第１培養システム第１弁（第１弁）
１１Ｂ　：第２培養システム第１弁（第１弁）
１２　　：第２弁
１３　　：第３弁
１８　　：気圧ポンプ
３０　　：培養液
４１　　：上清液
４２　　：沈殿液
５０　　：培地
１００　：培養システム
１０１　：第１培養システム（培養システム）
１０２　：第２培養システム（培養システム）
Ｘ　　　：水平方向
Ｙ　　　：鉛直方向

Claims (11)

  1. 　灌流培養によって細胞を培養する培養システムであって、
    　培地及び前記細胞を含む培養液を収容して前記細胞を培養する培養槽と、
    　前記培養液を静置して重力沈降によって上清液と前記細胞を含む沈殿液とに前記培養液を分離させる分離槽と、
    　前記培養槽と前記分離槽とを接続する第１接続路及び第２接続路と、
    　前記分離槽に接続されて前記上清液を回収する回収路と、
    　前記培養液、前記上清液、及び前記沈殿液の流れを制御する制御部と、を備え、
    　前記制御部は、
    　　前記培養槽から前記第１接続路を通って前記分離槽に前記培養液を流入させ、
    　　前記培養液の静置後、前記分離槽から前記回収路を通って前記上清液を流出させ、
    　　その後、前記沈殿液を前記分離槽から前記第２接続路を通って前記培養槽に戻す、培養システム。
  2. 　前記回収路は、前記分離槽の中に配置される、水平方向よりも鉛直方向の上方に向けて開口している開口部を有する、請求項１に記載の培養システム。
  3. 　前記回収路は、前記分離槽の中に配置される、本管部と、前記本管部から屈曲した屈曲部とを有し、前記開口部は前記屈曲部の先端に設けられている、請求項２に記載の培養システム。
  4. 　前記屈曲部は、鉤状に形成されている、請求項３に記載の培養システム。
  5. 　前記分離槽の内圧を調整する気圧ポンプと、
    　前記分離槽と前記第１接続路との接続状態を切り替える第１弁と、
    　前記分離槽と前記回収路との接続状態を切り替える第２弁と、
    　前記分離槽と前記第２接続路との接続状態を切り替える第３弁と、をさらに備え、
    　前記制御部は、前記気圧ポンプ、前記第１弁、前記第２弁、及び前記第３弁を制御することで、前記培養液、前記上清液、及び前記沈殿液の流れを制御する、請求項１から４の何れか一項に記載の培養システム。
  6. 　前記制御部は、
    　　前記第１弁を開放すると共に前記第２弁及び前記第３弁を閉塞した状態で、前記気圧ポンプにより前記分離槽の内圧を低下させて前記培養槽から前記分離槽に前記培養液を流入させ、
    　　前記第１弁及び前記第３弁を閉塞すると共に前記第２弁を開放した状態で、前記気圧ポンプにより前記分離槽の内圧を上昇させて前記分離槽から前記回収路に前記上清液を流出させ、
    　　前記第３弁を開放すると共に前記第１弁及び前記第２弁を閉塞した状態で、前記気圧ポンプにより前記分離槽の内圧を上昇させて前記分離槽から前記培養槽に前記沈殿液を流出させる、請求項５に記載の培養システム。
  7. 　前記第１弁、前記第２弁、及び前記第３弁は、何れか２つが閉塞状態となり、他の１つが開放状態となる共通の切替え弁である、請求項５または６に記載の培養システム。
  8. 　前記第１接続路及び前記第２接続路は、共通の１つの接続路であり、
    　前記分離槽の内圧を調整する気圧ポンプと、
    　前記分離槽と前記接続路との接続状態を切り替える第１弁と、
    　前記分離槽と前記回収路との接続状態を切り替える第２弁と、をさらに備え、
    　前記制御部は、前記気圧ポンプ、前記第１弁、及び前記第２弁を制御することで、前記培養液、前記上清液、及び前記沈殿液の流れを制御する、請求項１から４の何れか一項に記載の培養システム。
  9. 　前記制御部は、
    　　前記第１弁を開放すると共に前記第２弁を閉塞した状態で、前記気圧ポンプにより前記分離槽の内圧を低下させて前記培養槽から前記分離槽に前記培養液を流入させ、
    　　前記第１弁を閉塞すると共に前記第２弁を開放した状態で、前記気圧ポンプにより前記分離槽の内圧を上昇させて前記分離槽から前記回収路に前記上清液を流出させ、
    　　前記第１弁を開放すると共に前記第２弁を閉塞した状態で、前記気圧ポンプにより前記分離槽の内圧を上昇させて前記分離槽から前記培養槽に前記沈殿液を流出させる、請求項８に記載の培養システム。
  10. 　前記第１弁及び前記第２弁は、相補的に閉塞状態及び開放状態となる共通の切替え弁である、請求項８または９に記載の培養システム。
  11. 　培地及び細胞を含む培養液を収容して前記細胞を培養する培養槽と、
    　前記培養液を静置して重力沈降によって上清液と前記細胞を含む沈殿液とに前記培養液を分離させる分離槽と、
    　前記培養槽と前記分離槽とを接続する第１接続路及び第２接続路と、
    　前記分離槽に接続されて前記上清液を回収する回収路と、を備えた培養装置を用いて、灌流培養によって前記細胞を培養する培養方法であって、
    　前記培養槽から前記第１接続路を通って前記分離槽に前記培養液を流入させる第１工程と、
    　前記第１工程に続き、前記培養液を静置する第２工程と、
    　前記第２工程に続き、前記分離槽から前記回収路を通って前記上清液を流出させる第３工程と、
    　前記第３工程に続き、前記沈殿液を前記分離槽から前記第２接続路を通って前記培養槽に戻す第４工程と、を有する培養方法。
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