JPH09500818A - 細胞培養に使用される粒子沈降タンク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生存可能なハイブリドーマ細胞を抗体含有液体培地から等、粒子を大量の液体から分離する装置（１）は、垂直方向に対して傾斜した、複数の沈降板（３）、または他の面、および粒子を大量の液体から分離して沈降面上に沈降層を形成し適当なポイント（１１）で集められるように粒子を滑り降ろすことが可能な速度で粒子を含む液体を沈降面の上方向に流すポンプ若しくは他の手段からなる。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞培養に使用される粒子沈降タンク 本発明は、粒子の沈降(settle)装置および細胞培養への上記装置の使用に関す るものである。本発明は、ポリペプチドやタンパク質等の分泌された物質、特に モノクローナル抗体の製造を目的とした動物細胞の培養に適用される。 近年、様々な有用な産物の製造を目的とした動物細胞の培養への興味が高まっ ている。細胞融合技術（ケラー(Kehler)及びミルスタイン(Milstein)、ネーチャ ー(Nature)２５６巻、ページ４９５〜５９７（１９７５年））によって、一定の 特異性を有するマウスのモノクローナル抗体を分泌する多くの様々なハイブリド ーマを作製することが可能になった。モノクローナル抗体は、免疫精製(immunop urification)に関しては治療薬及び診断薬として有用であることが知られており 、さらに調査具(research tool)としても有用であることが知られている。また 、ヒトモノクローナル抗体が細胞融合プロセスから製造された（トンプソン(Tho mpson)ら、イムノロジー(Immunology)５８巻、ページ１５７（１９８６年））こ とにより、さらに利用可能性の範囲が広がった。組換ＤＮＡ技術は、モノクロー ナル抗体を変換及び改良するのに使用され、この際、宿主として様々な動物細胞 を依然として用いることが多かった。また、組換ＤＮＡ技術は、外来遺伝子によ ってエンコードされた産物を産生可能な遺伝子を有する細胞系を作製するのにも 使用されてきた。動物細胞は、動物細胞がタンパク質をグリコシル化し翻訳後修 飾を行うことができるため、しばしば細菌や酵母より優れていることが分かった 。 したがって、動物細胞融合技術及び動物細胞における組換ＤＮＡ技術 は、ワクチンの生産における従来の役割に加えて、有用な産物の生産において重 要な役割を果たしている。 経済的なコストで十分量このような産物を作製するために、細胞培養プロセス はスケールアップされる必要がある。従来のバッチ発酵技術は攪拌槽またはエア ーリフト型の発酵槽(airlift fermenter)で行われている。大きな発酵槽の例（ 例えば、２，０００ｄｍ³のエアーリフト型の発酵槽）もいくつかすでに存在す る。このような発酵槽は大きな施設内に建設されなければならず、設備を供給す る必要がある。比較的低いことが多いが、生産品の下流加工(downstream proces sing)が一般的に必要である。 細胞は発酵槽内に保持されるが産物を含むが細胞を含まない上清は連続的に抽 出され、発酵槽には数週間あるいは数ヵ月の期間新しい培地を補給し続ける連続 灌流技術に興味が集まってきた。この技術によって、発酵槽内の細胞密度をより 高くすることが可能であり、これにより、高い基質から産物への変換率が得られ 、発酵時間をより良好に利用することができ；さらに、より小さな発酵槽の使用 が可能になる。次に、細胞を保持するためには、発酵槽内に細胞を物理的に保持 し、最終的には産物の流れとなる周辺の培地から細胞を分離する手段がなければ ならない。動物細胞は細胞壁がなく感受性を有するため、上記保持手段は緩やか でなければならない。上記目的に使用される装置または方法は、重大な破壊を伴 うことなくまたはプロセスを干渉することなく実質的に連続した無菌操作が可能 である必要がある。設計は、簡潔で、強く、衛生的でかつ経済的なスケールアッ プが可能でなければならない。また、有害な生物体が中で成長する必要がある際 には、封じ込めが可能である必要がある。 様々な装置または方法が細胞を保持するために報告されまたは使用さ れてきた。これらとしては、外部若しくは内部スピンフィルター(spin filter) （ヒンメルファルブ(Himmelfarb)ら、サイエンス(Science)１６４巻、ページ５ ５５〜５５７（１９６９年））、膜分離器（クァチェック(Knazek)ら、サイエン ス(Science)１７８巻、ページ６５〜６７（１９７２年））、細胞の取込み(entr apment)（ニールソン(Nilsson)ら、ネーチャー(Nature)３０２巻、ページ６２９ 〜６３０（１９８３年））、被包(encapsulation)（ジャーヴィス(jarvis)及び グルディナ(Grdina)、バイオ テクニクス(Bio Techniques)１巻、ページ２２〜 ２７（１９８３年））または重力沈降(gravitational settling)（キタノ(Kitan o)ら、アプル マイクロバイオル バイオテクノル(Appl．Microbiol．Biotechn ol.)２４巻、ページ２８２〜２８６（１９８６年）及びバット(Batt)ら、バイオ テクノル プログ(Biotechnol．Prog.)６巻、ページ４５８〜４６４（１９９０ 年））が挙げられる。 一般的に用いられているほとんどの装置は、実験用のスケールでさらには場合 によっては工業的なスケールで良好に作動している；しかしながら、これらの装 置はすべて欠点を有する。スピンフィルター装置は、目詰まりを起こしやすく、 機械的なシールによっており、破壊されまたは集結性(integrity)が失われやす い。膜装置は、詰まりやすく、実験中は繰り返し交換する必要があるため無菌性 を損なう危険性を伴う。また、膜装置は、膜を清潔に保つために高い接線方向の 流量を必要とし、このことは剪断作用に感受性のある細胞には問題が生じうる。 細胞の被包技術は、しばしば、被膜内の生存率が低いが、抗体はその中に保持 される。被膜の形成は、スケールアップを成功させることが困難な複雑なプロセ スである。アガロースまたはアルギン酸塩等の物質製のビーズ内への細胞の取込 みは長期間の培養ではビーズの崩壊が起こり、ここでもスケールアップの問題が 生じる。 重力沈降装置は、構造が簡単で壊れるような動く部分を有さないので、非常に 有効である。また、フィルターまたは膜を持たないので、通常の使用では目詰ま りや壊れることもありえない。沈降タンクの使用は簡単にでき、これにより、細 胞の懸濁液がタンク中に残され、細胞は底に沈み細胞を含まない上層が残る。こ のタイプのタンクの主な欠点は、付属する発酵槽との関係で大きく、細胞が内に 止まる時間が長いため代謝効果が損なわれることがある。代謝効果はタンクを冷 却することによって克服できる；しかしながら、タンクの大きさは依然として問 題であり、ドートムンドセトラー(Dortmund Settler)（フルシャー(Hulscher)ら 、バイオテクノロジー アンド バイオエンジニアリング(Biotechnology and B ioengineering)３９巻、ページ４４２〜４４６（１９９２年））等の設計の改良 が必要である。 傾斜沈降(inclined sedimentation)の理論は、赤血球の沈降及びロールの形成 に関する研究を通して、イー パウンダー(E Pounder)（ジェー エックスプ フィジオル(J．Exp．Physiol.)１５巻、ページ２３５〜２５３（１９２５年）） によって１９２５年に開発された。この理論はバイオマスのリサイクルに広く適 用されてきたが、近年では動物細胞培養においてのみ使用されている。最も簡単 な形態は、垂直方向から傾斜した長い管または流路の上部接斜面(facing slope) 上に沈降させることによって、懸濁液から細胞を除去するものである。ここで、 細胞は、容器の底に滑り落ちて薄い沈降層を形成する。このようにして、細胞は 底部で濃縮され、上清は上部で浄化される。濃縮された細胞は、発酵槽に戻され ることにより発酵槽内に細胞を維持し、分泌分子を含む浄化された上清は収穫物 として上部から抽出される。 通常、傾斜沈降の理論は、以下の、バット(Batt)ら（バイオテクノル プログ (Biotechnol．Prog.)６巻、ページ４５８〜４６４（１９９０ 年））に示された方程式によって要約できる： Ｓ（ｖ）＝ｖｗ（ｌｓｉｎθ＋ｂｃｏｓθ） ただし、Ｓ（ｖ）は浄化された流体の容積流量であり、 ｖは粒子の沈降速度であり、 ｗは沈降タンク板の幅であり、 ｌは沈降タンク板の長さであり、 θは垂直方向に対する傾斜角度であり、 ｂは沈降タンクの傾斜壁間の間隔である。 上記方程式から、例えば、生育不能な(non-viable)ハイブリドーマは１．１ｃ ｍ／時間であり、生存可能な(viable)ハイブリドーマは２．９ｃｍ／時間である 等、様々な沈降速度を有する粒子に関する沈殿装置の性能特性を予想することが 可能である。 今日まで設計または試験されたすべての装置は非常に小さいスケールで使用さ れるのみであった。これらの装置は、大きくするとそれに比例して工業的スケー ルで使用できる細胞の滞留時間が長くなるため、容積を大きくすることはできな かった。 沈降タンクの設計を変更することによって沈降タンクの大きさを大きくするこ とが可能であることがここで発見された。上記を可能にする設計の変更は１つを 超える沈降面を提供することである。 本発明の第一の概念によると、垂直方向に対して傾斜した複数の沈降面を規定 する手段、および粒子を大量の液体から分離して面上に沈降層を形成し粒子を滑 り降ろすことが可能な速度で粒子を含む液体を面の上方向に流す手段からなる、 大量の液体から粒子を分離する装置を提供するものである。次に、このようにし て分離された粒子を集め、再使用され、廃棄され、または使用目的によっては、 さらに処理および／または取扱される。 このような「多板状の」沈降装置は、コンパクトであり、滅菌設計の原理に従 うことが可能であり、スケールアップでき、さらに連続して操作することが可能 である。したがって、本発明による装置は、動物細胞培養の最も厳しい要求にも 合致でき、細胞の保持及び高い生産性が得られる。また、本発明による装置は、 粒子を仕切り、粒子を含む大量の液体の流れから粒子を保持する浄化用の装置と しても使用できる。 このような設計によって、本発明による沈降装置は、大量の液体に対して、複 数の沈降面によって規定された、（既知の装置と比較すると）非常に大きな表面 積を有する。 本発明による装置は多くの用途が考えられるが、最も一般的なものの一つとし ては、細胞、特に動物源の細胞の、連続発酵がある。本装置は、発酵槽の流出口 に連結され、細胞上清液からすべての細胞をまたは選択された細胞集団（例えば 、生存可能な細胞とは沈降特性が異なる生育不能な細胞）を除去する。本発明は 、モノクローナル抗体を排出する培養ハイブリドーマ等の、タンパク質産生細胞 の発酵に特に適用される。 本装置は少なくとも３、５、１０または１５枚の様々な大きさの沈降面積を提 供する沈降面を有することが好ましい。いくつかの、または好ましくはすべての 面を規定する手段が取り外し可能である際には、より大きな汎用性が得られる。 各面の沈降特性は等しくない場合には類似であるため、本発明のほとんどの実 施態様においては、面は相互に平行である。しかしながら、場合によっては、特 定の面上の沈降特性が異なるように、例えば、液体の流入口部位等から生じる様 々な面の流量が異なるように、板のうち少なくとも１つが互いに若干集束する（ あるいは末広になる）ことが望ましい。 沈降面を規定する手段は板であることが好ましく、上部面（ここで沈 降及び滑りが起こる）が上記を目的に使用される。鏡面磨きされた(mirror-poli shed)ステンレス鋼によって優れた面が得られる。必要であればまたは好ましく は、特に鏡面磨きされた(mirror-polished)ステンレス鋼より安価な（及びより 有効でない）面を用いる際には、面をシリコーン材料等の、適当な潤滑剤で被覆 する；ジメチルジクロロシランが一例として挙げられる。板は、除去可能なよう に、積重ねて配置してもよい；他の実施態様としては、個々の板または板の組み 合わせが取り外し可能である。 面、及び本発明の好ましい実施態様においては板自身が垂直方向に対して傾斜 する角度は装置の特殊な器具によって決定される。 一般的には、角度は１０°〜５０°または８０°であるが、多くの用途では２ ０°〜４０°、または約３０°である。傾斜角度が調節できる手段が好ましい。 このような手段は調節可能な脚またはスタンドであってもよい。 傾斜角度は、装置が行う分離作業によって設定されるパラメーターの一つであ る。大量の液体は、一部のみを除去することを目的とする、異種の粒子集団を含 むものであってもよいと考えられる。様々な密度及び直径を有する粒子は異なる 速度で沈降するため、傾斜角度を含む、装置のパラメーターは不必要な粒子を除 去するように設定することができる。例えば、０．１ｃｍ／時間より大きいまた は０．０１〜１０ｃｍ／時間の沈降速度を有する粒子を除去することが望ましい ；ハイブリドーマ技術に本発明を適用する際には、生育不能な細胞から生存可能 な細胞を分離することが望ましい。 他のパラメーターとしては、液体の流速及び面の長さ（流れの方向に沿った） が挙げられる。液体の流速は装置の特殊な用途によって完全に変化する。細胞を リアクターシステムに保持しようとする、細胞上清液 体からハイブリドーマ細胞を分離する場合では、付属した発酵槽の面から発酵槽 の後ろへの細胞含有液の流速は、しばしば、０．５〜５ｄｍ³／時間であり、約 １ｄｍ³／時間であることが好ましい。この速度は細胞のタイプによって変化す る；細胞を流れ及び戻りのパイプウォーク(return pipework)の中で実質的な細 胞の沈降を防止するのに十分な速度で発酵槽に戻すことが初期の必要条件である 。 流れ方向の面の長さは必要により変えられる。５ｃｍから３０ｃｍの長さが一 般的である。生存可能な及び生育不能なハイブリドーマ細胞の両方を最大限保持 するためには、約３０ｃｍなどの長い長さが選択できる。生存可能なハイブリド ーマ細胞と生育不能なハイブリドーマ細胞とを最大限区別するためには、約１０ ｃｍなどの短い長さがより好ましい。一般的には、長さが短いほど、全体の沈降 効率は低いが、沈降タンクは生存可能な細胞と生育不能な（即ち、死んでいる） 細胞とをより区別できる。 板間の間隔は任意な距離でよく、一般的には０．２ｃｍから２ｃｍである。ハ イブリドーマを分離するためには、約０．５ｃｍが上清液の最適な流れ及び細胞 の沈降を生じさせると考えられる。前記で引用したバット(Batt)らの方程式を、 本発明による装置における板間の間隔を考慮して、以下のように修飾する： Ｓ（ｖ）＝ｖｎｗ（ｌｓｉｎθ＋ｂｃｏｓθ） ただし、Ｓ（ｖ）は浄化された流体の容積流量であり、 ｖは粒子の沈降速度であり、 ｎは板の数であり、 ｗは沈降タンク板の幅であり、 ｌは沈降タンク板の長さであり、 θは垂直方向に対する傾斜角度であり、 ｂは板間の間隔である。 この修飾された方程式は、数多くの様々な用途に対する、および目的とする使 用形態における面を規定する板の様々な数に関して、本発明による装置の寸法を 算出するのに用いられる。大きいまたは小さいスケールの装置は以下のように設 計される：大きいタイプの装置はより多くのおよび／またはより幅の広い板を有 する傾向にある。 板または他の面を規定する手段は一般的にハウジングに含まれる；このことは 装置を無菌的に操作しようとする際には重要であると考えられる。ハウジングは 長方形の断面を有し、適当な材料から構成される；電界研磨された、ステンレス 鋼が、無菌的な用途などの多くの用途で好ましい。ハウジングは目的とする使用 形態に必要な板の数より多い数の板を含むような大きさである；このような場合 、箱部材(box member)を、板が存在しないことにより生じる空隙を埋め、板の分 離を確保するために、使用してもよい（板状等の、鏡面磨きされたステンレス鋼 で構成されることが好ましい）。 分離される粒子を含む液体は流入口を通じてハウジングに入る；無菌的な設計 では、流入口は衛生的な連結部を有する。流入口は、一般的に、流れの方向に沿 った長手方向を最大限利用するために、沈降面の最下部の下あるいは余り上でな い所に位置する。 不必要な粒子が除去された液体は、流出口を通してハウジングから抜かれるが 、この際、ハウジングは同様に衛生的な連結部を備えていてもよい。流出口は、 一般的に、沈降面の長手方向の利用を最大限にするために、沈降面の最上部より 上あるいは余り下でない所に位置する。 粒子の収集用流出口は、面から滑り降りる沈降粒子が到達可能なハウジングの 最下点に設けられる。収集用流出口は、装置が付属したまたは操作して連結され た他の装置（例えば、発酵槽）に粒子を戻しやすくす る。 液体を沈降面から上方向に流す手段としては、必要であれば重力供給システム も容易に用いられるが、ポンプ（例えば、蠕動ポンプ）が挙げられる。 ポンプまたは液体を流す他の手段は、連続的に若しくは間欠的に作動してもよ い。間欠的に作動する場合には、ポンプを切っている間に、沈降が起こるが、周 辺の流体は静止している。これによって、正常な向流操作の際に生じるのと同様 、すでに沈降した細胞が液体の上方向に流れに妨げられずに沈降面を滑り降りる ことができる。間欠的な操作は、細胞が下に戻る速度を上げることにより細胞の 生存率及び生産性を向上することができる点で好ましい。 またはあるいは加えて、液体の流れは、例えば、５分間隔で約１分間、反対方 向になってもよい。ポンプの作動方向を逆にすることによってなされる、定期的 な逆流は、すでに沈降した細胞より上にある液体と同一方向(co-directional)に 動くことによって、短期間並流(co-current)沈降を生じさせ、細胞をより早く下 に戻すことを補助する効果を有する。 所定限度内で装置内の液温を維持する温度制御手段を設けてもよい。限度は、 使用目的によって変化し、例えば、１〜６０℃である。一般的には、２０〜４０ ℃の範囲内であり、温血動物細胞を含む液体では約３７℃である。温度制御手段 は水ジャケットあるいは他の適当な集成装置(arrangement)からなる。 明らかに示されているように、上記装置は細胞用の発酵槽に連結されてもよい 。したがって、本発明の第二の概念によると、液体培地中に細胞を含むように適 応される発酵槽容器、および上記装置からなるバイオリアクター器(bioreactor apparatus)であって、該装置が液体培地中の細胞または細胞集団を液体培地から 分離し、発酵槽容器に戻すことが可 能なように該発酵槽容器に連結されることを特徴とするバイオリアクター器を提 供するものである。 発酵槽容器は、（攪拌タンクまたはエアーリフト型等の）適当に懸濁できる設 計になっている。１つより多い沈降装置が平行に（または異なる沈降基準が他の 基準の後もう一つ用いられる際には、連続して）連結される。 発酵槽は、遺伝子操作によって修飾される、不死化される(immortalised)、他 の方法で修飾されるまたは修飾されないにかかわらず、哺乳動物、他の動物、植 物若しくは微生物細胞を培養するのに用いられる。本発明は、特に、例えば、モ ノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ細胞の連続灌流発酵に使用される。 本発明の第三の概念によると、粒子を大量の液体から分離して沈降面上に沈降 層を形成し粒子を滑り降ろすことが可能な速度で、垂直方向に対して傾斜した複 数の沈降面の上方向に粒子を含む液体を流すことからなる、大量の液体から粒子 を分離する方法を提供するものである。 本発明の各概念の好ましい形態は、必要な変更を加えて(mutatis mutandis)、 それぞれ他の概念と同様である。 本発明の好ましい実施態様を、以下の詳細な説明及び実施例において、添付し た図面を参照しながら、詳細に説明する。図を以下に説明する： 図１は、本発明の分離装置の縦断面図である； 図２は、図１の分離装置を２５ｄｍ³の発酵槽に付属させた概略図である； 図３は、実施例１において行われた実験中の時間に対する全細胞数及び生存可 能な細胞数、生存率（％）および灌流速度の変化を示すものである；および 図４は、実施例２において行われた実験中の時間に対する全細胞数及 び生存可能な細胞数、生存率（％）および灌流速度の変化を示すものである。 本発明による分離装置１の一般的な配置を図１に示す。装置１は、垂直方向に 対して３０°で傾斜した正方形チャンバー５中に挿入可能な硬質の積重ねを形成 する一緒に溶接された一連の板３を有する。正方形チャンバー５は、最小限のク リアランスを有する標準的な板を収納する大きさを有する箱型部材(box section )である。積重ねられた板３は４つのラグ７によって箱型部材内に保持される。 チャンバー５の箱型部材はテーパー付き下部チャンバー９状に引かれる；テーパ ー角度はすべて、積重ねられた板の傾斜角をまねて、垂直方向から３０°である 。テーパー付き下部チャンバー９は、トリ−クランプ（商標）(TRI-CLAMP^TM)コ ネクター１１によって１／２″（１．２７ｃｍ）の外径(OD)を有するチューブ状 で終わっている；これによって、再循環され沈降した材料を戻すための衛生的な 連結が可能になる。装置への流入口１３は、下部チャンバー９内に位置し、装置 １を再循環ループの発酵槽側に連結する。流入口１３は、流出口コネクター１１ への下部チャンバーを通じた再循環液の流路を形成するような角度を有する。沈 降動作は対流によって妨げられるので、装置１には正方形チャンバー５より大き な横断面を有するチューブから構成される水ジャケット１５が設けられている。 転移部(transition piece)１７によって円形ジャケットへの正方形箱型部材の流 出口が形成される。転移部１７は、トリ−クランプ(TRI-CLAMP)連結が設置され たヘッドプレート(headplate)１９に連結できる６″（１５．２７ｃｍ）のトリ −クランプ（商標）(TRI-CLAMP^TM)コネクターが設けられている。ヘッドプレー ト１９は、細胞が沈降した上清を抜くためのトリ−クランプ(TRI-CLAMP)コネク ターを有する排出管（１／２″または１．２７ｃｍの外径(OD)）２１を有する。 排出管２１は適当な無菌収 集タンクに接続されていてもよい。 水ジャケット１５には、沈降タンクの温度制御ができるサーモサーキュレイタ ー(thermocirculator)へのジャッケットの連結を容易にするホース接続部２３が 設けられている。装置１には３本の脚が設けられており、うち２本は固定された 脚２５でありもう１本は調節可能でかつ取り外し可能な脚２７である。調節可能 な脚２７は装置１の傾斜角度を変化させることができるが、このことは必要であ る。 装置１は全体が３１６Ｌステンレス鋼から構成される。この装置は、バイオ産 業または製薬産業に使用される小さな高品質のステンレス鋼製の容器の製造に熟 達した製作所によって製造される。溶接は高い水準で仕上げられる必要があり、 細胞懸濁液に接するすべての溶接部は目直しされ(dressed)かつ研削される(grou nd down)。板３は、積重ねて一緒に溶接される前に鏡面磨きされており、構築中 に表面仕上げをひっかいたりまたは傷付けたりしないようによく注意を払わなけ ればならない。残りの容器の内表面は平滑な仕上げが得られるように電解研磨さ れる。 使用する際には、図２に概略的に示されるように、哺乳動物細胞の培養物は適 当な大きさ、例えば、１０〜３０ｄｍ³の作業容積を有する発酵槽３１中に接種 される。発酵槽３１は、溶存酸素レベル、ｐＨ、過圧温度(temperature overpre ssure)及び混合比を制御可能である必要がある。また、発酵槽３１は、流出口３ ５で沈降タンクを経て培地を含む産物をからにするための抽出とのバランスをと るために、流入口３３を通じて供給される新鮮な培地を供給する連続した操作が 可能である必要がある。発酵槽３１は、細胞が成長の対数中期(mid-logarithmic phase)にくるまでバッチモード(batch mode)等で初めは操作される。発酵槽は 、例えば、０．２ＢａｒＧのやや過圧下で操作される。この時点で、水ジャケッ ト１５が予め発酵槽と同じ温度に調節された、分離装置１を有す る外部ループ３７，３９は、バルブ４１で分離装置１のガス抜きをすることによ って発酵槽の内容物でゆっくり満たされる。発酵槽３１は加圧されるので、発酵 槽の内容物で分離装置１は満たされる。発酵槽３１は、充填処理中新鮮培地収納 タンクから新鮮な培地で作業レベルまで補充される。 再循環ポンプ４３を有する再循環ループ３７，３９は、沈降タンクの再循環／ 戻しチャンバーを通して発酵槽から細胞を継続的に通過させるために作動され始 める。さらに、このシステムは１から１８時間の間平衡化される。これによって 、沈降タンク中に抽出された細胞内容物は沈降することになる。ここで、収集用 ポンプ４５を作動し始めることによって、灌流を開始してもよい。初めは、灌流 速度は１／２ｖｖｄ以下であるが、その後、灌流速度を、細胞の成長及び培地の 利用状態によって、発酵槽の細胞支持能（一般的にはＯ₂輸送速度）または沈降 タンクの細胞保持能の限界がくるまで、上げてもよい。 その後、発酵槽／沈降タンクのシステムは、新鮮な培地の一定の供給及び一定 の抽出が維持できるならば、長期間作動できる。再循環ポンプ４３は一定速度で 運転されるため、収集用ポンプ４５の速度を上げると、発酵槽から沈降タンクへ の流れは、全システムが発酵槽から加圧されているため、自動的に補正される。 または、ポンプが運転している際には細胞懸濁液を沈降板から抽出し、上記し たように、正常な向流モードで沈降が生じるように、時限装置で順次ポンプを脈 動させて(pulse on and off)もよい。ポンプを切った際には、沈降は起こるが周 囲の液は静止している。これによって、正常な向流操作中に生じるのと同様に、 すでに沈降した細胞が液体の上方向への流れによる妨害を何等受けることなく沈 降板を滑り降ろすことができる。この技術によって、細胞が発酵槽に戻る速度が 増加し、ゆえに細胞 の生存率及び生産性が向上できる。 上記方法をさらに改善したものが、ポンプ４５の流れを周期的（例えば、５分 間隔で１分間）逆行させることによって短期間並流沈降(co-current settling) を生じさせ、すでに沈降した細胞より上にある液体の同一方向の動きによって細 胞をより早く発酵槽に戻すのを補助することである。 本装置は、以下を含む多くの他の形態の様々な過程でも使用することができる ： １．（さらに処理若しくは殺すために水溜め(sump)中に間欠的にまたは処理終 了時に除去することを目的とした）沈降した粒子／細胞は再循環せずに粒子／細 胞含有液体が沈降タンクの下部に入り粒子／細胞を含まない流れを抜き出し、粒 子／細胞は沈降タンクの下部に保持される粒子／細胞を含む液体の単一の通過に よる浄化。 ２．連続した２つ以上の沈降タンクの使用であって、第一のタンクは発酵槽に 戻すための生存可能な細胞の保持を目的とし、第二またはそれ以降のより大きな 沈降タンクはさらなる下流加工(downstream processing)前の全細胞の保持を目 的とする。 他の実施態様としては、１５枚の板を有する装置１（fifteen plate device) 及び１０枚の板を有する装置１(ten plate device)が挙げられる。沈降タンクの 本体は挿入の構造が異なるのみで両方の場合で一致していてもよい。したがって 、１０枚の板の挿入は、５枚の板を水密性箱（鏡面磨きされた）によって置き換 えられた以外はすべての点で１５枚の板を挿入した場合と一致していてもよい。 １０枚の板の挿入の場合の板の長さは１０ｃｍである。 実施例１−ハイブリドーマ細胞の生育 ＥＳ４と称する細胞系由来のマウスのハイブリドーマ細胞を培養し、 ２５ｄｍ³のエアーリフト型の発酵槽（チェマップ チューリッヒ(Chemap Zuric h)製）に接種するには十分な細胞を得た。この細胞は、当該分野において既知の 一般的な方法で、マウスの脾細胞及びマウスのミエローマ細胞から融合されたも のであり、培養するとヒトのＢ血液型抗原に対する抗体を産生する不死の細胞系 を構成する。 接種材料を、約１０⁷個の凍結細胞を含むアンプルを入れ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ （ギブコ(Gibco)製）に５％ウシ胎児血清を加えた混合液中で３７℃でフラスコ 中で培養することによって調製した。この培養物をフラスコ中で連続的に拡張し 、上記培地中に１０⁵細胞／ｍｌを含むようにして１ｄｍ³の攪拌容器に撒くのに 十分な細胞を得た。さらに細胞を生育させ、１ｄｍ³の攪拌培養物を用いて、さ らに４ｄｍ³の作業容積を有する攪拌容器に撒いた。この４ｄｍ³の攪拌培養物を 用いて２５ｄｍ³の発酵槽に接種した。 発酵槽における初期細胞密度（０日目）は、０．７×１０⁵個生存可能細胞／ ｍｌであった。この発酵槽を、温度が３７℃、ｐＨが７．２及び溶存酸素（ｄＯ ）が空気飽和の５０％になるように制御した。ガスの散布速度は２０ｄｍ³のガ ス／時間に設定した。ガスは、ｐＨ及びｄＯに関して予め設定された制御バルブ を維持する全ガス流れ中に酸素、二酸化炭素及び窒素を混合した空気を含むもの であった。本実験をＳＡＬ ０２４と称した。 培地は、再度、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に５％ＦＣＳを加えたものであった。発酵槽 の作業容積は２１ｄｍ³であった。生存可能な細胞数が８６％の生存率で５×１ ０⁵個／ｍｌに達するまで、３日間バッチモードで任意に生育させた。 予めオートクレーブ滅菌された分離装置１（沈降タンク）を図２に示されるよ うに発酵槽に付属させ、発酵槽に無菌的に接続するためにシリ コーンチューブを再循環流出口及び流入口からニードルコネクター(needle conn ector)（チェマップ(Chemap)製）に繋いだ；沈降タンクのジャケットを満たし、 発酵槽温度と同じになるように３７℃で平衡化した。沈降タンクから捕集された 空気を抜くことによって、沈降タンクを発酵槽の内容物でゆっくり充填した。沈 降タンクへの発酵槽からの培養物の損失容積分は、新鮮な培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１ ２に５％ＦＣＳを加えたもの）で培地供給システムによって自動的に置換された 。再循環ポンプ４３を始動し、全システムを２時間で平衡化させ、沈降し戻した 細胞を発酵槽内に導入した。 浄化された液体を、１０ｄｍ³／日（灌流速度では抽出される容積／発酵槽の 容積／日）の初期速度で沈降タンクから抜き出した。この速度は、９日間で最大 ５０ｄｍ³／日まで急速に上昇した。 生存可能細胞集団は、１２日後約５×１０⁶個細胞／ｍｌ（５０ｄｍ³／日の灌 流速度に一致）にまで上昇した。この状態はさらに１０日間比較的一定を保った 。全細胞数（生存可能な細胞に死細胞を加えたもの）は１２日目から１５日目の 間に鋭く上昇したが、それ以降は上昇度がより鈍くなった。 したがって、全細胞集団が増加し、生存率は減少しながら、一定の生存可能細 胞集団が維持された。発酵槽の設定値の制御の問題によって生存可能細胞集団が 減少しその後実験を終了させた２２日目まで、この状態は維持された。結果を図 ３に示す。 全体で９３５ｄｍ³の培地を使用した。始めの１００ｄｍ³はＤＭＥＭ／Ｆ１２ に５％ＦＣＳを加えたものであり、それ以降の培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２に２％Ｆ ＣＳを加えたものであった。これによって、全体で３４．９ｇの抗体が得られた 。 本実験を通して、沈降タンクは９５〜９９％の細胞を保持した。具体 的には、０．５×１０⁵個の生存可能細胞および２×１０⁵個の死細胞が沈降して 取り出された。これは、９９％の生存可能細胞が保持され、９６％の死細胞が保 持されたことを意味する。 実施例２ すべての操作条件（灌流速度を除く）は実施例１と同様で繰り返した；結果を 図４に示す。本実験をＳＡＬ ０２７と称した。 実施例３−生存可能及び死細胞保持に関する沈降効率 発酵は、以下のように変更する以外は実施例２と同様にして行った： １．使用した細胞系がＢＩＲＭＡ １であり、この細胞系はＡ血液型物質に特 異的な抗体を分泌するマウスのハイブリドーマである。 ２．接種してから９日後の灌流速度が５０ｄｍ³／日であり、発酵槽内の細胞 集団は、３．７６×１０⁶個の生存可能細胞でおよび５．０８×１０⁶個の全細胞 で安定化した。（全細胞数は生存可能及び死細胞の合計である。）収集の流れで は、生存可能細胞は０．３×１０⁵個であり、全細胞は２×１０⁵個であり、これ より９９％の生存可能細胞の保持および９６％の全細胞の保持が得られた。 ３．灌流速度を段階的に上昇させ、沈降タンクの保持効率を試験した（結果は 下記表を参照）。 上記結果から、灌流速度が４．３８ＶＶＤまでは収集の流れ１ｍｌ当たりの細 胞の損失は有効には上昇していないことが分かる。上記発酵では、３．６２の灌 流速度での沈降タンクを経た発酵槽からの細胞の全損失は３．２７×１０¹⁰であ った。全発酵槽の内容物は１．５９×１０¹¹であり、発酵槽からの細胞の全損失 は２０％であった。発酵槽は細胞の成長によってこれらの損失した細胞を置換す ることができる。 ４．３８ＶＶＤの灌流速度では、発酵槽からの沈降材料１ｍｌ当たりの細胞の 損失割合（％）は実質的には上昇しない；しかしながら、１日当たりの全細胞損 失は灌流速度の上昇により増加し、３．８×１０¹⁰である。発酵槽における全細 胞数は１．０６×１０¹¹であり、これから発酵槽からの細胞の全損失は３６％で あることが示される。発酵槽内の生存可能な細胞数及び全細胞数は両方とも減少 していることから、発酵槽はこの速度では細胞を置換せずに細胞が損失すると結 論付けられた。 灌流速度を６．０３ＶＶＤまで上昇させると、１時間後に生存可能な細胞及び 全細胞の数は両方とも収集の流れにおいて増加しており、全細胞が４．８×１０¹⁰ 個である発酵槽に対して１日当たり６．６×１０¹⁰個が損失することが示され た。このことは、この速度では全細胞の流失が迅速に成されることを示すもので ある。細胞の損失のさらなる増加が８．１ＶＶＤの灌流速度で観察された。 ２１ｄｍ³のエアーリフト型の発酵槽を用いた際の沈降タンクの大きさに関す る上記結果から、最大の灌流速度は７６ｄｍ³／日（または３．６２ＶＶＤ）で ある。このようなタイプの実験を用いることによって必要とされる灌流速度に対 する沈降タンクの大きさの最適な構成が推察できる。 実施例４−生育不能な細胞の漏出実験 以下のように変更する以外は実施例３と同様の発酵を行った： １．使用した細胞系がＮＥＬＰ ３であり、この細胞系はＲｈＤ血液型物質に 特異的な抗体を分泌するヒトのヘテロハイブリドーマである。 ２．沈降装置は、それぞれの板の大きさが長さ１０ｃｍで幅１０ｃｍである１ ５枚の板を挿入したものを用いた。生育不能な細胞に関して１．１ｃｍ／時間の 沈降速度では、１０ｃｍの板では、修飾されたバット(Batt)らの方程式により、 交換速度が２１．５ｄｍ³／日、即ち約１ＶＶＤを超えると生育不能な細胞の漏 出を示すことが予想された。 灌流速度を段階的に上昇させ、沈降タンクの保持効率及び漏出レベルを試験し た（結果は下記表を参照）。 上記結果から、灌流速度が約１．５７までは収集の流れ１ｍｌ当たりの細胞の 損失は有効には上昇しないことが分かる。 この灌流速度を超えると、生育不能な細胞の濃度の増加が収集の流れ中に観察 され、全細胞保持効率が２．３８ＶＶＤで７９．６％まで減少した。生存可能な 細胞の保持もまた減少するが、その減少度合いは上記より少ない。これより、本 沈降装置は、２１ｄｍ³／日未満では、全細胞の保持と共に、生育不能な細胞に 関して計算されるような挙動を示すが、上記流速を超えると、より小さな生育不 能な細胞が漏出することが示される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年３月２４日 【補正内容】 水ジャケット１５には、沈降タンクの温度制御ができるサーモサーキュレイタ ー(thermocirculator)へのジャッケットの連結を容易にするホース接続部２３が 設けられている。装置１には３本の脚が設けられており、うち２本は固定された 脚２５でありもう１本は調節可能でかつ取り外し可能な脚２７である。調節可能 な脚２７は装置１の傾斜角度を変化させることができるが、このことは必要であ る。 装置１は全体が３１６Ｌステンレス鋼から構成される。この装置は、バイオ産 業または製薬産業に使用される小さな高品質のステンレス鋼製の容器の製造に熟 達した製作所によって製造される。溶接は高い水準で仕上げられる必要があり、 細胞懸濁液に接するすべての溶接部は目直しされ(dressed)かつ研削される(grou nd down)。板３は、積重ねて一緒に溶接される前に鏡面磨きされており、構築中 に表面仕上げをひっかいたりまたは傷付けたりしないようによく注意を払わなけ ればならない。残りの容器の内表面は平滑な仕上げが得られるように電解研磨さ れる。 使用する際には、図２に概略的に示されるように、哺乳動物細胞の培養物は、 延伸チューブ１０を含む、適当な大きさ、例えば、１０〜３０ｄｍ³の作業容積 を有する発酵槽３１中に接種される。発酵槽３１は、溶存酸素レベル、ｐＨ、過 圧温度(temperature overpressure)及び混合比を制御可能である必要がある。ま た、発酵槽３１は、流出口３５で沈降タンクを経て培地を含む産物をからにする ための抽出とのバランスをとるために、流入口３３を通じて供給される新鮮な培 地を供給する連続した操作が可能である必要がある。発酵槽３１は、細胞が成長 の対数中期(mid-logarithmic phase)にくるまでバッチモード(batch mode)等で 初めは操作される。発酵槽は、例えば、０．２ＢａｒＧのやや過圧下で操作され る。この時点では、 請求の範囲 １．垂直方向に対して傾斜した複数の沈降面を規定する手段、および粒子を大量 な液体から分離して面上に沈降層を形成し粒子を滑り降ろすことが可能な速度で 粒子を含む液体を沈降面の上方向に流す手段からなる、無菌または滅菌条件下で 大量の液体から粒子を分離する装置。 ２．少なくとも１５枚の沈降面を有する、請求の範囲第１項に記載の装置。 ３．沈降面を規定する手段が板である、請求の範囲第１または２項に記載の装置 。 ４．少なくとも各板の上部面は鏡面磨きされたステンレス鋼から形成される、請 求の範囲第３項に記載の装置。 ５．面が垂直方向に対して傾斜する角度が１０°から５０°である、請求の範囲 第１から４項のいずれかに記載の装置。 ６．面が垂直方向に対して傾斜する角度が調節可能である、請求の範囲第１から ５項のいずれかに記載の装置。 ７．該装置は０．５〜５ｄｍ³／時間の範囲の液体の流速で使用される、請求の 範囲第１から６項のいずれかに記載の装置。 ８．板間の間隔が０．２ｃｍから２ｃｍである、請求の範囲第３または４項に記 載の装置。 ９．面を規定する手段が分離される粒子を含む液体の流入口、粒子が分離された 液体の流出口および分離された粒子の収集用流出口を備えたハウジング中に含ま れる、請求の範囲第１から８項のいずれかに記載の装置。 １０．液体を沈降面の上方向に流す手段がポンプである、請求の範囲第１から９ 項のいずれかに記載の装置。 １１．該ポンプが間欠的な操作が可能である、請求の範囲第１０項に記載の装置 。 １２．該ポンプが定期的に流れを逆行させることが可能である、請求の範囲第１ ０または１１項に記載の装置。 １３．装置内の液温を所定の限度内に維持する温度制御手段を有する、請求の範 囲第１から１２項のいずれかに記載の装置。 １４．生存可能なまたは全ハイブリドーマ細胞を細胞含有培地から除去するため に用いられる、請求の範囲第１から１３項のいずれかに記載の装置。 １５．液体培地中に細胞を含むように適応される発酵槽容器、および無菌または 滅菌条件下における操作用の請求の範囲第１から１４項のいずれかに記載の装置 からなるバイオリアクター器であって、該装置が液体培地中の細胞または細胞集 団を液体培地から分離し、発酵槽容器に戻すことが可能なように該発酵槽容器に 連結されることを特徴とするバイオリアクター器。 １６．該発酵槽が攪拌タンクまたはエアーリフト型の発酵槽である、請求の範囲 第１５項に記載のバイオリアクター器。 １７．該発酵槽が哺乳動物細胞を培養するために用いられる、請求の範囲第１５ または１６項に記載のバイオリアクター器。 １８．粒子を大量の液体から分離して沈降面上に沈降層を形成し粒子を滑り降ろ すことが可能な速度で、垂直方向から傾斜した複数の沈降面の上方向に粒子を含 む液体を流すことからなる、無菌または滅菌条件下で大量の液体から粒子を分離 する方法。 １９．少なくとも１５枚の沈降面が存在する、請求の範囲第１８項に記載の方法 。 ２０．沈降面が板によって規定される、請求の範囲第１８または１９項 に記載の方法。 ２１．少なくとも各板の上部面は鏡面磨きされたステンレス鋼から形成される、 請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２２．面が垂直方向に対して傾斜する角度が１０°から５０°である、請求の範 囲第１８から２１項のいずれかに記載の方法。 ２３．面が垂直方向に対して傾斜する角度が調節可能である、請求の範囲第１８ から２２項のいずれかに記載の方法。 ２４．液体の流速が０．５〜５ｄｍ³／時間である、請求の範囲第１８から２３ 項のいずれかに記載の方法。 ２５．板間の間隔が０．２ｃｍから２ｃｍである、請求の範囲第２０または２１ 項に記載の方法。 ２６．該面が分離される粒子を含む液体の流入口、粒子が分離された液体の流出 口および分離された粒子の収集用流出口を備えたハウジング中に含まれる、請求 の範囲第１８から２５項のいずれかに記載の方法。 ２７．液体がポンプによって沈降面の上方向に流される、請求の範囲第１８から ２６項のいずれかに記載の方法。 ２８．液温が所定の限度内に維持される、請求の範囲第１８から２７項のいずれ かに記載の方法。 ２９．生存可能なまたは全ハイブリドーマ細胞を細胞含有培地から除去すること からなる、請求の範囲第１８から２８項のいずれかに記載の方法。 【図２】 【図４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウィルソン，ジェームズ，サミュエル イギリス国，ミドロチアン イーエッチ26 ９エッチエッチ，ペニクィック，グレン クロス ガーデンズ 23

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．垂直方向に対して傾斜した複数の沈降面を規定する手段、および粒子を大量 な液体から分離して面上に沈降層を形成し粒子を滑り降ろすことが可能な速度で 粒子を含む液体を沈降面の上方向に流す手段からなる、大量の液体から粒子を分 離する装置。 ２．少なくとも１５枚の沈降面を有する、請求の範囲第１項に記載の装置。 ３．沈降面を規定する手段が板である、請求の範囲第１または２項に記載の装置 。 ４．少なくとも各板の上部面は鏡面磨きされたステンレス鋼から形成される、請 求の範囲第３項に記載の装置。 ５．面が垂直方向に対して傾斜する角度が１０°から５０°である、請求の範囲 第１から４項のいずれかに記載の装置。 ６．面が垂直方向に対して傾斜する角度が調節可能である、請求の範囲第１から ５項のいずれかに記載の装置。 ７．液体の流速が０．５〜５ｄｍ³／時間である、請求の範囲第１から６項のい ずれかに記載の装置。 ８．板間の間隔が０．２ｃｍから２ｃｍである、請求の範囲第３または４項に記 載の装置。 ９．面を規定する手段が分離される粒子を含む液体の流入口、粒子が分離された 液体の流出口および分離された粒子の収集用流出口を備えたハウジング中に含ま れる、請求の範囲第１から８項のいずれかに記載の装置。 １０．液体を沈降面の上方向に流す手段がポンプである、請求の範囲第１から９ 項のいずれかに記載の装置。 １１．該ポンプが間欠的な操作が可能である、請求の範囲第１０項に記載の装置 。 １２．該ポンプが定期的に流れを逆行させることが可能である、請求の範囲第１ ０または１１項に記載の装置。 １３．装置内の液温を所定の限度内に維持する温度制御手段を有する、請求の範 囲第１から１２項のいずれかに記載の装置。 １４．生存可能なまたは全ハイブリドーマ細胞を細胞含有培地から除去するため に用いられる、請求の範囲第１から１３項のいずれかに記載の装置。 １５．液体培地中に細胞を含むように適応される発酵槽容器、および請求の範囲 第１から１４項のいずれかに記載の装置からなるバイオリアクター器であって、 該装置が液体培地中の細胞または細胞集団を液体培地から分離し、発酵槽容器に 戻すことが可能なように該発酵槽容器に連結されることを特徴とするバイオリア クター器。 １６．該発酵槽が攪拌タンクまたはエアーリフト型の発酵槽である、請求の範囲 第１５項に記載のバイオリアクター器。 １７．該発酵槽が哺乳動物細胞を培養するために用いられる、請求の範囲第１５ または１６項に記載のバイオリアクター器。 １８．粒子を大量の液体から分離して沈降面上に沈降層を形成し粒子を滑り降ろ すことが可能な速度で、垂直方向から傾斜した複数の沈降面の上方向に粒子を含 む液体を流すことからなる、大量の液体から粒子を分離する方法。 １９．少なくとも１５枚の沈降面が存在する、請求の範囲第１８項に記載の方法 。 ２０．沈降面が板によって規定される、請求の範囲第１８または１９項に記載の 方法。 ２１．少なくとも各板の上部面は鏡面磨きされたステンレス鋼から形成される、 請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２２．面が垂直方向に対して傾斜する角度が１０°から５０°である、請求の範 囲第１８から２１項のいずれかに記載の方法。 ２３．面が垂直方向に対して傾斜する角度が調節可能である、請求の範囲第１８ から２２項のいずれかに記載の方法。 ２４．液体の流速が０．５〜５ｄｍ³／時間である、請求の範囲第１８から２３ 項のいずれかに記載の方法。 ２５．板間の間隔が０．２ｃｍから２ｃｍである、請求の範囲第２０または２１ 項に記載の方法。 ２６．該面が分離される粒子を含む液体の流入口、粒子が分離された液体の流出 口および分離された粒子の収集用流出口を備えたハウジング中に含まれる、請求 の範囲第１８から２５項のいずれかに記載の方法。 ２７．液体がポンプによって沈降面の上方向に流される、請求の範囲第１８から ２６項のいずれかに記載の方法。 ２８．液温が所定の限度内に維持される、請求の範囲第１８から２７項のいずれ かに記載の方法。 ２９．生存可能なまたは全ハイブリドーマ細胞を細胞含有培地から除去すること からなる、請求の範囲第１８から２８項のいずれかに記載の方法。