JPS63252558A - 細胞分離装置及び細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ａ）産業上の利用分野 本発明は、動物細胞分離装置及び動物細胞の培養方法に
関するものである。更に詳しくは、動物細胞の分離装置
及びサスペンジョン状態で動物細胞を培養する方法に関
するものである。

（ｂ）従来技術 細胞培養技術は、例えばウィルス、ワクチン。

インターフェロンの如き抗ウィルス削成いはホルモンの
如き生物薬品の製造にとって重要である。

更に近年特定タンパク貿などを標的とするモノクローナ
ル抗体の生産は抗体産生細胞とミエローマによるハイブ
リドーマの培養によるものであり、その技術の解決は工
業的に重要なテーマである。

従来、細胞培養は一般にシャーレ試験管、培養びんなど
を用いて実験室的規模で行われている。

一方近年細胞の培養法及びそのための装置として、いく
つかの提案が為されている。これらの提案は、大きく分
けて付着培養（ａｎｃｈｏｒａｇｅ　ｄｅｐｅｎｄ−ｅ
ｎｔ、　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）と浮遊培養、つまりサスペン
ジョン培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ）
との２つの方式に分類されるが、これらの方式は培養さ
れる細胞の特性によっていずれかに決められる。

このうちサスペンジョン培養に関して下記の提案がなさ
れている。例えばマグネティックスターラーもしくは機
械的に駆動されるシャフト上の羽根車によって、スピナ
ーフラスコの中に調整された攪拌機能を設けた培養方法
が提案されている（米国特許第２，９５８，５１７号お
よび同第３．６４９．４６５号明細書参照）。

特開昭５７−６５１８０号公報には、回転可能なシャフ
ト上に支持される少くとも１枚の比較的大表面積の屈撓
性シートを攪拌機とし、該攪拌機を回転させて該シート
を波立たせ、それによってヒトの２倍体細胞のような成
る種の虚弱細胞に対し所望の穏やかな攪拌を作り出すサ
スペンジョン培養装置が提案されている。

しかし、上記装置による培養方法においては、細胞が一
定量の栄養分の中で培養されるため細胞の生長増殖は比
較的低い密度で停止する。

細胞のサスペンジョン培養において、細胞の生長増殖が
比較的低い密度で停止するのを防ぎ、細胞を大量に且つ
高密度で培養するために、一般に新しい培養液を培養槽
中へ供給しつつ成育阻害物質を含んだ古い培養液を培養
槽外へ排出しながら培養する方法、すなわち通称バーヒ
ユージョン方式と言われる方式が提案されてい°る（　
Ａｎｎｕａ　ＩＲｅｐｏｒｔｓ　ｏｎ　Ｆｅｒｍｅｎｔ
ａｔｉｏｎ　Ｐｒ０ＣｅＳＳｅＳ、　ＶＯｌ、６）。

この方式を用いて培養するに当って重要なことの１つは
、サスペンジョン液中の生細胞と前記古い培養液とを効
率よく分離し、古い倍溶液を培養槽外へ取出し、培養槽
内の細胞の成育環境を最適条件下に維持することである
。サスペンジョン液から生細胞と古い培養液とを分離す
るために種々のフィルターやまた種々の形式が提案され
ているが、フィルターの口塞りヤ、装置の構造の煩雑性
などの点で工業的培養装置としてはいずれも満足すべき
ものとは言い雌い。

特開昭５９−８２０８３＠公報および特開昭６０−９４
８２号公報には、培養装置内に細胞沈澱管を兼ねた培養
上清排出管と新鮮培地添加用の導管を設け、該導管から
培地を添加し同時に上記排出管から培養土清を排出しつ
つ培養を行うようにした浮遊細胞の高′ａ度培養装置が
提案されている。

一般に、浮遊性の動物細胞は数ミクロンないし数１０ミ
クロンと小さくしかもその比重は培地の比重と大きな差
がないため、浮遊細胞と培地とを重力によって分離する
上記の如き装置では、細胞沈降を有利に達成するために
沈降面積を大きくする必要がおるが、上記２件の特開昭
に開示された装置では沈降面積をあまり大きくとること
はできない。

特願昭６０−１９２３８＠明細書には、細胞の大量且つ
高密度の培養に適したパーヒユージョン方式による工業
的装置および方法が本発明者その一部によって提案され
ている。該細胞培養槽は、細胞のサスペンジョン培養ゾ
ーン、細胞のセトリングゾーン、該セトリングゾーンか
らの培養液排出口および該リスペンション培養ゾーン系
の培養液供給口とを有し、該サスペンジョン培養ゾーン
と該セトリングゾーンとは該細胞培養槽内で該セトリン
グゾーンの下方部位を通じて連絡するように仕切りによ
って仕切られており、そして該セトリングゾーンは該細
胞培養槽の槽側壁と該仕切りの間に形成されていること
を特徴とする装置によって達成される。

（Ｃ）発明の目的 本発明の目的は、動物細胞の有利な分離装置及びサスペ
ンジョン培養液から動物細胞を生きたまま分離する簡単
な工程を含む動物細胞の培養方法を提供することにある
。

本発明の他の目的は、動物細胞のサスペンジョン培養液
の一部を培養槽から抜出し、抜出したその培養液につい
て動物細胞を生きたまま分離する操作を実施する工程を
含む動物細胞の培養方法を提供することにある。

本発明のざらに他の目的は、動物細胞のサスペンジョン
培養液の一部から分離した動物細胞を再び培養槽に戻し
、一方動物細胞と分離された古い培養液を除去しそして
除去した量に相当するだけ新しい培養液を培養槽に補充
する、動物細胞の培養方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、動物細胞を高密度で含有す
る大量のサスペンジョン培養液の使用を実現することが
できる、パーヒユージョン方式による工業的な効率的培
養方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、微生物、酵母等と異なり外
力により変形し易く破壊され易い動物細胞を、それを含
む培養液から、遠心分離装置により生きたまましかも効
率よく分離するための装置及びその装置を使用した動物
細胞の培養方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、遠心分離装置による上記分
離を達成するために、遠心力作用時の動物細胞の沈降面
の構造に特徴を有する遠心分離装置を用いて、該分離を
実施する工程を含む、動物細胞の培養方法を提供するこ
とにある。

本発明のざらに他の目的は、遠心分離装置から、分離さ
れた動物細胞を生きたまま円滑に取出すことのできる工
夫を含む、上記培養方法を提供することにある。

本発明のざらに他の目的および利点は以下の説明から明
らかとなろう。

本発明のかかる目的および利点は、本発明によれば、 （ａ）サスペンジョン培養液の供給口、（ｂ）沈降した
動物細胞が遠心力によって沈降面に沿って移動しうるよ
うな構造を有する該沈降面、 （Ｃ）沈降面に沿って移動した動物細胞が集合する動物
綿ｒｌ！集合部、 （ｄ）該動物細胞集合部から該動物細胞を取出すための
取出口、および （ｅ）動物細胞が分離された培養母液を排出するための
母液排出口、 を備えた動物細胞分離装置によって達成され、ざらに本
発明によれば、 （Ａ）動物細胞を培養槽内でサスペンジョン培養に付し
、 （８）該培養槽より動物細胞を含むサスペンジョン培養
液の１部分を抜き出し、 （Ｃ）抜き出した該サスペンジョン培養液を遠心分離装
置へ供給して該サスペンジョン培養液から動物細胞を分
離し、 （Ｄ）該分離された動物細胞を遠心分離装置から取出し
、そして （Ｅ）該取出された動物細胞の少くとも１部分を上記（
Ａ）工程のため培養槽に戻す、 ことによる動物細胞培養方法において、該遠心分離装置
として前記（ａ）〜（ｅ）を備えた細胞分離装置を使用
する動物細胞培養方法によって達成される。

本発明の動物細胞の培養方法はサスペンジョン型の動物
細胞の培養（サスペンジョン培養）に適用される。サス
ペンジョン培養とは、水性媒体中で細胞それ自体を浮遊
させながら培養する方法をいう。

本発明の培養方法において、培養の対象となる動物細胞
は、サスペンジョン状態にて成育ないし増殖可能なもの
であり、天然の動物細胞のみならず、人為的或いは遺伝
子操作により変性された細胞例えばハイブリドーマであ
ることができ、またＩＬ−２の如きリンホカインを産生
ずるリンパ球由来の細胞、インターフェロン（ＩＦＮ）
の如き有用な生理活性物質を産生ずる２倍体細胞、ある
いは種々のモノクローナル抗体を、産生ずる細胞である
ことができる。本発明は、モノクローナル抗体を高い濃
度で１７る目的のため七ツク［］−ナル抗体を産生ずる
細胞の培養に対して特に適している。

本発明の上記（＾）工程は、上記の如き動物細胞を培養
槽内で９スペンジヨン培養に付す工程である。１ノスペ
ンジヨン培養に用いられる培養液は実質的に水よりなる
水性媒体である。該水性媒体は、動物細胞の培養に通常
使用される各種添加物例えば種々の無機塩、ビタミン類
、補酵素、ブドウ糖。

アミノ酸、抗生物質、生長促進因子などを含有している
。

また培養液には血清を加えることもできるが、血清をも
ちいない所謂無血清培地を培養液として使用することも
できる。無血清培地を使用するのが経済的に有利であり
、望ましい。

培養槽としては、動物細胞の仕込口、新しい培養培地の
仕込口、空気導入管、Ｗｔ拌機およびサスペンジョン培
養液の抜出し導管を少くとも備えたものが使用される。

このような培養槽は通常の培養タンクであることができ
る。

上記（８）工程は、培養槽より動物細胞を含むサスペン
ジョン培養液の１部分を、例えば培養槽からの培養液抜
出し導管を通じて、抜出す工程である。サスベンジフン
培養液の抜出しは、連続的にあるいは断続的に（間歇的
に）行うことができる。

抜出された動物細胞を含むシスペンション培養液の層に
見合う量で、新しい培養液を培養槽に連続的にあるいは
断続的に導入するのが望ましい。かくして、培養槽内の
サスペンジョン培養液中の主として動物細胞の代謝産物
からなる動物細胞の生育を阻害する（良くない影響を与
える）物質の濃度を、常に且つ可成り低水準に維持でき
ることとなり、その結果該サスペンジョン培養液中の動
物細胞の成育密度を増大させて培養を実施することを可
能とする。

このようにして、動物細胞の成育密度が増大した分だけ
、該動物細胞の生育に伴う有用な代謝産物の産生量を増
大させることが可能となる。

もらろん、上記の如く動物細胞の生育を阻害する物質の
濃度を低水準に、充分な管理の下に、維持することによ
って、動物細胞の増大した成育密度を長期間に亘って保
持したまま培養を実施しつづけることができ、有用な代
謝産物の増大した産生量を確保できることとなる。

培養槽から抜出された動物細胞を含むリスペンション培
養液は、上記（Ｃ）工程において遠心分離装置へ供給さ
れ、そこで動物細胞は分離される。

遠心分離装置へのサスペンジョン培養液の供給は、該装
置により処理可能な量を一度に仕込んでもよく、あるい
は連続的に少量ずつ行ってもよい。

分離された動物細胞を含む成分と古い培養液を遠心分離
装置から取出すには、遠心分離装置を回転させたまま連
続的に取出してもあるいは遠心分離装置の回転を停止し
て取出してもよい。

本発明によれば、例えば遠心分離装置へのサスペンジョ
ン培養液の供給を連続的に少量ずつ行いそして分離され
た動物細胞を含む成分と古い培養液との取出しを、別々
にしかしながらいずれも連続的に少量ずつ行う方法（以
下連続法という）、あるいは遠心分離装置へのサスペン
ジョン培養液の供給と分離された古い培養液の取出しを
連続的に少量ずつ行うが、該培養液の供給をある時間経
過した後停止し、しかるのち分離された動物細胞を含む
成分を取出す方法（以下、断続法という）によって、工
業的に特に有利に工程（Ｃ）を実施しうる。

上記（Ｃ）工程の実施に用いる遠心分離装置としては、 （ａ）リスペンション培養液の供給口、（ｂ）沈降した
動物細胞が遠心力によって沈降面に沿って移動しうるよ
うな構造を有する該沈降面、 （Ｃ）沈降面に沿って移動した動物細胞が集合する動物
細胞集合部、 （ｄ）該動物細胞集合部から該動物細胞を取出すだめの
取出口、および （ｅ）動物細胞が分離された培養母液を排出するだめの
母液排出口、 を備える遠心分離装置が使用される。

上記遠心分離装置の特徴は、上記（ｂ）の沈降面と上記
（Ｃ）の動物細胞集合部を有する点にある。

上記（ｂ）で規定する沈降面の構造は、沈降面上に沈降
した動物細胞がその場に止まらず、遠心力によって、沈
降面に沿って、沈降した場所から他の場所へ移動しつる
ような構造を意味している。そのような構造は、例えば
沈降面を有する回転ロータの回転軸から該沈降面までの
距離が等しく無く、最も距離の短い場所から最も長い場
所へ向けて距離が次第に長くなるようにゆるやかに変化
しているような沈降面によって代表される。沈降面の最
も距離の長い上記場所には、最も大きい遠心力が作用し
、沈降面の最も距離の短い上記場所には最も小さい遠心
力が作用し、その間の区間にはその中間の遠心力が作用
するから、例えば最も距離の短い場所に沈降した動物細
胞でさえ遠心力の作用により沈降面に沿って次第に距離
の長い場所へと移動し、やがて距離の最も長い場所に至
って集合するようになる。

上記（Ｃ）の動物細胞集合部はこのように沈降した動物
細胞が遠心力によっては最早移動しないような場所に設
けられる。

上記（ｂ）の沈降面は、好ましくは、ロータの回転軸を
含む１つの断面において、該回転軸から次第に距離が変
化しているような構造を有している。

かくして、回転軸に垂直な断面において該回転軸から最
も距離の長い前記場所と、該回転軸を含む１つの断面に
おいて該回転軸から最も距離の長い上記場所とが一致し
た極めて小さい５ｐｏｔに、遠心力によって動物細胞が
極めて効率的に集合するから、その５ｐｏｔに動物細胞
取出口を設ければ、該動物細胞を有利に取出すことがで
きる。

上記遠心分離装置が上記（ａ）の培養液供給口、（ｄ）
の集合した動物細胞の取出し口および（ｅ）の培養母液
排出口を、更に有することは説明を要しないであろう。

上記遠心分離装置を添付した図面により更に説明する。

添付図面の第１図、第２図および第３図には、本発明で
使用するに好適な遠心分離装置のロータ（分離槽）の概
念図が示されている。いずれの図においてもＡ図は回転
軸に直角方向の断面図であり、Ｂ図は回転軸を含む回転
軸に平行な方向の断面図である。

第１図において、１０は分離に供すべきサスペンジョン
培養液の供給口であり、１１及び１１°は動物細胞の沈
降面であり、１２は動物細胞集合部でおり、１３は該集
合部１２に集合した動物細胞を取出づ取出し口であり、
１４は母液排出口である。リスペンション培養液の供給
口１０はロータの回転軸から距離ｒだけ離れた位置にあ
り、母液排出口１４はほぼロータの回転軸の位置に設け
られである。第１図のロータの沈降面は１１゛の部分か
ら１１の部分に向けて回転軸からの距離が次第に緩やか
に大きくなっている。１１°の部分に沈降した細胞は遠
心力の作用により、１１の部分へ向けて沈降面に沿って
次第に移動する。第１図のＢ図によって、良く理解され
るとおり、沈降面はロータの底部から上部へ向って開い
ており、モして１１゛の部分よりも１１の部分の開きの
方が大きい。沈降面に、このような開きを設けることに
よって、例えば１１°の部分のロータの上部に近い箇所
に沈降した動物細胞も１１′の部分のロータの底部に近
い箇所に沈降した動物細胞も、やがて集合部１２に集合
するようになる。

動物細胞の取出し口１３は培養液の供給口１０よりも回
転軸から遠い距離Ｒにある。

第２図の遠心分離装置のロータは、第１図の遠心分離装
置のロータと基本的に同じであるが、次の点で相違する
。第２図のＡ図によって良く理解されるように、動物細
胞沈降面は２組の沈降面の組合せ、１１ａと１１ｂとか
ら成る。これらの２組の沈降面は、沈降面１１ａ上に沈
降した動物細胞が沈降面１１ｂ上に移動することが実質
的になく、その反対もまた成立するような関係にある。

従って、沈降面１１ａ上に沈降した動物細胞は沈降面１
１ａに沿って移動して集合部１２ａに到達し、一方沈降
面１１ｂ上に沈降した動物細胞は沈降面１１ｂに沿って
移動して集合部１２ｂに到達するので、これらの集合部
１２ａおよび１２ｂから分離された動物細胞を取出すた
めの取出し口も２ヶ所１３ａ、　１３ｂにある。

また、第２図のロータでは、母液取出し口１４は、回転
軸からｒ’ａ離れた位置にある。ｒｏは回転軸からり・
スベンジョン培養液の供給口までの距離ｒよりも小さい
。

第３図の遠心分離装置のロータも、第１図の遠心分離装
置のロータと基本的に同じであるが、第３図のＡ図から
良く理解されるとおり、沈降面１１がほぼ円形を有して
いる。しかし、この円の中心はロータの回転軸の中心と
ずれているので、動物細胞は集合部１２に集まり、取出
し口１３から取出される。

上記第１図、第２図および第３図のロータは、連続法に
より運転する場合に好適である。本発明で用いられる遠
心分離装置のロータは、ざらに分離板を備えることがで
きる。分離板は、回転軸に比較的近い部分、例えば培養
液供給口よりも回転軸に近い方の部分に存在する動物細
胞を有利に捕集し、そして沈降面に供給する。

第４図および第６図には、本発明に用いられる他の遠心
分離装置のロータの例が記載されている。

この遠心分離装置のロータは、分離された動物細胞を間
歇的あるいは連続的に該装置から取出すのに有利に使用
される。

第４図のロータは、第４図Ａ図および第５図から良く理
解されるとおり、はぼ三角形状の分離槽１５を持ってい
る。この分離槽１５内に、ある一定期間、培養液供給口
１０から培養液を供給しつつ、母液取出し口１４から母
液を後出して、遠心分離装置の運転をつづける。第４図
Ｂ図から良く理解されるとおり、分離槽１５は沈降した
動物細胞が集合部１２に集合するような沈降面構造を有
している。供給口１０は集合部１２の近傍に設けられて
おり、取出し口１４は分離槽１５の底部に連結している
。上記の如くして、一定期間運転をつづけたのら、培養
液の供給と母液の取り出しを停止し、取り出し口１４か
ら分離槽１５内に逆に母液を通じそして供給口１０から
該母液と一緒に分離槽内に蓄積した生きた動物細胞を取
り出す。この動物細胞を取り出す間、遠心分離装置の回
転は行っていても、停止していてもよい。

上記の如き間歇運転は、例えば第１図のロータを持つ遠
心分！ｌｔ装置によっても実施できることは当業者は理
解できるであろう。すなわち、第１図のロータでは、動
物細胞取り出し口１３から培養液を供給しつつ、母液排
出口１４から母液を排出する運転を一定期間実施し、そ
の後母液排出口からロータ内に逆に母液を供給してロー
タ内に蓄積した動物細胞を該母液と一緒に取り出し口１
３から取り出すことになる。

第６図のロータは、第６図Ａ図およびＢ図で良く理解さ
れるとおり、はぼ三角形状の分離槽１６と遠心方向に対
して傾きをもち、内部に分離板１８を有する分離槽１７
から構成されている。

ここで第６図Ａ図は軸断面図、Ｂ図はａ−ａ平面図であ
る。

リスペンション培養液は、培養液供給口１０から分離槽
１６に連続的に供給され、分離槽１６および分離槽１７
にて動物細胞が分離される。動物細胞が分離された培養
母液を母液排出口１９から、動物細胞を含む成分を細胞
取出口２１から別々に、しかしながら連続的に取出す。

第６図Ａ図から良く理解されるとおり、分離板１８は遠
心方向に対し傾斜をもち、培養液供給口１゜よりも回転
軸に近い部分に設けられ、細胞を有利に捕集し、分離槽
１６に供給可能な構造を有している。

分離槽１６は沈降した動物細胞が集合部２０に集合づる
ような沈降面構造を有している。

培養液供給口１０は分離４ｆＶ１６の底部に、細胞取出
口２１は集合部２０の近傍に、培養液母液排出口１９は
分離槽１７の頂部に設けられている。

ロータ本体は、ロータコア２２と口〜タボディー２３か
ら構成され、軸受２４．２５および軸受円゛定板２６．
２７にて支持されている。また、２８．２９はメカニカ
ルミール、　３０はサスペンジョン培養液供給ノズル、
３１は培養母液取出ノズル、３２は動物細胞を含む成分
の取出ノズル、３３は回転伝達用プーリー。

３４はロータバランス槽でおる。

本発明によれば、遠心分離装置は、該動物細胞を、それ
がサスペンドしている培養液から、生きたまましかも効
率的に分離するために下記の運転条件で運転されねばな
らない。一般に、動物細胞は外力によって変形し易く、
破壊され易いため、遠心分離装置により、生きたままし
かも効率的に、培養液から分離するのは困難であるが、
本発明者らの研究によって、下記（１）〜（４）の４つ
の運転条件を同時に満足することが臨界的であることが
明らかとされた。

（１）θ≦３００ （２）　ｚｘθ≦３ｘ１０４ （３）　Ｑ／Ｓ　・Ｚ≦０．３　Ｂヨ（ｊ（４）　５≦
Ｚ≦２０００ 上記式中、 θは遠心力１ｉＳｉｔ装置内における動物細胞の平均滞
留時間（分）であり、 Ｚは遠心効果であり、 Ｑは遠心分離装置へのサスペンジョン培養液の中位時間
当りの供給ｍ　（ｒｒＩＩｌ／ｍ１ｎ）であり、そして Ｓは遠心力作用時の沈降面積（ｃｍ２　）である。

遠心分離装置内における動物細胞の平均滞留時間（０２
分）は、上記式（１）に示されているとおり、３００分
以下に止めるべきである。３００分を越えると遠心分離
装置内において酸素欠乏などによる原因のために動物細
胞の生存率が顕著に低下する。平均滞留時間（θ）は、
好ましくは１５０分以下、殊に６０分以下である。

遠心分離装置内における動物細胞の平均滞留時間（θ）
は、例えば連続法すなわち遠心分離装置にり″スベンジ
ョン培養液を連続的に仕込みかつ分離された動物細胞を
連続的に取り出す方式では、仕込まれたサスペンジョン
培養液中の動物細胞が遠心条件下で存在しうる空間の体
積（ＶＣｌ２）を、分離された動物細胞を含む成分の該
遠心分離装置からの取り出し速度（Ｑｃ　−ｃｍ３　／
ｍ１ｎ）で割った値として求められる。

Ｚは遠心分離操作を行った時の遠心効果であり、回転軸
からの距離をｒ　（ｃｍ）　、回転角速度をω（ｒａｄ
　ｉａｎ／５ｅｃ）、そして重力の加速度をＣ７（ＣＩ
ｌｌ／５ｅｃ２　）で表わすと、ｒω２　／ｇで表わさ
れる。

遠心効果は、いわば動物細胞に負°荷される遠心力の大
きざを示しており、従って分離に供すべき）ノスペンシ
ョン培養液を遠心装置に供給するための培養液供給口の
位置（回転軸からの距離ｒ）によって決まる。

２は５〜２０００の範囲である。５より小さいと細胞の
分離操作を効率よ〈実施することが困難であり、一方２
０００を越えると細胞にかかる遠心力が大き過ぎて細胞
の破壊が著しくなるので望ましくない。遠心効果（Ｚ）
は、好ましくは１０〜１ｏｏｏの範囲、殊に好ましくは
２０〜３００の範囲にあるのが右利である。

また、２とθとを掛は合わせた値（２・θ）を、３Ｘ１
０’以下に保つ必要がおる。この値を越えた条件で遠心
操作を行うと、細胞自体の圧密によって生存率の定価が
次第に大きくなり不利である。

２・θの値は２Ｘ１０４以下が特に好ましい。

ざらにＳ（ｃｍ２）は遠心力作用時の沈降面積（ｃｍ２
）である。Ｓ　（ｃｍ２　）は、分離すべきサスペンジ
ョン培養液の遠心分離装置への供給口の位置（回転軸か
らの距！ｌｔｒ（Ｃｍ））における分離に関与する有効
面積として定義される。該有効面積は、回転軸からｒの
距離にある供給口の位置における仮想円が沈降面と交差
しない場合には、該供給口の位置（ｒ）とその位置にお
けるサスペンジョン培養液の液面の高さくｈ）とによっ
て、πｒ２ｈの値として求められる。また、上記仮想円
が沈降面と交差する場合には、有効面積は仮想円が沈降
面と交差する迄の部分の面積に減少し、πｒ２［）に、
交差する迄の角度割合を掛けた値として求められる。こ
の場合、上記液面の高さく　ｂ　）は、遠心分離装置の
分離槽の最も深い位置からの垂直距離をいうものと理解
すべきでおる。

有効面積Ｓを遠心効果２との掛は合わせた値Ｓ・２は、
遠心分離装置の分離能力を示すパラメーターである。本
発明方法では、遠心分離装置へのサスペンジョン培養液
の単位時間当りの供給ＩＱ（ｄ／ｌｌｌ１ｎ）をこのパ
ラメーターで割った値、すなわちＱ／Ｓ−Ｚの値を０．
３以下とする必要がある。

Ｑ／Ｓ−ｚの値は好ましくは０．２以下、特に好ましく
は０．１以下である。

かくして、−り記（１）〜（４）の運転条件の確保によ
って、本発明の上記工程（Ｃ）によれば、サスペンジョ
ン培養液から極めて高い生存率で動物細胞を生きたまま
効率的に分離することが可能となる。

分離された動物細胞は、本発明によれば、工程（Ｄ）に
おいて、遠心分離装置から取り出される。

工程（Ｄ）は、工程（Ｃ）に関して前記したとおり、連
続法において遠心分離装置から運転中少量づつ連続的に
分離された動物細胞を取出すことによって実施すること
ができ、あるいは断続法において培養の供給を停止した
のち分離された動物細胞を取出すことによって実施する
ことができる。

生きたまま取り出された動物細胞の少くとも１部分、す
なわち１部分又は全部は、本発明によれば、次いで、工
程（Ｅ）により、上記（Ａ）工程のサスペンジョン培養
のため培養槽に戻される。動物細胞の戻しは、培養槽が
有１−る動物細胞の仕込口を通じて好適に実施される。

動物細胞の戻しは、連続的にあるいは間歇的に行うこと
ができる。

本発明の一実施態様を、添付図面の第７図を用いて一層
具体的に説明する。

第７図の装置では、培養槽ＡＰ−１は新しい培養培地の
仕込ロＡ、空気（０２）導入管Ｂ、培養槽内の培養液中
の酸素濃度を測定し′″ＣＣ導入空気中の酸素濃度を調
節するためのｏｏｃ、ｔ＊拌機ＳＴ、排気管Ｃおよびサ
スペンジョン培養液の扱出し導管りを備えている。抜出
し導管りはポンプＰ−ｉを経過して、点Ｐで２つの経路
に分れる。

一方はポンプＰ−ＩＩを経過して導管Ｇによって古い培
養液の貯槽ＡＰ−３に至り、他方は遠心分離機ＡＰ−２
に連結され、そこから導管ＦによりバルブＹを通じてＡ
Ｐ−３に至る。遠心分離機ＡＰ−２からは導管Ｅがバル
ブＸを通じて伸びており、導管Ｅは培養槽ＡＰ−１に連
結されている。

培養槽ＡＰ−１内へ新しい培養培地を仕込み、空気導入
管Ｂがら空気を導入し、攪拌機を回転し、動物細胞を播
種して培養を開始する。所定時間培養後、培養槽内の細
胞数が飽和状態まで増加した時点で、ポンプＰ−Ｉの回
転を開始し、培養槽内の培養液を導管りを通じ遠心分離
機ＡＰ−２に送液して遠心分離機で動物細胞から母液を
分離し、分離された母液をバルブＹを開放した導管Ｆを
通じて該貯槽ＡＰ−３に送りつづける。この間、培養槽
ＡＰ−１内の液面が大きく変らないように、培地仕込口
Ａから連続的にあるいは間歇的に、新しい培地を培養槽
内に導入する。遠心分離機ＡＰ−２を上記のようにして
一定期間運転させた後、ポンプＰ−Ｉの運転を停止し、
バルブＹを閉じかつバルブＸを開放し、次いでポンプＰ
−ＩＩの運転を開始する。それによって、該貯槽ＡＰ−
３中の母液は導管Ｇを通じて遠心分離機ＡＰ−２に導か
れ、ＡＰ−２中に蓄積された生きた動物細胞を伴って導
管「を通じて培養槽へ戻される。装置をこのように運転
しつづけることによって、動物細胞の培養に伴って培養
槽内に次第に蓄積される動物細胞の成育を阻害する物質
の濃度を低水準に維持することができる。

以下実施例を掲げて本発明方法を詳述する。

実施例 （１）培養装置 添付第７図に示す培養システムを使用した。培養槽（Ａ
Ｐ−１＞はガラス製の全容積２１の攪拌型培養槽であり
正味の培養液仕込量は、１．２１でおる。

第７図のＡＰ−２は、第４図および第５図の遠心分離機
を使用し、沈降面積３＝３１．４ｃｍ２　、有効容積１
１ｍ１のローターを有プる遠心分離機である。

ポンプＰ−ｉ、Ｐ−ｎはペリスタポンプでおる。

（２）培地 基礎培地として、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地、ハム−１
２培地およびダルベツコ変法イーグル培地を′２：１：
１で混合したちのく以下ＲＤＦと称する〉を用いた。

上記基礎培地にインスリン２μ（１／ｄ、　トランスフ
ェリン１０μ（１／Ｗ１！、エタノールアミン１０μｇ
／Ｉｎｌ１゜亜セレン（ｆｉ　２　Ｘ　１０−３　ｍｏ
ｌｅ／　１添加したものを培地として使用した。

（３）培養方法および結果 培養システムを必らかじめオー・トクレーブ滅菌した。

しかるのち、）濾過滅菌した培地１，２１を培養槽に仕
込む。ついでマウスミエローマＰａＵＩ株とするマウス
×マウスハイブリドーマＪＴＣ−３株を２Ｘ１０５　ｃ
ｅｌｌｓ　／７となるように播種した。

この細胞はＩｇＧを産生するものでおる。培養槽では炭
酸ガス５％を含む酸素ガスが培養液中の溶存酸素濃度が
３１Ｘ）ｍとなるように吹込ノズルＢを通して自動的に
コントロールされて送入されている。

培養槽中の培養液は３７℃に保持されている。培養槽中
にはマリン型攪拌買が取付けられており攪拌速度は６０
ｒｐｍであった。

播種後４日間は回分培養を行った。第１表に示すように
培養開始後４日目に細胞密度は１．３×１０６　ｃｅｌ
ｌｓ　／ｄに達し、回分培養では最高密度に到達したと
判断し遠心機を用いた潅流培養を開始した。すなわち）
濾過滅菌した培養液を張込んである遠心機を駆動し、遠
心効果が６０（ｌとなるように回転数を合せた。次いで
バルブＸは閉、ポンプＰ−■は停止、バルブＹは開の状
態にしてポンプＰ−■を駆動し、１８０　ｄの培養混合
物を６．０　ｄ／ｍｉｎの速度で３０分間遠心分離機に
送液した。遠心分離機で細胞と分離された培養液はライ
ンＦを通じて古い培養液の貯槽ＡＰ−３へ流出して貯留
された。

この中の細胞密度は２．４　ｘ１０５　ｃｅｌｌｓ　／
ｒｒｄｌテあった。以上の操作が終了してただちにバル
ブＸは開。

バルブＹは閉、ポンプＰ−Ｉは停止の状態にして、ポン
プＧを駆動し古い培捲液ｂａｄを該貯槽ＡＰ−３から遠
心分離機に１０ｄ／ｍｉｎの速度で送液した。

この操作により遠心ローター中に滞召していた細胞は全
量遠心力＃を機から排出されランノＥを経由して培養槽
ＡＰ−１にもどした。培養液５０ｒｒＩｉの送液の終了
後ポンプＰ−■を停止した。この操作を第１表に示す時
間毎に１回自動的に行って培養を継続した。培養槽の液
位が平均して一定となるようにラインＡから連続的に新
培地を培養槽に供給した。培養開始５日目以降は培養槽
中から細胞を含む培養混合物を１日に１２０　＃ｆ系外
に扱き取った。

以上の実験１−Ｑ／Ｓ　Ｚ　Ｇ、ｔＯ，００３２テアリ
θハ３０．０ｍ１ｎ、ｚ・θは１，８００であった。

実験条件の一部および実験結果を表に示した。

但し表中培養液置換率とは有効培養容積に対して一日当
り新培地を供給する割合を意味する。

（実施例の実験結果）

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図、第４図および第６図は本発明
で使用するに好適な遠心分離装置のローター（分離槽）
の概念図である。第５図は第４図の斜視図でおる。第７
図は本発明の一実施態様を示したものである。 烏１［１１ｉ１ Ａ　　　　　　　　　　　　　Ｅ３ 児２― へ３０ Ａ　　　　　　　　　　　　８ ８４図 八日 第　５　口

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、動物細胞のサスペンジョン培養液から動物細胞と培
   養液とを分離するための遠心分離装置であって、該遠心
   分離装置は （ａ）サスペンジョン培養液の供給口、 （ｂ）沈降した動物細胞が遠心力によって沈降面に沿っ
   て移動しうるような構造を有する該沈降面、 （ｃ）沈降面に沿って移動した動物細胞が集合する動物
   細胞集合部、 （ｄ）該動物細胞集合部から該動物細胞を取出すための
   取出口、および （ｅ）動物細胞が分離された培養母液を排出するための
   母液排出口、 を備えたものである細胞分離装置。 ２、（Ａ）動物細胞を培養槽内でサスペンジョン培養に
   付し、 （Ｂ）該培養槽より動物細胞を含むサスペンジョン培養
   液の１部分を抜き出し、 （Ｃ）抜き出した該サスペンジョン培養液を遠心分離装
   置へ供給して該サスペンジョン培養液から動物細胞を分
   離し、 （Ｄ）該分離された動物細胞を遠心分離装置から取出し
   、そして （Ｅ）該取出された動物細胞の少くとも１部分を上記（
   Ａ）工程のため培養槽に戻す、 ことによる動物細胞培養方法において、該遠心分離装置
   として （ａ）サスペンジョン培養液の供給口、 （ｂ）沈降した動物細胞が遠心力によって沈降面に沿っ
   て移動しうるような構造を有する該沈降面、 （ｃ）沈降面に沿って移動した動物細胞が集合する動物
   細胞集合部、 （ｄ）該動物細胞集合部から該動物細胞を取出すための
   取出口、および （ｅ）動物細胞が分離された培養母液を排出するための
   母液排出口、 を備えた遠心分離装置を使用することを特徴とする動物
   細胞培養方法。 ３、該遠心分離装置は、下記運転条件 （１）θ≦３００ （２）＠Ｚ＠×θ≦３×１０＾４ （３）Ｑ／Ｓ・＠Ｚ＠≦０．３および （４）５≦＠Ｚ＠≦２０００ 〔上記式中、 θは遠心分離装置内における動物細胞の平均滞留時間（
   分）であり、 ＠Ｚ＠は遠心効果であり、 Ｑは遠心分離装置へのサスペンジョン培養液の単位時間
   当りの供給量（ｍｌ／ｍｉｎ）であり、そして Ｓは遠心力作用時の沈降面積（ｃｍ＾２）である〕で運
   転される第２項記載の培養方法。