JPS63164879A - 気泡塔型潅流培養方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は動物、植物の細胞、組織、器官など、及び微生
物の培養、特に使用する培地より比重の重い細胞を培養
するに適した気泡塔型灌流培養方法及びそのための装置
に関する。

従来の技術 従来、動物、植物の細胞や器官の培養、微生物の培養に
おいて用いられる装置のほとんどは、回分式のものであ
る。かかる回分式の装置を用いる場合には培養槽に投入
した培地中の栄養源が細胞増殖等に利用され枯渇すると
培養は終了する。従って、多くの細胞を入手するために
は、大型の装置が必要となる。

回分培養の場合、通気攪拌培養が一般的でインペラーと
スパージャ−により攪拌と通気を行う方法と、気泡によ
って回転運動を起し攪拌する気泡方式が知られており、
それぞれに適した培養装置が知られている。このうち気
泡塔培養装置とは培養装置の下部より空気等を通気する
ことにより通気ならびに攪拌を行う方式の培養装置であ
る〔遺伝３８　　（８）、　７２−７９　（１９８４）
）。

しかしながら回分式培養法では培養系内でのｐＨの低下
、代謝産物による生育阻害、栄養源の枯渇などの要因か
らある程度以上の生育細胞密度とすることは困難である
。最近、回分培養より高い細胞密度の得られる潅流培養
装置が開発されている。潅流培養装置とは培地の供給と
培養上清の抜出しとを連続的に行う培養装置をいう。こ
の型式の培養装置には回転するフィルターによって細胞
と上清とを分離し、上清を排出し、新鮮培地を加える回
転濾過塔型、インペラー型回分培養槽に細胞沈殿管を設
けることによって細胞と上滑とを分離する細胞沈殿管型
、及び中空繊維（ホロファイバー）中に通気するか培地
を通すホロファイバー型とがある〔遺伝３８　　（８）
、　７２−７９　（１９８４））。

又、特公昭６１−３６９１５には少なくとも一部の培養
液中の細胞を沈降させて得られる培養上清を培養装置外
に排出しながら新鮮培地を加えて培養する浮遊細胞の高
濃度培養法が記載されており、そのための装置の一例と
して上記細胞沈殿管型の培養装置が記載されている。

発明が解決しようとする問題点 上記潅流培養装置中、回転濾過塔型及び細胞沈殿管型は
インペラーにより攪拌を行う型式のものである。ところ
が動物細胞のような剪断力に感受性の細胞に対しては、
インペラーによる攪拌は好ましくなく気泡塔方式の攪拌
が優れていると考えられている。又、ホロファイバー型
は大型化が困難と考えられる。一方、気泡塔方式では大
型化は容易にできる。

本発明の気泡塔型灌流培養方法及び装置では従来の潅流
培養装置におけるかかる問題点を回避できる。

問題点を解決するための手段 本発明は気泡塔による細胞の浮遊培養において少なくと
も一部の培養液中の細胞を沈降させて得られる培養上清
を培養装置外に排出しながら新鮮培地を加えて培養する
ことを特徴とする浮遊細胞の灌流培養方法及び気泡塔型
培養装置において、気泡により培養液を攪拌循環させる
培養空間（以下、該空間を培養槽という）と隔壁により
隔てられ、隔壁上部は培養槽とは連通せず、隔壁下部は
培養槽と連通した空間（以下、該空間を上清分離槽とい
う）を設け、かつ培養槽への培地の供給及び上清分離槽
からの培養上清の抜出しを可能にした気泡塔型灌流培養
装置に関する。

気泡塔培養装置には種々の型式があるが、いずれの型式
においても気体の上昇に伴って上部に流動する部分と、
上端から下に向って流動する隔壁によって隔てられた下
降部分との２つの部分からなっている。上昇流は、気泡
の発生に伴って生じ、隔壁の上端に達し、あふれ出し下
降流となることで槽内での回転運動を生じ攪拌される。

細胞等はこの対流によって分散し、均一な溶存酸素及び
栄養分の補給を受ける。この２つの槽に上端を閉鎖し、
下端を開放したもう一つの部屋、すなわち上清分離槽を
つくると、この槽内は攪拌の影響をほとんど受けること
がなく静置されたと同様の状態になる。この攪拌の影響
の乏しい槽の上端は、比重の重い細胞粒子が下部へ沈降
し気泡槽内の攪拌部分へもどって行くため清澄な液とな
る。従って、この清澄な上滑をゆっくりとした速度で系
外に排出してもその清澄度は、はとんど変らない。系外
に排出する速度と培養槽部分に添加する速度とを同じに
すると一定量の連続培養が進行することになる。

上清分離槽下端に沈降する比重の重い細胞粒子が効率よ
く培養槽中へもどるようにするために培養槽と上清分離
槽との間の隔壁の下端を培養槽下端の上昇流と下降流の
分岐点より上に設けることが好ましい。

気泡培養槽でこのような上清分離槽を付加できる形状と
しては、その機能を満足するものであれば、いかなる形
状でもよく、第１図及び第２−１及び２−２に示した型
が好ましいものとして例示される。

第１図は、気泡塔の形状を二重円筒管とし、中心の内円
筒下部より気体を発し、上昇流を引き起す。その外側の
部分は内円部上端よりあふれた培養液が下降流となる部
分である。さらにその外側に、ジャケット様の上清分離
槽をもうけた。

第２−２図は、第１図と異なり、上清分離槽を中心に設
けた場合である。第３図に培養液の流れの方向を矢印で
示した。第３−３図に示したように培養槽の底を中心を
高く盛り上げその２番目の槽の下より気体を発生させる
と太い矢印のように流動する。一部細胞は、中心へも押
し出されるが、下部突起の下へともどり再び上昇流にま
き込まれることになる。

第２−１図は、円筒である必要はなく、箱形でもよく、
分離板で３つの部屋を造ればよい。

第３−２図に示すように下端中央の穴より気体を発生さ
せると太い矢印のように流動する。上清は、細い矢印で
示したように外部へ排出されている。

以上のように、隔壁に隔てられ下部を開放した上清分離
槽を通常の培養槽につけることによって細胞を含まない
上清を分離することができる。

第１図に記載した装置を例に示すと、培養債２βの装置
の場合、上清分離槽は１βの容量が適当である。上清分
離槽の内径１１０ｍｍ、培養槽１３の内径８０陥、内円
筒５の内径５７ｍｍとした。装置の高さは、培養槽１３
が５６０胴、内円筒５が３７０雅、上清分離槽１０が５
００ｍｍとしたものを示した。

これらの培養装置は第１図、第２図に示したように、コ
ンデンサー１、接種口２、培地添加口３、サンプリング
ライン４、内円筒５又は分離板１６、接続金具６、バッ
キング７、通気口８、通気ライン９、排液ライン１１、
固定部品１２などの他、温度制御のための温度センサー
、ヒーター、ｐＨ測　定や溶存酸素測定用のセンサー類
、気体流量制御のための流量計などを取付けることがで
きる。

一般的には、清澄な上清液を得るために培養槽容量２に
対し、上清分離槽容量を０．５〜２とすることが好まし
い。

実施例 実施例１ 第１図に示した気泡塔型灌流培養装置を用い、ヒ）　Ｉ
Ｊンバ芽球細胞であるナマルバ細胞を用いて培養を行っ
た。

ナマルバ細胞は、ＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０培地に３河／
ｍ１のトランスフマリン、５ｇ／ｍｌのインスリン、５
　ｍ　Ｍピルビン酸ソーダ、１．２５Ｘ１０−８Ｍ亜セ
レン酸、１ｍｇ／ｍｌガラクトース、４ｍＭグルタミン
、１０ｍＭへベス、２５　ｕ　／ｍｌペニシリンＧ、２
５■／ｍ１ストレプトマイシン、０．１ｇ／Ｊ重曹を加
えた無血清培地で培養した。

２β培養槽に上記培地１．９１を仕込み、１．３Ｘ　１
０６ｃｅｌｌｓ／　ｍｆｌのナマルバ細胞を接種し、空
気及び５％ＣＯ２を含む空気を流量比を適宜調節しなが
ら１．２〜２．４ｆ／ｈｒの流量で通気した。

１日目５００ｍｌ／ｄａｙ　、　２日目から８日目まで
１４２／ｄａｙ８日目より後２　ｆ！　／ｄａｙの流速
で培地添加口より添加し、上清分離槽上端の排液口より
上清を排出させた。

細胞密度は５日目で４．　Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ”ｃｅｌｌｓ
　／ｍ＋、８日目で７　ｘ　ｌ　Ｑ”ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
、１４４日目１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、以後徐々に
細胞数が増加し１８日後には１．２　Ｘ　１０　’ｃｅ
ｌｌｓ　／ｍｌに達した。

実施例２ ナマルバ細胞を第１図に示した装置を用い培養した。培
地として実施例１に示した培地に０．１ｇ／Ｊとなるよ
うにｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１ａを加えた培地を用いた。

２１培養槽に上記培地２βを仕込み、ナマルバ細胞をｌ
、　３　ｘ　ｌ　Ｑ　”ｃｅｌｌｓ　／ｍｌとなるよう
に接種した。通気は空気及び５９６Ｃ○２を含む空気を
流量比を適宜調節しながら１．２〜２．４ｊ！／ｈｒの
流量で行った。

潅流する培地里は、２４時間後より１０１００Ｏ／ｄａ
ｙで３日目まで通気し、３日後より１００日目で２０　
Ｑｍｌずつ増やし、１０日後までに２ｊｉ！／ｄａｙ　
とした。その後、２日ごとに２００ｍ１ずつ流量を増加
させ２００日目４１／ｄａｙとした。細胞数は８日目で
８　Ｘ　１．０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ。

１５５日目１．ｌ　ｘ　ｌ　Ｑ　’ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、
　２０日目で１、５　ｘ　ｌ　Ｑ　’ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
となった。

発明の効果 本発明方法及び装置により剪断力に感受性の細胞の培養
及び大量培養が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明の気泡塔型灌流培養装置の好
ましい具体例を示す。 第３図は本装置中の培養液及び培養上清の動きを示す。 特許出願人　　（１１４）工業技術院長飯　　塚　　幸
　　三 第１図 ４サンプリングライン　　５内円閤　　　　６接続金具
７パツキング　　　　８通気口　　　　９通気ライン１
０上清分離檀　　　　１１　排液ライン　１２固定部品
１３培蓑檀 第２図 第２−１図　　　　　第２−２図 １　コンデンサー　　　　　２　接種口　　　　３　培
地添加口８ａ気口　　　　　　　９通気ライン　　１０
　上清分悶槽１３培豐槽　　　　　　１４　排液口　　
　　１５　排気口１６分剛板 第３図 ！！！養上清の流れ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）気泡塔による細胞の浮遊培養において少なくとも
   一部の培養液中の細胞を沈降させて得られる培養上清を
   培養装置外に排出しながら新鮮培地を加えて培養するこ
   とを特徴とする浮遊細胞の灌流培養方法。
2. （２）気泡塔型培養装置において、気泡により培養液を
   攪拌循環させる培養空間（以下、該空間を培養槽という
   ）と隔壁により隔てられ、隔壁上部は培養槽とは連通せ
   ず、隔壁下部は培養槽と連通した空間（以下、該空間を
   上清分離槽という）を設け、かつ培養槽への培地の供給
   及び上清分離槽からの培養上清の抜出しを可能にした気
   泡塔型灌流培養装置。
3. （３）該隔壁の下端を培養槽下端の上昇流と下降流の分
   岐点より上に設けた特許請求の範囲第１項記載の気泡塔
   型灌流培養装置。