CN104160013A - 灌流式生物反应器系统及操作其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包括细胞聚集体捕获器的灌流式生物反应器系统。所述细胞聚集体捕获器被配置为用于从灌流式生物反应器系统移除细胞聚集体(例如大于约10个细胞的结块或聚集体)。在一些实施方案中，所述细胞聚集体捕获器具有沉降室和侧流室，这使得细胞聚集体能够沉降并被移除和丢弃。本发明提供了操作具有细胞聚集体捕获器的灌流式生物反应器系统的方法及多种其他实施方案。

Description

灌流式生物反应器系统及操作其的方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2012年1月18日提交的标题为“PERFUSIONBIOREADTOR SYSTEMS AND METHODS OF OPERATING THESAME”的美国临时专利申请61/587,940的优先权(代理人案号.BH-001/L)。
背景技术
常规的灌流式生物反应器系统和过程包括用于在液体培养基如组织培养液(tissue culture fluid,TCF)中培养细胞的生物反应器。所培养的细胞和TCF是通过例如泵出从所述生物反应器中除去，并且所述细胞是通过常规细胞保留装置(cell retention unit)与TCF分离。依旧含有一些细胞、颗粒和碎片的来自细胞保留装置的收获输出流随后被下一步处理。本文所使用的收获输出物包括经过进一步处理以获得所需产物(如凝固因子)的TCF。过滤技术，如死端深度过滤(dead-enddepth filtration)、膜过滤、微量过滤和/或离心可用于进一步浓缩和/或纯化来自细胞保留装置的收获输出物。
另一从细胞保留装置排出的具有相对高浓度的细胞的TCF输出流被直接返回(例如，回收或再循环)至生物反应器。在这样的连续灌流式生物反应器过程中，所述收获物输出流和再循环输出流在培养过程中是基本连续的，所述培养过程可为10天或更长的时间。然而，使用该类常规灌流配置可导致这样的情况：相对地不能充分地控制生物反应器细胞密度。
相应地，需要更高效地控制生物反应器细胞密度的灌流式生物反应器系统和方法。
发明内容
在第一实施方案中，本发明提供了灌流式生物反应器系统。所述灌流式生物反应器系统包括(1)生物反应器，其被配置为包含组织培养液和待培养的细胞；(2)细胞保留装置，其被配置为从生物反应器接收含有细胞的组织培养液，从所述组织培养液中分离一些细胞并提供组织培养液和细胞的收获输出物(harvest output)，以及提供组织培养液和细胞的再循环输出物；和(3)细胞聚集体捕获器，其被配置为接收所述组织培养液和细胞的再循环输出物，从所述组织培养液和细胞的再循环输出物中分离细胞聚集体，并将剩余的组织培养液和细胞返回至所述生物反应器。
在另一实施方案中，本发明提供了细胞聚集体捕获器。所述细胞聚集体捕获器包括(1)沉降室；(2)捕获器入口，其被配置为接收组织培养液和细胞的再循环输出物；(3)侧流室，其被配置为向生物反应器返回包含细胞的组织培养液的再循环输出物的至少一些；和(4)与所述沉降室相连的丢弃物捕获器出口，其被配置为输出细胞聚集体。
在另一系统实施方案中，本发明提供了灌流式生物反应器系统。所述灌流式生物反应器系统包括(1)生物反应器，其被配置为包含组织培养液和待培养的细胞；(2)细胞保留装置，其被配置为从所述组织培养液中分离一些细胞并提供收获输出物；和(3)细胞聚集体捕获器，其被配置为从所述组织培养液和细胞中分离细胞聚集体，并提供具有相对较低量的细胞聚集体的输出物。
在一个方法实施方案中，本发明提供了操作灌流式生物反应器系统的方法。所述方法包括(1)从生物反应器向细胞保留装置提供含有细胞的组织培养液；(2)在所述细胞保留装置中，从所述组织培养液中分离一些细胞，以提供组织培养液和细胞的收获输出物以及组织培养液和细胞的再循环输出物；和(3)在细胞聚集体捕获器中，从所述组织培养液和细胞的再循环输出物中分离细胞聚集体。所述组织培养液和细胞可返回至具有相对较低量的细胞聚集体的生物反应器中。
在另一方法实施方案中，本发明提供了操作灌流式生物反应器系统的方法。所述方法包括(1)从生物反应器提供组织培养液和细胞的流；(2)在细胞保留装置中，从所述组织培养液中分离一些细胞，以提供收获输出物；和(3)在细胞聚集体捕获器中，从所述组织培养液和细胞中分离细胞聚集体，以产生具有相对较低量的细胞聚集体的组织培养液。所述组织培养液和细胞可返回至具有相对较低量的细胞聚集体的生物反应器中。
本文列出了本发明教导的这些和其他特征。
附图说明
本领域技术人员可以理解，以下描述的附图仅用于解释说明目的。所述附图并不意欲以任何方式限定本发明教导的范围。
图1示出了一个实施方案的框图，该框图为依据所述实施方案的包括细胞聚集体捕获器的灌流式生物反应器系统的框图。
图2A示出了依据实施方案的细胞聚集体捕获器的横截面侧视图。
图2B示出了细胞聚集体捕获器实施方案沿着图2A剖面线2B-2B的仰视横截面端视图。
图3示出了流程图，该图说明了操作依据该实施方案的灌流式生物反应器系统的方法。
图4示出了另一流程图，该图说明了操作依据该实施方案的灌流式生物反应器系统的另一方法。
具体实施方式
细胞(包括动物细胞、植物细胞或微生物细胞)的培养可用于生产具有生物学活性的物质和具有药学活性的产品。然而，在某些细胞培养物中，细胞可以在一定程度上相互粘附并形成相对大的细胞结块(cell agglomerates)、细胞团(cell clumps)或聚集物(aggregations)(以下称为“细胞聚集体”)。当存在这种细胞聚集体时，它们可在灌流式生物反应器过程中造成某些加工问题。具体地，细胞聚集体的存在会使生物反应器内的细胞密度相对不稳定，即，难以充分地维持、保持或控制在所需的细胞密度设定值范围内。在存在细胞聚集体的情况下，也难以精确地测定细胞浓度。因此，时常需要通过周期性地运行常规灌流式生物反应器的丢弃物泵来弃去TCF和细胞。并且，难以确定被丢弃的TCF和细胞的量。毫无疑问，这种丢弃也排出了含有所需产品的有价值的TCF。另外，生物反应器培养物中的细胞，尤其是动物细胞或植物细胞，通常对所施加的机械剪切力非常敏感。因此，不仅希望使被丢弃的材料最少，还希望使细胞最少地暴露于可能造成损伤的剪切力下。另外，希望能够精确地控制生物反应器内的细胞密度。
因此，依据本发明的实施方案，本发明提供了改进的灌流式生物反应器系统。所述改进的灌流式生物反应器系统包括细胞聚集体捕获器，所述细胞聚集体捕获器被提供为、被配置为和/或被改造为适于与细胞保留装置关联运行。所述细胞聚集体捕获器在功能上是基于沉降作用的，其中细胞聚集体沉积并可从再循环流中除去。通过在灌流式生物反应器系统中联用细胞聚集体捕获器和细胞保留装置，可以向生物反应器返回相对大部分细胞，并且可以移除和丢弃可对灌流过程不利的细胞聚集体。
依据其他实施方案，灌流式生物反应器系统包括生物反应器，与生物反应器相连的细胞保留装置，被配置为从生物反应器接收TCF和细胞、从TCF分离一些细胞并提供收获输出物的细胞保留装置，和细胞聚集体捕获器，所述细胞聚集体捕获器被配置为从细胞保留装置接收TCF和细胞的再循环输出物、从TCF和细胞中分离细胞聚集体并将剩余TCF和细胞返回至生物反应器。
在另一实施方案中，本发明提供了操作灌流式生物反应器系统的方法。所述方法包括提供TCF和一些细胞，在细胞聚集体捕获器中接收TCF和细胞，以及在细胞聚集体捕获器中从TCF和细胞中分离细胞聚集体。剩余的TCF和细胞可被返回至具有相对低量的细胞聚集体的生物反应器中。
在另一实施方案中，本发明提供了操作灌流式生物反应器系统的方法。该方法包括从生物反应器向细胞保留装置提供包含细胞的TCF，从TCF分离一些细胞以提供收获输出物，同时剩余的再循环TCF和细胞被细胞聚集体捕获器接收，以及在细胞聚集体捕获器中从TCF和细胞中分离细胞聚集体。剩余的TCF和细胞可被返回至具有相对较低量的细胞聚集体的生物反应器中。本文所描述的方法、灌流式生物反应器系统及细胞聚集体捕获器可被改造为适于凝固因子的生产和/或其他用于产生生物试剂或因子的适当方法。
下文参考附图1-4描述了包括细胞聚集体捕获器的灌流式生物反应器系统、细胞聚集体捕获器和操作灌流式生物反应器系统的方法的这些以及其他实施方案。图1示出了灌流式生物反应器系统100的实施方案的方框图。所述灌流式生物反应器系统100包括具有生物反应器入口104和生物反应器出口106的生物反应器102。所述生物反应器102包括被配置为包括组织培养液(TCF)108及待培养的细胞109的培养室(culture chamber)105。所述灌流式生物反应器系统100可用于生产生物制品如凝固因子。例如，所述灌流式生物反应器系统100和方法可用于生产凝固因子如因子VII、VIII或因子IX，或其他适当的因子或物质。
生产因子VIII的示例方法记载于标题为“Process and Medium ForMammalian Cell Culture Under Low Dissolved Carbon DioxideConcentration”的US6,338,964中，其公开内容以引用的方式全文纳入本文。例如，细胞培养过程可包括在含有高浓度络合剂的TCF和具有低添加的NaHCO3的缓冲液中培养细胞。所述细胞培养过程可在培养室中进行，如图1中的培养室105，在一些实施方案中培养室可以是具有搅拌叶轮的搅拌釜式发酵罐。所述发酵罐可以与作为供氧系统的在培养室底部的微型发泡器(microsparger)或薄膜一起提供。TCF可以是基于DMED/F12制剂(由JRH(Lenexa,Kansas)或LifeTechnologies(Grand Island,N.Y.)市售)的培养基组合物，它添加了其他补充物如铁、Pluronic F-68、或胰岛素，并且可以基本上不含其他蛋白质。可使用络合剂组氨酸(his)和亚氨基二乙酸(IDA)，并且可使用有机缓冲液，如MOPS(3-[N-吗啉代]丙磺酸)、TES(N-三[羟甲基]甲基-2-氨基乙磺酸)、BES(N,N-二[2-羟乙基]-2-氨基乙磺酸)及TRIZMA(三[羟甲基]氨基乙烷)；上述所有试剂均可从例如Sigma(Sigma,St.Louis,Mo.)获得。在一些实施方案中，可向TCF单独地或组合补充已知浓度的上述络合剂或有机缓冲液。TCF可含有EDTA(如50μM)作为铁螯合剂。可使用其他组合物、制剂、补充物、络合剂和/或缓冲液。
细胞培养可通过用来自先前培养的培养物的细胞进行接种开始。可以(如自动地)在稳定的条件下维持典型的生物反应器参数，如约35℃-37℃的温度，约6.8-7.0的pH，约30％-70％的空气饱和度下的溶解氧(DO)，约30rpm-80rpm的搅拌速度，及大致恒定的液体体积。可使用其他生物反应器参数。DO和pH可使用市售探测器(probe)进行在线测量。生物反应器过程可以以分批模式开始，持续约1-2天，使初始细胞浓度加倍。这之后可以为灌流阶段，在灌流阶段中TCF被持续泵入生物反应器中，包含细胞(并可能一些细胞聚集体)的TCF被泵出。可以控制TCF的流速并使其与细胞浓度成比例地增加。稳态或稳定的灌流过程可在生物反应器中的细胞浓度达到目标高水平(例如，约10×106至20×106个细胞/mL)时实现，并可被控制在这一浓度。此时，流速可保持恒定。灌流式生物反应器系统中的细胞密度可维持在约4百万-4千万个细胞/毫升之间。可以使用其他生物制品、凝固因子、细胞浓度、细胞密度等。
再次参考图1，细胞109可为真核细胞或原核细胞，如动物细胞、植物细胞或微生物细胞。例如，细胞109可为幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)、肾细胞和B细胞的杂交细胞(HKB细胞)、人胚胎肾细胞(HEK细胞-亦被称为HEK293或293细胞)等。TCF109可通过TCF入口105A或灌流式生物反应器系统100的其他地方引入至培养室105。TCF108中的细胞109，由于其特性和加工(processing)，可不时地形成细胞聚集体109A，如放大图所示。本文使用的“细胞聚集体”意指相互连接或粘附以形成细胞群的细胞结块、细胞团或聚集物。可通过使用一个或多个本发明的实施方案移除的“细胞聚集体”的数目为约10个或更多个细胞、约20个或更多个细胞、或者甚至约40个或更多个细胞。一个或多个本发明的实施方案可移除具有约10个至约50，000个细胞的细胞聚集体，或者甚至可移除具有约40个细胞至约300个细胞的细胞聚集体。更普遍地，可通过使用一个或多个不同的实施方案移除的细胞聚集体109A，可包括具有一定大小和形状的细胞结块，其中在所述细胞结块中的至少一些内部细胞在灌流过程中由于缺乏充足的氧气和/或营养素而趋于死亡。细胞聚集体通常很大。例如，通过采用本发明的各种实施方案，可以分离并移除最小尺寸(横跨细胞聚集体)为约60微米或更大、或甚至100微米或更大的细胞聚集体109A。一个或多个本发明的实施方案可移除最小尺寸为约60微米至约3,000微米，甚至为约100至约500微米的细胞聚集体。并且/或者，可分离并移除更小的细胞聚集体。在生物反应器102中存在细胞聚集体109A通常是不合需要的，本文描述的本发明的灌流式生物反应器系统100和方法300、400可移除其中至少一些细胞聚集体109A，在许多情况下，可除去大多数细胞聚集体109A。所描述的灌流式生物反应器系统100包括细胞保留装置110，所述细胞保留装置110与生物反应器102流体连接(fluidly coupled)至生物反应器102并且被配置为从生物反应器102接收含有第一细胞浓度(C1)的细胞109的TCF108(可能含有一些细胞聚集体109A)。示例性的第一细胞浓度(C1)的范围可以是从约4×10^6个细胞/mL至约40×10^6个细胞/mL。可使用其他细胞浓度范围。在所描述的实施方案中，含有第一浓度(C1)的细胞109的TCF108，被从生物反应器出口106排出并经由通过第一管道113在细胞保留装置入口112处被接收。管道113可与任选的热交换器113H相连，所述热交换器113H具有冷却从生物反应器出口106排出的含有细胞109的TCF108的功能。配置所述细胞保留装置110，它是可操作的，因此它起的作用是从TCF108分离大部分的细胞109并在第一保留装置出口114处提供仅含有少量细胞109(具有第二细胞浓度(C2))的TCF108的收获输出物。因此，第二细胞浓度(C2)小于第一细胞浓度(C1)，即C2<C1，尤其地，C2<<C1。示例性的第二细胞浓度(C2)的范围可以是从约0.1×10^6个细胞/mL至约2×10^6个细胞/mL。可使用其他细胞浓度范围。所谓的收获输出物从第一保留装置出口114经过，通过第二管道115，例如借助与第二管道115相连的收获物泵117的抽吸作用。收获输出物可在下游分离和纯化过程118中被进一步分离和/或纯化。这些附加的分离和纯化过程118可以以连续或分批的方式进行。例如，这些下游分离和纯化过程118可如标题为“Devices And Methods For Integrated ContinuousManufacturing Of Biological Molecules”的美国公开文本No.2008/0269468中所描述的进行，该专利申请的公开内容以引用的方式全文纳入本文。例如，在分批模式中，一旦收集到指定体积的收获物，这通常在1-4天或更长时间以后，可断开一个或多个收获物收集容器与无菌发酵容器的连接，被收集的物质可称为是一个收获物批次。下一个步骤是移除细胞、碎片和颗粒。在工业规模下，该过程可通过利用离心及之后的死端(dead-end)膜过滤，或死端深度过滤及之后的死端膜过滤完成。也可施用其他技术如切向流(或“横流”)微过滤或任何其他适当的过滤技术。在任何情况下，颗粒移除过程的产物是一个批次的澄清的组织培养液(cTCF)。该cTCF可通过任何适当的方法(例如横流超滤(cross flow ultrafiltration))或通过填充床色谱法(packed bed chromatography)纯化(浓缩)。
在连续模式中，一定体积的收获输出物可通过与灌流式生物反应器系统整合的连续纯化系统进行纯化，所述生物反应器系统可保持在无菌条件下。本文使用的“连续的”意指在时间、顺序和/或操作上不间断，持续很长的时间。例如，细胞保留装置110可进行初始的细胞滞留并在第一保留装置出口114产生澄清的TCF108的收获输出物。分离和纯化过程118可包括通过合适的过滤系统对由第二管道115提供的收获输出物进行进一步的过滤(分离)以产生cTCF，所述合适的过滤系统的最终过滤精度(final filter rating)，在一些实施方案中，为约3微米或更小，0.45微米或更小，或甚至0.2微米或更小。可使用其他过滤精度。
过滤过程之后可以是例如包括连续超滤分离过程的纯化过程。在一些实施方案中，超滤可在特定流速下进行，所述特定流速低于流量对比TMP的曲线中压力依赖区域中目的分子的转变点(transitionpoint)，其中所述特定流速在整个连续超滤过程中基本上保持恒定。采用连续分离和纯化过程118可以得到相对较高的收率。在一些实施方案中，cTCF通过的超滤膜的面积(单位：平方米)大约等于cTCF的体积流速(单位：升/小时)的0.1至2倍，或甚至大约等于cTCF的体积流速(单位：升/小时)的0.3至1倍。可使用其他膜面积。
在细胞保留装置110中进行分离之后，在第二保留装置出口119处提供TCF108和具有相对较高浓度(第三细胞浓度(C3))的细胞109的再循环输出物。第三细胞浓度(C3)通常相对高于第一细胞浓度(C1)，即C3>C1，其原因是尽管在收获物输出流中将会失去较小体积的细胞109，但是在第一保留装置出口114提取的TCF108的体积更大。示例性的第三细胞浓度C3的范围可以是从约6×10^6个细胞/mL至约60×10^6个细胞/mL。可使用其他细胞浓度范围。细胞保留装置110可基于任何已知的细胞分离技术，如圆盘过滤器、旋转过滤器、扁平片状过滤器、微孔中空纤维过滤器、横流过滤器、涡流过滤器、连续离心机、离心式生物反应器、重力沉降器、超声波设备、旋液分离器等。可以使用任何适当类型的细胞保留装置110，其可被配置且是可操作的，并因此起到将进入的第一细胞浓度(C1)分离成排出的细胞浓度(C2和C3)的作用。
在所描述的实施方案中，灌流式生物反应器系统110包括细胞聚集体捕获器120。该细胞聚集体捕获器120可被配置并是可操作的，因此起到在捕获器入口121处从细胞保留装置110接收TCF108和细胞109(第三细胞浓度(C3))的再循环输出物。细胞保留装置110可通过第三管道122与细胞聚集体捕获器120流体连接。在一些实施方案中，可将细胞保留装置110和细胞聚集体捕获器120的功能整合至一个单独的装置中。因此，在这样的实施方案中，管道122可被除去，且细胞保留装置110的输出物可直接被捕获器入口121接收。
细胞聚集体捕获器120的作用为从在细胞聚集体捕获器120处接收的TCF108和细胞109(第三细胞浓度(C3)))的再循环输出物中分离细胞聚集体109A。在一个实施方案中，细胞聚集体109A的分离是连续地进行；即在操作过程中所述流是持续地来自细胞保留装置110。通常，当在流体中存在时，至少部分且通常相对较高比例的细胞聚集体109A被细胞聚集体捕获器120移除，并将剩余的TCF108和细胞109(具有第四细胞浓度(C4))返回至生物反应器102的入口104。示例性的第四细胞浓度(C4)的范围可以是从约5×10^6个细胞/mL至约50×10^6个细胞/mL。可使用其他细胞浓度范围。在一些实施方案中，包括细胞聚集体捕获器120的灌流式生物反应器系统100和方法可移除约20％至80％的细胞聚集体，但是也可移除其它百分数的细胞聚集体。
TCF108和细胞109可离开捕获器出口123并通过第四管道124到达生物反应器入口104。可提供一个或多个再循环泵125并且对其进行操作以使TCF108和细胞109流动。所述一个或多个泵125可位于任何方便的位置，如在管道113、122或124中，或其他适当的位置。在所描述的实施方案中，泵125与第四管道124相连。
另外，细胞聚集体捕获器120可包括任何适当的捕获器丢弃物出口126，所述捕获器丢弃物出口126可被配置且是可操作的，并因此起到从细胞聚集体捕获器120中移除少量TCF108和一些细胞聚集体109A的作用。在捕获器丢弃物出口126提供第五细胞浓度(C5)。示例性的第五细胞浓度(C5)可从约12×10^6个细胞/mL至约90×10^6个细胞/mL。可使用其他细胞浓度范围。由于一些细胞聚集体109A已被细胞聚集体捕获器120从过程流(proces flow stream)中移除，所以细胞浓度(C4)通常比细胞浓度(C3)小，即C4<C3。细胞聚集体109A和少量体积的TCF109可从捕获器丢弃物出口126流出来丢弃。可持续地或周期性地操作丢弃物泵127，以使细胞聚集体109A和少量的TCF108流经丢弃物管道128到达丢弃物容器，如柔软的袋子或其它类型的丢弃物容器。
现参考图2A和2B描述细胞聚集体捕获器120的结构和操作。细胞聚集体捕获器120包括可由刚性材料如不锈钢、玻璃或塑料制成的捕获器主体130。可以使用其他材料。TCF108和细胞109(可能包括一些细胞聚集体109A)在捕获器入口121处接收，如在捕获器主体130的顶部。如所描绘的，在操作过程中，TCF108和细胞109及可能的细胞聚集体109A可直接流入至可在与捕获器入口121直接相邻的位置处形成的扩张区132，并流入至细胞聚集体捕获器120的沉降室134。扩张区132可由具有角度的或弯曲的壁组成，该壁沿着沉降室134的长度方向的逐渐增加沉降室134的横截面积。在所描述的实施方案中，扩张区132显示为截头圆锥形(frustoconical)。但是，捕获器入口121横切面与沉降室134横切面之间任何大体上平滑的过度都可被使用。总体上，从入口121开始面积增加的改变速率(transitionalrate)可低于约8.4cm2/cm，且在一些实施方案中低于4.2cm2/cm,其目的是使加诸于细胞109的剪切力最小化。可使用其它改变速率。但是，在一些实施方案中，扩张区132可以不存在。
细胞聚集体捕获器120可包括侧流室136。侧流室136可与沉降室134一同被构建、配置和操作，以使TCF108和细胞109能够通过捕获器出口123离开细胞聚集体捕获器120，同时使得细胞聚集体109A在重力作用下在沉降室134中沉淀出来。在所描绘的实施方案中，侧流室136通常是圆柱形的，并从沉降室134的侧面134S沿水平方向延伸。例如，侧流室136可以以与沉降室134大体上垂直的方向延伸。但是，可使用其他形状、结构和除垂直以外的方向。
与沉降室134的扩张区132类似，细胞聚集体捕获器120可包括在与侧流室136的捕获器出口123直接相邻的位置处的收缩区138。在一些实施方案中，收缩区138可具有的面积收缩的改变速率不大于约8.4cm2/cm，在一些实施方案中，约4.2cm2/cm或更低。可使用更高或更低的改变速率。在一些实施方案中，可提供例如，可大于2的D3/D4比值。相似地，可在沉降室134底部的捕获器丢弃物出口126处提供丢弃物收缩区140。捕获器丢弃物出口126可具有最大横向尺寸D5(如，内径)。在一个或多个实施方案中，丢弃物收缩区140可具有的收缩面积的改变速率不大于约8.4cm2/cm，在一些实施方案中，约4.2cm2/cm或更低。可使用更高或更低的改变速率。在一些实施方案中，D1/D5比值可，例如，大于2。
更详细地说，在一些实施方案中，沉降室134可具有圆形的横截面，所述横截面的横向尺寸(D1)(例如内径)为约1.9cm至约6.4cm，在一些实施方案中，约2.5cm至约5.1cm。沉降室134的最大横截面积为约2.9cm2至约32cm2，例如，在一些实施方案中为约5.1cm2至约20cm2。捕获器入口121可具有圆形横截面，圆形横截面的横向尺寸(D2)(例如，内径)为约0.48cm至约1.6cm，例如，在一些实施方案中为约0.64cm至约1.3cm。在一些实施方案中，D1/D2比值，例如，可大于约2，或者甚至大于约4。但是，可使用其它适当的横截面形状和大小。
细胞聚集体捕获器120的合适尺寸可取决于灌流式生物反应器系统100的容量(如，其体积通过量)，且其尺寸可基于过流能力(flowcapacity)增加或减小。细胞聚集体捕获器120的尺寸还取决于其它因素如流体密度或粘度等。沉降室134的最大横截面积可等于或大于捕获器入口121的最大横截面积。在所描述的实施方案中，沉降室134的最大横截面积大于捕获器入口121的最大横截面积。特别地，在一些实施方案中，沉降室134的最大横截面积可为捕获器入口121最大横截面积的约4倍或更多倍，约10倍或更多倍，约30倍或更多倍，或甚至约60倍或更多倍。
沉降室134包括上部区134U和下部区134L。上部区134U位于侧流室136中心线142的上方，而下部区134L位于侧流室136中心线142的下方。在所描述的实施方案中，从扩张区132上端到收缩区140下端的沉降室134的总长度(Lt)可以为约9cm至37cm，在一些实施方案中，为约14cm至28cm。从收缩区132上端到侧流室136中心线142的上部区134U的长度(Lu)可为约5cm至18cm，在一些实施方案中，为约7cm至14cm。从收缩区140下端到侧流室136中心线142的下部区134L的长度(Ll)可为约5cm至18cm，在一些实施方案中，为约7cm至14cm。可使用其他尺寸。通常，合乎需要的是可以使用>0.5的Ll/Lu比值，在一些实施方案中，例如Ll/Lu>4。可使用其他比值。
在操作过程中，通过细胞聚集体捕获器120的体积流速通常保持为约0.0025m3/min至约0.0068m3/min，在一些实施方案中，为约0.0030m3/min至约0.0045m3/min。可以使用其他体积流速(如，容量)。但是，在一些实施方案中，需要将沉降室134内的液体流量大致保持在层流雷诺数(laminar Reynold number)范围内。沉降室134中的雷诺数可低于约2300，低于约1000，或甚至在一些实施方案中低于约500，以使混合最弱并促进细胞聚集体109A的充分沉淀和分离，其中雷诺数大致用公式1定义。
Re＝ρQ/μ    公式1
其中，
Q为流体的体积流速(m3/s)，
μ为流体的动力粘度(kg/(m·s))，且
ρ为流体的密度(kg/m3)。
但是，为促进细胞109在流体(flow stream)中充分地滞留以使得TCF108和细胞109可从捕获器出口123离开细胞聚集体捕获器120，并通常在沉降室134中不被沉淀出来，例如，沉降室134中的流体可具有足以使细胞109免于沉淀出来的雷诺数。
侧流室136可具有圆形横截面，圆形横截面的最大横向尺寸(D3)(例如，内径)为约1.9cm至约6.4cm，在一些实施方案中为约2.5cm至约5.1cm。侧流室136的最大横截面积为约2.9cm2至约32cm2，例如，在一些实施方案中为约5.1cm2至约20cm2。但是，可使用其他适当的横截面形状和大小。从进入测流室136的入口至收缩区138的出口端的侧流室136的全长(Ls)可以为约4cm至15cm，在一些实施方案中为约5cm至11cm。始自侧流室136的出口123的最大出口尺寸(D4)(如，内径)可为约0.48cm至1.6cm，在一些实施方案中，为约0.64cm至1.3cm。可使用其它尺寸。测流室136中的流体的雷诺数可高于，例如约2300，或甚至高于约4000。可使用其它雷诺数范围。可选择雷诺数使细胞109在侧流室136中的沉淀最少。
在一些实施方案中，沉降室134的最大横截面积(Asc)等于或大于侧流室134的最大横截面积(Asfc)，即Asc≥Asfc。特别地，沉降室134的最大横截面积(Asc)可等于侧流室136的最大横截面积(Asfc)，或甚至是侧流室136的最大横截面积(Asfc)的5倍或更多倍。可使用其他Asc/Asfc比值。横截面积的差别通常起到提高沉降能力的作用。本文描述的代表性尺寸D1-D5是针对灌流式生物反应器系统100的示例性实施方案，所述灌流式生物反应器系统100第二管道115中每天的流量为2000-3000升(图1)。具有更小或更大容量的灌流式生物反应器系统100可因使用本发明的实施方案而获益，例如第二管道115中每天的流量为约100-200升的灌流式生物反应器系统100。
在操作中，如本文所述的，在沉降室134和侧流室136中提供适当的尺寸和体积流速，细胞聚集体捕获器120被配置并且是可操作的，并因此被改造为适于移除大于或等于约10个聚集的细胞，大于或等于约20个聚集的细胞109，大于或等于约40个聚集的细胞109的细胞聚集体109A。在一些实施方案中，可移除较少量的聚集的细胞。细胞109和TCF108被允许离开侧流室136。因此，不合需要的细胞聚集体109A是通过操作本发明的各种实施方案而被移除。在一些实施方案中，由细胞聚集体捕获器120移除的不合需要的细胞聚集体109A可具有大于约60微米，大于约100微米，或甚至更大的最小横向尺寸(cross-wise dimension)(D6)(参见图2A)。可移除更小尺寸的细胞聚集体。使用细胞聚集体捕获器120的一个优势为可降低从灌流式生物反应器系统100丢弃TCF108的速度。特别地，可使丢弃TCF108的速度变慢以使得从细胞聚集体捕获器120的丢弃物细胞浓度(C5)大于或等于第一细胞浓度(C1)的3倍(其中C5≥3C1)，或甚至高于或等于约5倍(C1)(其中C5≥5C1)。
在所描述的实施方案中，细胞聚集体捕获器120被显示安装在细胞保留装置110的出口处。但是，应理解，细胞聚集体捕获器120可被放置在灌流式生物反应器系统100的其他地方。例如，细胞聚集体捕获器(如细胞聚集体捕获器120)可被提供在第一管道113的位置(如，临近生物反应器出口106或细胞保留装置入口112，或以其他方式与第一管道113相连)。在该实施方案中，TCF108和细胞109的再循环输出物——可能包含细胞聚集体109A——穿过细胞聚集体捕获器然后传至细胞保留装置110。因此，细胞聚集体109A可在进入保留装置110之前被从流体中移除。任选地，细胞聚集体捕获器可整合到生物反应器102中，如在生物反应器入口104处或其附近。
先参考图3描述操作灌流式生物反应器系统100的各种实施方案的方法。一个操作灌流式生物反应器系统100的方法300包括：在302中，从生物反应器(例如生物反应器102)向细胞保留装置(如细胞保留装置110)提供含有细胞(如细胞109，和可能的一些细胞聚集体109A)的组织培养液(如TCF108)。含有细胞的组织培养液可以具有第一浓度(C1)。另外，方法300包括：在304中，在细胞保留装置中从组织培养液分离一些细胞，以提供组织培养液和细胞的收获输出物(例如，在第二管道115)以及组织培养液和细胞的再循环输出物。所述收获输出物可具有第二细胞浓度(C2)。所述组织培养液和细胞的再循环输出物可具有第三细胞浓度(C3)。组织培养液和细胞的再循环输出物可在第三管道122中提供。在306中，在细胞聚集体捕获器(如细胞聚集体捕获器120)中从组织培养液和细胞的再循环输出物中分离细胞聚集体(例如，109A)。最后，在308中，将组织培养液和细胞返回至具有相对较低量的细胞聚集体的生物反应器中(所述相对较低量是与在没有细胞聚集体捕获器120的情况下返回至生物反应器102的组织培养液和细胞相比)。返回的组织培养液和细胞可具有第四细胞浓度(C4)。在分离过程中，周期性地或持续性地，在沉降室134中从细胞109分离出来的细胞聚集体109A可沉淀到沉降室134的底部并可从细胞聚集体捕获器(例如细胞聚集体捕获器120)排出并被丢弃，如通过捕获器丢弃物出口126。
现参考图4描述另一个操作灌流式生物反应器系统100的示例性方法。所述方法400包括:在402中，从生物反应器(如生物反应器102)提供组织培养液(如TCF108)和细胞(如细胞109和可能的一些细胞聚集体109A)的流体。另外，所述方法400包括：在404中，在细胞保留装置(如细胞保留装置110)中从组织培养液中分离一些细胞以提供收获输出物(如，管道115中的输出物)。在406中，在细胞聚集体捕获器(如细胞聚集体捕获器120)中从组织培养液和细胞中分离细胞聚集体。在408中，将组织培养液和细胞返回至具有相对较低量的细胞聚集体的生物反应器中(所述相对较低数量是与没有细胞聚集体捕获器120的情况下返回到生物反应器102的组织培养液和细胞相比)。根据上面的描述应可以认识到，细胞聚集体捕获器(如细胞聚集体捕获器120)可被置于细胞保留装置(如细胞保留装置110)之前或之后，或在灌流式生物反应器系统100的其它位置，其中细胞聚集体109A可被有效地从其再循环流中移除。另外，在灌流式生物反应器系统中可提供多个细胞聚集体捕获器。
根据实施方案的方法可用于移除大于或等于约10个聚集的细胞，大于或等于约20个聚集的细胞(或甚至大于或等于约40个聚集的细胞)的细胞聚集体(例如，109A)，所述聚集的细胞可粘附在一起成团或成块(尽管在一些实施方案中可移除更小的细胞聚集体)。例如，可移除如上所公开的细胞聚集体(如109A)的范围。正因为如此，在灌流的操作过程中，可相对更严格地控制生物反应器102中的密度。另外，另一项优势是，可减少TCF108的丢弃物体积。相应地，这带来明显的好处是：产物体积损失可被最小化。这一优势即使在其中只形成相对少量细胞聚集体109A的灌流式生物反应器系统100中也是显著的。
上述描述仅公开了细胞聚集体捕获器、包括细胞聚集体捕获器的灌流式生物反应器系统及操作灌流式生物反应器系统方法的示例性实施方案。并不意欲将本发明的教导局限于这种实施方案。相反，如本领域技术人员会理解的那样，本发明的教导包括多种替代方案、修改及等价物。例如，如果相对小的细胞聚集体的出现对于灌流式生物反应器系统的性能是不利的，那么细胞聚集体捕获器的其他实施方案可用于移除所述细胞聚集体。本文使用的段落标题仅用于组织目的，不应被解释为以任何方式限制所描述的主题。

Claims (31)

1.一种灌流式生物反应器系统，包括：
生物反应器，其被配置为包含组织培养液和待培养的细胞；
细胞保留装置，其被配置为从所述生物反应器接收含有所述细胞的组织培养液，从所述组织培养液中分离一些细胞并提供组织培养液和细胞的收获输出物，以及提供组织培养液和细胞的再循环输出物；和
细胞聚集体捕获器，其被配置为接收所述组织培养液和细胞的再循环输出物，从所述组织培养液和细胞的再循环输出物中分离细胞聚集体，并将剩余的组织培养液和细胞返回至所述生物反应器。
2.权利要求1的灌流式生物反应器系统，其中所述细胞聚集体捕获器包括：
沉降室，和
侧流室。
3.权利要求2的灌流式生物反应器系统，其中所述细胞聚集体捕获器包括在从捕获器入口至所述沉降室的扩张区。
4.权利要求2的灌流式生物反应器系统，其中所述细胞聚集体捕获器包括在从所述侧流室至捕获器出口的收缩区。
5.权利要求2的灌流式生物反应器系统，其中所述沉降室的横截面积等于或大于所述侧流室的横截面积。
6.权利要求5的灌流式生物反应器系统，其中所述沉降室的横截面积是所述侧流室横截面积的至少5倍。
7.权利要求2的灌流式生物反应器系统，其中所述侧流室从所述沉降室开始沿水平方向延伸。
8.权利要求1的灌流式生物反应器系统，其中所述细胞聚集体捕获器被配置为移除大于或等于约10个聚集细胞的细胞聚集体。
9.权利要求1的灌流式生物反应器系统，其中所述细胞聚集体捕获器被配置为移除大于或等于约20个聚集细胞的细胞聚集体。
10.权利要求1的灌流式生物反应器系统，其中所述细胞聚集体捕获器被配置并改造为适于移除最小尺寸大于约60微米的细胞聚集体。
11.权利要求1的灌流式生物反应器系统，包括通过所述细胞聚集体捕获器的连续的组织培养液和细胞的流。
12.一种细胞聚集体捕获器，包括：
沉降室；
捕获器入口，其被配置为接收组织培养液和细胞的再循环输出物；
侧流室，其被配置为将含细胞的组织培养液的所述再循环输出物的至少一些返回至生物反应器；和
与所述沉降室相连的丢弃物捕获器出口，其被配置为输出细胞聚集体。
13.权利要求12的细胞聚集体捕获器，其中所述沉降室和侧流室被配置为移除大于约10个细胞的细胞聚集体。
14.权利要求12的细胞聚集体捕获器，包括从捕获器入口至所述沉降室的扩张区。
15.权利要求12的细胞聚集体捕获器，包括在所述侧流室的捕获器出口的收缩区。
16.权利要求12的细胞聚集体捕获器，其中所述沉降室的最大横截面积等于或大于所述侧流室的最大横截面积。
17.权利要求16的细胞聚集体捕获器，其中所述沉降室的最大横截面积是所述侧流室的最大横截面积的5倍或更多倍。
18.权利要求12的细胞聚集体捕获器，其中所述侧流室从所述沉降室开始沿水平方向延伸。
19.一种操作灌流式生物反应器系统的方法，包括：
从生物反应器向细胞保留装置提供包含细胞的组织培养液；
在所述细胞保留装置中从所述组织培养液分离一些细胞，以提供组织培养液和细胞的收获输出物，以及组织培养液和细胞的再循环输出物；和
在细胞聚集体捕获器中从所述组织培养液和细胞的再循环输出物中分离细胞聚集体。
20.权利要求19的方法，包括将组织培养液和细胞返回至具有相对较低量的细胞聚集体的所述生物反应器中。
21.权利要求19的方法，包括丢弃来自所述细胞聚集体捕获器的细胞聚集体。
22.权利要求19的方法，包括丢弃细胞聚集体和组织培养液，使得来自细胞聚集体捕获器的丢弃物细胞浓度是提供给所述细胞保留装置的含有细胞的组织培养液的第一细胞浓度的至少约3倍或更多倍。
23.权利要求19的方法，其中所述细胞聚集体包括大于或等于约10个聚集的细胞。
24.权利要求19的方法，其中所述细胞聚集体包括大于或等于约20个聚集的细胞。
25.权利要求19的方法，其中所述细胞聚集体具有大于约60微米的最小尺寸。
26.权利要求19的方法，其中所述细胞包括产生凝固因子的哺乳动物或其他细胞。
27.权利要求26的方法，其中所述细胞包括BHK细胞、HKB细胞或HEK细胞。
28.权利要求19的方法，包括产生因子VII、因子VIII或因子IX。
29.一种灌流式生物反应器系统，包括：
生物反应器，其被配置为包含组织培养液和待培养的细胞；
细胞保留装置，其被配置为从所述组织培养液分离一些细胞并提供收获输出物；和
细胞聚集体捕获器，其被配置为从所述组织培养液和细胞中分离细胞聚集体并提供具有相对较低量的细胞聚集体的输出物。
30.一种操作灌流式生物反应器系统的方法，其中包括：
从生物反应器提供组织培养液和细胞的流；
在细胞保留装置中从所述组织培养液中分离一些细胞以提供收获输出物；和
在细胞聚集体捕获器中从所述组织培养液和细胞中分离细胞聚集体，以产生具有相对较低量的细胞聚集体的组织培养液。
31.权利要求30的方法，还包括将组织培养液和细胞返回至具有相对较低量的细胞聚集体的生物反应器。
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