JP5055479B2

JP5055479B2 - 自動細胞培養装置

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Publication number: JP5055479B2
Application number: JP2007114821A
Authority: JP
Inventors: 尚史津村
Original assignee: JTEC Corp
Current assignee: JTEC Corp
Priority date: 2007-03-27
Filing date: 2007-03-27
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2027-03-27
Also published as: JP2008237203A

Description

本発明は、自動細胞培養装置に係わり、更に詳しくは回転培養装置に自動培養液交換機能を備えた自動細胞培養装置に関する。

従来から自動細胞培養装置は各種提供されている。例えば、本出願人の先願に係る特許文献１には、培養皿を収容した複数の培養カセットを取り扱い、分注作業等の際にロボットアームで自動的に移動させるこことが可能であるとともに、インキュベータ内のガス濃度や温度、湿度等の雰囲気を管理することが可能であり、インキュベータ内の汚染は勿論のこと、分注作業等で培養皿を移送する際にも汚染を確実に防止できる自動細胞培養システムが開示されている。

また、特許文献２には、被検者の細胞培養に必要な培養操作を行うための操作部と、細胞を培養するためのインキュベータ部と、培養に必要な試薬類や培養器具類を保管する保管部と、オートクレーブ滅菌を行うための蒸気供給部とを備え、前記インキュベータ部及び前記保管部は、それぞれ前記操作部に連通すると共に、前記操作部との間にそれぞれ密閉扉を備えており、該密閉扉を選択して開閉することにより、前記操作部と、該操作部に通ずる前記インキュベータ部及び前記保管部の何れかと、に前記蒸気供給部からの滅菌蒸気が供給されることを特徴とする自動細胞培養装置が開示され、また前記操作部は、操作ロボットと、遠心分離器と、細胞培養に必要な培養操作機器とを備えている点が記載されている。そして、特許文献３には、培養容器内の細胞を培養させる培養装置本体を設け、該培養装置本体内に、前記培養容器を収納するインキュベータと、該培養容器内の薬剤を吸引する薬剤吸引機と、該培養容器を搬送する多関節型ロボットとを設け、該多関節型ロボットに、前記培養容器の搬送と、該培養容器の蓋の着脱と、該培養容器内の薬剤吸引時に容器を傾斜させる機能とを具備させた、多関節型ロボットを備えた自動細胞培養装置が記載されている。

しかし、前述の特許文献２，３記載の自動細胞培養装置は、２次元培養装置において培養液の交換作業等を人から多関節型ロボットに置き換えて自動化したものであり、人の出入りを極力少なくして雑菌の侵入を防ぐという意味では効果的であるが、高価な汎用の産業用ロボットを用いて人と同等な作業を行わせるだけであり、装置コストの高騰は避けられないのである。しかも、通常の２次元細胞培養装置の域を脱せず、３次元培養を実現するための装置ではない。

ところで、骨髄に由来する間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪、靭帯などの組織に分化する多分化能を持つが、生体外での通常の培養では、細胞は地球重力によってシャーレの底に沈み、２次元シートしか作らず本来の細胞の形質を失うことが知られている。そこで、無重力に近い微小重力環境での３次元培養を実現するために開発されたのが、ＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇｗａｌｌｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターによる培養方法であり、適切な分化誘導因子のもとで３次元培養を行うと細胞本来の組織に分化する。ＲＷＶは、シンセコン社から発売されており、図８及び図９に示すように、ガス透過膜を裏側に備えた偏平円筒形のベッセル１００が、回転制御装置の水平な回転軸（図示せず）への取付部１０１を中心に回転することにより、細胞に及ぼす重力の方向を絶えず変化させ、時間平均すると、地上重力の１００分の１という微小重力環境を作り出すことができ、それにより細胞塊が沈降せずふわふわと浮いた状態で培養できる装置である。この装置を一般的に回転培養装置と称する。そして、前記ベッセル１００の取付部１０１と反対側の面には、細胞液投入口１０２と、培養液交換用の供給口１０３と排出口１０４とが設けられ、それぞれ供給口１０３と排出口１０４には回転により開閉するコック１０５と着脱可能なゴムキャップ１０６が設けられている。

ここで、ＲＷＶにおける培地の交換作業は、図１０に示すように、ゴムキャップ１０６を外して新しい培養液が入った供給シリンジ１０７の先端を前記供給口１０３に密嵌し、他方空の排出シリンジ１０８の先端を前記排出口１０４に密嵌した後、両コック１０５を開き、一方の手で供給シリンジ１０７のピストンを押し込んでベッセル１００内に培養液を供給し、それと同時に他方の手で排出シリンジ１０８のピストンを引き抜いてベッセル１００内の古い培養液を吸い出すのである。通常、細胞の培養期間は２週間程度である場合が多く、数日毎に培地を交換する必要があるため、前述の煩雑で熟練を要する培地交換作業をその都度行わなければならない。この手作業による培地交換作業は、非常に手間と時間を要し、多数のＲＷＶを稼動させている場合には大変な負担となるばかりでなく、培地交換作業中に予期せぬ環境汚染が生じる恐れもある。また、ベッセル１００の正面に、細胞液投入口１０２や、供給口１０３と排出口１０４が設けられているので、内部の細胞の様子を確認する際に視野が狭まるといった不都合がある。
特開２００６−０１４６７５号公報特開２００６−１１５７９８号公報特開２００６−１４９２６８号公報

通常の２次元培養装置の自動化技術はかなり進みつつあり、市販されているものもあるが、ＲＷＶ３次元回転培養は、培養液の交換作業等を始めとして未だ手動に頼るところが大きく、ＲＷＶ３次元回転培養装置の自動化は、これまでなされて来なかった。現在、試験研究レベルでは、細胞播種、培養液交換、滅菌操作、組織の採取などを研究者の手によるマニュアル操作によって行っている。また、現在の再生医療は、ＣＰＣ（セルプロセッシングセンター）のような大規模施設が必要不可欠であり、立地条件、効率面及びコスト面など多くの問題を抱えており、高額医療を余儀なくされているのが現状である。

これからの培養装置に求められることは、（ｉ）自動化を考慮した培養液交換手法を考案し、長期間（約１ケ月）の培養で汚染が発生しないこと、（ｉｉ）トレーサビリティ機能を有すること、（ｉｉｉ）長期間の培養過程の中で安定した培養が促進するように細胞塊が絶えず浮遊するように回転制御をすること、（ｉｖ）ＧＭＰ（ＧｏｏｄＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＰｒａｃｔｉｃｅ）基準を満たした培養システムを構築することにある。

そこで、本発明が前述の状況に鑑み、解決しようとするところは、ＲＷＶを用いた回転培養技術をもとに細胞播種、培養液交換、品質管理等を自動化したＧＭＰ対応のＣＰＣ不要のシステムを構築することが可能な自動細胞培養装置を提供する点にある。

本発明は、前述の課題解決のために、密閉筐体内に、水平な回転軸を有する円筒形培養容器に、細胞液投入口と、培養液交換用の供給口と排出口とが設けられた回転培養装置を備え、前記供給口と排出口は対となって前記培養容器の外周円筒面で回転中心に対して互に１８０°の回転角度離れた位置に半径方向へ向けて設け、該供給口と排出口を鉛直線上に配置し且つ供給口を上に位置させた状態で、前記供給口に新しい培養液が入った供給シリンジを気密状態で挿脱するとともに、前記排出口に空の排出シリンジを気密状態で挿脱するシリンジ移動手段と、前記供給シリンジを供給口に挿入し且つ前記排出シリンジを排出口に挿入した状態で、供給シリンジのピストンを押し込むと同時に、排出シリンジのピストンを引き抜く操作を行うピストン駆動手段とを備えることを特徴とする自動細胞培養装置を構成した（請求項１）。

ここで、前記供給口と排出口の対を前記培養容器の外周円筒面に複数対設けるとともに、各供給口と各排出口は等角間隔毎に設けていることが好ましい（請求項２）。

また、前記供給口と排出口はセプタムシール構造とし、前記供給シリンジと排出シリンジはそれぞれ先端に前記セプタムシールを貫通可能な注射針を有していることがより好ましい（請求項３）。

また、前記細胞液投入口を前記培養容器の外周円筒面に設け、該細胞液投入口は回転により開閉するキャップを備え、該細胞液投入口が鉛直線上の上側に位置する状態で、前記キャップを自動的に開閉するキャッパーと、前記キャップを外した細胞液投入口から細胞液を投入する細胞液供給手段を備えていると更に好ましい（請求項４）。

ここで、密閉筐体内に、前記供給シリンジを保管する供給シリンジストッカラックを有する温度制御付きの保冷室と、前記排出シリンジを保管する排出シリンジストッカラックを備えるとともに、使用済みの供給シリンジと排出シリンジを廃棄する廃棄ボックスを備え、前記シリンジ移動手段にて、保冷室内の供給シリンジストッカラックから供給シリンジを取り出し、排出シリンジストッカラックから排出シリンジを取り出して、培養液交換後に廃棄ボックスに投入するようにしている（請求項５）。

また、前記ピストン駆動手段は、前記供給シリンジを供給口に挿入し且つ前記排出シリンジを排出口に挿入した状態で、該供給シリンジのピストンの端部と排出シリンジのピストンの端部に、それぞれ同時に係合可能な一対の操作アームを設けたリンクアームと、該リンクアームを鉛直方向へ平行移動させる鉛直移動機構とからなっている（請求項６）。

そして、前記供給シリンジと排出シリンジは、それぞれ供給用アダプターと排出用アダプターに保持されていることが好ましい（請求項７）。

また、前記供給用アダプターと排出用アダプターには、前記シリンジ移動手段を構成する移載ハンドを係合する係合部と、供給シリンジストッカラックと排出シリンジストッカラックにそれぞれ係止するフランジ部を有していることがより好ましい（請求項８）。

以上にしてなる本発明の自動細胞培養装置は、ＲＷＶを用いた回転培養技術を前提として、自動的に培養液を交換する機能を備えているので、研究者等の培養作業従事者の負担を大幅に低減し、細胞培養の効率化を図ることができるとともに、培養中における汚染の可能性を極力少なくすることができ、ＧＭＰ対応のＣＰＣを持たない医療機関でも再生医療の臨床適応を目指すことができるようになり、再生医療を飛躍的に普及させることができる。

本発明は、回転培養装置の培養容器に、供給口から供給シリンジで新しい培養液を注入すると同時に、排出口から排出シリンジで古い培養液を吸い出すといった従来から実績のある培養液交換作業を、完全に自動化することができるのである。つまり、円筒形培養容器の外周円筒面に供給口と排出口を設けたこと、供給口と排出口は回転中心に対して互に１８０°の回転角度離れた位置に半径方向へ向けて設けたこと、そして供給口と排出口を鉛直線上に配置し且つ供給口を上に位置させた状態で、前記供給口に新しい培養液が入った供給シリンジを気密状態で挿脱するとともに、前記排出口に空の排出シリンジを気密状態で挿脱するシリンジ移動手段と、前記供給シリンジを供給口に挿入し且つ前記排出シリンジを排出口に挿入した状態で、供給シリンジのピストンを押し込むと同時に、排出シリンジのピストンを引き抜く操作を行うピストン駆動手段とを備えたことにより培養液の自動交換を可能にしたのである。しかも、培養容器の正面には、視界を遮る供給口と排出口が存在しないので、培養経過の観察が非常にやり易くなるのである。

そして、前記供給口と排出口の対を前記培養容器の外周円筒面に複数対設けるとともに、各供給口と各排出口は等角間隔毎に設けていることにより、培養液の交換実施に際して常に新しい供給口と排出口を使うことができるので、培養液交換時の汚染を極力抑制することができ、また供給口と排出口の数が異なる培養容器を用意しておけば、培養日数に応じて最適な培養容器を選択することもできる。

また、供給口と排出口はセプタムシール構造とし、供給シリンジと排出シリンジはそれぞれ先端にセプタムシールを貫通可能な注射針を有しているので、注射針をセプタムシールに刺し抜きするだけで、気密状態を維持して供給口と排出口にそれぞれ供給シリンジと排出シリンジを挿脱することができる。

更に、細胞液投入口を培養容器の外周円筒面に設け、該細胞液投入口は回転により開閉するキャップを備え、該細胞液投入口が鉛直線上の上側に位置する状態で、前記キャップを自動的に開閉するキャッパーと、前記キャップを外した細胞液投入口から細胞液を投入する細胞液供給手段を備えることにより、最初の細胞液投入も自動化することができ、更に汚染の発生を極力抑制することができる。

また、前記シリンジ移動手段にて、保冷室内の供給シリンジストッカラックから供給シリンジを取り出し、排出シリンジストッカラックから排出シリンジを取り出して、培養液交換後に廃棄ボックスに投入するので、一連の操作を、シリンジを保持したままシリンジ移動手段で連続的に行うことができるので、装置構成が簡単になる。

また、ピストン駆動手段は、供給シリンジを供給口に挿入し且つ排出シリンジを排出口に挿入した状態で、該供給シリンジのピストンの端部と排出シリンジのピストンの端部に、それぞれ同時に係合可能な一対の操作アームを設けたリンクアームと、該リンクアームを鉛直方向へ平行移動させる鉛直移動機構とからなっているので、該リンクアームを鉛直方向下方へ移動させるだけで、供給シリンジのピストンを押し込むと同時に、排出シリンジのピストンを引き抜く操作を正確に同調させて行うことができる。

そして、供給シリンジと排出シリンジは、それぞれ供給用アダプターと排出用アダプターに保持されているので、シリンジの破損を防止することができる。

また、前記供給用アダプターと排出用アダプターには、前記シリンジ移動手段を構成する移載ハンドを係合する係合部と、供給シリンジストッカラックと排出シリンジストッカラックにそれぞれ係止するフランジ部を有しているので、シリンジ移動手段にて取り扱う際に正確な位置決めができる。

本発明の実施形態を添付図面に基づき更に詳細に説明する。図１は培養容器とシリンジの関係を示し、図２は本発明に係る自動細胞培養装置の全体概観を示し、図３及び図４は自動細胞培養装置における培養液の交換作業の様子を示し、図中符号１は回転培養装置、２は培養容器、３は回転制御装置、４は供給シリンジ、５は排出シリンジ、６はシリンジ移動手段、７はピストン駆動手段、８はキャッパー、９は保冷室をそれぞれ示している。

前記回転培養装置１は、図１、図２、図５及び図６に示すように、偏平な円筒形培養容器２と、該培養容器２を装着して回転させる回転制御装置３とから構成されている。そして、前記培養容器２には、その一側面（背面側）の回転中心と同心状に取付部１０を設けるとともに、該培養容器２の外周円筒面に、細胞液投入口１１と、培養液交換用の供給口１２と排出口１３とを設け、そして雌ネジ構造の前記取付部１０を前記回転制御装置３の回転軸１４の先端の雄ネジ部に接続し、前記培養容器２を水平な回転中心の回りに回転するようになっている。ここで、肝臓由来の細胞に限らず、分化誘導で用いるサイトカインなど培地への添加因子は高価であり、培養容器２の容量はできるだけ少ないことが望ましく、容量としては１０〜２０ｍｌであり、１０ｍｌ以下が望ましい。しかし、前記培養容器２の容量は、培養目的に応じて最適に決定すべきである。

図５及び図６に示すように、前記培養容器２の背面側で取付部１０の周囲には、空気の取入口１５を設け、その内側に設けたガス透過膜１６を通して培養液中に酸素を供給し、二酸化炭素を排出できるようになっており、また正面側は内部を透視可能なように観察窓１７となっている。

そして、図１及び図５に示すように、前記培養容器２の供給口１２と排出口１３は、対となって前記培養容器２の外周円筒面で回転中心に対して互に１８０°の回転角度離れた位置に半径方向へ向けて設けられている。本実施形態では、前記供給口１２と排出口１３を３対設けた例を示しているが、少なくとも一対あれば良く、その対の数は培養対象細胞の培養日数と培養液の交換頻度によって決定される。図１に示すように、前記培養容器２は正面視において時計周りに回転するとして、３個の供給口１２は反時計回りにそれぞれ１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃと表示し、同様に３個の排出口１３も反時計回りにそれぞれ１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃと表示することにする。ここで、例えば、供給口１２Ａと排出口１３Ａが対となり、回転中心Ｏを通る直径の線上に位置している。そして、前記供給口１２と排出口１３を３対設ける場合には、各供給口１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃと排出口１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃを等角間隔毎に設けている。前記供給口１２と排出口１３を３対以上の複数対設ける場合も同様である。

そして、前記細胞液投入口１１は、前記供給口１２と排出口１３の中間位置に、前記培養容器２の半径方向に軸中心を設定して設けている。この細胞液投入口１１は、回転により開閉するキャップ１８を備え、該キャップ１８を外して細胞液を投入できるようになっている。

前記供給口１２は、図７に示すように、前記培養容器２の外周円筒面の半径方向に連通するように接続したポート１９の端面に、シリコンゴムからなるセプタムシール２０を配置し、該セプタムシール２０の外周部を、前記ポート１９に螺合した押えキャップ２１で押圧して密閉した構造となっている。つまり、前記供給口１２はセプタムシール構造となっており、前記供給シリンジ４と排出シリンジ５の先端に装着した注射針２２をセプタムシール２０に貫通させて気密状態で接続することができ、また注射針２２を抜いてもその弾性復元によって貫通穴が塞がり、気密状態を維持することができるようになっている。図示しないが、前記排出口１３もセプタムシール構造となっている。

ここで、前記供給シリンジ４と排出シリンジ５は、通常の市販品であり、シリンダー２３の端部に指掛けフランジ２４を有するとともに、ピストン２５の端部にも指当てフランジ２６を有している。そして、前記供給シリンジ４と排出シリンジ５は、それぞれ供給用アダプター２７と排出用アダプター２８に保持されている。前記供給用アダプター２７と排出用アダプター２８は、合成樹脂製の円筒部材であり、内部にシリンダー２３を密嵌し、指当てフランジ２６を利用して抜止め状態で固定できるようになっており、基端部には前記シリンジ移動手段６で保持するための凹環状の係合部２９を共通構造として設けている。具体的には、前記供給用アダプター２７と排出用アダプター２８の係合部２９は、前記指掛けフランジ２４を移動不能に包持する包持部３０と該包持部３０と所定間隔をおいて形成した円環状のフランジ部３１を突設して形成している。更に、前記排出用アダプター２８には、前記フランジ部３１と所定間隔を置いた位置に第２のフランジ部３２を突設している。

図２及び図３に示すように、新しい培養液が入った前記供給シリンジ４，…は、温度制御付きの保冷室９の内部に設けた供給シリンジストッカラック３３に係止されて保管され、空の排出シリンジ５，…は適所に設けた排出シリンジストッカラック３４に係止されて保管されている。前記供給シリンジストッカラック３３と排出シリンジストッカラック３４は同じ構造のものであり、前記供給用アダプター２７又は排出用アダプター２８の本体円筒部を嵌合する平面視Ｕ字形の係止部３５，…を所定数等間隔に形成し、前記供給シリンジ４は注射針２２を下方に向けて、供給用アダプター２７のフランジ部３１で係止し、前記排出シリンジ５は注射針２２を上方に向けて、排出用アダプター２８の第２のフランジ部３２で係止している。

前記保冷室９は、図２に示すように、前記シリンジ移動手段６の動作に連動して扉３６が開閉するようになっている。そして、前記シリンジ移動手段６を構成する移載ハンド３７を開いた扉３６から保冷室９の内部に進入させ、前記供給シリンジストッカラック３３に保管されている供給シリンジ４の供給用アダプター２７に設けた係合部２９を移載ハンド３７で掴み、係止部３５から外して保冷室９の内部から取り出す。その際、前記扉３６は自動的に閉じる。それから、前記移載ハンド３７で保持したまま供給シリンジ４を前記培養容器２の直上まで移動させる。それと同時に、前記排出シリンジストッカラック３４に保管されている排出シリンジ５の排出用アダプター２８に設けた係合部２９を、他の同様構造の移載ハンド３７で掴み、係止部３５から外して前記培養容器２の直下まで移動させる。

それから、前記シリンジ移動手段６の両移載ハンド３７，３７を同調させて接近するように上下方向に移動させて、前記供給シリンジ４の注射針２２を前記供給口１２のセプタムシール２０に貫通させて気密状態で接続すると同時に、前記排出シリンジ５の注射針２２を前記排出口１３のセプタムシール２０に貫通させて気密状態で接続する。このように、同時に上下から注射針２２，２２をそれぞれセプタムシール２０，２０に突き刺すので、前記培養容器２にかかる上下からの押圧力が相殺され、その取付部１０や回転軸１４に殆ど外力が作用しないのである。尚、逆に注射針２２，２２をそれぞれセプタムシール２０，２０から抜く場合も、同時に両移載ハンド３７，３７を同調させて離間するように上下方向に移動させるので、同様に取付部１０や回転軸１４に殆ど外力が作用しないのである。

このように、前記シリンジ移動手段６は、前記供給シリンジ４を装着した供給用アダプター２７と、前記排出シリンジ５を装着した排出用アダプター２８とをそれぞれ取り扱うことができるように、独立した二つの移載ハンド３７，３７を備えている。一方の移載ハンド３７は、前記供給シリンジ４を保冷室９の内部の供給シリンジストッカラック３３から取り出し、前記培養容器２の直上まで移動させ、その状態で上下動し、使用済みの供給シリンジ４を図示しない廃棄ボックスに投入する動作を行う。他方の移載ハンド３７は、前記排出シリンジストッカラック３４から取り出し、前記培養容器２の直下まで移動させ、その状態で上下動し、使用済みの排出シリンジ５を図示しない廃棄ボックスに投入する動作を行う。このような動作をすることができる機構は、リニアガイドとロータを組み合わせて構成することができ、その具体的な構造は本発明では特に限定されず任意である。

また、前記ピストン駆動手段７は、図４に示すように、前記供給シリンジ４を供給口１２に挿入し且つ前記排出シリンジ５を排出口１３に挿入した状態で、該供給シリンジ４のピストン２５の端部に有する指当てフランジ２６と、排出シリンジ５のピストン２５の端部に有する指当てフランジ２６に、それぞれ同時に係合可能な一対の操作アーム３８，３８を設けたリンクアーム３９と、該リンクアーム３９を鉛直方向へ平行移動させる鉛直移動機構（図示せず）とからなっている。前記リンクアーム３９は、鉛直方向に配した杆体であり、その上下両端部に前記操作アーム３８，３８が全体として正面視コ字形になるように固定されている。各操作アーム３８の先端部は、前記ピストン２５の指当てフランジ２６を係止し、若しくは挟持できるような構造になっている。

そして、前述のように、前記供給シリンジ４の注射針２２を前記供給口１２のセプタムシール２０に貫通させて接続し且つ前記排出シリンジ５の注射針２２を前記排出口１３のセプタムシール２０に貫通させて接続した状態で、前記シリンジ移動手段６の移載ハンド３７，３７で供給用アダプター２７と排出用アダプター２８をしっかりと保持したまま、前記ピストン駆動手段７の両操作アーム３８，３８を、供給シリンジ４のピストン２５の指当てフランジ２と排出シリンジ５のピストン２５の指当てフランジ２に係合させ（図４（ａ）参照）、それから前記リンクアーム３９を下方へ移動させることにより、前記供給シリンジ４のピストン２５を押し込んで新しい培養液を培養容器２に注入すると同時に、前記排出シリンジ５のピストン２５を引き抜いて使用済みの古い培養液を吸い出して交換するのである（図４（ｂ）参照）。この培養液の交換作業中に前記培養容器２には殆ど外力が作用しないので、精密機器である回転制御装置３にダメージを与える恐れがないのである。

ここで、前記培養容器２に複数対の供給口１２，…と排出口１３，…を設けた場合に、最初に培養液を交換する際には、先ず前記培養容器２を供給口１２Ａと排出口１３Ａが鉛直方向を向くように静止させて前述の操作により培養液を交換する。それから、培養容器２を所定の回転数で回転させて培養を行い、設定された時間が経過した後、今度は前記培養容器２を供給口１２Ｂと排出口１３Ｂが鉛直方向を向くように静止させて前述の操作により培養液を交換する。この操作を繰り返して培養を行うのである。この培養液の交換作業は、培養液を上から注入し、下から吸い出す方式であり、重力の作用も利用しているので、非常に効率が高い。また、交換作業中に気泡の混入も防止することができる利点がある。ここで、前記培養容器２の回転角度を正確に検出し、正確な回転角度の位置に静止させる必要があり、前記回転制御装置３にそのような機能が備わってない場合には、強制的に培養容器２の静止位置を修正する機能を付加する必要がある。それには、前記培養容器２の所定位置にマーカーを設け、該マーカーを光学的、電磁的に読み取る検出手段と、培養容器２を所定の回転角度位置まで回転させて静止させる回転駆動手段とで構成する。このような機能を、前記回転制御装置３に持たせることが最も好ましい。

また、細胞の培養を開始するにあたり、前記培養容器２の細胞液投入口１１からの細胞液の投入も自動的に行うことも可能である。それには、前記培養容器２を細胞液投入口１１が鉛直線上の上側に位置するように静止させ、その状態で前記キャップ１８をキャッパー８で回転させて外し、該キャップ１８を外した細胞液投入口１１から図示しない細胞液供給手段にて細胞液を投入し、それから細胞液供給手段を退避させて前記キャッパー８でキャップ１８を回転させて閉じる。

これらの機構は、全て密閉筐体内に組み込まれおり、一連の細胞培養期間中は一切人手に頼らなくてもよいようになっているので、汚染の危険性は皆無に近くなる。但し、管理されたバイオ実験専用のクリーンルーム内に構築する等、汚染の恐れがない場合には、全ての機構を密閉筐体内に組み込まなくても良いことは勿論である。

本発明で採用している回転培養装置１は、細胞は沈降することなく三次元集合体を形成することができること、攪拌ストレスによる壊死を回避することができること、効率的に分化誘導物質を作用させることができること、老廃物の除去・養分の供給が可能であること、といった利点がある。本発明では、複数の供給シリンジ４，…を用いて順次培養液を供給することができるので、細胞の培養ステージに応じて最適な成分配合の培養液を用いることができる。

培養期間中に、培養の状況を確認することは重要である。培養の状況としては、（１）培養中にｐＨの変化や培地添加物の消費、老廃物の蓄積等による培地の色の変化の確認、（２）コンタミネーションによる培地の濁りの有無、（３）浮遊細胞から三次元の組織が形成されたかどうかの確認等が挙げられる。本発明では、前記培養容器２の正面には視界を遮るものがないので、正面の観察窓１７に向けて配置した撮像カメラや各種の分析機器を通して内部の状況を観察することができ、また画像処理によって現状を分析し、それに基づいて回転制御装置３をフィードバック制御したり、培養液の交換タイミングを自動的に探るといったことも可能となる。

本発明の自動細胞培養装置は、代表的にはヒト骨髄細胞から移植可能な軟骨組織を構築するために使用することができる。更に、軟骨再生以外にも再生医療の研究は、網膜剥離症や白内障などを対象とした角膜再生、骨欠損や骨粗しょう症を対象とした骨再生、糖尿病などを対象とした膵臓（ラ氏島）再生、拡張型心筋症などを対象とする心筋再生、パーキンソン病やアルツハイマー症を対象とする神経再生などにも及んでいるので、これら軟骨再生以外の再生医療においても、本発明の自動細胞培養装置が有効であると考えられる。本発明の自動細胞培養装置は、将来的には軟骨再生医療のみならず再生医療全般に適応され得るものであり、再生医療の普及のための必須かつ重要な基盤技術となるものと確信する。

本発明の自動細胞培養装置の要部を示し、回転培養容器とシリンジの関係を示す部分正面図である。本発明の自動細胞培養装置の概略配置図である。シリンジを用いた培養液の交換操作の概念を示す説明図である。供給シリンジと排出シリンジを同時に操作して培養液を交換する操作を示し、（ａ）は初期状態を示す部分断面図、（ｂ）は培養液の交換中の状態を示す部分断面図である。培養容器の簡略縦断正面図である。培養容器の簡略縦断側面図である。培養容器の供給口の拡大部分断面図である。従来の回転培養容器の正面図である。従来の回転培養容器の平面図である。従来の回転培養容器における培養液交換操作を示す説明図である。

符号の説明

１回転培養装置
２培養容器
３回転制御装置
４供給シリンジ
５排出シリンジ
６シリンジ移動手段
７ピストン駆動手段
８キャッパー
９保冷室
１０取付部
１１細胞液投入口
１２，１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃ供給口
１３，１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃ排出口
１４回転軸
１５取入口
１６ガス透過膜
１７観察窓
１８キャップ
１９ポート
２０セプタムシール
２１押えキャップ
２２注射針
２３シリンダー
２４指掛けフランジ
２５ピストン
２６指当てフランジ
２７供給用アダプター
２８排出用アダプター
２９係合部
３０包持部
３１フランジ部
３２フランジ部
３３供給シリンジストッカラック
３４排出シリンジストッカラック
３５係止部
３６扉
３７移載ハンド
３８操作アーム
３９リンクアーム
１００ベッセル
１０１取付部
１０２細胞液投入口
１０３供給口
１０４排出口
１０５コック
１０６ゴムキャップ
１０７供給シリンジ
１０８排出シリンジ

Claims

密閉筐体内に、水平な回転軸を有する円筒形培養容器に、細胞液投入口と、培養液交換用の供給口と排出口とが設けられた回転培養装置を備え、前記供給口と排出口は対となって前記培養容器の外周円筒面で回転中心に対して互に１８０°の回転角度離れた位置に半径方向へ向けて設け、該供給口と排出口を鉛直線上に配置し且つ供給口を上に位置させた状態で、前記供給口に新しい培養液が入った供給シリンジを気密状態で挿脱するとともに、前記排出口に空の排出シリンジを気密状態で挿脱するシリンジ移動手段と、前記供給シリンジを供給口に挿入し且つ前記排出シリンジを排出口に挿入した状態で、供給シリンジのピストンを押し込むと同時に、排出シリンジのピストンを引き抜く操作を行うピストン駆動手段とを備えることを特徴とする自動細胞培養装置。
前記供給口と排出口の対を前記培養容器の外周円筒面に複数対設けるとともに、各供給口と各排出口は等角間隔毎に設けている請求項１記載の自動細胞培養装置。
前記供給口と排出口はセプタムシール構造とし、前記供給シリンジと排出シリンジはそれぞれ先端に前記セプタムシールを貫通可能な注射針を有している請求項１又は２記載の自動細胞培養装置。
前記細胞液投入口を前記培養容器の外周円筒面に設け、該細胞液投入口は回転により開閉するキャップを備え、該細胞液投入口が鉛直線上の上側に位置する状態で、前記キャップを自動的に開閉するキャッパーと、前記キャップを外した細胞液投入口から細胞液を投入する細胞液供給手段を備えている請求項１〜３何れかに記載の自動細胞培養装置。
密閉筐体内に、前記供給シリンジを保管する供給シリンジストッカラックを有する温度制御付きの保冷室と、前記排出シリンジを保管する排出シリンジストッカラックを備えるとともに、使用済みの供給シリンジと排出シリンジを廃棄する廃棄ボックスを備え、前記シリンジ移動手段にて、保冷室内の供給シリンジストッカラックから供給シリンジを取り出し、排出シリンジストッカラックから排出シリンジを取り出して、培養液交換後に廃棄ボックスに投入してなる請求項１〜４何れかに記載の自動細胞培養装置。
前記ピストン駆動手段は、前記供給シリンジを供給口に挿入し且つ前記排出シリンジを排出口に挿入した状態で、該供給シリンジのピストンの端部と排出シリンジのピストンの端部に、それぞれ同時に係合可能な一対の操作アームを設けたリンクアームと、該リンクアームを鉛直方向へ平行移動させる鉛直移動機構とからなる請求項１〜５何れかに記載の自動細胞培養装置。
前記供給シリンジと排出シリンジは、それぞれ供給用アダプターと排出用アダプターに保持されている請求項１〜６何れかに記載の自動細胞培養装置。
前記供給用アダプターと排出用アダプターには、前記シリンジ移動手段を構成する移載ハンドを係合する係合部と、供給シリンジストッカラックと排出シリンジストッカラックにそれぞれ係止するフランジ部を有している請求項７記載の自動細胞培養装置。