JP6989828B2 - 細胞塊を集合させる方法及び細胞塊を集合させる装置 - Google Patents
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Description
本願は、2017年11月30日に、日本に出願された特願2017-230609号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
例えば、特許文献1に記載された細胞の培養装置(以下、培養装置とも略して言う)は、ガス交換機能を備えた1軸式の回転式バイオリアクターである。培養装置では、横向きの円筒形バイオリアクター内に液体培地が満たされている。液体培地に細胞(細胞塊)を播種した後で、バイオリアクターの水平軸方向に沿ってバイオリアクターを回転させながら培養を行う。バイオリアクターの回転によってバイオリアクター内の細胞(塊)に掛かる重力の方向が周期的に変化することで、細胞がバイオリアクターに対して相対的に微小な範囲に保持される。つまり、細胞の沈降が抑制される。細胞は液体培地内で均一に懸濁され、必要時間培養増殖され、融合して組織塊を形成する。
本発明の細胞塊を集合させる方法は、液体培地を含み生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容された回転体を回転させて前記細胞塊を集合させる細胞塊集合工程を行うことを特徴としている。
また、本発明の細胞塊を集合させる装置は、液体培地を含み生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容される回転体と、前記回転体の中心軸上に互いの間に隙間を形成して配置され、母材の各端部を取付けるための第1取付け部及び第2取付け部と、を備えることを特徴としている。
この発明によれば、中心軸の周辺に細胞塊を集合させることができる。
この発明によれば、細胞塊を母材周囲に集合させることができる。
また、上記の細胞塊を集合させる装置において、前記母材内に液体培地を供給させる供給部を備え、前記供給部は、本体と、前記本体により第2液体媒体が供給される供給配管と、前記第2液体媒体を前記本体内に戻す排出配管と、を有し、前記供給配管及び前記排出配管は、前記取付け部に連通してもよい。
これらの発明によれば、母材を通して液体培地中の栄養や酸素等を供給し、細胞塊が壊死するのを抑制することができる。
この発明によれば、回転体内に空気が入っていても、その空気により比重調整液内の流れが乱れることを抑制して、細胞を確実に集合させることができる。
この発明によれば、回転体内に空気が無い状態から、細胞塊をさらに確実に集合させることができる。
また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記母材は人工血管又は再生血管であってもよい。
図1に示すように、本実施形態の集合装置1は、回転体11と、一対の取付け部21,22と、供給部26と、を備えている。
回転体11は、後述する比重調整液及び細胞(細胞塊)を収容する収容空間が形成されていれば、特に形状は限定されない。本実施形態では、回転体11は、第1側部12と、第2側部13と、外周板14と、を有している。側部12,13は、円板状に形成され、互いに対向するように配置されている。外周板14は、筒状に形成されている。外周板14の軸線方向の各端部は、第1側部12の外周縁部、及び第2側部13の外周縁部にそれぞれ連なっている。回転体11は、樹脂等により中空の円柱状に形成されている。
例えば、外周板14には、ゴム等により注入口15が形成されている。注入口15は、外周板14を貫通し、回転体11の内部空間に達している。回転体11には、開閉可能な蓋部が設けられていることが好ましい。蓋部を閉じたときに、回転体11における蓋部以外の部分に対して、蓋部が液密に接続される。
また、本明細書で言う細胞とは、スフェロイドを形成できるものであれば、特に限定はないが、例えば、動物由来細胞であり、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター等の哺乳動物由来細胞のことを意味する。細胞は、培養細胞として株化されたものであっても、生物組織から得られた初代細胞であってもよい。胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(以下、iPS細胞と言う)、間葉系幹細胞、細胞として、神経幹細胞等を用いることができ、また、分化細胞としては、肝細胞、膵島細胞、腎細胞、神経細胞、角膜内皮細胞、軟骨細胞、心筋細胞等を用いることができる。さらに、臍帯血、骨髄、脂肪、血液由来組織性幹細胞から分化誘導される細胞を用いることもできる。あるいは腫瘍化した細胞、遺伝子工学的手法により形質転換された細胞やウイルスベクターにより感染された細胞を用いることもできる。
回転体11は、モータ等の駆動部により中心軸C周りに回転する。駆動部は、回転体11の外周板14の外面に接触してこの外面を回転させたり、回転体11と同軸に固定されたプーリ等に巻かれたベルトを回転させることにより、駆動力を伝達させる。
取付け部21,22は、回転体11と同一の材料で形成されている。
なお、母材は人工血管Dであるとしたが、母材はこれに限定されず再生血管等でもよい。ここで言う再生血管とは、再生医療により形成された血管のことを意味する。
図2に示すように、細胞塊W2は、iPS細胞由来細胞W4と、血管内皮細胞(HUVEC)W5と、間葉系細胞(MSC)W6と、を所定の比率で混ぜた混合物W2aを、ウェル内等に集合させて共培養したものである。
ここで言う血管内皮細胞とは、血管内皮を構成する細胞、又はそのような細胞に分化することのできる細胞のことを意味する。ここで言う間葉系細胞とは、主として中胚葉に由来する結合織に存在し、組織で機能する細胞の支持構造を形成する結合織細胞のことを意味するが、間葉系細胞への分化運命が決定しているが、まだ間葉系細胞へ分化していない細胞も含む概念である。
細胞塊W2の比重は、比重調整液W1の比重よりも小さい。例えば、細胞塊W2の比重は1.05である。
ここで言う第1液体培地、及び後述する第2液体培地は特に限定はなく、培養する細胞(塊)に合わせて適宜選択することができる。例えば、MEM、α-MEM、DMEM、RPM1、cRDF、ERDF、F12、MCDB131、F12/DMEM、及びWE等の公知の培地を挙げることができる。また、細胞がヒト幹細胞である場合、ヒト全能性幹細胞用培地として市販されている、mTeSR1(Stem Cell Tech.社製)、Essential 8(登録商標、Life Technologies社製)、Ripro FF/FF2/XF(リプロセル社製)、StemSure(登録商標、和光純薬社製)、CELRENA(細胞科学研究所製)、S-Medium(DSファーマ社製)、StemFit(味の素社製)等を用いることができる。
また、ここで言う生体適合性とは、生体に強い悪影響や強い刺激を与えないことから、生体成分、細胞(塊)等の生体組織、及び生体由来の物質のいずれか1つ以上と共存することが可能である属性を意味する。
比重調整剤は、細胞分離用の密度勾配媒体であることが好ましい。密度勾配媒体として、OptiPrep(登録商標、コスモ・バイオ株式会社製)が用いられる。例えば比重調整液W1の比重は、1.06以上1.08以下である。ただし、細胞塊W2の比重が比重調整液W1の比重よりも小さければ、比重調整液W1の比重は、例えば1.03以上1.15以下、1.01以上1.20以下とすることができる。
比重調整液W1中の比重調整剤の濃度は、比重調整液W1が細胞塊W2に害を与えない程度の濃度であることが好ましい。
例えば、本体27は、図示はしないが、供給タンク、ポンプ、廃棄タンクを有している。供給タンク内には、第2液体培地(液体培地)が収容されている。第2液体培地は特に限定されないが、第1液体培地と同一であってもよい。
ポンプは、供給タンク内の第2液体培地を一定の流速で供給配管28に供給する。供給部26は、回転体11内に第2液体培地を供給する。排出配管29を通して本体27に戻された使用済みの第2液体培地は、廃棄タンク内に収容される。
なお、供給部26は、第2液体培地に代えて血液や人工血液等を供給してもよい。
まず、取付け工程(図3に示すステップS1)において、回転体11の蓋部を開け、人工血管Dの各端部を取付け部21,22に嵌め込む。これにより、回転体11の中心軸C上に人工血管Dを配置する。人工血管Dの各端部と取付け部21,22との間は、液密に封止される。人工血管Dの配置後、回転体11の蓋部を閉じる。取付け工程S1が終了すると、ステップS3に移行する。
次に、脱気工程(ステップS5)において、比重調整液W1が収容された回転体11を、駆動部により中心軸C周りに回転させる。空気の比重は比重調整液W1の比重よりも小さいため、空気に作用する向心力により、比重調整液W1に対して空気が中心軸Cの径方向外側から中心軸Cに向かって移動する。回転体11内の空気は、人工血管D上に集約する。人工血管Dはガス透過性を有するため、空気が回転体11内から人工血管Dの血管壁を通して人工血管D内に除去される。
この脱気工程S5は、後述する細胞塊集合工程S9よりも前に行う。
次に、細胞塊集合工程(ステップS9)において、比重調整液W1と複数の細胞塊W2とが収容された回転体11を、駆動部により中心軸C周りに回転させる。細胞塊W2の比重は比重調整液W1の比重よりも小さいため、細胞塊W2に作用する向心力により、比重調整液W1に対して複数の細胞塊W2が中心軸Cに向かって移動する。図4に示すように複数の細胞塊W2は、中心軸C上に配置された人工血管Dの外周面に集合する。
以上により、集合方法Sの全工程が終了する。
以下では、重力が作用する地上において、回転する回転体11中で複数の細胞塊W2が移動する様子をシミュレーションした結果について説明する。
回転体11の直径を20mm、厚さを10mmとし、側部12,13及び外周板14の厚さは無視した。回転体11は、中心軸Cが水平面に沿って配置されているとした。
細胞塊W2の径を100μm(マイクロメートル)、比重を1.05とした。回転体11内に供給される細胞塊W2の数は、600とした。比重調整液W1の比重を1.08とした。人工血管Dの径を1mmとした。重力が図5に示す下方Aに向かって1G(9.8m/s2)で作用するとした。回転体11の中心軸C周りの回転速度を、150rpm(回転/分)とした。
供給部26により人工血管D内に第2液体培地を供給させながら、細胞塊集合工程S9を行う。このため、人工血管Dを通して第2液体培地中の栄養や酸素等を複数の細胞塊W2に供給することができる。
脱気工程S5は、細胞塊集合工程S9よりも前に行う。従って、回転体11内に空気が無い状態から、細胞塊集合工程S9において細胞塊W2をさらに確実に集合させることができる。
例えば、前記実施形態では、集合装置1は、取付け部21,22を備えなくてもよい。この場合、集合方法Sでは取付け工程S1は行われない。人工血管Dを取付けずに細胞塊W2を集合させると、細胞塊W2は中心軸Cの周辺(中心軸C上)に集合する。中心軸C上の向心力が弱い場合には、細胞塊W2は管状に集合する。
集合装置1は、供給部26を備えなくてもよい。集合方法Sでは、脱気工程S5を細胞塊集合工程S9と同時に行ってもよいし、脱気工程S5を行わなくてもよい。
以下では、本発明の実施例及び比較例を具体的に示してより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
表1に示すように、比重調整剤としてサンプルNo.1~No.6のものを検討した。
回転体の中心軸上に、人工血管を配置した。iPS細胞由来の肝前駆細胞、血管内皮細胞及び間葉系細胞を所定の比率で混ぜて細胞塊を作成した。図9に示すように、回転体内に比重調整液を充填し、複数の細胞塊を注入した状態で回転体を回転させた。回転体は、回転速度150rpmで、12分間回転させた。
なお、比重調整剤(比重調整液)が合格となる判断基準は、比重調整剤が生体適合性を有し、細胞塊よりも比重が大きく、比重調整剤内で複数の細胞塊が生存することである。
比重調整剤として、サンプルNo.1のリンパ球分離溶液(ナカライテスク株式会社製)を、第1液体培地に70%(重量%)混合させて比重調整液を作成した。この場合、比重調整液中の30%が第1液体培地である。比重調整液の比重は1.06であり、pHは7.8であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、複数の細胞塊が生存しており、合格となることが分かった。
(実施例2)
比重調整剤として、サンプルNo.2のOptiPrep(登録商標、コスモ・バイオ株式会社製)を、第1液体培地に14%混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は1.06~1.07であり、pHは7.8であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、図10、及び図11において矢頭に示すように、クサビラオレンジを発現した血管内皮細胞、間葉系細胞、及びEGFPを発現したTkDA 3-4細胞(iPS細胞)由来肝前駆細胞を含む細胞塊は、人工血管上に集合した。この際、図12に示すように、複数の細胞塊が蛍光発現を保持、すなわち生存しており、合格となることが分かった。
比重調整剤として、サンプルNo.3のOptiPrepを、第1液体培地に15%混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は1.07~1.08であり、pHは7.8であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、血管内皮細胞、間葉系細胞、及びEGFPを発現したTkDA 3-4細胞は正常な形態とは少し異なるが、複数の細胞塊が生存しており、合格となることが分かった。
(実施例4)
比重調整剤として、サンプルNo.4のPercoll(登録商標、GEヘルスケア株式会社製)を、第1液体培地に70%混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は1.07~1.08であり、pHは8.1であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、血管内皮細胞及び間葉系細は正常な形態とは少し異なるが、複数の細胞塊が生存しており、合格となることが分かった。
比重調整剤として、サンプルNo.5のポリタングステン酸ナトリウムを、第1液体培地に6%~8%混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は1.06であり、pHは6.6であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、人工血管から細胞塊が剥がれ、細胞塊が壊死してしまうことが分かった。複数の細胞塊が生存できず、不合格であった。
(比較例2)
比重調整剤として、サンプルNo.6のメチルセルロースを、第1液体培地に0.10%混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は、0.98であった。この比重調整液よりも比重が小さい細胞塊は想定されないため、不合格であった。
11 回転体
21 第1取付け部(取付け部)
22 第2取付け部(取付け部)
26 供給部
C 中心軸
D 人工血管(母材)
S 集合方法(細胞塊を集合させる方法)
S5 脱気工程
S9 細胞塊集合工程
W1 比重調整液
W2 細胞塊
Claims (9)
- 液体培地を含み生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容された回転体を回転させて前記細胞塊を集合させる細胞塊集合工程を行う細胞塊を集合させる方法。
- 前記細胞塊集合工程では、前記回転体を前記回転体の中心軸周りに回転させて、前記中心軸の周辺に前記細胞塊を集合させる請求項1に記載の細胞塊を集合させる方法。
- 前記回転体の前記中心軸上に母材を配置した状態で、前記細胞塊集合工程を行う請求項2に記載の細胞塊を集合させる方法。
- 前記母材内に液体培地を供給させながら、前記細胞塊集合工程を行う請求項3に記載の細胞塊を集合させる方法。
- 前記回転体を回転させて、前記回転体内の空気を前記母材上に集約して前記母材を通して前記回転体内から前記空気を除去する脱気工程を行う請求項3又は4に記載の細胞塊を集合させる方法。
- 前記脱気工程は、前記細胞塊集合工程よりも前に行う請求項5に記載の細胞塊を集合させる方法。
- 前記母材は人工血管又は再生血管である請求項3から6のいずれか1項に記載の細胞塊を集合させる方法。
- 液体培地を含み生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容される回転体と、
前記回転体の中心軸上に互いの間に隙間を形成して配置され、母材の各端部を取付けるための第1取付け部及び第2取付け部と、
を備える細胞塊を集合させる装置。 - 前記母材内に液体培地を供給させる供給部を備え、
前記供給部は、
本体と、
前記本体により第2液体媒体が供給される供給配管と、
前記第2液体媒体を前記本体内に戻す排出配管と、
を有し、
前記供給配管及び前記排出配管は、前記取付け部に連通する請求項8に記載の細胞塊を集合させる装置。
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