CN109923204A - 用于细胞的自动化独立并行批量处理的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
提供适用于执行多个细胞制剂的独立并发处理的细胞处理设备，该细胞处理设备包括：(I)细胞处理站；以及(II)多个细胞处理模块，其中多个细胞处理模块与细胞处理站接合并通信；其中所述多个细胞处理模块中的每一个包括限定在其内的离散处理隔室，所述处理隔室包括：(i)试剂包，所述试剂包包括一个或多个试剂容器；以及(ii)一个或多个流体盒，每个流体盒包括一个或多个细胞处理隔室和细胞培养隔室，其中每个处理隔室彼此流体连通。还提供了流体盒，还提供了细胞处理设备的使用方法。
Description
技术领域
本申请涉及用于细胞样品的自动批量处理的新方法和装置。特别地，它涉及高级疗法药物产品(ATMP)的并行批量处理，例如CAR-T细胞疗法产品。
背景技术
近年来，人们对细胞疗法领域的兴趣越来越大。细胞疗法涉及将细胞材料，通常是完整的活细胞引入患者体内，用于治疗多种疾病，包括癌症，以及用于再生医药。
细胞疗法涉及用于治疗的细胞的产生，也称为高级疗法药物产品(ATMP)。为了解决全身免疫反应和疾病传播的潜在风险，ATMP通常在称为自体细胞疗法(ACT)或自体再生疗法的过程来源于患者自身的细胞。
最广泛形式的自体细胞疗法包括从患者体内去除合适的细胞材料，选择和扩增细胞，任选地对细胞进行体外修饰，然后在将处理过的细胞材料重新引回到同一患者之前之前采取适当的质量控制措施。这种方法的相关实例是产生用于治疗癌症的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)疗法产品。
在产生用于治疗的CAR-T细胞的典型方法中，细胞材料以体液如血液的形式从患者体内除去。然后分离和修饰T细胞，使得它们在细胞表面上表达特异于患者所患的特定形式癌症的受体。在重新引入患者时，细胞具有靶向和杀死癌症的能力。此外，细胞具有增殖能力，从而放大免疫应答。自体CAR-T细胞疗法是一种治疗癌症的强大新技术，在某些情况下可显着改善反应率。
由于必须采用的复杂性和严格的处理过程，ATMP的生产成本通常仍然很高。产生所需修饰的细胞材料的工作流程包括在重新引入之前通过培养分离适当的细胞类型、修饰、浓缩和/或扩增。在整个过程中还要求无菌条件并且在过程期间以及过程结束时还要求严格的质量控制程序，以确保满足严格的安全和法规要求。在自体手术中，另外需要每个患者样品必须保持其完整性，并且必须避免与其他患者样品的任何程度的交叉污染，以防止患者暴露于不完全来自患者自身细胞的细胞。
历史上，ATMP是通过传统的开放式实验室环境生产的。在这里，通过使用所谓的“洁净室”设施来维持患者样品的无菌性和完整性，其中通过使用合适的操作条件和设备(例如层流气流橱柜和适当的灭菌技术)减少样品的风险交叉污染。这通常需要该设施以连续的“一个接一个”的过程进行操作。在这些条件下努力增加生产过程的产量可能导致样品交叉污染的可能性更大。在材料处理方面也存在需要克服的物流和安全方面的困难，例如试剂处理/定量给料，特别是样品跟踪。
以串行方式增加吞吐量的替代方案是采用并行方法来进行细胞处理。迄今为止，用于并行处理细胞样品的方法和系统使用多个单独的仪器。但是，这些过程仍然按照“每个仪器一个样品”的一般原则运行。增加额外的设备和人员来操作设施固有地增加了容量，但是这种方法也导致资本支出和人员成本的显着增加。此外，作为降低个体患者样品交叉污染风险的常用方法是将样品物理地分开，通常是分开的房间，这也导致对洁净室空间的需求增加，洁净室空间在制造设施或医疗环境中通常是非常宝贵的。此外，通过这种方法，难以通过将来自每个仪器的公共资源集中作为共用设施(例如质量控制系统，电源和输入气体输入歧管)来实现节省。
还试图在集成过程系统上集中处理细胞制剂，但成效有限。还有人尝试使用手动操作进行中央处理。迄今为止开发的系统非常复杂，并且由于非常高的成本和需要培训足够数量的操作者而遇到了困难。在US2009/0126285中描述了这种设施的示例。
用于细胞疗法的细胞材料的并行处理已在WO 2016/012459中进行了描述。在该方法中，样品在一次性封闭处理板内的无菌隔室中隔离。通过位于处理站内的处理单元，每个板内的样品作为一个进行处理。处理站适于具有更大的处理单元中的板的容量，这需要更长的时间，从而确保样品尽可能高效地以最小的延迟在整个过程中进行。虽然WO 2016/012459中描述的设备解决了增加批量处理系统的容量的问题，但是它无法解决并行地完全独立处理各个样品的需要。因此，WO 2016/012459的系统不能在在降低的资本支出和减少洁净室空间的要求方面实现相同的成本节省的同时以真正独立的并行方式提供处理样品的灵活性。
因此，仍然需要一种系统，该系统提供细胞制剂的自动独立并行处理，特别是细胞疗法的细胞制剂，而不会受到已知系统的缺陷的影响。
发明概述
本发明的一个目的是克服或减轻现有技术系统的至少一个上述缺点或者至少提供相关技术系统的有用替代方案。
本发明的第一方面提供了适用于对多个细胞制剂进行独立并发处理的细胞处理设备，该细胞处理设备包括：
(I)细胞处理站；以及
(II)多个细胞处理模块，
其中，所述多个细胞处理模块与所述细胞处理站接合并通信；
其中所述多个细胞处理模块中的每一个包括在其内限定的离散处理隔室，所述处理隔室包括：
i.试剂包，所述试剂包包括一个或多个试剂容器；
ii.一个或多个流体盒，每个流体盒包括一个或多个细胞处理隔室和细胞培养隔室，
其中每个所述处理隔室彼此流体连通。
适当地，所述设备被配置成使得所述多个细胞制剂中的每一个在整个处理过程中在物理上和/或时间上分开。
在一个实施方案中，所述多个细胞处理模块中的每一个适于一次处理单细胞制剂。适当地，所述细胞处理模块包括用于细胞处理的封闭的基本上无菌的环境。通常，所述封闭的基本上无菌的环境设置在所述试剂包和/或所述流体盒内。
在一个实施方案中，所述细胞处理模块的至少一部分是一次性使用的部件。适当地，基本上所有的细胞处理模块都是一次性使用的部件。在实施方案中，所述细胞处理模块的所述一次性使用的部件选自包括以下的组：所述流体盒；所述试剂包；以及所述流体盒和所述试剂包两者(细胞处理单元)。
在一个实施方案中，所述细胞处理站包括可由所述多个细胞处理模块中的一个或多个细胞处理模块使用的集中设施。适当地，所述集中设施选自包括以下的组：
i.平台底盘；
ii.用户界面显示；
iii.软件和操作系统许可；
iv.中央处理单元(CPU)；
v.主控制系统，包括嵌入式控制器和程序逻辑控制器(PLC)；
vi.电源和配电系统；
vii.控制细胞处理模块或其部件的温度所需的热管理设备；
viii.培养箱气体混合物供应设施；
ix.用于原位测量和/或测试的一个或多个系统；以及
x.离心驱动系统。
在根据本发明第一方面的设备的实施方案中，其中原位测量和/或测试存在于细胞处理站的集中设施中，它们选自包括以下的组：细胞计数；细胞鉴定；纯度；同质性；效力；表征；和质量控制手段。
在一个实施方案中，所述细胞处理模块适于在整个细胞处理中容纳所述细胞制剂。
在另一实施方案中，所述多个细胞处理模块中的每一个包括适于与所述细胞处理系统上的集中设施连接的一个或多个连接器。
在实施方案中，所述试剂包中的所述一个或多个试剂容器适于容纳细胞处理所需的一种或多种非细胞流体。适当地，所述试剂包包括一个或多个可移除的连接器，用于将所述试剂包连接到所述流体盒。通常，每个流体盒配置成在整个细胞处理过程中容纳和操纵单细胞制剂。在一个实施方案中，每个细胞处理模块包括单个流体盒。
在本发明第一方面的一个实施方案中，所述流体盒包括至少一个输入端口、分离室、活化室、转导室、细胞培养室和至少一个输出端口。适当地，所述流体盒还包括选自包括以下的组的元件：
i.过滤器、离心机和其他活性表面，用于将细胞制剂分离成不同的组分；
ii.用于培养细胞和引入活性试剂的反应容器、烧瓶和烧杯；
iii.廊道、通道和流体回路，用于引导流体围绕流体盒流动，流入和流出流体盒。
在一个实施方案中，所述流体盒还包括至少一个泵和至少一个阀门，用于至少部分地控制流体流动，其中流体流动选自包括以下的组：流动通过所述流体盒中的流体回路；流入所述流体盒；以及流出所述流体盒。适当地，所述至少一个泵选自由正排量泵、隔膜、柱塞式泵、叶轮泵、蠕动泵组成的组；并且其中阀门选自包括隔膜阀、旋转阀及其组合的组。
在本发明的第二方面，提供了一种流体盒，其适于为其中的细胞处理提供封闭的无菌环境的流体盒，其中所述流体盒包括至少一个输入端口、分离室、活化室、转导室、细胞培养室和至少一个输出端口。
在实施方案中，所述流体盒还包括选自包括以下的组的元件：
i.过滤器、离心机和其他活性表面，用于将细胞制剂分离成不同的组分；
ii.用于培养细胞和引入活性试剂的反应容器、烧瓶和烧杯；以及
iii.廊道、通道和流体回路，用于引导流体围绕流体盒流动，流入和流出流体盒。
在一个实施方案中，所述流体盒还包括至少一个泵和至少一个阀门，用于至少部分地控制流体流动，其中流体流动包括流体流过所述流体盒中的流体回路，流入流体盒，以及流出流体盒。适当地，所述至少一个泵选自包括以下的组：正排量泵、隔膜、柱塞式泵、叶轮泵、蠕动泵及其组合；其中所述阀门选自包括隔膜阀、旋转阀及其组合的组。
在本发明第二方面的一个实施方案中，所述流体盒是一次性使用的部件。
本发明的第三方面提供了细胞处理单元，其中所述细胞处理单元包括一个或多个流体盒和试剂盒，其中所述流体盒包括至少一个输入端口、分离室、活化室、转导室、细胞培养室以及至少一个输出端口，并且其中所述试剂包包括一个或多个试剂容器，其中所述试剂包中的一个或多个试剂容器适于容纳细胞处理所需的一种或多种非细胞流体。适当地，流体盒和试剂包是集成的单个实体。通常，细胞处理单元是一次性使用的部件。
在本发明第三方面的实施方案中，流体盒是本发明第二方面的流体盒。
在本发明的第四方面，提供了适用于与细胞处理站集成的细胞处理模块，其中，所述细胞处理模块包括：
-细胞处理单元，所述细胞处理单元包括流体盒和试剂包，其中所述流体盒包括至少一个输入端口、分离室、活化室、转导室、细胞培养室和至少一个输出端口，并且其中所述试剂包包括一个或多个试剂容器，其中所述试剂包中的一个或多个试剂容器适于容纳细胞处理所需的一种或多种非细胞流体；以及
-装置，用于保持和接合流体盒和试剂包，使得流体盒和试剂包的流体连接点耦合以提供流体盒与试剂包之间的流体连通。
在本发明第四方面的实施方案中，如权利要求31所述的细胞处理模块，其中，所述细胞处理模块还包括以下中的一个或多个：
-至少一个连接器，用于将所述细胞处理模块或其部件连接到所述细胞处理站；
-至少一个传感器；
-培养箱外壳，用于为所述细胞处理模块提供温控环境；
-加热垫和控制器，用于为所述细胞处理模块提供热能；
-容纳在所述细胞处理模块内的一个或多个机械致动器，用于致动所述流体盒内的元件；
-容纳在所述细胞处理模块内的一个或多个机械致动器，用于致动所述试剂盒内的元件；
-离心设施。
适当地，所述至少一个传感器选自由以下组成的组：热电偶/热敏电阻组成，用于测量温度；压力传感器，用于测量流体压力；流量计，用于测量流体流量；以及过程要求的生物传感器。
在一个实施方案中，细胞处理单元是一次性使用的部件。
在进一步的实施方案中，所述流体盒是本发明第二方面的流体盒；和/或细胞处理单元是本发明第三方面的细胞处理单元。
本发明的第五方面提供了一种用于执行至少两种细胞制剂的独立并发处理的方法，其中所述方法包括：
1)提供细胞制剂；
2)提供流体盒，其中所述流体盒包括一个或多个细胞处理隔室和细胞培养隔室；
3)将细胞制剂放入所述流体盒中；
4)组装包括所述流体盒和试剂包的细胞处理模块；
5)使所述细胞处理模块与细胞处理站上的可用接受点接合；
6)操作所述细胞处理站以进行所述细胞制剂的自动细胞处理，以提供处理过的细胞制剂；
7)利用另外的细胞制剂重复步骤1至6，以便在细胞处理站上独立和并发处理至少两种细胞制剂；
8)任选地重复步骤7，直到所述细胞处理站上的所有可用接受点都被细胞处理模块占用；
9)当完成该细胞制剂的自动细胞处理时，从所述细胞处理站移除所述细胞处理模块。
10)对所述细胞处理站上的每个细胞处理模块重复步骤9；
其中该方法的步骤(3)、(4)和(5)以步骤(2)与步骤(6)之间的任何顺序进行。
在本发明第五方面的实施方案中，每种细胞制剂的细胞处理在空间上和/或时间上与每个其它的细胞制剂分开。
在进一步的实施方案中，所述方法在封闭的无菌环境中进行。适当地，所述封闭的无菌环境在所述流体盒和所述试剂包中的一个或多个内。
在一个实施方案中，在从所述细胞处理站移除所述细胞处理模块之前，进一步处理所述细胞制剂。适当地，所述进一步处理选自包括冷冻用于冷冻保存和配制成包含处理过的细胞制剂的组合物的组。
在本发明第五方面的实施方案中，所述自动化细胞处理包括选自包括以下的组的一个或多个步骤：
a.选择细胞；
b.富集细胞；
c.步骤(a)的选定细胞和/或步骤(b)的富集细胞的活化；
d.细胞的遗传修饰以提供遗传修饰细胞；
e.扩增步骤(d)的遗传修饰细胞以提供扩增细胞；
f.洗涤步骤(e)的扩增细胞；
g.步骤(e)的扩增细胞的浓度；
h.配制步骤(e)的扩增细胞以提供细胞配制物，其中所述细胞配制物用于保存和/或直接注射。
在一个实施方案中，细胞是T细胞。适当地，步骤(d)中的遗传修饰是用嵌合抗原受体(CAR)进行遗传修饰。通常，所述CAR选自包括以下的组：NKG2D CAR和B7H6CAR。
在进一步的实施方案中，该方法在根据本发明的第一方面的细胞处理设备上进行；流体盒是本发明第二方面的流体盒；和/或细胞处理模块是本发明第四方面的细胞处理模块。
本发明的第六方面提供了一种计算机设备，包括处理器和编码耦合到处理器的一个或多个非神经网络程序的存储器，其中所述程序使处理器执行根据本发明第五方面的方法。
附图说明
图1显示了根据本发明的细胞处理设备的示意图，其中接合了四个细胞处理模块。
图2a示出了根据本发明的细胞处理设备的实施方案的计算机生成表示，该细胞处理设备适于容纳安装在手推车上的两个细胞处理模块。示出一个细胞处理模块与细胞处理设备脱离，从而可以看到流体盒和试剂包。
图2b示出了根据本发明的细胞处理设备的实施方案的示意图，该细胞处理设备适于容纳未安装在手推车上的四个细胞处理模块。示出一个细胞处理模块与细胞处理设备脱离，从而可以看到流体盒和试剂包。
图2c示出了未安装在手推车上的细胞处理模块的实施方案的示意图。
图3显示了根据本发明的细胞处理单元的实施方案，其包括组装形式的流体盒和试剂包。
图4显示了细胞处理单元，其包括分解形式的流体盒和试剂包。
图5示出了流体盒内的活化、转导和扩增区域的实施方案的截面透视图。
图6显示了患者衍生材料如何连接到并包括在已包含试剂包和流体盒的CPM中的实施方案。
图7示出了根据本发明的设备内的细胞处理的基本处理流程的实施例。
图8示出了根据本发明的设备内的细胞处理的详细处理流程的实施例。
图9显示了根据本发明实施方案的用于生产T细胞的自动化过程中的质量控制和分析的过程流程的实施方案。
图10显示了在本发明的设备的一个实施方案中产生的T细胞的扩增(图10a)和活力(图10b)数据。
发明详述
在阐述本发明之前，提供许多定义仅仅是为了帮助理解本发明。本文引用的所有参考文献都通过引用整体并入。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
将参照特定实施方案并参考某些附图来描述本发明，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求限定。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。所描述的附图仅是示意性的而非限制性的。在附图中，为了说明的目的，一些元件的尺寸可能被夸大并且未按比例绘制。
如本文所用，术语“包含”意指必须包括任何所述元素，并且也可任选地包括其他元素。“基本上由......组成”意味着必须包括任何列举的元素，排除将实质上影响所列元素的基本和新颖特征的元素，并且可以任选地包括其他元素。“由......组成”表示排除除了列出元素以外的所有元素。由这些术语中的每一个限定的实施方案都在本发明的范围内。
在提及单数名词时使用不定冠词或定冠词的情况，例如：“a(一)”或“an(一个)”，“the(该)”，这包括该名词的复数，除非另有特别说明。此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分相似元件，而不一定用于描述次序或时间顺序。应理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以除本文描述或说明顺序之外的其他顺序操作。
除非另有说明，否则本发明的实践采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术和化学方法的常规技术，这些技术在本领域普通技术人员的能力范围内。这些技术也在文献中有解释，例如M.R.Green，J.Sambrook，2012，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Fourth Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY；Ausubel，F.M.等(1995年和定期补充；Current Protocols inMolecular Biology，ch.9,13和16，John Wiley&Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree和A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley&Sons；J.M.Polak和James O′D.McGee，1990，In Situ Hybridisation：Principles andPractice，Oxford University Press；M.J.Gait(编辑)，1984，OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach，IRL出版社；以及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis ofDNA Methods in Enzymology，Academic Press。这些一般文本中的每一个都通过引用并入本文。
本文使用的术语“细胞”通常是指真核细胞，更特别是哺乳动物细胞，最特别是人细胞。
这里参考细胞样品的并发、同时或并行处理使用的术语“独立”定义为每个样品以这样的方式处理，使得在空间上(物理)和时间上(时间)与正在同一设备上处理或要在同一设备上处理的任何样品的处理分开。为避免产生疑问，“独立”一词，特别是应用于时间独立性时，包括样品的相互作用，如果在需要多于一个样品使用共用设施之间有定时上的冲突，则一个或多个样品的处理可以延迟或重新路由以适应这种情况。
本文中关于处理隔室使用的短语“流体连通”可以指直接流体连通(即，两个隔室紧邻)或间接连通(流体可能需要在其到达处理隔室之前穿过例如容器、管或其他隔室)，只要不会永久阻止流体在隔室之间流动。流可以是双向的，单向的，或者在两个以上的方向上。
如本文所用的术语“自体的”是指同一个体。如本文所用的术语“同种异体”是指相同的物种，但是不同的个体。
如本文所用的术语“单采血液成分术”定义为医学技术，其中受试者的血液通过分离出一种特定成分并将其余部分返回循环的装置。因此，单采血液成分术是一种体外过程。
如本文所用，术语“PBMC”是外周血单核细胞。该细胞类型是指具有圆形细胞核的任何外周血细胞。这些细胞由淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞组成。
本文所用的术语“T细胞”是指在其细胞表面上具有T细胞受体的淋巴细胞。该术语是指所有类型的T细胞(效应子，辅助细胞，细胞毒性或杀伤细胞，记忆、调节或抑制因子，自然杀伤细胞，粘膜相关不变量和γδ)以及T细胞亚群和/或T细胞祖细胞。注意，对于一些同种异体应用，T细胞可能被制成T细胞受体缺陷，但是这些TCR缺陷型T细胞仍被设想为本文的T细胞。
本发明的一个目的是提供使用这些系统的系统和方法，以增加细胞产品，特别是高级疗法药品(ATMP)的生产灵活性和生产量。ATMP的一个例子是CAR-T细胞疗法产品。
根据本发明的系统对生物材料或从患者移除的样品(例如血液)执行一系列制造工艺步骤。所有过程都在封闭的无菌环境中进行。该设备旨在并发处理来自多个患者的材料或样品，样品之间没有交叉污染。给定样品的处理与先前或随后在设备中处理的其他样品平行并且以完全独立的方式进行。
根据本发明的系统具有在一个设备上同时以独立方式处理多个患者样品的能力。该系统可以自动化以最小化操作者干预并提高样品和试剂处理的准确性，并最小化样品跟踪中的误差。
将这种系统用于并发处理大大减少了等待时间：在可以处理多个细胞批次的典型设备中，需要同时加载这些细胞批次，并且在该过程完成之前不能添加新批次。这导致细胞制造系统的启动操作的延迟(在操作设备之前需要存在足够批次的细胞，否则它不是最大限度地使用)，以及开始处理新细胞批次的延迟(如果典型的细胞制造设备是可操作的，需要在装载新批次之前终止操作)。由于特别针对需要紧急治疗的病情严重的患者设想了细胞疗法，因此这种延迟的减少是非常有益的。
更详细地，本发明的系统包括容纳一个或多个细胞处理模块(CPM)的细胞处理站(CPS)。每个CPM代表用于处理的单个细胞样品的封闭系统，其一旦组装，就与来自外部环境和系统中的其他CPM的污染隔离。
每个CPM包括一个或多个流体盒(FC)，其中装载有细胞样品。通常，每个CPM包括单个FC。FC可以从CPM移除，或者可以永久地附接到CPM，并且样品直接加载到其中。适当地，FC可从CPM移除。适当地，在装载细胞样品之前，FC以基本上无菌或无菌的状态提供，以防止污染待装载的样品。通常，FC是一次性使用的盒，为每个新样品提供无菌状态的新盒。适当地，FC在所需的细胞处理完成后被丢弃并且不再使用。
每个CPM还包括一个或多个试剂包(RP)。RP包含相应CPM中包含的样品的细胞处理所需的各种流体。RP可以从CPM移除，或者可以永久地连接到CPM，并且试剂直接加载到其中。适当地，RP可从CPM移除。适当地，RP在装载试剂之前以基本上无菌的条件提供。RP可以以清洁，无菌的状态提供，以防止被加载的试剂污染。通常，RP是一次性使用的盒，其针对每个新样品以无菌状态提供。适当地，RP在所需的细胞处理完成后被丢弃并且不再使用。
下面提供了CPS、CPM、FC和RP中的每一个的具体实施方案的更详细描述：
细胞处理站(CPS)
CPS提供了一个中央支持平台，其中可以可拆卸地安装一个或多个CPM。CPS可以同时容纳一个或多个CPM。CPS可以适于容纳其在其中被操作的设施所需的数量的CPM。通常，CPS将具有同时容纳至少两个CPM的能力。适当地，CPS将具有同时容纳三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个CPM的能力。在一个实施方案中，CPS可以同时容纳四个CPM。
CPS还可以包括可以由至少两个安装的CPM使用的一个或多个公共或共用设施(下文中称为“平台设施”)。在实施方案中，平台设施可以包括公共电源、控制系统和用户界面、中央培养箱和制冷设施以及平台QC系统。
CPS中提供的可由一个或多个CPM共用的典型设备功能和技术包括：
-平台底盘；
-用户界面显示；
-软件和操作系统许可证
-中央处理单元(CPU)；
-主控制系统，包括嵌入式控制器和程序逻辑控制器(PLC)；
-电力供应商和配电系统；
-加热和冷却所需的热管理设备，包括用于例如的低温保存的冷冻；
-用于原位测量的系统，可能包括细胞计数，细胞鉴定，效力，细胞纯度(或杂质的表征/测量)，同质性，细胞表征，内毒素检测，安全性监测(例如通过检测病毒拷贝数或复制型逆转录病毒)，支原体检测；
-离心驱动系统。
在一些情况下，使用由多个CPM共用的设施可以减少仅用于每个细胞过程的部分或一部分的设施的冗余。这样的实施例可以是仅在细胞处理内的设定点处用于质量控制目的的分光光度计，或者是集中式用户控制面板。可替代地，共用设施可以提供更准确或更一致的服务提供，例如混合温度控制的供应气体或电力。
由于细胞在培养操作中花费的相当大部分的总体制造时间，本发明的方法是可行的；在培养期间，大多数流体处理和细胞处理技术都是不活动的。因此，通过在细胞处理模块之间共用这些技术，适当的批量启动时间的适度交错能够提高昂贵技术的利用率。
在本发明的实施方案中，CPS还可以包括以下中的一个或多个：
-培养箱气体混合物供应设施连接到平台中装载的一个或多个CPM中的每一个。通过仅具有一个培养箱供应设施和气体混合物控制系统以及为一个或多个CPM和其中包含的FC中的每一个提供更加热和化学计量稳定的培养环境，公共培养箱具有节省成本的益处。可以将单独的CPM培养箱外壳集成为单个CPU培养箱外壳设施，其中FC的CPM闭合和支撑结构可以将FC直接接受到公共培养箱外壳中。
-用于每个CPM和某些公共平台设施的控制系统、监控和用户操作过程的单个用户界面点。用户界面还可以包括显示在交互式触摸屏上的图形用户界面，该交互式触摸屏与可编程逻辑控制器(PLC)环境和硬件接口；
-到各种平台和CPM电气部件的电源基础设施和分配网络。
-质量控制系统，用于监控中间过程中每个CPM及其中包含的样品的关键细胞参数和质量。将QC系统作为平台设施的好处是通过在CPM之间共用昂贵的设备来节省成本，因为它在整个过程中具有相对较低的利用率。
在一个实施方案中，QC系统包括通过使用分析设备如流式细胞仪、光学细胞计数器，通过细胞计数、细胞活力、细胞表征或其他细胞/生物监测中的一种或多种来监测样品的状态。作为非限制性实例，QC系统可包括通过显微镜检查、荧光、台盼蓝或流式细胞术监测细胞计数和活力；通过流式细胞术或其他方法监测细胞的特性，纯度或同质性；检测内毒素(如通过LAL测试)；安全性监测(例如通过病毒拷贝数(VCN)的PCR和/或具有复制能力的逆转录病毒的检测(RCR-测试))；Myclopasma检测(例如通过PCR或革兰氏染色)；监测效力(例如通过与细胞系共培养)。
通过机器人或其他机械手段将QC系统定位在每个CPM的基准位置，或通过光学、电子或其他其他传输设备或其中QC设备可以在CPM之间共用的其他方法将每个CPM QC基准位置的输出传输到平台QC系统，可以在CPM之间共用QC设施。值得注意的是，QC过程可能发生在过程后和CPU本身之外。类似地，将注意到每个CPM可以具有其自己的个体QC系统。
-分别用于细胞电穿孔、融合或转染的电穿孔、电融合或转染设备。类似地，应注意每个CPM可具有其自己的个体电穿孔、电融合或转染系统。本文还设想使用声孔、磁传导或基因枪将核酸递送到细胞中。
-制冷供应设施连接到各个CPM制冷外壳，为过程中使用的各种试剂提供必要的温度环境。将注意到，各个CPM制冷外壳可以集成为单个CPS制冷外壳设施，由此RP的CPM封闭和支撑结构可以将RP直接接受到公共的制冷外壳中。
该系统可进一步包括保存装置，用于保存所获得的细胞。根据具体实施方案，保存装置可以是低温保存装置。特别地，可以将细胞配制成用于低温保存，在合适的收容器(例如袋子)中提供，并且将收容器中的细胞立即冷却至所需温度，通常冷冻。通常，低温保存在-20℃或更低，-60℃或更低，-80℃或更低，或-196℃或更低的温度下进行。根据这样的实施方案，CPS将配备合适的冷冻供应设施。保存或低温保存的过程可以在不需要人工干预的情况下实现，从而在不需要人员方面具有优势(这也意味着可以随时启动细胞处理方法，因为不需要匹配具有熟练操作者可用性的过程的结束时间)，没有时间延迟(即立即低温保存导致产品保持在最佳状态)。尽管原则上可以通过这种方式将细胞储存在系统中，但通常设想，一旦适当冷冻，袋子可以被转移到更适合长期储存的存储空间，并且系统中的保存装置被腾出用于保存新批次的细胞。
根据特定实施方案，用于保存所获得的细胞的保存装置或保存室包括在系统内。这种保存装置或保存室通常适合于低温保存，因此能够冷冻适当配制的细胞。通常，保存室用于初始冷冻和可能的短期储存。尽管在系统中长期储存可能是可行的，但是特别设想这将在另一个位置进行，因此系统可以自由地保存更多的批次。
-供热设施管件连接到各个CPM加热外壳，为过程中使用的各种试剂提供必要的温度环境。应注意的是，各个CPM加热外壳可以集成为单个CPS加热外壳设施，由此RP的CPM闭合和支撑结构可以将RP直接接受到公共加热外壳中。
通常，加热供应设施旨在将细胞保持在合适的温度，特别是37℃或更高，35℃或更高，32℃或更高，30℃或更高，25℃或更高。然而，加热供应可以例如也可以用于为基于QC的方法提供正确的温度，并且在一些这些实施方案中，可能需要更高的温度(例如，基于PCR的方法需要94-98℃，48-72℃，68-72℃之间的温度循环，取决于使用的酶)。
细胞处理模块(CPM)
CPM是一个分立模块，可以可拆卸地连接，对接，集成或安装在CPS上。CPM接受特定患者和细胞过程的FC和RP。一个或多个CPM可以立即安装在CPS平台中，从而可以同时处理多个患者样品。根据安装一个或多个早期CPM的时间，在CPS中安装或移除第二个或更多CPM的时间没有限制。适当地，任何新的CPM都在由操作者的需求决定的时间安装，并且CPS将以对所有过程最高效的方式对过程开始和后续操作进行排序，然后同时运行。
CPM可以是适合于其设想的细胞处理的任何大小。在一个实施方案中，CPM位于可以在生产设施周围操纵的手推车上，该手推车用于在该过程的所需部件安装在CPS中之前收集该过程的所需部件，例如，构成试剂包和包含用于处理的细胞样品的流体盒的部件。图2a中给出了这种实施方案的图示说明。
大剂量细胞疗法需要大量的培养基和支持试剂，当将其掺入试剂包中时，可能导致总体一次性重量太高而不能安全携带。使CPM安装在手推车上不需要将试剂储存设施放在CPS附近，从而降低了安装成本和潜在的操作者伤害。
将CPM安装在车轮或其他运输工具上(例如在手推车中)也允许实现其他优点：CPM与CPS的对接可以被引导(例如通过轨道)并且可以是自动的或半自动的(例如，使用制动系统以避免CPM与CPS的粗暴耦合)。可以合并用于正确对接的级别工具或检查，以便CPS可以相应地显示肯定或错误消息。
在一个实施方案中，手推车可用于直接在床边从患者收集细胞样品。在实施方案中，手推车适于能够对接或安装到CPS中，该CPS被适当地推到适当位置。
尽管使CPM具有可以容易地四处移动的形式(例如通过添加轮子)的优点，但这不是先决条件，而是可以考虑其他设计(例如以节省空间)。图2b显示了具有四个可手动加载的CPM的CPS实施例。图2c更详细地示出了该实施方案的CPM。
在实施方案中，CPM包括以下中的一个或多个：
-装置，接合FC和/或RP，使得一旦FC和/或RP封闭在它们各自的外壳内，FC和/或RP的配合流体连接点耦合。这种接合装置适当地不会损害相应外壳的热完整性。接合FC和RP的一种可能方法是转换FC和RP支持结构中的一个或两个以将两个实体组合在一起。这可以包括连接到任一外壳的提升机构，该提升机构是用户操作的或自动启动的动作。应注意，FC和RP的接合可替代地发生在机器外部，并且还是由操作者执行的过程。还应注意，如果FC和RP是集成实体，则可能不需要接合装置。
-与所需CPS平台设施的一系列连接，包括与电源、控制系统和用户界面的电气和数据连接，与培养箱和制冷设施的管件连接，与平台QC系统的物理连接。将注意到，另一个实施方案可以看到每个单独的CPM具有它们自己的专用设施。
-根据过程的要求，为FC和试剂包提供一系列传感器，以监控各种不同的参数。这些传感器可包括用于测量温度的热电偶或热敏电阻，用于测量流体压力的压力传感器，用于测量流体流速的流量计，诸如葡萄糖监测器的氧气传感器，氧传感器，以及该过程所需的其他传感器。此外，传感器可以提供闭合的反馈控制回路以优化过程的各个阶段内的变量。
在实施方案中，CPM包括培养箱外壳，以在该过程期间为RP提供温控环境。适当地，外壳提供冷藏(即低于环境温度)环境。通常，冷藏外壳内保持的温度低于约15℃。适当地，温度低于约10℃，8℃，6℃，4℃，2℃，0℃。在一个实施方案中，将外壳冷藏以提供约4℃的环境。冷藏外壳的好处是为温度敏感试剂提供了在整个过程中存活的合适环境，从而消除了额外的操作人员在中间过程中加载时间和温度敏感试剂并且可能阻碍或干扰过程。在一个实施方案中，冷藏外壳是CPM内的密封和隔热隔室，具有封闭和支撑结构，其中RP被插入，保持和密封。在一个替代实施方案中，冷藏外壳是较小的隔间，其仅为RP的一部分提供冷藏设施。
在一个实施方案中，CPM还可包括加热垫和控制器，以向FC和/或试剂包提供额外的热能。适当地，加热垫仅向FC提供热量。除了培养箱外壳之外还具有加热垫的好处是在进入FC之前或进入FC时快速加热试剂流体的手段，这减少了通过环境热升高试剂流体温度的任何延迟。类似地，加热垫提供对培养箱内试剂流体温度的更精细控制。在实施方案中，加热垫具有适于提供所需加热特性的任何形式。适当地，加热垫是Peltier热部件、硅基热晶片、电加热金属块或其他提供热能的装置。在实施方案中，加热垫取代培养箱外壳作为该过程的主要热源。通常，加热垫被配置用于在细胞处理中保持合适的温度，特别是37℃或更高，35℃或更高，32℃或更高，30℃或更高，25℃或更高。然而，也可以使用相同或不同的加热垫来为基于QC的方法提供正确的温度，并且在一些实施方案中，可能需要更高的温度(例如，基于PCR的方法需要94-98℃，48-72℃，68-72℃之间的温度循环，取决于所用的酶)。
在实施方案中，CPM还包括容纳在CPM内的机械致动器和FC内的致动元件，例如泵、阀门或其他动态部件。例如，可以使用隔膜泵。这种泵送技术利用由气压或机械驱动的振荡隔膜来产生流体室(隔膜下方)的体积变化，每次振动很像气缸中的活塞。这种泵送方法模仿心脏动作，因此被认为对细胞是最自然和温和的。该技术的使用提供了一种无管解决方案，其制造成本低且易于组装。为了在进气和排气冲程中致动隔膜，CPM中的泵马达可以用在曲柄型布置上。类似地，泵可以由压力和真空供应装置气动驱动。作为另外一种选择或除此之外，可使用阀膜片，利用向内推动的弹性隔膜，以在活化时产生抵抗堰阻止流体流动的流体密封。设想的另一个动态部件是精密流体计量单元，其可以控制高精度、少量流体的重复分配。机械致动器容纳在CPM内的优势在于它降低了FC的成本和复杂性，特别是当FC是一次性的一次性使用的部件时，因为只有低成本的泵和阀头将在后处理处置掉，而致动装置可以保留并再次使用。
在实施方案中，CPM包括离心设施，其中FC可以用作该过程的分离、活化、转导、扩增或其他阶段的部分。
流体盒(FC)
FC是个体CPM的组成部分，其在整个细胞处理过程中包含和操纵细胞。每个CPM可包括适合于进行的细胞过程的任何数量的流体盒。通常，每个CPM包括一个或多个FC。在一个实施方案中，每个CPM包括一个FC。当安装在CPM中时，一个或多个FC提供封闭的结构，以防止来自其他样品和环境的交叉污染。
为了保持经杀菌的无菌条件，FC可以在无菌条件下新使用并在一次使用后丢弃(即单细胞处理程序)。可替代地，可以在使用后适当地处理FC，以在重复使用之前将其回收到经杀菌的无菌状态。
FC容纳细胞材料并提供可用于该过程的不同步骤的元件。在本发明的实施方案中，这些元件包括：
-用于分离患者材料的过滤器、离心机或其他活动表面(分离)。
-用于培养细胞和引入活性试剂的反应容器、烧瓶或烧杯(活化，转导，扩增)；
-一个或多个废物处置容器；
-用于引导流体从FC的一个区域流向另一个区域的廊道、通道和流体回路。
在实施方案中，FC还包含将流体和细胞移动到为该过程的各个步骤分配的FC内的不同位置所需的泵和阀门。适当地，所使用的泵的类型是正排量泵，例如隔膜泵或柱塞式泵，但是可以预期可以使用任何合适的泵类型。类似地，阀门可以适当地是隔膜或旋转阀，但是可以使用任何合适的阀类型。
泵和阀门还可以使RP中的流体在该过程中根据需要移动到FC中。这些流体可包括患者输入材料、试剂介质、活性试剂和/或其他所需流体。
在实施方案中，FC还包含流体连接点，以实现FC与RP之间的流体连通，以允许两者作为单独的物品制造，供应和装载，并且一旦安装在CPM中就提供封闭系统。该连接需要在整个过程中保持FC的无菌完整性，并且这可以使用例如脱开、气密密封或其他经杀菌或无菌连接器来实现，以流体连接两个物品。
流体盒中的至少一些流体回路将输送含有细胞的流体，可能是已经培养一段时间的细胞。由于这些细胞可能倾向于聚集在一起，根据特定实施方案，引导试剂包中的流体流动的流体回路被设计成在细胞产品流过时破坏细胞聚集。这可以通过改变管道直径并结合急转弯(包括90°转弯)来实现。这样，细胞液的流动不是线性的，并且将模仿例如通过例如上下移液实现的效果，但不需要任何人为干预。
在本系统的实施方案中，RP可以集成到FC中以将RP和FC提供为单个整体部件。这种方法可以减少操作者的努力、浪费输出或提供由集成组合提供的其他益处。
在实施方案中，FC的构造是模制和/或焊接的基本上刚性的聚合物组件，其具有带有泵或阀门特征的弹性体包覆成型区域。可以存在封装在模制部件之间的分立过滤器元件。在某些实施方案中，FC的设计和布局可以使用模制的流体廊道来引导流体通过该过程的步骤，其中整体隔膜泵提供移动适当流体的动力。FC的构造可替代地包括具有离散流体部件的柔性管网络，例如保持在刚性框架中的叶轮泵、蠕动泵、过滤器或离心机。作为另一替代方案，FC的构造可以是整体模制组件与具有离散流体元件的柔性管状段的组合。
试剂包(RP)
RP是患者特定的消费品，其包含该过程所需的各种非细胞流体。流体可以是液体、水溶液、气体混合物、凝胶、冻干材料悬浮液或其他流体组合物。适当地，流体可以是患者输入材料、本体介质、活性成分和所需的其他试剂。适当地，试剂可包括：患者全血，单采血液成分术，分离的患者细胞材料，细胞生长培养基如X Vivo，细胞分离培养基如Ficoll，成熟剂，细胞活化剂或抑制剂，细胞因子，酶，抗体或类似蛋白质，蛋白质，肽，病毒或病毒载体(例如逆转录病毒，慢病毒，腺病毒或基于其的载体)，转座子(例如睡美人)，其他核酸(例如mRNA，shRNA，siRNA，miRNA，裸DNA，质粒，lncRNA，反义寡核苷酸)，合成分子(例如PNA，LNA，钉合肽)，缓冲液，重构培养基。
通常，出于实际原因，将区分患者衍生材料和其他材料。例如，在合适的储存条件下，非患者衍生材料可以在RP中预组装。当需要进行细胞处理时，患者衍生材料将仅包括在RP中或连接到RP。因此，根据某些实施方案，仅含有非患者衍生材料的RP可以已经与FC连接和/或并入CPM中，后来仅包括患者衍生材料。患者衍生材料可以掺入RP中或与RP连接。
对于如何将患者衍生材料连接到并包括在已经包括RP和FC的CPM中的非限制性示例，参见图6a-e，其描绘了以下步骤：
-步骤1：在细胞处理模块上放置管焊机，并将血液分离装置加载到分配的收容器中(图6a)；
-步骤2：将输入管从细胞处理模块并且将输出管从血液分离袋加载到管焊机中并焊接(图6b)；
-步骤3：从管焊机上松开焊管并处理管端(图6c)；
-步骤4：从细胞处理模块顶部取下管焊机，将焊管连接放在血液分离袋顶部(图6d)；
-步骤5：现在可以将CPM和患者细胞产物加载到CPS中进行处理(图6e)。
RP还包含流体连接点，以实现FC和RP之间的连接，以允许两者作为单独的物品制造，供应和装载(有关连接方法的更多详细信息，请参阅FC)。
还应注意的是，RP可以与FC集成，其中腔室在预先填充有上述流体的结构内。
RP的构造和布局包括刚性结构，其容纳一个或多个试剂容器和流体连接点以与FC连接。刚性结构可以由模制和焊接的聚合物组件组成，其具有用于插入离散试剂容器的特定区域。各个试剂容器可以是柔性且柔韧的聚合物薄膜结构，其中焊接有模制的无菌连接器。
RP还可以包括刚性模制聚合物组件，其具有弹性体包覆模制区域，其中连接器硬件插入件被模制，由此刚性结构中的模制空腔形成容纳流体材料的容器。
可替代地，试剂包还可以包括一系列离散的试剂容器，其具有单独装载的集成流体连接点。根据一些具体实施方案，在试剂包中预见到空容器用于废物处置。
容纳一个或多个单独包装的试剂流体包的刚性试剂结构的益处是：允许多个试剂制造供应商和场所；根据治疗方案，试剂包的可配置性；多次灌装步骤防止污染；以及其他好处。
作为非限制性实例：根据特定实施方案，可配置的试剂包可能需要在细胞过程开始时仅结合试剂包的一部分，而试剂包的另一部分在过程正在进行中时连接或结合在细胞处理模块中。当然，连接需要以无菌方式进行，而不会损害设备或过程的封闭性质。可以使用它的实施例是例如提供病毒载体，可以在转导步骤之前进行。
在一个实施方案中，RP构造提供在过程中间向RP添加其他试剂，而无需从CPM完全移除RP或将流体连接与FC分离。在一个实施方案中，这种结构将包括具有合适的无菌屏障的可锁定舱口，该可锁定舱口打开以暴露RP结构内的隔室，由此可以插入额外的试剂并流体连接至FC。
方法
根据本发明的设备和方法可用于生产多种用于治疗的细胞，特别是用于细胞疗法。细胞疗法定义为在患者中施用活的全血细胞或使特定细胞群成熟以治疗疾病。这些包括但不限于输血、骨髓移植、干细胞疗法(包括造血干细胞(HSC)疗法或诱导多能干细胞(iPSC)疗法)和脐带血疗法。最近，基于细胞的免疫疗法已经受到很多关注，其中涉及免疫系统的细胞被修饰并施用于患者以改善对例如癌症或传染病的免疫应答。这种基于细胞的免疫疗法包括例如基于树突细胞的免疫疗法、NK细胞免疫疗法、B细胞免疫疗法、T细胞免疫疗法-包括但不限于基于TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)的疗法、TCR疗法(其中T细胞配备有经修饰的TCR)或嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法。尽管本文所述的细胞处理设备可用于处理在这些方法中的任何一种中使用的细胞，但它特别适用于涉及细胞修饰的那些方法(除了细胞的培养或扩增之外)。这是因为这样的方法需要对样品执行多个不同的操作。换句话说，该设备和方法特别适用于基于细胞的免疫疗法。
基于细胞的免疫疗法可以是自体的(使用患者自身的细胞进行细胞处理，然后再输注或再注射)或同种异体(使用供体细胞进行细胞处理，然后施用于患者)。该设备和方法可用于两种类型的疗法，但所获得的时间优势对于自体免疫疗法是最重要的，这是特别设想的。这是因为这些疗法从患者材料开始-当从供体材料开始时，可以预先制备细胞制剂。
设想的方法通常在如本文所述的流体盒中进行。由于该盒在其运行时与试剂包流体连通并提供用于细胞处理的封闭系统，因此也可以说该方法在连接到合适试剂包的盒中进行(即，如本文所述的细胞处理单元)。此外，由于盒和试剂包通常形成细胞处理模块的一部分，所述方法通常在如本文所述的细胞处理模块中进行。提供这些细胞模块用于细胞处理站，因此该方法特别适合于在如本文所述的细胞处理设备中执行。
设备提供对细胞样品的自动处理的完全封闭环境的优点在于，与正常细胞制造方法相比，这些方法可以在非分类区域中进行。
本文所述的方法通常包括提供细胞样品作为第一步。样品可以取自健康受试者，或来自需要治疗的患者(通常是自体方法中的病例)。起始材料含有合适的细胞。对于基于细胞的免疫治疗方法，细胞样品通常含有免疫系统的细胞。特别地，细胞样品将含有外周血单核细胞(PBMC)。甚至更特别地，细胞样品将含有淋巴细胞。最特别地，细胞样品将含有T细胞。
细胞样品的非限制性实例包括血液，单采血液成分术或白细胞去除术产物，骨髓或淋巴。特别设想血液和单采血液成分术，因为它们的收集侵入性最小并且容易含有足够数量的合适细胞。
然后可以将细胞样品置于如本文所述的细胞处理模块中。这可以通过将它们结合到试剂包中来实现(即，试剂包将包含几个容器，一个具有患者衍生材料，至少一个具有非患者衍生材料)，或者通过无菌方式将它们连接到流体盒，或将它们放入流体盒中。还可以是已经组装了细胞处理模块，其包括与试剂包(即细胞处理单元)连接的流体盒，并且细胞样品装载在细胞处理模块中(例如通过以无菌方式将其连接到流体盒或试剂包中)。因此，细胞样品、流体盒和试剂包提供和彼此连接的顺序通常是可互换的，并且可取决于设备布局或要进行的过程的性质。一旦组装并包含细胞样品，细胞处理模块然后可以与细胞处理站上的可用接受点接合，并且可以操作细胞处理站以执行细胞样品的自动细胞处理。在一些实施方案中，患者材料可以装载在已经与细胞处理站接合的细胞处理模块中。然而，细胞处理方法仅在细胞样品处于(或连接到)细胞处理模块时才开始。注意，在一些特定实施方案中，当仅提供试剂包的一部分时可以启动细胞处理方法，并且在稍后的时间点提供试剂包的其余部分。例如，这可以是以特定方式最佳地存储的材料的情况，或者通常在分类环境中处理的材料的情况。
在如本文所述的设备中执行的方法的特定优点是可以在同一设备上的不同样品上执行两种或更多种细胞处理方法，彼此独立，但基本上并发(即，至少部分地在时间上重叠)。因此，在完成先前样品的处理方法之前，可以在同一设备上(在不同的细胞处理模块中)启动关于新细胞样品的方法。换句话说，提供细胞样品，提供流体盒和试剂包，将细胞样品连接到流体盒(或在细胞处理模块中装载细胞样品)和接合细胞处理模块的步骤可以以一种不按顺序但并发(或部分并行)的方式重复。并发过程的数量通常由可以在细胞处理站中同时接合的细胞处理模块的数量来确定。
这些方法可以在彼此独立的同一设备上执行。虽然这可能意味着在同一设备中对不同的细胞样品并发地执行不同的细胞过程，但通常是同时执行的相同的细胞过程。
根据特定实施方案，该设备在同一患者的不同细胞样品上并发且独立地执行相同的细胞过程。这样，可以在同一设备上对同一患者进行多次剂量。
特别设想的一个方面是自动化细胞处理的方法用于制造基于细胞的免疫疗法。这通常需要修饰干细胞、PBMC、淋巴细胞、NK细胞、B细胞或T细胞。根据一些实施方案，修饰是遗传修饰。根据其他实施方案，修饰是T细胞的遗传修饰，例如通过制备TCR修饰的T细胞或CAR修饰的T细胞。
实施例3中提供了制备CAR-T细胞的典型方法，作为可以在根据本发明的设备上适当执行的方法的实施例。
如本文所述的自动细胞处理方法通常包括选自以下的一个或多个步骤：
·选择和/或富集感兴趣的细胞
·细胞活化
·细胞的遗传修饰，例如通过转导
·扩增细胞
·细胞浓度
·配制细胞，其中配制物用于保存(包括低温保存)和/或直接注射
在这些步骤之间，通常用合适的缓冲液洗涤细胞以除去过量的试剂或者为了改变培养基。下面更详细地描述这些不同的步骤。
细胞的选择和/或富集
通常，细胞样品起始材料不是待处理细胞的纯种群。相反，患者材料(例如全血)或部分处理的患者材料(例如单采血液成分术产物)用作起始材料。这些材料包含多种细胞类型，并且为了选择和/或富集要处理的特定细胞类型，可以使用不同的方法(也取决于细胞类型)。由于基于细胞的免疫疗法中使用的许多细胞类型是一种或另一种PBMC，因此也可以通过富集或选择PBMC(从而富集多于一种类型的细胞)来完成细胞的富集，这可能会也可能不会随后进一步富集或选择特定细胞类型(例如T细胞，NK细胞，B细胞，单核细胞，淋巴细胞)。
样品上的PBMC选择最通常使用Ficoll程序，使用基于最初开发的方法的简单快速离心程序来进行，所述方法是本领域公知的(Isolation of mononuclear cellsand granulocytes from human blood(从人血液中分离单核细胞和粒细胞)。(论文IV)A.，Scand.J.，Clin.Lab.Invest.21Suppl，97,77-89(1968)；Isolation ofleucocytes from human blood–further observations(从人血液中分离白细胞-进一步观察)。(论文II).A.，Scand J.Clin.Lab.Invest.21Suppl，97,31-50(1968)；Isolation of lymphocytes,granulocytes and macrophages(淋巴细胞，粒细胞和巨噬细胞的分离)。A.，Scand.J.，Immunol.5Suppl，5,9-15(1976))。
在本文提供的方法中，取决于细胞处理设备或流体盒的设计，PBMC的富集或选择(或者，等效地，非PBMC的PBMC的分离)也可以通过以下方式实现：
-冷冻细胞，杀死红细胞(RBC)和粒细胞，并使T细胞和单核细胞存活；
-使用微流体通道，可以从血液样品中去除RBC(通常基于它们的不同表型：不同的尺寸，重量，体积，光散射或标记物可以用于引导微流体回路中的不同细胞)；
-通过使用水力旋流器或几个阶段的水力旋流器，RBC可以从血液样品中除去，因为它们的向心力与流体阻力的比率不同；
-使用多层过滤器尺寸，可以从样品中正向选择T细胞，去除RBC和粒细胞。额外的过滤器可用于执行其他清洗步骤；
-使用磁珠/云，可以使用阴性选择分离PMBC以去除RBC/粒细胞(裂解和磁珠)，以及T细胞和单核细胞的阳性选择；
-使用不同密度的RBC和PBMC，可以使用离心机仅收集全血中的PBMC；
-通过使用逆流离心机(CFC)，我们可以从T细胞中分离出RBC和粒细胞，并进行几个洗涤步骤；
-使用纤维过滤，可以进行介质交换以在洗涤阶段浓缩细胞。切向流动中空纤维过滤器对此有用；
-可以使用RBC裂解缓冲液如氯化铵(NH4Cl)溶液裂解红细胞；
-Hetastarch可用作RBC的沉淀剂；
-用链霉抗生物素蛋白包被的MagcloudzTM凝胶与生物素缀合的CD3抗体结合使用，可用于阳性选择T细胞；
-使用声学技术生成多维驻波以分离RBC细胞。
而且，特定细胞的阳性或阴性选择步骤(通常使用标记物)可用于该方法中以实现细胞的选择或富集。例如，CD3、CD4和CD8标记物可用于富集T细胞，CD19和CD20用于人B细胞，CD11c，CD123，BDCA-2，BDCA-4用于树突细胞，CD56用于人NK细胞，CD34用于造血干细胞细胞，CD14和CD33用于人单核细胞或巨噬细胞，CD66b用于人粒细胞，CD41，CD61，CD62用于人血小板，CD235a用于红细胞。后三种细胞类型通常是负选择的(即从样品中除去)。针对这些标记物的抗体是公知的，可商购获得并且常规用于选择或富集这些细胞类型。抗体可以在这些方法中，使用涂有这些抗体的表面(例如在流体盒中)，使用具有此类抗体的柱，使用具有这些抗体的(对)磁珠(为了易于操作)，使用可以与这些抗体偶联的(对)磁珠(例如使用MagCloudzTM套件；)等等。
活化细胞
一旦获得了适当的细胞群(直接作为细胞样品，或在选择和/或富集适当细胞的步骤之后)，该方法可以进一步包含活化细胞的步骤。在大多数情况下，该步骤是任选的，但是当该方法需要使用(γ-)逆转录病毒或(γ-)逆转录病毒载体修饰细胞时，该步骤特别有用。这是因为逆转录病毒(取决于菌株)优先或排他地转导分裂细胞。慢病毒和腺病毒(以及基于其的载体)通常也感染分裂细胞和非分裂细胞，因此细胞活化不是先决条件。对于非病毒方法(例如电穿孔、声波穿孔、转染、磁转染、基因枪)也是如此。
如本领域所述进行细胞活化。通常，CD3抗体(OKT3)用作活化信号。也可以使用第二活化信号，例如，抗CD28抗体。这种第二活化信号也可以用作唯一的活化信号，尽管基于抗CD3的活化是本领域中最常见的。其他活化信号例如是抗CD2抗体，抗4-1BB抗体。可用于活化细胞的细胞因子包括但不限于IL-2，IL-7，IL-12，IL-15和IL-21，它们可单独使用或组合使用。
细胞的遗传修饰
本文描述的方法通常涉及细胞的遗传修饰步骤。可以使用本领域的标准程序进行遗传修饰，包括但不限于转染、电穿孔、电融合、声孔效应，磁转染或基因枪。根据具体实施方案，通过用病毒载体转导进行遗传修饰。病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体和腺病毒载体。
遗传修饰方案在本领域中是公知的并且与本文描述的方法相容，并且可以适应本文所述的细胞处理设备(假设适当的硬件集成在设备、细胞处理模块或流体盒中)。当使用阳离子试剂时，一些病毒转导方案(特别是逆转录病毒，但也包括慢病毒)的效率增强，例如，(纤连蛋白片段)、聚凝胺(溴化己二甲铵)或vectofusin-1。因此，遗传修饰的方法可能需要使用这些试剂，例如，使用涂层板或袋。可以在方法中实施遗传修饰步骤的其他示例性方式，通过使用以下
-MagcloudzTM涂有(或类似产品)并悬浮在CFC锥体中；
-使用(或类似产品)涂覆的CFC锥体可以实现转换；
-使用CFC的锥体可以实现转导，从而形成细胞和病毒载体相互作用的流化床；
-转导可以通过将细胞和病毒载体导入过滤器中来实现，所述过滤器已经用合适的引物如引发，或者没有引发步骤；
-可以通过使用声学技术用病毒载体浓缩细胞来实现转导。
遗传修饰的类型(即，引入哪种构建体或改变哪种蛋白质的表达)不限制本发明：可以进行任何遗传修饰。然而，特别设想用于细胞免疫疗法的是TCR-修饰的T细胞的产生(通过遗传修饰引入经修饰的TCR)或CAR-修饰的T细胞、NK细胞等。
可以在遗传修饰方案中引入的CAR构建体的实例包括但不限于针对以下靶标的CAR：CD19，BCMA，CD20，CD22，CD30，CD33，CD38，CD70，CD123，CEA，c-Met，CS1，EGFRvIII，EpCAM，ERRB2，HER-2/neu，叶酸受体α，GD2，IL-13Ra2，L1-CAM，间皮素，MUC1，MUC16，PSCA，PSMA，TAG-72，NKG2D，NKp30和B7H6。CAR可以是第一代构建体(仅具有一个刺激结构域，通常为CD3ζ或FcεRI)，第二代构建体(具有额外的刺激结构域，通常为CD28或4-1BB)，或第三代构建体(具有两个额外的刺激结构域，通常为选自已提及的组的一个和OX40、ICOS、DAP10、DAP12、CD2、CD27、CD30、CD40或类似的链)。它们也可以进一步修饰(抑制性CAR、门控CAR、sideCAR、TRUCK、装甲CAR等)。还特别设想的是使用双特异性CAR，其对两种不同靶标具有特异性。
特别设想的是使用NKG2D CAR(如WO2006036445中所述)，B7H6 CAR(如WO2013169691中所述)或NKp30 CAR(如WO2013033626中所述)。
经修饰的TCR具有优于CAR的优点，即它们也可以靶向细胞内蛋白质。除了CAR所设想的靶标之外，经修饰的TCR设想的靶标的实例包括但不限于：NY-ESO-1，MAGE-A3，ROR-1，WT-1。
扩增
在该过程的不同阶段，可以培养或扩增细胞，以增加在处理方法结束时获得的经处理细胞的数量。例如，细胞可在活化之前或之后，或在修饰之后，或在浓缩或配制之前进行扩增。通常，细胞的扩增可以在透气性快速膨胀设备中进行，例如G-REXTM系统
但是，目前的方法不限于使用G-REXTM；还设想了以下备选方案，并且技术人员可以找到扩增细胞的类似方式。
-中空纤维：将细胞加载到过滤管的中空纤维的中心以进行活化和/或扩增。生长培养基和细胞因子可以在纤维外部循环，因此通过纤维馈给/接触细胞；
-定制烧瓶：烧瓶底部由与G-Rex烧瓶类似的材料构成，用于透气性；
-无需摇动的细胞培养袋；
-需摇摆的细胞培养袋，例如在单次使用WAVE bioreactorTM 中；
-附有抗体的水凝胶：这形成了有效的、大的表面区域，可以活化和扩增细胞。如果需要，可以添加额外的凝胶。水凝胶可以容纳在烧瓶、袋子或CFC收容器中。
-微载体珠可用于任何需要培养贴壁依赖性细胞的应用中。
注意，用于细胞扩增的表面也可以用于容器中用于其他工艺步骤(例如，使用中空纤维或微载体珠也可以发生活化步骤)。
洗涤，浓缩，配制
该方法可包含一个或多个洗涤细胞和/或浓缩细胞的步骤。这些可以根据已知的程序设想。作为非限制性的，实施例3指定了这些步骤中的几个步骤。
设想用于洗涤细胞的典型缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)或Hanks的平衡盐溶液(HBSS)。
通常进行浓缩步骤以减小体积，并且需要选择性地除去流体，同时将细胞保留在样品中。尽管可以在整个过程中进行浓缩步骤，但最典型的是，在配制之前，在该过程结束时设想浓缩步骤。可用于浓缩细胞(或减少样品体积)的合适技术包括但不限于逆流离心机(CFC)、中空纤维过滤器(HFF)、切向流过滤(TFF)、声学技术。
该方法的最终结果通常是适当配制的扩增数量的细胞。如果配制物用于直接施用于患者(通常是直接注射或直接灌注)，则新鲜产物通常将配制在含有盐水缓冲液和血清的合适培养基中，如本领域详述。如本文所用的“直接施用”是指产物通常在24小时内施用(即，不需要长期储存或添加稳定剂)并且在施用前不冷冻产品。它不一定意味着产物立即从细胞处理设备取出给患者。
当细胞配制物用于保存时，通常使用保存溶液或将其添加到配制物中，特别是用于低温保存。当配制物进行低温保存时，通常将低温保护剂添加到细胞中，例如DMSO或甘油。用于低温保存的配制物是本领域公知的，并且还可以含有海藻糖、葡聚糖、乙二醇、丙二醇等。
QC测试
除了用于制造处理后细胞的所有方法步骤(从提供细胞样品，到细胞的修饰，到配制细胞用于保存或直接施用)之外，该方法还可以包括用于在过程的不同阶段进行质量控制的步骤。与其他步骤一样，QC采样和测试完全自动化并在封闭系统中完成。图9中提供了示例性细胞处理方法(这里是T细胞的逆转录病毒转导方法)的不同QC采样步骤的示意图。
可以结合在本文描述的细胞处理方法中的QC方法步骤可以例如包括通过显微镜、荧光、台盼蓝或流式细胞术监测细胞计数和活力；通过流式细胞术或其他方法监测细胞的特性、纯度或同质性；检测内毒素(如通过LAL测试)；安全性监测(例如通过病毒拷贝数(VCN)的PCR和/或有复制能力的逆转录病毒的检测(RCR-测试))；支原体检测(例如通过PCR或革兰氏染色)；监测效力(例如通过与细胞系共培养)。
本发明解决了几个问题。首先，在本文描述的系统中，用于制造细胞疗法的机器的高资本成本通过CPM的统一来解决，以降低系统成本，同时益处是允许在CPS内共用和重用昂贵的组件。
通过CPS中的多个CPM共用公共设施还有利于减少处理多个患者样品所需的机器占用空间。由于在获取，调试和操作这样的空间方面的费用，洁净室中的地板空间趋于受限，因此在该环境中减少对地板空间的需求导致设施成本的降低。
此外，提供封闭的无菌系统允许细胞制造在非分类环境中而不是在指定的洁净室中进行。因此，通过在一个设备中结合不同的细胞处理步骤，不仅设备更紧凑(因此需要更少的空间)，它对空间的性质也有更少的要求。利用本发明的设备，对于受控的无菌条件，例如层流式橱柜和个人防护装备，没有要求或要求最小。这消除了对这些昂贵资源的需求和维护。这还减少或消除了对操作者的增强培训的需要，否则操作者将需要熟悉在无菌条件下工作所需的技术和设备。
减小设备的尺寸和成本以及减少或消除对洁净室空间的需求使得本发明的系统更容易位于患者附近，例如在医院中。患者和制造地点的这种接近降低了由于患者材料到制造地点的可追溯性而出错的可能性。可以在单个位置更容易地实现可追溯性管理(例如，使用与患者腕带上的ID匹配的一次性盒上的ID，从而从收集样品到疗法返回患者之后保持可追溯性)。这减少或消除了通常与传统系统中的物流故障有关的与信息转手相关的风险。
患者和样品处理的位置的紧密接近的进一步优点可总结如下：
-减少运输到生产地点期间患者材料的繁重物流，包括温度管理；
-降低将患者材料运输到制造地点的成本。患者材料的运输可以在患者材料收集标准操作程序(SOP)中实施。这意味着消除了安排运输的第三方的成本。这也避免了额外的潜在错误/错误标记源。
由本发明的系统解决的另一个问题是减少或避免由于手动过程中的操作者错误而导致的患者材料的无意破坏或丢失。设备内的制造过程是自动化的，无需操作者干预和复杂、灵巧的手动操作。在整个过程自动化过程中，操作者交互减少到最少，从而减少了操作者错误的情况。
同样，系统过程的优化可以通过由自动化系统执行的原位实时测量(例如细胞计数)和测试(例如效力)来实现。这种分析的结果可以直接输入该样品的未决制造决策(即为扩增留出更长的时间)。这有利于在整个过程自动化过程中将操作者交互减少到最小，从而减少操作者错误的情况。
本发明通过在FC内提供“功能上封闭的”经杀菌或无菌处理环境来解决由于传统实验室条件下的开放处理引起的污染导致的患者材料的损失，可以由自动化系统进行完整性测试。这样，基本上消除了污染风险。
此外，自动化质量控制和产品分析的集成解决了使用基于实验室的分析的高成本和手动处理样品导致操作者错误的可能性的缺点。
由于需要专业操作者执行复杂的手动任务的成本(包括工资成本，培训成本和验证资源培训成本)，也通过优化的自动化系统来解决，该系统负责过程的复杂任务。这种自动化方法无需熟练的操作者及其相关的培训成本。理想情况下，CPS旨在实现最大的用户友好性，并且用户界面显示上显示的消息不需要专门的操作者来理解。通过向设备的制造商或供应商发送潜在的错误消息，可以进一步减少对设备位置处的专业操作者的需求，使得制造商或供应商可以提供帮助(而不是例如医院雇用技术专家)。
最后，本发明的系统在提供患者样品的独立并行处理的灵活性方面提供了显着的优点。可以根据需要独立地准备每个CPM并将其加载到CPS中。这可以在不考虑系统的操作状态或先前已经在相同机器中的相邻CPM中开始处理的任何样品的情况下完成。系统将根据需要为每个CPM分配资源。由于设想大多数(如果不是全部)细胞处理将在每个CPM内的各个FC内进行，则由于等待共用资源而导致的延迟风险降低，并且机器运行时效率保持在高水平。这在细胞处理的吞吐量不规则的环境中具有显着的益处，例如，在基于患者需要的时间去除患者样品的临床环境中，并且需要高效，快速的细胞处理周转来优化患者护理。样品的高效处理、最小的空间要求和上面概述的其他成本优势在降低疗法产品成本方面具有整体优势。
实施例
实施例1：根据本发明的细胞处理系统
如图1中最佳所示，本发明的细胞处理设备100的实施方案包括细胞处理站101，一个或多个细胞处理模块102与细胞处理站101集成。在图2a中，示出了细胞处理设备100的一个实施方案，其中细胞处理模块102安装在手推车上，使得它可以在制造设施周围旋转以收集该过程所需的试剂和其他物品，或者从患者收集样品。在该实施方案中，流体盒103估计重15千克，试剂包重量估计为40千克。
将细胞处理模块安装在手推车上提供了用于收集和装载一次性部件所需的手动处理的解决方案，所述一次性部件太大或太重而不能用手安全地或舒适地携带。手推车被设计成准确地并且特别地与细胞处理模块102的各种部件接口，允许它们在被装载到细胞处理站101之前被预先连接在一起。这样，操作者可以从各自的存储设施收集过程所需的各种组件，同时将它们装载到同时将它们连接在一起的手推车上。一旦所有部件被装载到手推车上，操作者就会将手推车引导到手推车对接座中，其中细胞处理站将与手推车和细胞处理模块接口。
手推车具有由安装有将细胞处理模块102保持在精确位置的定位特征的金属结构制成的刚性构造，使得当所述手推车与细胞处理站101对接，细胞处理模块102与细胞处理站界面的对准是正确的。最初通过使用保险杠(未示出)的近似引导来实现将手推车与细胞处理站101对接。一旦手推车接合，就会有与细胞处理模块102接合的线性引导件(未示出)；这些引导件最终负责细胞处理模块102与细胞处理站101的精确对准。通过将一次性物质支撑在铰接平衡件上使得细胞处理模块102被提升或降低以实现最终对准，使得这种对准成为可能，在对接期间不对操作者施加阻力。在对接手推车之前，铰接和质量平衡是无效的，以确保以安全的方式运输细胞处理模块102。一旦手推车的前部与细胞处理站101接合，就释放质量平衡锁，并且细胞处理模块102最终可以通过对准轨道定位。
示出了细胞处理站101具有集中用户界面105。
细胞处理模块102包括流体盒103和试剂包104。典型的细胞处理模块在图3中以组装形式示出。试剂包104位于流体盒103的顶部。当安装试剂时，在试剂包104与流体盒103之间建立无菌流体连接。
图4以分解形式示出了细胞处理模块102。散装试剂储存在多个箱子202内的袋子200中，它们一起形成试剂包104。箱子202用作外壳并且装有空的或预先装满的袋子，然后箱子通过一些机械手段封闭，作为制造过程的部分，其中系统应用的操作者不能在不使用异常力或工具的情况下轻易打开箱子。箱子202还提供定位和支撑袋子200的流体入口和/或出口的连接点的装置。箱子202的另一个功能是提供定位装置，这可以用于RP到FC的连接过程或只是允许RP堆叠以进行大容量储存和传输。箱子的结构可以是折叠的塑料结构或完全模制有辅助或铰接盖子。箱子不能提供气密密封，因为这样会防止流体从袋子中抽出。试剂包104被分成单独的单元，容纳试剂的储存，并且促进了人工处理的容易性。
中空纤维过滤器204被包裹在流体回路层206中。流体回路层206包括两个模制形式208,208′，其在底部用硅膜210和聚碳酸酯(PC)覆盖膜212密封。输出(低温)袋213是流体回路层206的部分并且在过程结束时被移除。QC和IPC样品214在处理期间储存，并且如果需要离线测试则可从外部访问。
包括三个基于硅膜的血管的膨胀室216被示出，与转导容器218、活化容器220以及包含搅拌叶轮224和多个虹吸管226的混合容器222一起示出。虹吸管226用于添加和移除材料并且还冲洗腔室以获得更好的细胞回收。
下桶228形成用于流体盒103的外壳。
图5显示了流体盒103的培养容器布局，其包括膨胀室216、转导容器218和活化容器220。活化容器220和转导容器218的构造使用具有顶部和底部结合的FEP膜的框架。容器220,218被堆叠以实现取决于工艺的所需面积，并且如果需要增加或减少则提供设计灵活性。膨胀室216的结构使用顶部和底部粘合的硅膜。该设计允许气体G在水平之间通过，从而允许跨膜的良好交换。
实施例2：根据本发明的装置中的处理工作流程的详细描述
在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种根据图7和8中所示的工艺流程操作的细胞处理设备100。
获得包含从人或动物受试者获得的细胞材料的样品20。可以通过本领域已知的单采血液成分术技术获得样品。将样品20引入工作流程10，其包括一系列处理步骤，能够选择和分离包含在样品20内的特定细胞类型，以及该材料的适当处理以产生所需的输出细胞产物90。
在一个实施方案中，将单采血液成分细胞样品材料20引入工作流程10。该材料通过选择步骤30进行，其中细胞材料被分级或以其他方式处理，以鉴定所需的细胞亚型-例如T细胞。分离的细胞材料亚型进展到任选的活化步骤40，其中如果适合于该细胞类型，可以活化所需的细胞亚型。对细胞材料进行转导步骤50，其中可以发生暴露于一种或多种生长因子和/或用一种或多种重组载体转染细胞材料。所得的细胞材料进行到扩增步骤60，允许细胞传代并促进所需处理后的细胞材料的扩增。在达到所需扩增的预定阈值基准时，将细胞转移至配制步骤70，在那里对它们进行处理以提供最终的细胞产物90。配制70可包括细胞材料的浓缩，与保存溶液的组合以及在需要时的低温保存。在整个过程10中，通过分析步骤80进行质量控制和过程参数监测，分析步骤80与每个上述过程步骤集成并且能够对每个过程步骤进行反馈控制。
在本发明的一个实施方案中，过程10在细胞处理设备100内进行。设备100包括细胞处理模块101，其包括包含并结合多种试剂的试剂包104，以及结合液体处理和液体装置的流体盒103，处理装置一起有助于形成适合于过程10的执行的系统。因此，细胞处理模块101一旦组装，就定义了一个对外部环境是封闭的便携式系统，节省了输入和输出端口，这使得细胞处理能够以最小的污染风险进行，并且在整个程序中具有高水平的细胞材料特性的完整性。
在细胞处理模块101内，来自受试者(适当地是患者)的细胞材料经由输入容器125被引入到流体盒103。通常，输入容器125被配置为容纳单采血液成分术的产物并且将包括包含合适的生物相容性聚合物材料的袋子或小袋。输入容器125的体积可以变化，但可能在至少50ml至至多3000ml的范围内，尽管对于大多数单采血液成分术，体积通常在100ml至300ml之间，然后容器125将相应地适应液体或凝胶状态的单采血液成分细胞材料的该体积范围。输入容器125通过使用无菌管焊接器制成的流体连接件与流体盒103接合，其中来自容器125的管可以连结到从流体盒103突出的输入管。可以使用机械无菌流体连接器来形成替代的连接手段，容器125可以从第三方管组接收，因此在连接到流体盒103之前需要装配配合连接器。通过致动阀门126将细胞材料引入到流体盒103中，阀门126又引导细胞材料流入位于流体盒103内的配量室127。在整个系统中，可以通过施加外部压力、机械泵(包括静脉泵)或适当的毛细管流动来驱动流体流动。
在试剂包104内，多个试剂容器110提供进行过程10所需的一系列试剂。试剂容器110适当地包括用于细胞培养、活化和扩增的各个阶段的适当生长培养基；溶解剂(例如氯化铵)；生长因子；营养成分；转染试剂，包括病毒载体；以及保存解决方案。试剂容器110保持与位于流体盒103内的处理室140流体连通。试剂可以通过单独致动的供应管线111从试剂容器110中的任何一个引入处理室140。适合于相应的试剂，供应管线111可以进一步包括居间混合室112和配量容器113。这样，在试剂容器110内保持浓缩、冻干或另一种储存形式的试剂可以在引入处理室140之前适当地重构成标准的预定浓度或组合成可接受的剂量配方。任选地，处理室140物理地包含在平面台或区域内。平面台可以包括各种辅助细胞处理系统，这些辅助细胞处理系统彼此流体连通，并且重要的是与处理腔室140流体连通。
处理室140限定足够的体积，以进行包含细胞材料和试剂的溶液的充分混合。此外，处理室140包括混合装置，该混合装置可包括磁性叶轮或其他旋转机械混合器。
包含在配量室127内的细胞材料可以被引入处理室140，在那里它被保持用于过程10的初始选择步骤30。为了裂解细胞材料中包含的不需要的红细胞(源自单采血液成分术程序)，将氯化铵从试剂容器110引入处理室140中，以达到约0.8％的浓度。在混合和温育之后，将处理过的多孔材料从处理室140泵送到位于流体盒103内的一系列切向流过滤回路170中的第一个。适当地，切向流过滤回路包括允许从不需要的过量溶液体积、试剂和裂解的细胞材料分离细胞滞留物到废物容器197的中空纤维过滤器。在过程10中的任何时刻，收集在废物容器197内的流出废物可以排空到密封的废物储存室198中。包含在滞留物流内的细胞材料返回到处理室140，在处理室140中从试剂容器110引入限定体积的培养基。包含在处理室140内的保留物-培养基混合物可以通过过滤回路170再循环一次或多次，随后用额外的培养基清洗，以确保从选择步骤30中去除不需要的试剂或废料。选择步骤30的产物返回到处理室140。
在过程10中的任何时刻，但通常在定义的过程步骤的结束或开始，可以通过维护处理室140和分析模块190之间的流体连通的分析供应管线191吸移处理后的细胞材料的受控体积或等分试样并将其转移到分析模块190。受控体积的处理过的细胞材料沿着供应管线191进入分析模块190，在那里它可以保持在配量容器192内。在过程中，细胞计数可以由细胞计数器193对包括在配量容器192内的容积进行。细胞计数器193与包含在设备100内的CPU(未示出)进行电子通信。分析步骤80的结果作为整体通知过程10内的决策。因此，过程细胞计数的结果确定是否将额外的培养基从试剂容器110引入处理室140以控制细胞浓度。可替代地，如果在过程10中的该阶段或任何阶段存在故障，则可以暂停该过程或者可以警告设备100的操作者。
图9中提供了根据本发明实施方案的用于生产T细胞的自动化过程中的质量控制和分析的过程流程的非限制性实施例。
为了开始活化步骤40，细胞培养基可以与试剂混合室112中的试剂容器110内包含的冻干细胞因子组合。受控剂量的重构细胞因子溶液通过供应管线111转移到处理室140，在那里是将其与选择步骤30的细胞产物组合并混合，以产生活化细胞配制物。一系列受控剂量的活化细胞配制物通过供应管线141顺序转移到多个活化表面151。活化表面由软或刚性容器制成，其包括促进细胞粘附和气体渗透的水平表面。活化表面151是一个或多个单独的隔室，其可以由流体回路单独填充和清空。活化表面151包括在流体盒103内的分立隔室150内，该分立隔室150与包括处理室140的平面处理区分开。活化表面151的分离允许在完成活化步骤40可能需要的延长的时间段内独立地调节环境条件，即温育。可以将任何过量的活化细胞配制物排放到废物容器197中并如前所述丢弃。在从处理室140中排出活化细胞配制物后，用另外的培养基吹扫试剂容器110的腔室，所得的流出物也被送到废物容器197。
在完成活化步骤40后，通过将活化的细胞产物从每个活化表面151通过供应管线141转移回处理室140来收获活化的细胞。组合的活化细胞产物在处理室140内混合以确保同质性。然后将活化的细胞产物从处理室140泵送到第二切向流过滤回路170′，从而促进细胞滞物的浓缩并将不需要的用过的培养基除去到废物容器197。浓缩的活化细胞产物返回到处理室140中。如前所述，吸出受控体积的浓缩活化细胞产物并在分析模块190内进行过程中细胞计数。过程中细胞计数的结果确定是否将额外的培养基从试剂容器110引入处理室140以控制细胞浓度。
当受控剂量的病毒载体经由供应管线111从试剂包104中的试剂容器110转移到处理室140时，发生转导步骤50的开始，在处理室140中它与活化步骤40的细胞产物组合并混合以产生转导细胞配制物。一系列受控剂量的转导细胞配制物通过供应管线141顺序转移到多个转导表面152。转导表面152由软或刚性容器制成，其包括提供气体渗透的水平表面。转导发生在下表面上，其中不需要针对细胞粘附优化的表面，但本发明的描述也不排除这点。转导表面152是一个或多个单独的可堆叠隔室，其可以由流体回路单独填充和排空。转导表面152还包括在流体盒103内的隔室150中，该隔室150与平面处理区分开。可以将任何过量的转导细胞配制物排出到废物容器197中并如前所述丢弃。在从处理室140中排出转导细胞配制物后，用试剂容器110的另外的培养基吹扫室，所得的流出物也被送到废物容器197。
完成转导步骤50后，通过将来自每个转导表面152的转导细胞产物通过供应管线141转移回处理室140来收获转导的细胞。组合的转导细胞产物在处理室140内混合以确保同质性。然后将转导的细胞产物从处理室140泵送到第三切向流过滤回路170”，从而促进细胞直流物的浓缩并将不需要的用过的培养基除去到废物容器197。浓缩的转导细胞产物返回到处理室140。如上所述，吸出受控体积的浓缩转导细胞产物并在分析模块190内进行过程中细胞计数。过程中细胞计数的结果确定是否将额外的培养基从试剂容器110引入处理室140，以便控制浓缩的转导细胞产物中的细胞浓度。
当细胞培养基与冻干的生长因子和试剂混合室112中的试剂容器110内包含的合适的信号传导/增殖促进分子组合以产生扩增细胞培养基时，发生扩增步骤60的开始。受控剂量的扩增细胞培养基通过供应管线111转移到处理室140，在那里它与转导步骤50的细胞产物组合并混合以产生细胞扩增配制物。一系列受控剂量的细胞扩增配制物通过供应管线141顺序转移到多个扩增表面153。扩增表面153也包含在与平面处理区分开的流体盒103内的分立隔室150内。过量的扩增细胞配制物可以排放到废物容器197中并如前所述丢弃。在从处理室140排出扩增细胞配制物之后，可以用试剂容器110的附加培养基吹扫室，所得的流出物也被引导到废物容器197。
在完成扩增步骤60时，通过将细胞产物从每个扩增表面153通过配制物供应管线142转移到配制物室195来收获扩增的细胞。将组合的细胞产物在配制物室195内混合以确保均匀性。然后将活化的细胞产物从处理室140泵送到切向流过滤回路171，从而促进细胞产物配制物在直流物中的浓缩，并将不需要的用过的培养基除去到废物容器197。浓缩的细胞产物配制物被返回配制物室195。如前所述，抽吸受控体积的浓缩细胞产物配制物并在分析模块190内进行过程中细胞计数。过程中细胞计数的结果确定质量控制和调整到细胞产物90的最终制剂以储存或施用于受试者所需的参数。将适当的配制物溶液和试剂(例如但不限于人血清白蛋白，CryoStorTM溶液和抗体)从试剂容器110引入配制室195，以产生最终所需的细胞产物90。细胞产物90从配制物室195经由产物输出管线143到达一个或多个无菌细胞产物输出容器196。
在本发明的一个实施方案中，方法10可以包括在扩增步骤60之后定期收获细胞的步骤。例如，根据细胞培养过程的性质，可能需要在不同时间监测细胞扩增或收获。在这种情况下，可以从一个或多个扩增表面153分批次地而不是同时地周期性地收获细胞。
在本发明的另一个实施方案中，方法10可以包括在扩增步骤60之后定期收获细胞的步骤，但是其中细胞从一个或多个扩增表面153返回到细胞处理室140，以便可以发生分析80和扩增60的另外的过程步骤。例如，取决于培养下的细胞类型，如果在扩增步骤60期间细胞生长比预期慢，则可能需要更换或补充用过的扩增培养基。因此，通常盒101包括与处理室140流体连通的附加过滤回路170，以允许重复过滤和浓缩步骤结合到过程10中。操作者或自动化方式可能需要这些附加步骤来响应于在任何一个分析步骤80期间收集的数据。因此，不是在设备100内创建不必要的冗余，包括额外的处理，试剂和分析容量可以促进设备100的灵活性，使得它可以处理不同质量和数量的多样的起始材料。
实施例3：用于生产用于细胞疗法的CAR-T细胞的自动和手动过程的比较
概观
为了评估自动化细胞处理的可能性，在Celyad上构建并测试了根据本说明书的细胞处理设备的原型。该设备经过优化和编程，用于生产CAR-T细胞。为了评估细胞处理设备的性能，并行运行手动过程，并比较所产生细胞的不同标准。如下面将详述的，自动化制造过程成功地测试了CAR-T细胞的产生，达到了与手动过程相似的质量参数，包括嵌合抗原的表达和效力。自动化过程似乎导致更高的细胞回收(第0天-第2天)和更高的细胞扩增(第2天-第8天)。设想的进一步改进是细胞洗涤和浓缩步骤的优化，以确保切向流处理后更高的细胞回收率。
引入
常见的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)制造过程包括以下步骤：
-富集单核细胞
-T细胞活化
-T细胞转导
-T细胞扩增
-T细胞制剂
通常，这些步骤使用特定试剂或容器进行。临床方案的实施例(例如用于NKR-2(THINK)试验治疗性免疫疗法)使用Ficoll富集单核细胞，使用烧瓶用于T细胞活化步骤，袋子用于T细胞转导步骤，气体渗透性快速细胞扩增设备(GREXTM，SaintPaul，Minnesota)用于T细胞扩增，T细胞配制通过使用常规离心机的缓冲液交换完成。
为了使这种制造过程自动化，细胞处理设备原型依赖于类似的单次使用的一次性物品。
过程概述
即时细胞处理设备原型(CDP)是一种自动化流体处理系统，具有用于操作控制的触摸屏界面。CDP由蠕动泵、阀门和用于处理袋的袋式混合器组成。它还包括压力和流体传感器。流体运动由CPS中的计算机控制系统管理，其使泵和阀门同步以实现指定的任务。为了便于参考，细胞处理站(CPS)包括计算机控制系统和触摸屏接口，而细胞处理模块(CPM)包括泵、阀门和袋式混合器。处理袋是流体盒的一部分。只有一个CPM用于此对比测试。CPM中还包括试剂包，其包括用于不同工艺步骤的一次性物品。在这里，开发了四个不同的一次性使用的一次性套件以执行所有所需的制造步骤：一个用于单核细胞富集和T细胞活化，一个用于T细胞转导，一个用于T细胞扩增，一个用于T细胞配制。
每个一次性套件包括入口/出口管线，允许以下部件的连接：
-包含试剂和/或细胞的袋子(试剂包的部分)
-细胞培养容器(袋子或GREXTM)(流体盒的部分)
所有连接均使用无菌焊接技术进行，从而保持系统的功能封闭性。
所有缓冲液交换过程(细胞洗涤，细胞浓缩和试剂交换)依赖于使用中空纤维过滤器的切向流过滤程序进行。总体积交换固定为过程期间细胞体积的3倍，并且在收获期间最终洗涤时固定为6次。
在每个制造步骤中，细胞(在过程开始时作为单采血液成分产物或在过程中作为过程中培养细胞提供)自动从细胞收容器(入口)转移到细胞处理袋。对于培养的细胞，从细胞收容器到细胞处理袋的连接包括一系列90°管弯头和连续的管直径变化。这种特殊的设计有助于在细胞处理袋之前破坏细胞团块(细胞通过这种细胞管的流动达到与温和的上下移液相同的效果，以破坏细胞团块，但无需人为干预)，获得由单细胞组成的样品。
细胞处理袋具有三个采样灯泡，可以收集细胞进行计数、活力和其他特性测试，而不会影响系统的功能封闭性。袋式混合器可确保处理袋中的细胞浓度均匀化。处理袋连接到秤，该秤允许在处理期间进行容量监控。为便于参考，采样灯泡和标尺是用于原位测量和测试的系统的实施例。
基于细胞计数，下游收容器的数量和大小(CPS的输入)，设备可以在正确的浓度下以适当的缓冲液自动配制细胞并进行适当的细胞接种。对于原型，除了处理袋之外，CPM中使用的流体盒包括几个不同性质的容器，其允许在必要的时间内培养细胞。下表列出了每个步骤使用的容器。这些容器与适当的一次性套件无菌连接。
表3.1通过细胞处理设备原型在每个步骤中使用的流体盒容器
将接种的培养容器保持在37℃和5％CO 2下。
实验方案和结果
起始原料和活化(第0天-第2天)
将从健康供体收集的白细胞分离术产物在室温下储存并在收集后48小时内处理。制造过程开始于通过用NH4Cl(RBC裂解缓冲液)处理白细胞分离产物来产生用于活化的细胞，如下：
第0天
第1组-CDP
-将40mL白细胞分离产物转移到细胞处理袋中；
-将选定体积的白细胞分离物在3体积的NH4Cl(红细胞裂解缓冲液)中混合；
-在室温下9分钟后，通过在室温下加入320mL HBSS终止裂解反应。使用中空纤维过滤器(HFF)以基于切向流的策略进行缓冲液交换，将细胞重新悬浮在X-VivoTM中用于计数；
-然后将细胞配制在活化缓冲液中，并以1M细胞/ml接种于4个AC197 VueLifeTM袋(Saint)中，总共197mL/袋。
第2组-手动
-将35ml白细胞分离产物转移到细胞处理袋中；
-将选定体积的白细胞分离物在3体积的NH4Cl(红细胞裂解缓冲液)中混合；
-在室温下5分钟后，通过在室温下加入8倍体积的HBSS终止裂解步骤；
-以200g离心作用10分钟(此步骤有助于去除血小板)；
-除去上清液，将细胞重悬于X-VivoTM中进行细胞计数；
-然后将细胞配制在活化缓冲液中并以1M细胞/ml接种于6个T175烧瓶中，总共92ml/瓶
活化缓冲液包含40 ng/ml可溶性抗人CD3 mAb(OKT3克隆)和100U/ml IL-2，在X-VivoTM-15培养基中补充5％人AB血清加2 mM L-谷氨酰胺(完整X-VivoTM-15培养基)。活化步骤持续两天。
表3.2总结了用NH4Cl进行细胞处理。第1组(CDP)中NH4Cl后的细胞回收比手动过程高10％(77％对68％)。
表3.3总结了在活化/容器类型(和使用的容器数)下接种的总细胞，在活化过程结束时收获的细胞和活化步骤后的细胞回收。CDP的回收率高出13％(57％对44％)
表3.2在不同组中用NH4Cl进行细胞操作的总结
表3.3不同组中细胞活化的总结。
转导(第2天-第4天)
第2天
对于转导，用两个组中的PL240袋中的逆转录病毒载体转导活化的细胞。作为逆转录病毒构建体，使用针对B7-H6的CAR-T(描述于WO2013169691中)。
在第2天从CDP中活化的细胞开始产生第二手动对照组：这是为了评估CDP驱动的活化的影响。我们将其称为第3组。
方案如下所述：
使用预涂袋进行转导。
通过在PBS中以8μg/ml的浓度用过夜包衣来制备预涂袋。在室温下用PBS+HSA 1％进行至少30分钟的封闭步骤后的第二天。
上述所有步骤均手动完成。在除去封闭溶液后，与CDP一起使用的袋子是无菌连接的。
用于转导的容器是细胞培养袋，OrigenTM的PL30或PL240，以及PL30/29ml和PL240/142ml的接种。接种浓度对于手动过程为1M/ml，对于CDP驱动过程为0.7M/ml。
简述：
第1组-CDP
-活化袋(AC 197)无菌连接到转导套件；
-将细胞转移到处理袋中；
-细胞计数后，将细胞配制在转导培养基中，使用HFF以基于切向流的策略进行缓冲液交换；
-然后将细胞配制在转导缓冲液中，并以0.7M细胞/ml接种于2个PL240袋中，总共142ml/袋。
第2组-手动
-从T175收获活化细胞；
-旋转后，将细胞重悬浮于X-VivoTM中，计数并配制在完全转导缓冲液中，终浓度为1×106个细胞/ml；
-将细胞以1M/ml接种于1个PL240袋中；
第3组-手动，从CDP活化细胞开始
为了进一步评估和验证基于CDP的活化，从第1组转导的剩余细胞收集细胞并手动配制(用离心机)以1M/ml的浓度接种在PL30袋中。
转导缓冲液：将细胞重悬浮于补充有5％人AB血清，2mM L-谷氨酰胺的X-VivoTM-15培养基中，并通过与逆转录病毒上清液(载体)共培养转导，使嵌合抗原B7H6和截短的CD19(tCD19)表达。载体代表最终体积的50％。tCD19用于监测转导效率。使用的载体是由Celyad的研发团队制造的mTZ47.2.1(内部名称)，物理颗粒滴度为1.9.1010。
培养基中的另外的试剂是-终浓度-100U/ml的IL-2，40ng/ml的抗CD3。
表3.4总结了每个组第4天的用于转导的容器类型，使用的载体和滴度，细胞收获和活力以及扩增倍数。
在第4天，用CDP操纵的细胞的倍数扩增最高：第1组的2.6对第2组的1.5或第3组的1.8
表3.4转导步骤的总结
扩增(第4天-第8天)
在第4天，在所有组中，通过在透气性细胞培养设备中培养转导细胞来开始扩增转导细胞。
第1组
将转导后的PL240袋无菌连接至试剂袋用于扩增，配制在IL-2和X-VivoTM中。使用HFF以基于切向流的策略进行缓冲液交换和体积浓缩。
在该过程结束时，通过设备在补充有100U/ml IL-2的600ml完全X-VivoTM-15培养基中自动接种G-REXTM 100M-CS(先前通过无菌连接器连接至流体盒)。
G-REXTM 100M-CS是G-REXTM容器，相当于GREXTM 100M。首字母缩略词CS代表封闭系统，它意味着存在尾纤，其允许流体交换，同时保持容器的封闭性质。
第2组和第3组
转导后，用HBSS洗涤T细胞一次，然后接种用于扩增步骤。
将转导的细胞以G-REXTM表面的1×106个细胞/cm2接种，然后进入：
-第2组-G-REX 100M-CS，600ml完全X-VivoTM-15培养基，补充100U/ml的IL-2
-第3组-G-REXTM 10M，60ml完全X-VivoTM-15培养基，补充100U/ml的IL-2
大约48小时后，将另外50％的新鲜的完全X-VivoTM-15加100U/ml的IL-2加入到每个G-REXTM烧瓶中。再培养两天后，在第8天收获细胞。
第1组
-在冷却的HBSS中洗涤细胞，并使用中空纤维通过切向流策略浓缩；
-计数后，通过设备以2,7M/ml将细胞配制在冷冻的HBSS中，然后在收集袋中收获300M细胞；
-在程序结束时取得用于质量评估的样品。
注意，为了能够以相同的方式比较产物，操作者通过离心分离并在限定的低温保存缓冲液中配制，从收集袋产生低温保存的细胞样品。因此，在原型中，收获只是半自动的，而所有其他步骤都由设备管理。这是由于原型设计，而不是由于设备的固有限制，并且细胞的重新悬浮/收获可以完全自动化。
第2组和第3组
使用实验室离心机将细胞用冷却的HBSS洗涤一次。计数细胞后，将它们配制，在程序结束时收集样品。
表3.5总结了G-REXTM 10M/G-REXTM 100M/G-REXTM 100M-CS中收获时的细胞产量和活力。第1组和第2组的扩增倍数为27倍，第3组的扩增倍数为21倍。
| 组 | 接种的细胞 | GREX的类型和数量 | 收获的细胞(M) | 活力(％) | 扩增倍数 |
| 第1组 | 1.00E+08 | GREX<sup>TM</sup>100M-CS | 2.71E+09 | 96％ | 27 |
| 第2组 | 1.00E+08 | GREX<sup>TM</sup>100M-CS | 2.71E+09 | 97％ | 27 |
| 第3组 | 1.00E+07 | GREX<sup>TM</sup> 10M | 2.09E+08 | 97％ | 21 |
表3.5在GREXTM 10M或GRETM 100M中收获时的细胞产量和活力
可比性测试结果
在该过程期间和之后，采集样品以评估程序的可比性。可比性评估基于：
-工艺参数
·每个步骤的细胞计数和活力(回收或扩增评估)
·第2天-通过流动活化细胞
·第4天–载体拷贝数
·第4天-嵌合抗原受体的表达水平
-最终产物特性
·细胞计数和活力
·嵌合抗原受体的表达水平
·VCN
·与癌细胞系一起培养时的干扰素-γ分泌和杀伤试验
·T细胞成熟特征
·T细胞耗竭
注意：CDP上的细胞计数和活力始终在洗涤和浓缩步骤之前进行，而对于手动步骤，我们总是旋转并重悬细胞一次
测试：细胞活化(第2天)
方法：CD69和CD25标记物的流量监测
结果：
结论：CD69是早期活化的标记物，而CD25在24h后升高。结果表明所有的组都被正确活化并具有可比性，如CD69+细胞的缺乏和活化组与CD25标记物对照的约50％(44％-52％)的变化所指示的。
测试：转导(第4天)
方法：流量监测tCD19和qPCR评估平均载体拷贝数(VCN)/细胞
结果：
| 组 | VCN | SD | 抗原表达 |
| 第1组 | 1.92 | 0.04 | 40％ |
| 第2组 | 1.92 | 0.06 | 50％ |
| 第3组 | 1.93 | 0.05 | 40％ |
结论：三组的细胞都成功转导，VCN在三组试验中均相同。我们还能够在转导阶段结束时检测到tCD19的表达。在完全手动条件下，第4天检测到阳性tCD19细胞多10％(50％对40％)
测试：制造过程结束时的转导(第8天)
方法：通过tCD19上的流程验证并通过qPCR评估载体拷贝数(VCN)/细胞
结果：
| 组 | VCN | SD | 抗原表达 |
| 第1组 | 2.43 | 0.07 | 51％ |
| 第2组 | 2.50 | 0.14 | 57％ |
| 第3组 | 2.80 | 0.44 | 53％ |
结论：三组的细胞成功转导，确认三组VCN等效。tCD19表达可在所有3个组中检测到，范围是第1组的51％(CDP组)与第2组的57％(手动组)之间
测试：制造过程结束时的T细胞成熟谱
方法：流量监测CD45RA和CD62L
结果：
| 成熟 | 中枢记忆 | 原生 | 效应T细胞 | 效应记忆 |
| CD45RA-/CD62L+ | CD45RA+/CD62L+ | CD45RA+/CD62L- | CD45RA-/CD62L- | |
| 第1组 | 45.7％ | 7.69％ | 4.92％ | 41.7％ |
| 第2组 | 43.4％ | 5.46％ | 3.80％ | 47.3％ |
| 第3组 | 38.0％ | 6.49％ | 6.41％ | 49.1％ |
结论：在制造过程结束时，大多数细胞呈现中枢记忆或效应记忆表型，制造过程不会影响过程结束时的T细胞谱。
测试：在制造过程结束时T细胞耗尽
方法：流量监测PD1和Lag3
结果
| PD1-/LAG3+ | PD1+/LAG3+ | PD1+/LAG3- | PD1-/LAG3- | |
| 第1组 | 1.97％ | 0.94％ | 8.02％ | 89.1％ |
| 第2组 | 1.49％ | 1.04％ | 10.8％ | 86.7％ |
| 第3组 | 1.31％ | 1.22％ | 14.8％ | 82.7％ |
| 对照PBMCS | 1.07％ | 0.16％ | 1.63％ | 97.1％ |
| 对照PBMCS | 1.26％ | 0.27％ | 1.87％ | 96.6％ |
结论：在制造过程结束时，大多数细胞(≥80％)对于耗尽标记物PD1和LAG3都是阴性的，只有8-14％的细胞对PD1标记物呈阳性。有趣的是，自动化过程是PD1表达最低的过程。
对照组是在第0天通过CDP设备或通过手动过程产生的PBMC细胞，在RBC裂解步骤后立即低温保存PBMC细胞。
测试：在制造过程结束时T细胞效力
方法：靶细胞系(HeLa细胞)上的CAR-T细胞溶解活性(杀伤试验)和靶细胞上的IFN-γ分泌(K562)
结果：
LOD：检测限制；LOQ：量化限制
LOD：检测限制；LOQ：量化限制
结论：在暴露于相关的癌细胞系模型后，在三组条件下制造的CAR-T细胞被证明在杀伤试验和IFNγ分泌中有同等效力。结论是定性的，它们是基于与PBMC对照的比较。
对照组是在第0天通过CDP设备或通过手动过程产生的PBMC细胞，在RBC裂解步骤后立即低温保存PBMC细胞。
结论
CDP被证明是适合于维持制造嵌合抗原受体T细胞所需的所有制造步骤的设备。
细胞回收率为77％时，白细胞分离产物(而不是Ficoll程序)的RBC裂解被证实是获得PBMC样群的有效方法。活化后，回收率为57％。这些数据在其他CAR-T方案的制造验证数据范围内。
有趣的是，通过观察单核细胞的数量，使用CDP自动处理细胞导致比手动方法更高的回收率：RBCs裂解后回收率为77％对68％，活化后回收率为57％对44％。
第2天的活力为88％(自动组)和76％(手动组)。这些结果低于我们在以ficoll选择开始的过程中通常观察到的结果(通常约为90％)。由于红细胞溶解处理产生的产物不如使用ficoll过程获得的产物那么干净，我们怀疑观察到的细胞死亡率较高是由于非T细胞数量比通常用ficoll观察到的更多，这些细胞会在前两天内自然死亡。
观察第2天的活化谱，我们观察到在所有组中细胞都被正确活化。
这与早期的内部研究一致，表明AC袋可以以与T瓶类似的方式维持活化。在CDP评估中活化的背景下，我们最终在活化步骤期间使用不同的接种密度。在所有条件下使用1M/ml，而得到的接种密度/cm2不同：T烧瓶活化为0.5M细胞/cm2，AC袋为0.7M细胞/cm2。
基于活细胞计数，我们监测转导(第2天-第4天)和扩增(第4天-第8天)步骤期间的细胞扩增。
如下表3.6所示，在比较全自动过程(第1组)与完全手动过程(第2组)时，活力总是非常相似。
比较这两个组时，G-REXTM的扩增倍数是相同的。由于在第1组转导期间获得了更高的扩增倍数(2.6对1.5)，因此组合扩增有利于自动化过程(第1组)与完全手动(第2组)：分别为70.5对41.2。第2天至第8天的组合扩增也显示在图10a中，在图10b中显示收获时的活力。
在附加对照(第3组)中，该过程成功完成；然而，我们确实在转导期间观察到中间扩增，观察到与第1组相比的差异可能是由于较低的活力(86％对90％)。在扩增阶段，与其他两个组相比，第3组的细胞也表现出更少的群体倍增。差异可能是由于使用了不同类型的GREXTM：GREXTM10M与GREXTM 100M-CS。
表3.6不同组中CAR-T细胞的扩增率和活力的总结。
用于转导的载体是在所有3个组中在转导步骤期间使用的最终培养物体积的50％。在下一代一次性物品中，将重新考虑处理袋尺寸和HFF能力，允许使用高达90％转导体积的载体。
如上所述，细胞洗涤、浓缩、缓冲液交换和培养基配制的每个步骤通过使用中空纤维(HFF)通过切向流进行。该过程成功进行，在过程中缓冲液交换目标总量为3个体积，最终配方为6个体积。通过评估HFF前/后的细胞回收率(表3.7)，我们确定了另一个可能的改善领域，因为回收率介于39％和86％之间(见下表)。在过去，我们确实观察到细胞聚集会对细胞回收产生负面影响。设计与CDP一起使用的一次性套件，使得当含有细胞的流体从培养容器移动到处理袋时，所有细胞团块都被解聚，产生单细胞悬浮液。由于收集样品和进行手动计数所需的时间，细胞已经开始重新聚集，在处理时间内产生可见的团块。我们相信通过重新考虑一次性设计可以提高回收率，从而在HFF之前也可以分解细胞团块。
| 第0天 | 第2天 | 第4天 | 第8天 | |
| 制造步骤 | 活化 | 转导 | 扩增 | 收获 |
| 回收HFF:后/前 | N/A | 53％ | 86％ | 39％ |
表3.7在不同阶段CDP中的细胞回收率
在制造过程结束时，测试所有细胞的成熟谱、耗尽和效力。所有测试均证实所用的方法产生相同质量的细胞：细胞不会耗尽并且能够以类似的方式杀死细胞并产生干扰素-γ。大约90％的细胞似乎是中枢或效应记忆T细胞，大致均匀分开。
总之，自动化过程和手动过程都允许产生具有相似VCN/细胞(范围2.43-2.80)和抗原表达(范围51％-57％)的CAR-T。自动化过程似乎导致更高的细胞回收(第0天-第2天)和更高的细胞扩增(第2天-第8天)，在收获时具有相似的细胞活力。设想进一步优化细胞洗涤和浓缩步骤以确保切向流处理后更高的细胞回收率。
实施例4：用于生产用于细胞疗法的CAR-T细胞的独立同时自动化过程在同一设备上运行
在实施例3中，对细胞的自动和手动处理进行了比较。这证实了使用细胞处理设备原型的自动化处理产生了类似的细胞产物。仅使用原型的一个细胞处理模块进行比较。在该实施例中，将使用两个处理模块重复实施例3中描述的自动化过程。这些将在同一设备上运行，但启动时间不同(但不是按顺序进行：第二批处理将在第一批完成之前启动。这样，两批CAR-T细胞将以并发和独立的方式进行：并发，因为两者的处理将同时在同一设备上运行(或至少，与过程的时间显着重叠)，并且独立，因为无论第一批细胞的工艺如何，都能够启动第二批的处理。应该理解，虽然两批细胞的制造都将使用相同的计算机控制系统和触摸屏界面，但它们将依赖于单独的试剂包和流体盒(即，每批在其自己的细胞处理模块中制造)。
应当理解，尽管本文已经针对根据本发明的细胞和方法讨论了特定实施方案、具体构造以及材料和/或分子，但是可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下对形式和细节进行各种改变或修改。提供这些实施例是为了更好地说明具体实施方案，并且不应认为它们限制了本申请。本申请仅受权利要求的限制。
Claims (50)
1.适用于对多个细胞制剂进行独立并发处理的细胞处理设备，该细胞处理设备包括：
(I)细胞处理站；以及
(II)多个细胞处理模块，
其中，所述多个细胞处理模块与所述细胞处理站接合并通信；
其中所述多个细胞处理模块中的每一个包括在其内限定的离散处理隔室，所述处理隔室包括：
i.试剂包，所述试剂包包括一个或多个试剂容器；
ii.一个或多个流体盒，每个流体盒包括一个或多个细胞处理隔室和细胞培养隔室，
其中每个所述处理隔室彼此流体连通。
2.根据权利要求1所述的细胞处理设备，其中所述设备被配置成使得所述多个细胞制剂中的每一个在整个处理过程中在物理上和/或时间上分开。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的细胞处理设备，其中所述多个细胞处理模块中的每一个适于一次处理单细胞制剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞处理设备，其中所述细胞处理模块包括用于细胞处理的封闭的基本上无菌的环境。
5.根据权利要求4所述的细胞处理设备，其中所述封闭的基本上无菌的环境设置在所述试剂包和/或所述流体盒内。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞处理设备，其中，所述细胞处理模块的至少一部分是一次性使用的部件。
7.根据权利要求6所述的细胞处理设备，其中基本上所有的细胞处理模块都是一次性使用的部件。
8.根据权利要求7所述的细胞处理设备，其中所述细胞处理模块的所述一次性使用的部件选自包括以下的组：所述流体盒；所述试剂包；以及所述流体盒和所述试剂包两者。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的细胞处理设备，其中，所述细胞处理站包括可由所述多个细胞处理模块中的一个或多个细胞处理模块使用的集中设施。
10.根据权利要求9所述的细胞处理设备，其中所述集中设施选自包括以下的组：
i.平台底盘；
ii.用户界面显示；
iii.软件和操作系统许可；
iv.中央处理单元(CPU)；
v.主控制系统，包括嵌入式控制器和程序逻辑控制器(PLC)；
vi.电源和配电系统；
vii.控制细胞处理模块或其部件的温度所需的热管理设备；
viii.培养箱气体混合物供应设施；
ix.用于原位测量和/或测试的一个或多个系统；以及
x.离心驱动系统。
11.根据权利要求10所述的细胞处理设备，其中所述原位测量和/或测试选自包括以下的组：细胞计数；细胞鉴定；纯度；同质性；效力；表征；和质量控制手段。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的细胞处理设备，其中所述细胞处理模块适于在整个细胞处理中容纳所述细胞制剂。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的细胞处理设备，其中，所述多个细胞处理模块中的每一个包括适于与所述细胞处理系统上的集中设施连接的一个或多个连接器。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的细胞处理设备，其中所述试剂包中的所述一个或多个试剂容器适于容纳细胞处理所需的一种或多种非细胞流体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的细胞处理设备，其中所述试剂包包括一个或多个可移除的连接器，用于将所述试剂包连接到所述流体盒。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的细胞处理设备，其中每个流体盒配置成在整个细胞处理过程中容纳和操纵单细胞制剂。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的细胞处理设备，其中每个细胞处理模块包括单个流体盒。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的细胞处理设备，其中所述流体盒包括至少一个输入端口、分离室、活化室、转导室、细胞培养室和至少一个输出端口。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的细胞处理设备，其中所述流体盒还包括选自包括以下的组的元件：
i.过滤器、离心机和其他活性表面，用于将细胞制剂分离成不同的组分；
ii.用于培养细胞和引入活性试剂的反应容器、烧瓶和烧杯；
iii.廊道、通道和流体回路，用于引导流体围绕流体盒流动，流入和流出流体盒。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的细胞处理设备，其中所述流体盒还包括至少一个泵和至少一个阀门，用于至少部分地控制流体流动，其中流体流动选自包括以下的组：流动通过所述流体盒中的流体回路；流入所述流体盒；以及流出所述流体盒。
21.根据权利要求20所述的细胞处理设备，其中所述至少一个泵选自由正排量泵、隔膜、柱塞式泵、叶轮泵、蠕动泵组成的组；并且其中阀门选自包括隔膜阀、旋转阀及其组合的组。
22.适于为其中的细胞处理提供封闭的无菌环境的流体盒，其中所述流体盒包括至少一个输入端口、分离室、活化室、转导室、细胞培养室和至少一个输出端口。
23.根据权利要求22所述的流体盒，其中所述流体盒还包括选自包括以下的组的元件：
i.过滤器、离心机和其他活性表面，用于将细胞制剂分离成不同的组分；
ii.用于培养细胞和引入活性试剂的反应容器、烧瓶和烧杯；以及
iii.廊道、通道和流体回路，用于引导流体围绕流体盒流动，流入和流出流体盒。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的流体盒，其中，所述流体盒还包括至少一个泵和至少一个阀门，用于至少部分地控制流体流动，其中流体流动包括流体流过所述流体盒中的流体回路，流入流体盒，以及流出流体盒。
25.根据权利要求24所述的流体盒，其中所述至少一个泵选自包括以下的组：正排量泵、隔膜、柱塞式泵、叶轮泵、蠕动泵及其组合；其中所述阀门选自包括隔膜阀、旋转阀及其组合的组。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的流体盒，其中，所述流体盒是一次性使用的部件。
27.细胞处理单元，其中所述细胞处理单元包括一个或多个流体盒和试剂盒，其中所述流体盒包括至少一个输入端口、分离室、活化室、转导室、细胞培养室以及至少一个输出端口，并且其中所述试剂包包括一个或多个试剂容器，其中所述试剂包中的一个或多个试剂容器适于容纳细胞处理所需的一种或多种非细胞流体。
28.根据权利要求27所述的细胞处理单元，其中所述流体盒和所述试剂包是集成的单个实体。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的细胞处理单元，其中，所述细胞处理单元是一次性使用的部件。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的细胞处理单元，其中所述流体盒是权利要求22至26中任一项所述的流体盒。
31.适用于与细胞处理站集成的细胞处理模块，其中，所述细胞处理模块包括：
i.细胞处理单元，所述细胞处理单元包括流体盒和试剂包，其中所述流体盒包括至少一个输入端口、分离室、活化室、转导室、细胞培养室和至少一个输出端口，并且其中所述试剂包包括一个或多个试剂容器，其中所述试剂包中的一个或多个试剂容器适于容纳细胞处理所需的一种或多种非细胞流体；以及
ii.装置，用于保持和接合流体盒和试剂包，使得流体盒和试剂包的流体连接点耦合以提供流体盒与试剂包之间的流体连通。
32.根据权利要求31所述的细胞处理模块，其中，所述细胞处理模块还包括以下中的一个或多个：
-至少一个连接器，用于将所述细胞处理模块或其部件连接到所述细胞处理站；
-至少一个传感器；
-培养箱外壳，用于为所述细胞处理模块提供温控环境；
-加热垫和控制器，用于为所述细胞处理模块提供热能；
-容纳在所述细胞处理模块内的一个或多个机械致动器，用于致动所述流体盒内的元件；
-容纳在所述细胞处理模块内的一个或多个机械致动器，用于致动所述试剂盒内的元件；
-离心设施。
33.根据权利要求32所述的细胞处理模块，其中，当存在时，所述至少一个传感器选自由以下组成的组：热电偶/热敏电阻组成，用于测量温度；压力传感器，用于测量流体压力；流量计，用于测量流体流量；以及过程要求的生物传感器。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的细胞处理模块，其中，所述细胞处理单元是一次性使用的部件。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的细胞处理模块，其中所述流体盒是权利要求21至26中任一项所述的流体盒。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的细胞处理模块，其中，所述细胞处理单元是权利要求27至30中任一项所述的细胞处理单元。
37.用于执行至少两种细胞制剂的独立并发处理的方法，其中所述方法包括：
1)提供细胞制剂；
2)提供流体盒，其中所述流体盒包括一个或多个细胞处理隔室和细胞培养隔室；
3)将细胞制剂放入所述流体盒中；
4)组装包括所述流体盒和试剂包的细胞处理模块；
5)使所述细胞处理模块与细胞处理站上的可用接受点接合；
6)操作所述细胞处理站以进行所述细胞制剂的自动细胞处理，以提供处理过的细胞制剂；
7)利用另外的细胞制剂重复步骤1至6，以便在细胞处理站上独立和并发处理至少两种细胞制剂；
8)任选地重复步骤7，直到所述细胞处理站上的所有可用接受点都被细胞处理模块占用；
9)当完成该细胞制剂的自动细胞处理时，从所述细胞处理站移除所述细胞处理模块。
10)对所述细胞处理站上的每个细胞处理模块重复步骤9；
其中该方法的步骤(3)、(4)和(5)以步骤(2)与步骤(6)之间的任何顺序进行。
38.根据权利要求37所述的方法，其中每种细胞制剂的细胞处理在空间上和/或时间上与每个其它的细胞制剂分开。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述方法在封闭的无菌环境中进行。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述封闭的无菌环境在所述流体盒和所述试剂包中的一个或多个内。
41.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其中在从所述细胞处理站移除所述细胞处理模块之前，进一步处理所述细胞制剂。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述进一步处理选自包括冷冻用于冷冻保存和配制成包含处理过的细胞制剂的组合物的组。
43.根据权利要求37至42中任一项所述的方法，其中所述自动化细胞处理包括选自包括以下的组的一个或多个步骤：
a.选择细胞；
b.富集细胞；
c.步骤(a)的选定细胞和/或步骤(b)的富集细胞的活化；
d.细胞的遗传修饰以提供遗传修饰细胞；
e.扩增步骤(d)的遗传修饰细胞以提供扩增细胞；
f.洗涤步骤(e)的扩增细胞；
g.步骤(e)的扩增细胞的浓度；
h.配制步骤(e)的扩增细胞以提供细胞配制物，其中所述细胞配制物用于保存和/或直接注射。
44.根据权利要求37至43中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
45.根据权利要求44的方法，其中步骤(d)中的遗传修饰是用嵌合抗原受体(CAR)进行遗传修饰。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述CAR选自包括以下的组：NKG2D CAR和B7H6CAR。
47.根据权利要求37-46中任一项所述的方法，其中所述方法在根据权利要求1至21中任一项的细胞处理设备上执行。
48.根据权利要求37至47中任一项所述的方法，其中所述流体盒是根据权利要求22至26中任一项所述的流体盒。
49.根据权利要求37至48中任一项所述的方法，其中，所述细胞处理模块是根据权利要求31至36中任一项所述的细胞处理模块。
50.计算机设备，包括处理器和编码耦合到所述处理器的一个或多个非神经网络程序的存储器，其中所述程序使所述处理器执行根据权利要求37至49中任一项所述的方法。
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