JP2683946B2 - 細胞培養によるタンパク質産生方法 - Google Patents
細胞培養によるタンパク質産生方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 「発明の目的」 産業上の利用分野 本発明は遺伝子組換え技術あるいは細胞融合技術によ
って調製された、所望のタンパク質を持続的に産生する
形質転換細胞、またはハイブリドーマを培養し、当該タ
ンパク質を産生させる際に、培地に酪酸あるいはその
塩、及び産生を増大させる他の試剤を添加させることを
特徴とする有用タンパク質の産生方法に関する。さらに
詳細には、血液凝固第VIII因子産生形質転換細胞、ある
いはモノクローナル抗体産生細胞を培養して、所望の血
液凝固第VIII因子あるいはモノクローナル抗体を調製す
る際の産生増強方法に関する。
って調製された、所望のタンパク質を持続的に産生する
形質転換細胞、またはハイブリドーマを培養し、当該タ
ンパク質を産生させる際に、培地に酪酸あるいはその
塩、及び産生を増大させる他の試剤を添加させることを
特徴とする有用タンパク質の産生方法に関する。さらに
詳細には、血液凝固第VIII因子産生形質転換細胞、ある
いはモノクローナル抗体産生細胞を培養して、所望の血
液凝固第VIII因子あるいはモノクローナル抗体を調製す
る際の産生増強方法に関する。
従来の技術及び発明が解決しようとする問題点 遺伝子組換え技術、あるいは細胞融合技術に代表され
るバイオテクノロジーの発展は、従来、容易に得ること
のできなかった生体由来微量物質を工業的に且つ安全に
生産することを可能とした。例えば、ヒト成長ホルモン
（特開昭 58−174396）、あるいはインシュリン（特開
昭 58−107184）をコードする遺伝子を組み込んだベク
ターを適当な宿主に作用させ、形質転換して得られる当
該タンパク質産生細胞を培養して、これらのタンパク質
を調製する方法はその代表的な例である。
るバイオテクノロジーの発展は、従来、容易に得ること
のできなかった生体由来微量物質を工業的に且つ安全に
生産することを可能とした。例えば、ヒト成長ホルモン
（特開昭 58−174396）、あるいはインシュリン（特開
昭 58−107184）をコードする遺伝子を組み込んだベク
ターを適当な宿主に作用させ、形質転換して得られる当
該タンパク質産生細胞を培養して、これらのタンパク質
を調製する方法はその代表的な例である。
また、血友病患者の補充療法に用いられているヒト血
液凝固因子（W.I.Wood,et al.,Nature312 p.330〜337
（1984）、J.J.Toole,et al.,ibid.312 p.342〜347（19
84）、特開昭63−313587、特願昭63−8545）、あるいは
低タンパク血症等の治療に用いられるヒト血清アルブミ
ン（EP319067）等の血漿タンパクの工業的規模での生産
に関して、現在、遺伝子組換え技術を駆使した方法によ
る精力的な研究が展開されている。
液凝固因子（W.I.Wood,et al.,Nature312 p.330〜337
（1984）、J.J.Toole,et al.,ibid.312 p.342〜347（19
84）、特開昭63−313587、特願昭63−8545）、あるいは
低タンパク血症等の治療に用いられるヒト血清アルブミ
ン（EP319067）等の血漿タンパクの工業的規模での生産
に関して、現在、遺伝子組換え技術を駆使した方法によ
る精力的な研究が展開されている。
従来、これらの血漿タンパク質の生産は、ヒト血漿を
原材料として行なわれてきたため、原材料の量的確保に
制限があることや、原料血漿中に夾雑する可能性のある
肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等の病原性ウイル
スの伝播防止のための方策を、極めて慎重且つ充分に行
なうことが不可欠であった。従って、遺伝子組換え技術
による血漿タンパク質の生産は、上記の従来法に比較し
て経済性、生産性及び安全性に優れたものとして期待さ
れるものである。
原材料として行なわれてきたため、原材料の量的確保に
制限があることや、原料血漿中に夾雑する可能性のある
肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等の病原性ウイル
スの伝播防止のための方策を、極めて慎重且つ充分に行
なうことが不可欠であった。従って、遺伝子組換え技術
による血漿タンパク質の生産は、上記の従来法に比較し
て経済性、生産性及び安全性に優れたものとして期待さ
れるものである。
また、細胞融合技術によって調製されるハイブリドー
マを培養することによって、有用なモノクローナル抗体
を恒久的に得ることも可能になった。
マを培養することによって、有用なモノクローナル抗体
を恒久的に得ることも可能になった。
ところで、上述のように従来の技術を凌駕し、種々の
長所を有する当該バイオテクノロジーではあるが、これ
を工業的規模での生産に発展させるためには、なお克服
しなければならない問題がいくつか存在する。ひとつに
は、所望のタンパク質を効率的に得る際の培養産生効率
である。
長所を有する当該バイオテクノロジーではあるが、これ
を工業的規模での生産に発展させるためには、なお克服
しなければならない問題がいくつか存在する。ひとつに
は、所望のタンパク質を効率的に得る際の培養産生効率
である。
例えば、血友病Ａ患者の血液凝固障害に基づく出血に
対する補充療法に供されるヒト血液凝固第VIII因子の場
合、原料血漿中には約200ng/mlの濃度で存在するが、遺
伝子熊換え技術を用いて調製された当該血液凝固因子産
生細胞を、通常の方法で培養して所望のタンパク質を得
ようとする場合は、その培養上清中の標準的な産生量は
約20ng/ml程度であることが知られている（Pavirani,
A.,et al.,Biotechnology ５ p.389〜392（1987））。
遺伝子組換え技術を用いた場合のこの産生量の低さは、
主として当該タンパク質の分子量の大きさ（約300KD
a）、及びこれに関連する当該タンパク質の宿主細胞か
ら培養上清への分泌のされにくさに起因すると考えられ
る（Kaufman,R.J.,et al.,Mol.Cell Biol.９ p.1233〜1
242（1989））が、上述のように、通常の培養産生方法
では培養上清中の所望の当該血液凝固因子の産生効率は
極めて低い。
対する補充療法に供されるヒト血液凝固第VIII因子の場
合、原料血漿中には約200ng/mlの濃度で存在するが、遺
伝子熊換え技術を用いて調製された当該血液凝固因子産
生細胞を、通常の方法で培養して所望のタンパク質を得
ようとする場合は、その培養上清中の標準的な産生量は
約20ng/ml程度であることが知られている（Pavirani,
A.,et al.,Biotechnology ５ p.389〜392（1987））。
遺伝子組換え技術を用いた場合のこの産生量の低さは、
主として当該タンパク質の分子量の大きさ（約300KD
a）、及びこれに関連する当該タンパク質の宿主細胞か
ら培養上清への分泌のされにくさに起因すると考えられ
る（Kaufman,R.J.,et al.,Mol.Cell Biol.９ p.1233〜1
242（1989））が、上述のように、通常の培養産生方法
では培養上清中の所望の当該血液凝固因子の産生効率は
極めて低い。
また、ハイブリドーマを培養して、所望のモノクロー
ナル抗体を得る場合、例えばマウス型モノクローナル抗
体では、通常、培養上清中に10〜100μg/ml程度の濃度
で産生されるが、ハイブリドーマの種類によっては、極
めて微量の抗体しか得られない場合も存在する。とりわ
け、ヒトへの直接投与による、種子の感染症に対する治
療剤としての可能性が期待されるヒト型モノクローナル
抗体の場合、低い産生効率を示す場合が多い。
ナル抗体を得る場合、例えばマウス型モノクローナル抗
体では、通常、培養上清中に10〜100μg/ml程度の濃度
で産生されるが、ハイブリドーマの種類によっては、極
めて微量の抗体しか得られない場合も存在する。とりわ
け、ヒトへの直接投与による、種子の感染症に対する治
療剤としての可能性が期待されるヒト型モノクローナル
抗体の場合、低い産生効率を示す場合が多い。
従って、血液凝固因子や産生量の低いモノクローナル
抗体等の所望の有用タンパク質の産生において、当該技
術を工業的規模での産生に拡張するに際しては、設備面
および経済性の観点から改善の余地が多く残されてお
り、とりわけ産生効率の増強方法が強く望まれる。
抗体等の所望の有用タンパク質の産生において、当該技
術を工業的規模での産生に拡張するに際しては、設備面
および経済性の観点から改善の余地が多く残されてお
り、とりわけ産生効率の増強方法が強く望まれる。
そこで、この問題を克服するための方法が研究され、
最近、細胞培養系にある種の添加剤を加え、所望のタン
パク質の産生効率を増強させる方法がいくつか報告され
た。例えば、酪酸を最適実施態様とするアルカン酸また
はそ塩をタンパク質産生細胞の培養系に添加し、目的と
するタンパク質の産生効率を増強させる方法（特表昭63
−503273）、あるいはタンパク質産生細胞のビーズ培養
を特徴とする培養系において、酪酸またはその塩を添加
する産生増強法などが知られている（PCI W089/0668
6）。さらに、本来的にインターフェロンを産生する細
胞の、産生を誘起する以前に炭素数２〜６の直鎖アルカ
ン酸（好適には酪酸）またはその塩を含有する培地中で
培養することも特徴とする、インターフェロン産生細胞
培養方法（USP4,216,203）。また、培地にグルココルチ
コイド、酪酸、またはジメチルスルホキシドを添加す
る、インターフェロン産生増強方法（特開昭57−7409
3）等が報告されている。
最近、細胞培養系にある種の添加剤を加え、所望のタン
パク質の産生効率を増強させる方法がいくつか報告され
た。例えば、酪酸を最適実施態様とするアルカン酸また
はそ塩をタンパク質産生細胞の培養系に添加し、目的と
するタンパク質の産生効率を増強させる方法（特表昭63
−503273）、あるいはタンパク質産生細胞のビーズ培養
を特徴とする培養系において、酪酸またはその塩を添加
する産生増強法などが知られている（PCI W089/0668
6）。さらに、本来的にインターフェロンを産生する細
胞の、産生を誘起する以前に炭素数２〜６の直鎖アルカ
ン酸（好適には酪酸）またはその塩を含有する培地中で
培養することも特徴とする、インターフェロン産生細胞
培養方法（USP4,216,203）。また、培地にグルココルチ
コイド、酪酸、またはジメチルスルホキシドを添加す
る、インターフェロン産生増強方法（特開昭57−7409
3）等が報告されている。
種々の有用タンパク質の培養産生系に、酪酸に代表さ
れる直鎖アルカン酸またはその塩を添加し、産生効率を
増強させる技術思想に基づく上述の先行技術において
は、確かに該添加剤によるタンパク質産生増強効果が明
らかにされている。
れる直鎖アルカン酸またはその塩を添加し、産生効率を
増強させる技術思想に基づく上述の先行技術において
は、確かに該添加剤によるタンパク質産生増強効果が明
らかにされている。
しかしながら、目的とするタンパク質および産生細胞
の組み合せによっては、産生効率が極めて低い場合が事
実として存在し、酪酸単独の効果ではなお、不充分な場
合が予想される。例えば、前述の遺伝子組換え技術を利
用して血液凝固第VIII因子を産生させる場合がその代表
的な例である。事実、遺伝子組換え技術を利用して調製
された当該血液凝固因子を産生する組換え動物細胞を培
養し、目的とするタンパク質を産生させる場合に、酪酸
塩（この場合、酪酸ナトリウム）を添加すると、培養上
清中の当該血液凝固因子の産生量は無添加の場合に比較
して1.3〜2.5倍程度増加することが報告されている（Do
rner,A.J.,et 9l.,J.Biol.Chem.254 p.20602〜20607（1
989））。しかしながら、上述のように、元来、産生効
率の低い当該血液凝固因子産生系においては、酪酸塩に
る産生増強効果のみでは不充分であり、特に、工業的規
模で該血液凝固因子の生産を行う場合はよりいっそうの
産生効率の増強が求められる。
の組み合せによっては、産生効率が極めて低い場合が事
実として存在し、酪酸単独の効果ではなお、不充分な場
合が予想される。例えば、前述の遺伝子組換え技術を利
用して血液凝固第VIII因子を産生させる場合がその代表
的な例である。事実、遺伝子組換え技術を利用して調製
された当該血液凝固因子を産生する組換え動物細胞を培
養し、目的とするタンパク質を産生させる場合に、酪酸
塩（この場合、酪酸ナトリウム）を添加すると、培養上
清中の当該血液凝固因子の産生量は無添加の場合に比較
して1.3〜2.5倍程度増加することが報告されている（Do
rner,A.J.,et 9l.,J.Biol.Chem.254 p.20602〜20607（1
989））。しかしながら、上述のように、元来、産生効
率の低い当該血液凝固因子産生系においては、酪酸塩に
る産生増強効果のみでは不充分であり、特に、工業的規
模で該血液凝固因子の生産を行う場合はよりいっそうの
産生効率の増強が求められる。
本件発明者はこれらの状況を鑑み、鋭意研究を重ねた
結果、特に、血液凝固第VIII因子を産生する細胞の培養
系、あるいはモノクローナル抗体を産生する細胞の培養
系において、酪酸またはその塩を単独で培養産生系に添
加する上述の従来技術をはるかに凌ぐ産生増強効果をも
たらす本発明を完成させるに至った。
結果、特に、血液凝固第VIII因子を産生する細胞の培養
系、あるいはモノクローナル抗体を産生する細胞の培養
系において、酪酸またはその塩を単独で培養産生系に添
加する上述の従来技術をはるかに凌ぐ産生増強効果をも
たらす本発明を完成させるに至った。
「発明の構成」 問題点を解決するための手段 本発明は遺伝子組換え技術あるいは細胞融合技術によ
って調製された、所望のタンパク質を持続的に産生する
形質転換細胞またはハイブリドーマを培養し、当該タン
パク質を産生させる際に、培地に酪酸またはその塩を添
加し、さらに産生を相乗的に増大させる、リチウム塩ま
たはLPSからなる他の試剤を添加させることを特徴とす
る、所望の有用タンパク質産生方法である。
って調製された、所望のタンパク質を持続的に産生する
形質転換細胞またはハイブリドーマを培養し、当該タン
パク質を産生させる際に、培地に酪酸またはその塩を添
加し、さらに産生を相乗的に増大させる、リチウム塩ま
たはLPSからなる他の試剤を添加させることを特徴とす
る、所望の有用タンパク質産生方法である。
本発明は、以下の態様によって達成される。
（１）所望のタンパク質を持続産生する動物細胞を常法
によって培養する際に、その細胞系に最適な培地組成か
らなる培地中に、酪酸あるいはその塩、さらに本発明に
よって明らかになったこれらの添加剤の効果を増大させ
る他の試剤を添加して培養する。この場合、目的とする
タンパク質あるいは細胞系の種類に特別な制約はない
が、血液凝固第VIII因子を産生する形質転換動物細胞、
あるいは特定の抗原に対するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマの場合に、とりわけ大きな効果が認
められる。また、培地の産生増強添加剤以外の基本的組
成は通常の動物細胞の培養に用いられる培地のものが適
用され、細胞系に応じて適宜調整されうる。
によって培養する際に、その細胞系に最適な培地組成か
らなる培地中に、酪酸あるいはその塩、さらに本発明に
よって明らかになったこれらの添加剤の効果を増大させ
る他の試剤を添加して培養する。この場合、目的とする
タンパク質あるいは細胞系の種類に特別な制約はない
が、血液凝固第VIII因子を産生する形質転換動物細胞、
あるいは特定の抗原に対するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマの場合に、とりわけ大きな効果が認
められる。また、培地の産生増強添加剤以外の基本的組
成は通常の動物細胞の培養に用いられる培地のものが適
用され、細胞系に応じて適宜調整されうる。
（２）上述の培地中に添加する産生量増強のための試剤
は酪酸またはその塩、およびこれに相乗効果をもたらす
リチウム塩またはLPS等よりなる他の試剤である。酪酸
は通常、ナトリウム塩の形で添加されることが多いが、
塩の形態および種類についてはこれに限られることはな
い。ここで用いられるリチウム塩の種類についても特別
な制約はないが、塩化リチウム、酢酸リチウム等が好適
に用いられる。また、LPSについてもその種類、由来に
ついては特別な制約はない。
は酪酸またはその塩、およびこれに相乗効果をもたらす
リチウム塩またはLPS等よりなる他の試剤である。酪酸
は通常、ナトリウム塩の形で添加されることが多いが、
塩の形態および種類についてはこれに限られることはな
い。ここで用いられるリチウム塩の種類についても特別
な制約はないが、塩化リチウム、酢酸リチウム等が好適
に用いられる。また、LPSについてもその種類、由来に
ついては特別な制約はない。
また、これらの添加剤の添加量については、所望のタ
ンパク質の産生を増大させるが細胞の生育速度には実質
的に悪影響を及ぼさない濃度であれば特に制限されな
い。実際的には、酪酸またはその塩が、0.1〜5.0mM、好
ましくは0.5〜2.0mM、およびリチウム塩が2.0〜50mM、
好ましくは10〜50mMの濃度で好適に使用される。さら
に、酪酸塩の効果を増強させる試剤としてLPSが用いら
れる場合は10ng/ml〜1.0mg/ml、好ましくは0.5〜100μg
/mlの濃度が望ましい。
ンパク質の産生を増大させるが細胞の生育速度には実質
的に悪影響を及ぼさない濃度であれば特に制限されな
い。実際的には、酪酸またはその塩が、0.1〜5.0mM、好
ましくは0.5〜2.0mM、およびリチウム塩が2.0〜50mM、
好ましくは10〜50mMの濃度で好適に使用される。さら
に、酪酸塩の効果を増強させる試剤としてLPSが用いら
れる場合は10ng/ml〜1.0mg/ml、好ましくは0.5〜100μg
/mlの濃度が望ましい。
各種の試剤の添加の時期については、各々の培養する
細胞系によって好適に選択されるべきであり、特別な制
約はない。望ましくは、所望のタンパク質を産生する細
胞の、培養における予想される最終到着密度の80〜90％
の生育状態に達した時期に、上記の試剤を含む培地に交
換した場合、産生効率における好ましい結果をもたら
す。
細胞系によって好適に選択されるべきであり、特別な制
約はない。望ましくは、所望のタンパク質を産生する細
胞の、培養における予想される最終到着密度の80〜90％
の生育状態に達した時期に、上記の試剤を含む培地に交
換した場合、産生効率における好ましい結果をもたら
す。
上述の態様で培養された所望のタンパク質は、常法に
従って回収され、精製される。すなわち、沈澱法、各種
のクロマトグラフィー等を組み合わせた生物化学的手法
によって、所望の精製度と濃度のものを得ることができ
る。このように過程において、本発明の添加が悪影響を
及ぼすようなことはない。
従って回収され、精製される。すなわち、沈澱法、各種
のクロマトグラフィー等を組み合わせた生物化学的手法
によって、所望の精製度と濃度のものを得ることができ
る。このように過程において、本発明の添加が悪影響を
及ぼすようなことはない。
本発明による、酪酸またはその塩を添加した培養系
に、新たに効果を増強するいくつかの試剤を添加する方
法によって、酪酸塩単独添加の場合に比較して約1.3〜
4.0倍の産生効率の増大がもたらされ、その結果得られ
る経済的効果は極めて大きい。
に、新たに効果を増強するいくつかの試剤を添加する方
法によって、酪酸塩単独添加の場合に比較して約1.3〜
4.0倍の産生効率の増大がもたらされ、その結果得られ
る経済的効果は極めて大きい。
以下、本発明の特徴を明らかにするために、実施例に
沿って詳述するが、これらの実施例は本発明の種々の具
体例を説明するものであって、本発明はこれらの実施例
に限定されるものではない。
沿って詳述するが、これらの実施例は本発明の種々の具
体例を説明するものであって、本発明はこれらの実施例
に限定されるものではない。
実施例 １ 酪酸塩効果を増強する他の添加剤の検討 遺伝子組換え技術用いて調製された血液凝固第VIII因
子産生CHO細胞（特願昭63−85454、寄託番号微工研 第
9873号）をカルチャーディッシュ（NUNCLON社）上で培
養した。生育培地は10％胎仔ウシ血清補給 ASF104培地
（味の素）とし、細胞は底面積9.6cm2の1we11あたり5.0
×105個の密度で播種した。
子産生CHO細胞（特願昭63−85454、寄託番号微工研 第
9873号）をカルチャーディッシュ（NUNCLON社）上で培
養した。生育培地は10％胎仔ウシ血清補給 ASF104培地
（味の素）とし、細胞は底面積9.6cm2の1we11あたり5.0
×105個の密度で播種した。
細胞がディッシュ上で充分に生育した後、生育培地を
吸引除去して、下記の（表１）に示す各種の添加剤を含
有する培地で置換した。酪酸はナトリウム塩の形で添加
し、対照の培養液には酪酸塩及びその他の添加剤は加え
なかった。
吸引除去して、下記の（表１）に示す各種の添加剤を含
有する培地で置換した。酪酸はナトリウム塩の形で添加
し、対照の培養液には酪酸塩及びその他の添加剤は加え
なかった。
細胞数は血球計算盤を用いて定量した。また、第VIII
因子活性は、標準的な血液凝固分析（Hardistyet al.,T
hrombosis et Diathesis Haemologica72,p.215（196
2））における、第VIII因子欠損血漿の遅延部分トロン
ボプラスチン時間を減少させる能力について定量した。
この際、凝固因子定量用因子標準血漿（Dade社）をスタ
ンダードとしてこれを１単位（1 IU）とした。
因子活性は、標準的な血液凝固分析（Hardistyet al.,T
hrombosis et Diathesis Haemologica72,p.215（196
2））における、第VIII因子欠損血漿の遅延部分トロン
ボプラスチン時間を減少させる能力について定量した。
この際、凝固因子定量用因子標準血漿（Dade社）をスタ
ンダードとしてこれを１単位（1 IU）とした。
酢酸リチウム、塩化リチウム、LPSの添加によって酪
酸の効果を約1.3〜4.0倍程度増強することが判明した
（表２）。また、上記の濃度域における、これらの添加
剤による顕著な細胞数の変化は認められず、細胞自体の
生育には実質的には悪影響を及ぼしていないことが確認
された。
酸の効果を約1.3〜4.0倍程度増強することが判明した
（表２）。また、上記の濃度域における、これらの添加
剤による顕著な細胞数の変化は認められず、細胞自体の
生育には実質的には悪影響を及ぼしていないことが確認
された。
実施例 ２ 酢酸リチウムによる酪酸塩効果の増強 産生培地として、ASF104培地に1mM酪酸塩及び各濃度
の酢酸リチウムをそれぞれ添加し、72時間培地を継続さ
せた以外は実施例１と同様の実験手順に従った。
の酢酸リチウムをそれぞれ添加し、72時間培地を継続さ
せた以外は実施例１と同様の実験手順に従った。
この結果、酢酸リチウム濃度5.0〜50mMの範囲で酪酸
効果の顕著な増強が認められた（第１図、×：対照（無
添加）、○：酪酸塩1mM、▲：酪酸塩1mM＋酢酸リチウム
5.0mM、●：酪酸塩1mM＋酢酸リチウム10mM、△：酪酸塩
1mM＋酢酸リチウム20mM、□：酪酸塩1mM＋酢酸リチウム
50mM）。
効果の顕著な増強が認められた（第１図、×：対照（無
添加）、○：酪酸塩1mM、▲：酪酸塩1mM＋酢酸リチウム
5.0mM、●：酪酸塩1mM＋酢酸リチウム10mM、△：酪酸塩
1mM＋酢酸リチウム20mM、□：酪酸塩1mM＋酢酸リチウム
50mM）。
実施例 ３ 塩化リチウムによる酪酸塩効果の増強 産生培地として、ASF104培地に1mM酪酸塩及び各濃度
の塩化リチウムをそれぞれ添加し、72時間培養を継続さ
せた以外は実施例１と同様の実験手順に従った。この結
果、塩化リチウム濃度5.0〜50mMの範囲で酪酸効果の増
強が認められた（第２図、×：対照（無添加）、○：酪
酸塩1mM、▲：酪酸塩1mM＋酢酸リチウム5.0mM、●：酪
酸塩1mM＋酢酸リチウム10mM、△：酪酸塩1mM＋酢酸リチ
ウム20mM、□：酪酸塩1mM＋酢酸リチウム50mM）。
の塩化リチウムをそれぞれ添加し、72時間培養を継続さ
せた以外は実施例１と同様の実験手順に従った。この結
果、塩化リチウム濃度5.0〜50mMの範囲で酪酸効果の増
強が認められた（第２図、×：対照（無添加）、○：酪
酸塩1mM、▲：酪酸塩1mM＋酢酸リチウム5.0mM、●：酪
酸塩1mM＋酢酸リチウム10mM、△：酪酸塩1mM＋酢酸リチ
ウム20mM、□：酪酸塩1mM＋酢酸リチウム50mM）。
参考例 産生増強効果に及ぼす酪酸塩の濃度 産生培地として、ASF104培地に各濃度の酪酸塩を添加
し、72時間培養を継続させた以外は実施例１と同様の実
験手順に従った。
し、72時間培養を継続させた以外は実施例１と同様の実
験手順に従った。
酪酸塩濃度0.2〜5.0mMにおいて、無添加の場合に比較
して２〜４倍産生能を増強させる効果を認めた（表
３）。
して２〜４倍産生能を増強させる効果を認めた（表
３）。
実施例 ４ モノクローナル抗体の産生に及ぼす各種添加剤の効果 KohlerとMilsteinの方法（Nature 256 p.495（197
5））を基にして調製された、ヒト組織因子に対するモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（14−11
株）をカルチャーディッシュで培養した。生育培地は10
％胎仔ウシ血清を含んだRPMI 1640培地（日水製薬）を
用いた。細胞を播種し充分に増強させた後、培地を吸引
除去し1Mmの酪酸塩及び、これに5.0mMの酢酸リチウムを
添加した培地に置換し、24時間培養した。
5））を基にして調製された、ヒト組織因子に対するモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（14−11
株）をカルチャーディッシュで培養した。生育培地は10
％胎仔ウシ血清を含んだRPMI 1640培地（日水製薬）を
用いた。細胞を播種し充分に増強させた後、培地を吸引
除去し1Mmの酪酸塩及び、これに5.0mMの酢酸リチウムを
添加した培地に置換し、24時間培養した。
分泌されたヒト組織因子に対するモノクローナル抗体
は通常のELISA（二次抗体として抗マウスIgG−HRP標識
DAKO社）を用いて測定した。
は通常のELISA（二次抗体として抗マウスIgG−HRP標識
DAKO社）を用いて測定した。
本実施例において、5.0mM酢酸リチウムの添加によ
り、当該ハイブリドーマの培養におけるモノクローナル
抗体の細胞あたりの産生量は、酪酸塩単独の添加の場合
に比較して、約85％増加した。（表４） 「発明の効果」 本発明の実施態様は特に、所望のタンパク質の産生細
胞である、遺伝子組換え技術を用いた形質転換細胞、あ
るいは細胞融合技術によるハイブリドーマに適用する
と、適当な濃度の添加剤の使用により、所望のタンパク
質の産生を相当量増大させることができる。
り、当該ハイブリドーマの培養におけるモノクローナル
抗体の細胞あたりの産生量は、酪酸塩単独の添加の場合
に比較して、約85％増加した。（表４） 「発明の効果」 本発明の実施態様は特に、所望のタンパク質の産生細
胞である、遺伝子組換え技術を用いた形質転換細胞、あ
るいは細胞融合技術によるハイブリドーマに適用する
と、適当な濃度の添加剤の使用により、所望のタンパク
質の産生を相当量増大させることができる。
以上述べてきたように、培養系に酪酸あるいはその
塩、および産生を増大させる他の添加剤を適当量加える
ことを特徴とする本発明の利点は、製造プロトコールを
大幅に変更することなく、極めて僅かな経費で、所望の
タンパク質の産生を実質的に増加させることができる点
にある。
塩、および産生を増大させる他の添加剤を適当量加える
ことを特徴とする本発明の利点は、製造プロトコールを
大幅に変更することなく、極めて僅かな経費で、所望の
タンパク質の産生を実質的に増加させることができる点
にある。
第１図は血液凝固第VIII因子産生動物細胞の培養におけ
る当該血液凝固因子の産生に及ぼす酪酸塩と酢酸リチウ
ムの増強効果を示す。第２図は血液凝固第VIII因子産生
動物細胞の培養における当該血液凝固因子の産生に及ぼ
す酪酸塩と塩化リチウムの増強効果を示す。
る当該血液凝固因子の産生に及ぼす酪酸塩と酢酸リチウ
ムの増強効果を示す。第２図は血液凝固第VIII因子産生
動物細胞の培養における当該血液凝固因子の産生に及ぼ
す酪酸塩と塩化リチウムの増強効果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】血液凝固第VIII因子をコードする遺伝子を
有する発現ベクターにより形質転換され該血液凝固第VI
II因子産性能を有するチャイニーズハムスター卵巣細胞
（以下、CHO細胞とも称する）及び細胞融合技術を用い
て調整されモノクローナル抗体産生能を有するハイブリ
ドーマより選ばれる動物細胞を培養して、所望の血液凝
固第VIII因子またはモノクローナル抗体を産生させる際
に、使用する培地中に、酪酸もしくはその塩と、リチウ
ム塩もしくはリポポリサッカリド（以下、LPSとも称す
る）とが含有されることを特徴とする、血液凝固第VIII
因子及びモノクローナル抗体より選ばれるタンパク質の
産生方法。 - 【請求項２】酪酸もしくはその塩が0.1〜5.0mM及びリチ
ウム塩が2.0〜50mMの濃度で存在する請求項１に記載の
タンパク質の産生方法。 - 【請求項３】酪酸もしくはその塩が0.5〜2.0mM及びリチ
ウム塩が10〜50mMの濃度で存在する請求項１または請求
項２のいずれかに記載のタンパク質の産生方法。 - 【請求項４】酪酸もしくはその塩が0.1〜5.0mM及びLPS
が0.01μg/m1〜1.0mg/mlの濃度で存在する請求項１に記
載のタンパク質の産生方法。 - 【請求項５】酪酸もしくはその塩が0.5〜2.0mM及びLPS
が0.5〜100μg/mlの濃度で存在する請求項１または請求
項４のいずれかに記載のタンパク質の産生方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12172990A JP2683946B2 (ja) | 1990-05-11 | 1990-05-11 | 細胞培養によるタンパク質産生方法 |
| US07/997,670 US5378612A (en) | 1990-05-11 | 1992-12-28 | Culture medium for production of recombinant protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12172990A JP2683946B2 (ja) | 1990-05-11 | 1990-05-11 | 細胞培養によるタンパク質産生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0420294A JPH0420294A (ja) | 1992-01-23 |
| JP2683946B2 true JP2683946B2 (ja) | 1997-12-03 |
Family
ID=14818439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12172990A Expired - Lifetime JP2683946B2 (ja) | 1990-05-11 | 1990-05-11 | 細胞培養によるタンパク質産生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2683946B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170098922A (ko) | 2015-01-26 | 2017-08-30 | 우베 고산 가부시키가이샤 | 물질의 생산 방법 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2009094B1 (en) | 2006-04-13 | 2010-06-09 | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | Fusion partner cells |
-
1990
- 1990-05-11 JP JP12172990A patent/JP2683946B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170098922A (ko) | 2015-01-26 | 2017-08-30 | 우베 고산 가부시키가이샤 | 물질의 생산 방법 |
| US10519478B2 (en) | 2015-01-26 | 2019-12-31 | Ube Industries, Ltd. | Method of producing substance |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0420294A (ja) | 1992-01-23 |
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