DE3885983T2 - Verfahren zur Herstellung des rekombinanten menschlichen Faktors VIII:C. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung des rekombinanten menschlichen Faktors VIII:C.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der Aktivität des menschlichen Faktors VIII:C. Insbesondere betrifft es ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins des menschlichen Faktors VIII:C mit Hilfe gentechnischer Verfahren.
- Der menschliche Faktor VIII:C ist ein Glycoprotein des Blutplasmas, welches am Intrinsic-system der Blutgerinnung beteiligt ist und als ein Cofaktor des Faktors IXa fungiert, einer Serinprotease, die den Faktor X aktivieren kann. Bei Patienten mit Hämophilie A, einer erblich bedingten X-chromosomal rezessiven Blutungsstörung, ist der Faktor VIII:C defekt oder im Blut nicht vorhanden. Zur Behandlung von Blutungen bei Hämophilie A-Patienten, verursacht durch Blutgerinnungsstörungen, wurde klinisch die sogenannte Faktor VIII:C-Austauschtherapie angewendet, ein Verfahren, bei dem die Blutung durch Ergänzung des Faktors VIII:C zum Stillstand gebracht wird; erfahrungsgemäß die vernünftigste und zuverlässigste Therapie.
- Zur Ergänzung des Faktor VIII:C-Mangels bei Hämophilie A-Patienten wurde meistens Blutplasma oder Kryopräzipitat, das durch Gefrieren von Blutplasma und anschließendes Auftauen des Plasmas gewonnen wird, verwendet. Heutzutage werden Faktor VIII-Konzentrate für den genannten Zweck verwendet.
- Quelle für den menschlichen Faktor VIII:C ist menschliches Blutplasma. Heutzutage im Handel erhältliche Faktor VIII-Konzentrate haben einen Anteil des Faktors VIII:C von etwa 0,04 Gew. %. Herkömmliche Faktor VIII-Konzentrate enthalten meistens verschiedene Arten von Verunreinigungen aus dem menschlichen Blutplasma. Obwohl Versuche in der Spenderauswahl und der Entwicklung von Verfahren zur Inaktivierung von Viren gemacht wurden, besteht die Gefahr der Kontamination mit Viren, wie etwa jenen, die Hepatitis oder das Erworbene Immunschwäche-Syndrom (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS) hervorrufen.
- Um zuverlässigere Faktor VIII-Präparate bei geringeren Kosten zu erhalten, ohne sich auf die quantitativ beschränkte menschliche Blutplasmaquelle zu verlassen und auch ohne Angst vor unerwünschter Kontamination mit Viren, die in gepooltem Blutplasma enthalten sind, wird unter diesen Umständen gegenwärtig versucht, Faktor VIII:C mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie herzustellen und zwar durch Clonierung von Genen, die den menschlichen Faktor VIII:C codieren und Expression dieser Gene in tierischen Zellen und Mikroorganismen.
- Nachdem das Gen des menschlichen Faktors VIII:C cloniert wurde, zum ersten Mal durch J. Gitschier et al. (vgl. Nature 312 (1984), 326-330) und dann in Babyhamster-Nierenzellen exprimiert wurde durch W.I.Wood et al. (vgl. Nature 312 (1984), 330-337), wurden viele Versuche zur Herstellung des menschlichen Faktors VIII:C mit Hilfe rekombinanter Gentechnologie beschrieben. Die Versuche zur Clonierung der cDNA des menschlichen Faktors VIII und ihre Expression in Säugetierzellen werden veranschaulicht durch J.J. Toole et al. (vgl. Nature 312 (1984), 342-347), M.A. Truett et al. (vgl. DNA 4 (1985), 333-349), N. Sarver et al. (vgl. Europäische Patentanmeldung Nr. 265, 778) und durch A. Pavirani et al. (vgl. Biotechnology 5 (1987), 389-392). Ergänzend hierzu sei die Clonierung der cDNA des menschlichen Faktors VIII:C und ihre Expression in Mikroorganismen durch V. Ooyen et al. (vgl. Europäische Patentanmeldung Nr. 253, 455) erwähnt. Jedoch, erfolgt gemäß dieser Verfahren die Expression des Gens nur vorübergehend oder die Genexpressionsraten sind teilweise sehr niedrig, da der menschliche Faktor VIII:C ein Glycoprotein mit einem sehr hohen Molekulargewicht ist. Daher sind diese bekannten Verfahren für eine industrielle Produktion des menschlichen Faktors VIII:C nicht ausreichend.
- Es wird angenommen, daß der natürliche menschliche Faktor VIII:C eine Domäne mit der Struktur A1-A2-B-A3-C1-C2 besitzt, in der A1, A2 und A3 homologe Aminosäuresequenzen besitzen; C1 und C2 besitzen ebenfalls homologe Aminosäuresequenzen (G.A. Vehar et al., Nature 312 (1984), 337-342). Es wird vermutet, daß ein Teil oder die gesamte B-Domäne nicht für die wichtige Cofaktor-Aktivität des menschlichen Faktors VIII:C notwendig ist. Um die Genexpressionsrate bei der Produktion des Faktors VIII:C mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken zu steigern, wurde deshalb versucht, eine molekulare Spezies zu entwickeln, die biologische Aktivität zeigt, wobei sie durch Deletion eines Teils oder der gesamten B-Domäne derart modifiziert wurde, daß sie so klein wie möglich ist.
- Der natürliche menschliche Faktor VIII:C ist ein polymorphes Glycoprotein, das von 2332 Aminosäureresten gebildet wird und ein Molekulargewicht von über 300 KDa besitzt, wobei die Abschnitte, die von der Aminosäure an Position 1 (Ala-1) bis zu der Aminosäure an Position 1648 (Arg-1648) gebildet werden, allgemein als schwere Ketten bezeichnet werden, während die Abschnitte von Glu-1649 bis zu Tyr-2332 leichte Ketten genannt werden. Der natürliche menschliche Faktor VIII:C ist der proteolytischen Spaltung durch Enzyme, wie Thrombin Faktor Xa und aktiviertes Protein C in kleinere molekulare Fragmente ausgesetzt und der Faktor VIII:C wird auf diese Weise aktiviert oder inaktiviert.
- Der biologisch aktive Faktor VIII:C im Plasma besteht aus einem heterogenen Gemisch von schweren Ketten, deren Länge von 1648 Aminosäuren bis zu 740 Aminosäuren reicht (vgl. L.-O Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 2979-2983). Gemäß den Beobachtungen von Andersson besteht der kleinste biologisch aktive Faktor VIII:C aus einer schweren Kette von Ala-1 bis Arg-740 und einer leichten Kette von Glu-1649 bis Tyr-2332, wobei die schwere und die leichte Kette über eine Calcium-Ionen-Brücke verknüpft sind.
- In der vorliegenden Erfindung ist der natürliche aktive menschliche Faktor VIII:C ein Protein, dem ein Teil oder das gesamte Peptid der B-Domäne im Bereich von Ser-741 bis Arg-1648 des natürlichen menschlichen Faktors VIII:C fehlt, wobei das Aminoende der leichten Kette über eine Peptidbindung kovalent an das Carboxylende der schweren Kette gebunden ist.
- Der natürliche aktive menschliche Faktor VIII:C wird beispielsweise wie folgt abgekürzt. Der natürliche aktive menschliche Faktor VIII:C, in dem ein Polypeptid-Fragment (H-Kette), von Ala-1 bis Arg-740 kovalent an die Aminosäure eines Polypeptids (L-Kette), von Glu-1649 bis Tyr-2332 gebunden ist, wird abgekürzt als "740-Arg-1649 Glu-Faktor VIII:C". "740 Arg-1649 Glu-Faktor VIII:C" wird nachstehend als RE bezeichnet.
- J.J Toole et al. beschreiben die Expression des 981 Pro-1563 Asp-Faktors VIII:C und des 759 Thr-1640 Pro-Faktors VIII:C in COS-Zellen (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 5939-5942) und in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) (vgl. PCT-Anmeldung Nr. WO 86/06101).
- R. Kaufman beschreibt die Expression des 740 Arg-1647 Gln-Faktors VIII:C in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (vgl. PCT-Anmeldung Nr. WO 87/04187).
- D.L. Eaton et al. beschreiben die Expression des 796 Gln-1563 Asp-Faktors VIII:C in Säugetierzellen (vgl. Biochemistry 25 (1986), 8343-8347); C. Gorman (vgl. Europäische Patentanmeldung Nr. 260148) und A. Pavirani et al. beschreiben die Expression des 116 Asp-1455 Asp-Faktors VIII:C in BHK-21-Zellen (vgl Japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 22195/1988). N. sarver et al. beschreiben die Expression des 746 Ser-1561 Leu-Faktors VIII:C in C127 Mauszellen (vgl. Europäische Patentanmeldung Nr. 265, 778). M. Pasek et al. beschreiben die Konstruktion einer cDNA, die den 740 Arg-1649 Glu-Faktor VIII:C und den 744 Gln-1563 Asp- Faktor VIII:C codiert und deren Expression in BMT-10-Zellen (Gerard R.D. et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 3231-3240, vgl. PCT-Anmeldung Nr. WO 88/831). In Mikroorganismen wurde das Gen des 866 Thr-1663 Asp-Faktors VIII:C von V. Ooyen et al. (vgl. Europäische Patentanmeldung Nr. 253, 455) exprimiert.
- Die Expressionsraten, die mit den Verfahren der zitierten Literatur erreicht werden, scheinen nicht ausreichend zu sein.
- Es wurde versucht, ein exogenes Gen durch gentechnische Verfahren, unter Verwendung eukaryontischer Zellen als Wirtszellen, beispielsweise tierische Zellen, zu exprimieren, zum Beispiel in einem Verfahren, in dem Ovarzellen des Chinesischen Hamsters mit Dihydrofolat-Reduktase-Mangel ((dhfr): dhfr(-) CHO-Zellen), eingesetzt werden (vgl. Urlaub G. et al., Prot. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 4216-4220). Bei den Zellen handelt es sich um eukaryontische Zellen, die exogene Gene kontinuierlich exprimieren können. In den PCT- Anmeldungen WO 86/06101 und WO 87/ 04187 sind zwar CHO-Zellen beschrieben, die einen spezifischen natürlichen aktiven menschlichen Faktor VIII:C produzieren können, die Etablierung einer Zellinie, die den 740 Arg-1649 Glu-Faktor-VIII:C konstant bei hoher Produktion effizient herstellt, wurde bis jetzt noch nicht beschrieben.
- Die Erfindung betrifft eine Zellinie, die konstant und kontinuierlich exogene Gene des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C bei hoher Produktionseffizienz exprimieren kann, in einem billigen Medium schnell wachsen kann und mit Hilfe gentechnischer Verfahren stetig vermehrt werden kann. Die Erfindung betrifft auch eine Transformante tierischer Zellen (eukaryontische Zellen), die erzeugt wird, indem die tierischen Zellen mit einem Expressionsvektor des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C transformiert werden, wobei der Epressionsvektor die DNA-Sequenz in die tierischen Zellen einbringt, die den natürlichen aktiven menschlichen Faktor VIII:C codiert, stromabwärts von mindestens einem Promotor. Eine Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zur Produktion des rekombinanten menschlichen Faktors VIII:C bereitzustellen, bei dem die Transformante, wie oben beschrieben, gezüchtet wird und das im Kulturmedium angereicherte Produkt abgetrennt wird. Diese und weitere Aufgaben bzw. Vorteile dieser Erfindung sollen dem Fachmann durch die folgende Beschreibung veranschaulicht werden.
- Figur 1 zeigt DNA- und Aminosäuresequenzen von RE (codiert 740 Arg-1649 Glu-Faktor VIII:C) im Plasmid Ad.RE.neo. Figur 2 zeigt Restriktionskarten der Plasmide Ad.RE.neo(a) und pSV2-dhfr(b), die in Beispiel 1 verwendet werden. Figur 3 zeigt graphisch die Aktivität des Faktors VIII:C im Überstand der Kultur, die durch Züchtung der Transformante in Beispiel 3 gewonnen wird. Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung des in Beispiel 5 verwendeten Plasmids Ad.RE.dhfr. Figur 5 zeigt die Faktor VIII-Aktivität im Überstand der Kultur, die durch Züchtung der Transformante in Beispiel 7 gewonnen wird. Figur 6 zeigt die Menge an Faktor VIII:C-Antigen im Kulturmedium, das durch Züchtung der Transformante in Beispiel 7 erhalten wird. Figur 7 zeigt den Antigen-Spiegel des Faktor VIII:C-von Willebrand Faktor- Komplexes im Kulturüberstand des Beispiels 7.
- Die in der Erfindung verwendeten Transformanten werden durch Transformation tierischer Zellen mit Expressionsvektoren des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C erzeugt.
- Die Expressionsvektoren des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C tragen ein Gen, das einen natürlichen aktiven menschlichen Faktor VIII:C codiert, mindestens einen Promotor stromaufwärts davon, gegebenenfalls mindestens einen Enhancer, wobei Promotor und Enhancer aus tierischen Genen und tierischen Viren (z.B. ein Affenvirus oder ein Adenovirus) stammen, gegebenenfalls ein selektierbares Gen für tierische Zellen (z.B. das Neomycin-Resistenz- Gen: Transposon Tn5 oder das Dihydrofolat-Reduktase-Gen (dhfr)) und gegebenenfalls ein amplifizierbares Gen (z.B. das Dihydrofolat-Reduktase-Gen (dhfr) oder das Adenosin- Deaminase-Gen).
- In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Expressionsvektor des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C ein Gen, das den natürlichen aktiven menschlichen Faktor VIII:C codiert, das sich an ein stromaufwärts liegendes Signalpeptid-Gen (notwendig für die Sekretion) anschließt und eine DNA-Sequenz eines Poly-rA-Anknüpfungssignals, welche stromabwärts davon liegt. In diesem Expressionsvektor ist das Gen unter der Kontrolle eines Enhancers und eines Promotors, die in eukaryontischen Zellen funktionieren. Außerdem enthält der bevorzugte Expressionsvektor ein Neomycin-Resistenz-Gen (Transposon Tn5), einen Replikationsursprung für Escherichia coli und ein Antibiotika-Resistenz-Gen. Ein solcher Expressionsvektor ist zum Beispiel das Plasmid Ad.RE.neo, das in der PCT-Anmeldung Nr. WO 88/831 offenbart ist, wobei "RE" für 740 Arg-1649 Glu-Faktor VIII:C steht.
- RE (740 Arg-1649 Glu-Faktor VIII:C) hat die in Figur 1 gezeigte Aminosäure- und DNA-Sequenz.
- Die Signalpeptid-DNA- und -Aminosäuresequenz in der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise die eines natürlichen menschlichen Faktors VIII:C (vgl. Nature 312 (1984), 330-337), schließt aber alle ein, die präzise zwischen dem Signalpeptid-Bereich und dem Bereich des reifen Proteins während des Sekretionsprozesses gespalten werden kann.
- Jeder Promotor der in eukaryontischen Zellen funktioniert, kann im erfindungsgemäßen Expressionsvektor verwendet werden. Solche Promotoren schließen Promotoren tierischer Virusgene und Promotoren tierischer Gene ein, die bei der Transkription von Genen des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C in tierischen Zellen wirksam sind. Geeignete tierische Virus-Promotoren sind beispielsweise der SV 40- Promotor für die frühe Region, der SV 40-Promotor für die späte Region, der späte Adenovirus-2-Hauptpromotor, der HB- Virus-Gen-Promotor oder der Retrovirus-Gen-Promotor. Geeignete Gen-Promotoren tierischer Zellen sind beispielsweise der Promotor eines Thymidin-Kinase-Gens, der Promotor eines Metallothionein-Gens oder der Promotor eines Interferon- Gens. Bevorzugte Promotoren unter ihnen sind der SV 40-Promotor für die frühe Region, der SV 40-Promotor für die späte Region und der späte Adenovirus-2-Hauptpromotor. Die Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein.
- Der Expressionsvektor des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C trägt ein Gen, das Resistenz gegen Antibiotika oder Derivate davon (z.B. Geneticin, G418 etc.) verleiht, zum Beispiel ein Neomycin-Resistenz-Gen, um die Selektion der transformierten tierischen Zellen einfacher zu machen. Daneben ist die Verknüpfung mit einem Replikationsursprung von E.coli und einem Antibiotika-Resistenz-Gen hilfreich, um eine einfache Herstellung einer reinen Vektor- DNA in großer Menge zu ermöglichen. Der Replikationsursprung ist vorzugsweise ein Plasmid, das vom Colicin-E1-Plasmid, z.B. pBR322, und seinen analogen Plasmiden abstammt. Die Antibiotika-Resistenz-Gene schließen ein Ampicillin-Resistenz- Gen, ein Tetracyclin-Resistenz-Gen, ein Kanamycin-Resistenz- Gen, ein Streptomycin-Resistenz-Gen, ein Neomycin-Resistenz- Gen oder ähnliche ein.
- Die eukaryontischen Wirtszellen für die Genexpression des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C in dieser Erfindung schließen alle tierischen Zellen ein, die das Gen des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C exprimieren können. Während eine Vielzahl tierischer Zellinien zur erfindungsgemäßen Expression der Gene verwendbar ist, werden Hamsterzellen bevorzugt, besonders Ovarzellen des Chinesischen Hamsters. Besonders bevorzugte Zellen sind Ovarzellen des Chinesischen Hamsters, denen es an Dihydrofolat-Reduktase-Aktivität (DHFR) mangelt; solche Zellen sind für Selektion und Isolierung der gewünschten Transformanten sowie für effektive Genamplifizierung geeignet. Besonders bevorzugte Zellinien sind DHFR(-)-CHO-Zellen DXB11 und DHFR(-)-CHO-Zellen DG44 (vgl. G. Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 4216-4220), wobei DG44 in Hinsicht auf stabile und einfache Züchtung besonders bevorzugt wird.
- Das Einbringen der DNA in eukaryontische Zellen kann mit bekannten Verfahren, beispielsweise einem Verfahren von F.L. Graham et al. (vgl. Virology 54 (1973), 536-539) oder einem Verfahren von H. Potter et al. (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 7161-7165) durchgeführt werden. Wenn man tierischen Zellen, denen es an einem Gen mangelt, z.B. CHO- Zellen, denen das Dihydrofolat-Reduktase-Gen fehlt (dhfr), einer Co-Transfektion (vgl. Cell 16 (1979), 777-785) mit einem dhfr-Gen-tragenden Plasmid (z.B. pSV2-dhfr, vgl. Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864) und einem Expressionsvektor des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C aussetzt, gefolgt von Selektion in einem Selektionsmedium, das kein Hypoxanthin, Glycin und Thymidin enthält, erhält man CHO-Zellen, in denen dhfr-Gene eingeführt und exprimiert wurden und das Gen des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C möglicherweise eingeführt ist.
- Wenn bei den angeführten Verfahren die Transformation mit eukaryontischen Zellen durchgeführt wird, sollte vorzugsweise ein linearisiertes Plasmid in die Zellen übertragen werden, das vorher durch Spaltung mit entsprechenden Restriktionsenzymen, die die Expression des gewünschten Produktes nicht beeinträchtigen, hergestellt wird; so kann das gewünschte exogene Gen in die Chromosomen der eukaryontischen Zellen mit großer Effizienz integriert werden.
- Außerdem können tierische Zellen, in die das Gen des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C integriert ist, das inserierte Neomycin-Resistenz-Gen (Transposon Tn5) zusammen mit diesem Gen exprimieren, daher können die tierischen Zellen durch Wachstum der Zellen in einem Medium, das mit einem Neomycin-Derivat (z.B. Geneticin , G418 etc.) ergänzt ist, einfach selektiert und isoliert werden.
- Die hergestellten Transformanten des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C können auch durch Kombination der vorher erwähnten Verfahren selektiert und isoliert werden.
- Alternativ dazu wird ein dhfr-Gen vorher in den vorstehend erwähnten Expressionsvektor des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C inseriert und dieser zusammengesetzte Vektor in die Wirtszellen eingeführt. Es ist möglich, das Gen des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C und das dhfr-Gen auf benachbarten Positionen in die Chromosomen der Wirtszellen zu integrieren.
- In den so hergestellten Transformanten setzt sich die Amplifikation des Gens des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C wirksam fort. Auf diese Weise kann man eine Transformante gewinnen, die das Gen des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C in höheren Ausbeuten exprimiert.
- Wenn die erfindungsgemäß verwendeten Transformanten, die ein amplifizierbares Gen (z.B. dhfr-Gen, Adenosin-Desaminase-Gen etc.) enthalten, unter für eine Genamplifikation entsprechend geeigneten Bedingungen gezüchtet werden (im Falle des dhrf-Gens wird die Amplifikation in Gegenwart von Methotrexat in einer Konzentration von 1-10,000 nM durchgeführt), kann das von den Transformanten getragene Gen des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C genauso wie das dhfr-Gen amplifiziert werden. Als Ergebnis stellen die Transformanten entsprechend der erhöhten Gen-Dosis eine große Menge des gewünschten Proteins her und daher kann der gewünschte rekombinante natürliche aktive menschliche Faktor VIII:C in dem Kulturmedium in einer großen Menge hergestellt werden.
- Die Transformanten, die das Gen des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C exprimieren, können auch in einem serumfreien Medium gezüchtet werden, genauso wie in dem herkömmlichen serumhaltigen Medium, um den gewünschten rekombinanten menschlichen Faktor VIII:C zu erhalten. Zusätzlich können die Transformanten auch in einer Suspension mit oder ohne einem Träger gezüchtet werden.
- Die Züchtung der Transformanten sollte vorzugsweise unter Zugabe eines Stoffes durchgeführt werden, der die Menge des im Medium angereicherten gewünschten rekombinanten menschlichen Faktor VIII:C steigert. Derartige Stoffe schließen vorzugsweise verschiedene Arten von Proteinen ein, wie Albumin, von Willebrand-Faktor, Polyethylenglykol, Natriumselenit, Protease-Inhibitoren wie E-Aminocapronsäure, Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), Aprotinin oder Cyclodextrine.
- Der erfindungsgemäß hergestellte rekombinante menschliche Faktor VIII:C, d.h. das Expressionsprodukt des Gens des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C, wird in der Transformante als einzelne Kette synthetisiert. Ein Teil dieser Expressionsprodukte wird vielleicht in Form einer einzelnen Kette in das Kulturmedium sezerniert. Ein anderer Teil der Produkte wird vielleicht in Form mehrerer Ketten sezerniert, entstanden durch proteolytische Spaltung in der Transformante. Im Falle des 740 Arg-1649 Glu-Faktors VIII:C scheint sich die proteolytische Spaltung überwiegend an der Peptidbindung zwischen Arg-740 und Glu-1649 zu ereignen, wo die zwei Ketten miteinander über eine Calcium-Ionen-Brücke verknüpft sind. Der erhaltene zweikettige aktive Faktor VIII:C scheint die gleiche Struktur zu besitzen, wie die aktive molekulare Spezies des Faktors VIII:C im menschlichen Blutplasma, wie von L.-O. Andersson et al. ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 2979-2983) entdeckt.
- Der Grad des proteolytischen Processing in der Transformante kann durch Optimierung der Züchtungsbedingungen kontrolliert werden.
- Das produzierte und im Kulturmedium angereicherte rekombinante Protein des Faktors VIII:C kann gereinigt werden und zwar durch Entfernen der Zellen aus dem Kulturmedium, Konzentrieren des Mediums und dem Aussetzen des Überstandes einer Kombination einer Vielzahl herkömmlicher Reinigungsverfahren und Strategien.
- Die herkömmlichen Reinigungsverfahren schließen ein Verfahren ein, das einen Unterschied der Löslichkeit nutzt (z.B. Aussalzen oder Ausfällen mit einem Lösungsmittel), ein Verfahren das einen Unterschied im Molekulargewicht nutzt (z.B. Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration oder SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese), ein Verfahren, das einen Unterschied in der elektrischen Ladung nutzt (z.B. Ionenaustauschchromatographie), ein Verfahren, das spezifische Affinität nutzt (z.B. Affinitäts-Chromatographie), ein Verfahren, das einen Unterschied in der Hydrophobizität nutzt (z . B. hochauflösende Umkehrphasen-Flüssig-Chromatographie) oder ein Verfahren, das einen Unterschied im isoelektrischen Punkt nutzt (z.B. isoelektrische Elektrophorese).
- Während der durch diese Erfindung hergestellte rekombinante menschliche Faktor VIII:C sowohl in einkettiger Form als auch in zweikettiger Form, wie sie produziert werden, verabreicht werden kann, soll deutlich gemacht werden, daß es zum Schutzbereich dieser Erfindung gehört, einen solchen rekombinanten Faktor VIII:C darreichen zu können, nachdem er einer proteolytischen Spaltung in vitro ausgesetzt wurde. Beispielsweise kann der einkettige rekombinante menschliche Faktor VIII:C, so wie er hergestellt wurde, in vitro in die entsprechende zweikettige Form gespalten werden und anschließend können die Ketten über eine Calcium- oder eine Brücke aus einem anderen Erdalkalimetall vor, während oder nach der Reinigung verknüpft werden. Der erfindungsgemäße rekombinante menschliche Faktor VIII:C kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren in geeignete Arzneimittel formuliert werden.
- Die bei der vorliegenden Erfindung gewonnene Lösung, die den rekombinanten menschlichen Faktor VIII:C enthält, kann gegebenenfalls gefriergetrocknet werden, um ein pulvriges Produkt zu erhalten. Die Gefriertrocknung kann in Gegenwart eines Stabilisators, wie Sorbit, Mannit, Dextrose, Maltose, Glycerin, menschliches Serumalbumin (HSA) oder einer Kombination davon, durchgeführt werden.
- Die erfindungsgemäßen Transformanten tierischer Zellen können den gewünschten rekombinanten menschlichen Faktor VIII:C in hoher Ausbeute konstant und kontinuierlich herstellen, können in einem billigen Medium schnell wachsen und können dauerhaft stetig vermehrt werden. So kann gemäß der vorliegenden Erfindung der gewünschte rekombinante menschliche Faktor VIII:C im industriellen Maßstab hergestellt werden. Insbesondere hat es die vorliegende Erfindung ermöglicht, im kommerziellen Maßstab einen rekombinanten Faktor VIII:C herzustellen, von dem man annimmt, daß er der kleinsten Species aktiver und intakter Faktor VIII:C-Moleküle im menschlichen Blutplasma entspricht. Der erfindungsgemäß hergestellte rekombinante menschliche Faktor VIII:C ist hilfreich zur Behandlung von Blutungen bei Hämophilie A- Patienten, denen es an Faktor VIII:C mangelt.
- Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die aber nicht die Erfindung begrenzen sollen.
- Die in den Beispielen verwendete Transformante E. coli HB101(RE), hergestellt durch Transformation mit dem in den Beispielen verwendeten Expressionsvektor-Plasmid Ad.RE.neo, wurde von Biogen Inc. als ATCC 53517 hinterlegt.
- In einer FALCON -Flasche (Kulturflasche, Züchtungsoberfläche: 150 cm²) wurden DHFR(-)-CHO-Zellen DG44 (vgl. G. Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 4216- 4220, und andere) in Ham's F12-Medium, mit 10 % fötalem Kälberserum, bei 37ºC über Nacht gezüchtet. Nach der Züchtung wurden die Zellen mit Trypsin abgelöst und das Plasmid Ad.RE.neo, das ein Expressionsvektor für den natürlichen aktiven menschlichen Faktor VIII:C ist (20 ug auf 3x10&sup6; Zellen), sowie das Plasmid pSV2-dhrf (vgl. Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864) (10 ug auf 3x10&sup6; Zellen) in die Zellen durch ein elektrophoretisches Verfahren von H. Potter et al. (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 7161-7165) eingeführt. Das Gemisch ließ man 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen und wurde danach in Ham's F12-Medium, mit 10 % fötalem Kälberserum, 2 Tage weitergezüchtet. Nach Ersetzen des Mediums durch Ham's F12-Medium für die Selektion von DHFR(+)-Zellen, welches 10 % dialysiertes fötales Kälberserum, aber kein Hypoxanthin, Glycin und Thymidin enthält, wurde die Züchtung bei 37ºC fortgesetzt; das Kulturmedium wurde währendessen in Intervallen von 3 bis 4 Tage ausgetauscht. Nach etwa 2 Wochen Züchtung ließ man die Zellen, die DHFR(+) geworden sind, Kolonien bilden.
- Die so gewonnenen DHFR(+)-transformierten Zellen wurden in einem zweiten Selektionsmedium, d.h. in Ham's F12-Medium, das 10 % fötales Kälberserum und G418 (Geneticin , hergestellt von GIBCO, 400 ug/ml) enthält, weitergezüchtet. Nach Züchtung der G148-resistenten Zellen für 1 bis 2 Wochen, ließ man die neo(+)-transformierten Zellen Kolonien bilden.
- Die Clonierung der neo(+)-, DHFR(+)-transformierten Zellen wurde mit einem bekannten Verfahren (z.B. Grenzverdünnungsverfahren) durchgeführt. Nach der Clonierung wurden die clonierten Zellen in Ham's F12-Medium mit 10 % dialysiertem fötalem Kälberserum und G418 (400 ug/ml, ohne Hypoxanthin, Glycin und Thymidin) gezüchtet. Die clonierten Zellen wurden abgetrennt und bis zu einer Konfluenz von etwa 80 % gezüchtet. Nach Austausch des alten Mediums gegen frisches Medium wurde die Züchtung für 48 Stunden fortgesetzt und die Aktivität des Faktors VIII:C im Kulturmedium durch ein Verfahren mit einem synthetischen Substrat (Verwendung von Coatest Faktor VIII:C, hergestellt von Kabi Vitrum) und die Gerinnungszeit von aktiviertem partiellem Thromboplastin ("activated partial thromboplastin coagulation time", APTT) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
- Die in Tabelle 1 aufgeführte Transformante RE.1A-3 wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, am 17. Februar 1988 mit der Hinterlegungsnummer FERM P-9873 (als CHO-TK- 0001) hinterlegt und bei derselben Hinterlegungseinrichtung unter dem Budapester Vertrag am 24. August 1988 als FERM BP- 2014 erneut hinterlegt. Tabelle 1 Transformanten Aktivität des Faktors VIII:C (mU/ml) Synthetisches Substrat-Verfahren
- Die in Beispiel 1 hergestellte CHO-Zellinie RE.1C-3, die fähig ist, den natürlichen aktiven menschlichen Faktor VIII:C (740 Arg-1649 Glu-Faktor VIII:C) zu produzieren, wurde in Ham's F12- Medium gezüchtet, das 20 nM Methotrexat (MTx), 10 % dialysiertes fötales Kälberserum und G148 (400 ug/ml), aber kein Hypoxanthin, Glycin und Thymidin enthielt. Die gewachsenen Zellen wurden bei stetig steigenden Konzentrationen von MTX im Medium subkultiviert, beginnend mit 100 nM und ansteigend bis 500 nM. Die MTX-resistenten Clone wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 gezüchtet und die Aktivität des Faktors VIII:C im Kulturmedium wurde genauso gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Aktivität des Faktors VIII:C (mU/ml) (gemessen mit dem synthetischen Substrat-Verfahren) Transformanten Original-Zellen (RE.1C-3) MTX 20 nM- resist. Zellen
- Die Aktivität des Faktors VIII:C im Kulturmedium der in Beispiel 1 hergestellen transformierten CHO-Zellinie RE.1C-3 und des Clons RE.1C-3(500), der von den MTX-resistenten (500 nM) Zellen in Beispiel 2 stammt, wurde über einen bestimmten Zeitraum gemessen.
- In einer Kulturflasche (Züchtungsoberfläche: 150 cm²) wurden CHO-Zellen RE.1C-3 und CHO-Zellen RE.IC-3(500) (jeweils 10&sup5; Zellen) in Ham's F12-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (30 ml) bei 37ºC in einem CO&sub2;- Brutschrank gezüchtet. Zwei Tage nach Beginn der Züchtung wurde die Zellzahl und die Aktivität des Faktors VIII:C in dem Kulturmedium jeden Tag überprüft. Die Ergebnisse sind in der beiliegenden Figur 3 dargestellt. Wie in Figur 3 dargestellt, reicherte sich der Faktor VIII:C in dem Kulturmedium bei Vermehrung der Zellen an und auch nachdem die Vermehrung der Zellen gestoppt wurde, wurde der Faktor VIII:C kontinuierlich hergestellt. Die maximale Aktivität in CHO-Zellen RE.1C-3 betrug 12,3 mU/ml und in CHO-Zellen RE.1C-3(500) 42 mU/ml.
- In einer Kulturflasche (Züchtungsoberfläche: 25 cm²) wurden DHFR(-)-CHO-Zellen DG44 und DHFR(-)-CHO-Zellen DXB11 bei 37ºC über Nacht in Nucleoside enthaltendem MEM-alpha- Medium (hergestellt von GIBCO) gezüchtet, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum. Nach der Züchtung wurden Ad.RE.neo (10 ug), linearisiert durch Verdauung mit Pvu I, und pSV2-dhfr (0.5 ug), linearisiert durch Verdauung mit Pvu I, in die erhaltenen Zellen mit Hilfe des DNA-Calciumphosphat-Co-Präzipitations-Verfahren von F.L. Graham et al. (vgl. Virology 52 (1973), 456) eingeführt.
- Nach der Gen-Einschleusung wurde das Medium durch frisches ersetzt und die Zellen bei 37ºC über Nacht inkübiert. Danach wurde das Medium durch ein Medium für die Selektion der DHFR(+)neo(+)-Zellinie, d.h. MEM-alpha-Medium, ergänzt mit 10 % dialysiertem fötalem Kälberserum und G418 (400 ug/ml), aber ohne Nucleoside (hergestellt durch GIBCO) ersetzt, und die Züchtung wurde bei 37ºC fortgesetzt. Nach etwa 2 Wochen Züchtung ließ man DHFR(+)neo(+)-Zellen Kolonien bilden.
- Die so isolierten DHFR(+)neo(+)-transformierten CHO- Zellen DG44 und CHO-Zellen DXB11 wurden in MEM-alpha-Medium, ergänzt mit 20 nM MTX, 10 % dialysiertem fötalem Kälberserum und G148 (400 ug/ml), aber ohne Nucleoside, gezüchtet. Die gewachsenen Zellen wurden kontinuierlich subkultiviert, indem sie schrittweise steigenden Konzentrationen von MTX im Medium, von 100 nM bis 500 nM, ausgesetzt wurden. Die Zellen wurden bis einer Konfluenz von etwa 80 % wachsen gelassen. Das Medium wurde durch frisches ersetzt und die Züchtung 3 Tage fortgesetzt, danach wurde die Aktivität des Faktors VIII:C im Kulturmedium mit dem synthetischen Substrat-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Aktivität des Faktors VIII:C (mU/ml) (gemessen mit dem synthetischen Substrat-Verfahren) Wirtszellen Originaltransformant MTX 20 nM-resist. Zellen CHO-Zellen DG44 CHO-Zellen DXB11
- Die DHFR(+)neo(+)-CHO-Zellen DG44 (MTX 500 nM-resistent) wurden cloniert, wobei die in Tabelle 4 aufgeführten CHO-Zellklone erhalten wurden, die den rekombinanten Faktor VIII:C (740 Arg-1649 Glu-Faktor VIII:C) in großen Mengen herstellen können. Tabelle 4 Clone Aktivität des Faktors VIII:C (U/ml(gemessen mit dem synthetischen Substrat-Verfahren)
- Wir isolierten ein Fragment des Dihydrofolat-Reduktase-Gens des dhfr-exprimierenden Plasmids pSV2-dhfr, wie in Beispiel 1 verwendet, durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen Pvu II und EcoR I und anschließendes Auffüllen des überhängenden 5'AATT-Endes mit T&sub4;-DNA-Polymerase, wobei DNA mit glattem Ende erhalten wurde. Durch Elektrophorese in einem 0.7 % igen Agarose-Gel wurde ein das dhfr-Gen tragende Fragment isoliert.
- Getrennt davon, wurde das den natürlichen aktiven menschlichen Faktor VIII:C exprimierende Plasmid Ad.RE.neo mit dem Restriktionsenzym Sma I verdaut und dann das dhfr-Gen- Fragment mit der T&sub4;-DNA-Ligase inseriert. Das entstandene Plasmid Ad.RE.dhfr ist ein Vektor, der imstande ist, das Gen des natürlichen aktiven menschlichen Faktors VIII:C und das Dihydrofolat-Reduktase-Gen zu exprimieren.
- Das Plasmid Ad.RE.dhfr wurde durch Verdauung mit dem Restriktionsenzym Pvu I linearisiert; die gewonnene lineare DNA (10 ug) wurde mit einer Träger-DNA (Kalbsthymus-DNA, 10 ug) in 0.25 M CaCl&sub2; (100 ul) gemischt und HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (100 ul) tropfenweise hinzugesetzt. Das so hergestellte DNA-Calciumphosphat-Komplex-Präzipitat wurde DHFR(-)-CHO-Zellen DG44 hinzugesetzt, die vorher in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, subkultiviert wurden.
- Die Zellen wurden 15 Stunden gezüchtet und das Medium danach durch MEM-alpha-Medium ersetzt, das keine Ribonucleoside und Desoxyribonucleoside enthielt (hergestellt durch GIBCO), ergänzt mit 10 % dialysiertem fötalem Kälber-serum (nachstehend bezeichnet als "ein Medium zur Selektion von dhfr-exprimierenden Zellen"); die Züchtung wurde fortgesetzt, wobei die DHFR(+)-transformierten CHO-Zellen RED44 erhalten wurden. Nach 12 Tagen Züchtung wurde die Aktivität des Faktors VIII:C im Kulturmedium mit einem synthetischen Substrat-Verfahren gemessen. Er wurde in einer Menge von 10 mU/ml exprimiert.
- Anschließend wurden die RED44-Zellen durch ein Grenzver-dünnungsverfahren cloniert.
- Nach der Clonierung wurden die Zellen auf einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen (hergestellt von Nunk) ausplattiert und in einem Medium zur Selektion von dhfr-exprimierenden Zellen (1 ml) gezüchtet. Wir ließen jede clonierte Zelle bis zur Konfluenz wachsen, dann wurde die Aktivität des Faktors VIII:C im Kulturmedium mit einem synthetischen Substrat-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Clone Aktivität des Faktors VIII:C (U/ml) (gemessen mit dem synthetischen Substrat-Verfahren)
- Vier in Beispiel 5 isolierte (in Tabelle 5 aufgeführt) Clone von CHO-Zellen RED44, die imstande sind, den rekombinanten Faktor VIII:C zu produzieren, wurden in eine FALCON -Kulturplatte mit 6 Vertiefungen übertragen und in dem Medium zur Selektion von DHFR-exprimierenden Zellen, mit 10 nM Methotrexat (MTX) gezüchtet. Die Zellen wurden in stetig ansteigenden Konzentrationen von MTX, beginnend mit 50 nM MTX und weiter bis zu 100 nM MTX, gezüchtet. Die Zellen ließ man bis zu 95 % Konfluenz wachsen und drei oder vier Tage nach dem Auswechseln des Mediums wurde die Aktivität des Faktors VIII:C im Kulturmedium genauso gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6 Aktivität des Faktors VIII:C (mU/ml) (gemessen mit dem synthetischen Substrat-Verfahren) Clone MTX Konzentrationen:
- Unter den CHO-Zellen, die imstande sind, den natürlichen aktiven menschlichen Faktor VIII:C herzustellen, wurde die in Tabelle 6 aufgeführte CHO-Zelle RED44.A7 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, am 11. März 1988 mit der Hinterlegungsnummer FERM P-9935 (als CHO RED44.A7) hinterlegt und am 25. August 1988 bei derselben Hinterlegungseinrichtung als FERM BP-2016 erneut hinterlegt.
- Die in Beispiel 5 clonierten MTX-resistenten CHO-Zellen RED44.A7, die imstande sind, den rekombinanten Faktor VIII:C zu produzieren, wurden in eine FALCON -Kulturplatte mit 6 Vertiefungen (#3046) überführt und in Gegenwart von 50 nM Methotrexat in dem Medium zur Selektion von DHFR-exprimierenden Zellen (4 ml) gezüchtet, dem gereinigter menschlicher von Willebrand-Faktor in einer Konzentration von 0, 1, 3 bzw. 10 U/ml hinzugefügt wurde. Während der Züchtung wurde in Abständen eine Probe des Kulturmediums entnommen und getestet.
- Die Aktivität des Faktors VIII:C in den Proben wurde mit einem synthetischen Substrat-Verfahren gemessen und der Gehalt an Faktor VIII:C-Antigen (Faktor VIII:C-Ag) unter Verwendung von anti-Faktor VIII:C monoclonalen Antikörpern in einem ELISA gemessen. Außerdem wurden Antigen-Gehalte des Faktor VIII:C-von Willebrand Faktor-Komplexes in einem ELISA gemessen, dabei wurde als erster Antikörper ein monoclonaler anti-menschlicher Faktor VIII:C-Antikörper verwendet und ein polyclonaler Kaninchen-anti-menschlicher von Willebrand Faktor-Antikörper (vgl. Acta Heamatol. Jpn. 50 (1987), 1681- 1688). Die mit dem synthetischen Substrat-Verfahren gemessenen Aktivitäten des Faktors VIII:C sind in der beigefügten Figur 5 dargestellt. Die mit ELISA gemessene Menge des Faktor VIII:C-Antigens und der mit ELISA gemessene Antigen-Gehalt des Faktor VIII:C-von Willebrand Faktor-Komplexes sind in Figur 6 bzw. in Figur 7 dargestellt.
- Die in Beispiel 5 hergestellten MTX-resistenten CHO- Zellen RED.44.A7, die imstande sind, den natürlichen aktiven menschlichen Faktor VIII:C zu produzieren, wurden in eine FALCON -Gewebekulturplatte mit 6 Vertiefungen überführt und 24 Stunden in dem Medium zur Selektion von DHFR-exprimierenden Zellen (3 ml) gezüchtet, das 50 nM Methotrexat enthielt. Das Medium wurde dann entfernt und die Zellen in einem im Handel erhältlichen serumfreien Medium (ASF-Medium 104, hergestellt von Ajinomoto Co., Inc., 3 ml) inkubiert. Während der Züchtung wurden in Abständen Proben des Kulturmediums entnommen und getestet. Die Aktivität des Faktors VIII:C in den Proben wurde dann mit einem synthetischen Substrat-Verfahren gemessen. In einem Kontrollversuch wurde ein herkömmliches, serumhaltiges Medium (MEM-alpha-Medium, mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS)) verwendet. Die vorstehenden Analysen wurden 3, 5 und 7 Tage nach dem Mediumwechsel gemacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 Aktivität des Faktors VIII:C (mUlml) (Synthetisches Substrat-Verfahren) Medium ASF-Medium 104 MEM-alpha-Medium mit 10 % FCS
- Außerdem wurden die MTX-resistenten CHO-Zellen RED44.A7 in der vorstehend beschriebenen Weise gezüchtet, mit dem Unterschied, daß dem serumfreien Medium verschiedene Zusätze hinzugefügt wurden, wie Polyethylenglykol (PEG) 20,000, Natriumselenit, E-Aminocapronsäure, Phenylmethansulfonyl-fluorid (PMSF), menschlicher von Willebrand-Faktor (h- vWF), Rinderserumalbumin (BSA), Aprotinin oder α-Cyclodextrin, und daß die Methotrexat-Konzentration 100 nM betrug; die Aktivität des Faktors VIII:C im Kulturmedium wurde während eines bestimmten Zeitraums mit einem synthetischen Substrat-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 bis Tabelle 11 dargestellt.
- Das Faktor VIII:C-Antigen wurde in einem ähnlichen Experiment unter Verwendung von Aprotinin untersucht, mit dem Ergebnis, daß die Expressionsrate nach der Zugabe von 100 bis 10000 KIU/ml zwei oder dreimal höher ist, als bei der Kontrolle ohne Zusatz von Aprotinin. Tabelle 8 (Wirkungen jedes Zusatzes zum serumfreien Medium) Aktivität des Faktors VIII:C (mU/ml) (Synthetisches Substrat-Verfahren) Zusätze PEG 20.000 (0.1 %) Natriumselenit (13 ug/ml) PEG + Natriumselenit α-Cyclodextrin (0.1 %) ohne Zusatz Tabelle 9 ( Wirkungen des Zusatz von ε-Aminocapronsäure zum serumfreien Medium) Aktivität des Faktors VIII:C (mU/ml) (Synthetisches Substrat-Verfahren) Zusätze 1 mM ε-Aminocapronsäure ohne Zusatz Tabelle 10 (Wirkungen des Zusatz von PMSF u. h-vWF zum serumfreien Medium) Aktivität des Faktors VIII:C (mU/ml) (Synthetisches Substrat-Verfahren) Zusätze ohne Zusatz Tabelle 11 (Wirkungen des Zusatz von BSA zum serumfreien Medium, bei 2 Tagen Züchtung) Konzentration von BSA (ug/ml) Aktivität des Faktors VIII:C (mU/ml) (Synthetisches Substrat-Verfahren)
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der
Aktivität des menschlichen Faktors VIII:C, das aus der
schweren und leichten Kette des menschlichen Faktors VIII:C
besteht, durch Züchtung von transformierten tierischen
Zellen in einem Nährmedium, welche einen
Expressionsvektor enthalten, umfassend
die DNA-Sequenzen, die der schweren und leichten Kette
entsprechen, welche zu einer Signalpeptidsequenz
verknüpft sind,
mindestens einen Promotor stromaufwärts davon, und
mindestens einen Enhancer,
und Gewinnung des Proteins mit der Aktivität des
menschlichen Faktors VIII:C, das sich im Nährmedium
angereichert hat,
dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung unter Zugabe
von Albumin, Polyethylenglykol, Natriumselenit,
ε-Aminocapronsäure, Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF),
Aprotinin oder Cyclodextrinen zum Nährmedium durchgeführt
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Züchtung des
Transformanten unter Bedingungen durchgeführt wird, die für
die Induktion einer Genamplifikation geeignet sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Züchtung des
Transformanten in einem serumfreien Medium durchgeführt
wird.
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