WO2016121768A1 - 物質の産生方法 - Google Patents

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WO2016121768A1
WO2016121768A1 PCT/JP2016/052207 JP2016052207W WO2016121768A1 WO 2016121768 A1 WO2016121768 A1 WO 2016121768A1 JP 2016052207 W JP2016052207 W JP 2016052207W WO 2016121768 A1 WO2016121768 A1 WO 2016121768A1
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cells
cell
polyimide porous
porous membrane
culture
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萩原　昌彦
基久 清水
幸周 和田
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宇部興産株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a substance using cells.
  • Cell culture and substance-producing cells generally exist as a group having a three-dimensional structure in vivo.
  • the cells when culturing cells in an artificial environment, the cells are dispersed in a classic planar culture method in which cells are two-dimensionally cultured in a single layer attached to the bottom of the culture vessel or in a liquid culture medium.
  • a suspension culture method for culturing in a state is generally used.
  • the cells used in the planar culture method cells with relatively high adhesion are suitable, but even when suitable cells are used, the properties of the cells may greatly change due to differences in the culture environment.
  • the suspension culture method there are suitable cells and unsuitable cells.
  • microcarriers As a typical cell culture carrier, microcarriers, which are small particles capable of attaching and growing cells, are widely studied (Patent Document 3). Many types of microcarriers have been researched and developed, and many are commercially available. It is widely used in the production of vaccines and proteins, and is widely adopted as a methodology as a system that can withstand scale-up.
  • microcarrier culture there is an upper limit in the amount of cell culture because microcarriers need to be sufficiently stirred and diffused and do not aggregate.
  • it is necessary to carry out complicated work in terms of methodology for example, in order to separate the carrier itself, it is necessary to separate fine particles with a filter or the like that separates fine particles.
  • the shape since the shape is limited to the particulate matter called microcarrier, the property that comes from the shape is inevitable.
  • a method of continuously culturing large amounts of spheroid-shaped cells by a three-dimensional culture method using methylcellulose or gellan gum has also been found.
  • a bioreactor or the like using a cellulose sponge a large amount of cell culture can surely be performed.
  • there are many operational restrictions such as a large closed system and inability to easily contact the culture environment.
  • the polyimide porous membrane polyimide is a general term for polymers containing an imide bond in a repeating unit.
  • the aromatic polyimide means a polymer in which aromatic compounds are directly linked by an imide bond.
  • Aromatic polyimide has a conjugated structure through the imide bond between aromatic and aromatic, so it has a rigid and strong molecular structure, and the imide bond has a strong intermolecular force, so it has a very high level of heat. Has mechanical, mechanical and chemical properties.
  • Patent Documents 6 to 8 are particularly excellent in permeability of substances such as gas, high porosity, excellent smoothness of both surfaces, relatively high in strength, and in the direction of film thickness despite high porosity.
  • a polyimide porous membrane having a large number of macrovoids having excellent proof stress against compressive stress is described. These are all polyimide porous membranes prepared via an amic acid.
  • the present invention aims to provide a method for producing a substance using cells, a substance production apparatus, a kit, and use.
  • the present inventors have made a cell using a polyimide porous membrane.
  • a cell using a polyimide porous membrane By culturing, it was found that a large number of cells can be cultured in a limited space without special pretreatment, etc., and by utilizing its high-density culture characteristics, efficient substance production can be realized,
  • the present invention has been conceived. Therefore, the present invention is characterized by culturing cells using a polyimide porous membrane.
  • Cells grow stably and three-dimensionally by utilizing the large-diameter connection holes through which the cells can pass, and even if the cells contain a large amount of cells compared to planar culture, By ensuring that the connection hole is in contact with the culture medium, the growth can be continued stably. Similar structural characteristics contribute to the production of substances such as proteins and viruses, and the production substances can be efficiently supplied to the medium. Furthermore, due to the thin film properties, flexible properties, shape stability, and free formability of the polyimide porous membrane, it is possible to coexist a large amount of sheets in a small unit space and to stack a large number of membranes.
  • the sheet can be sterilized simply and quickly by a plurality of means. Furthermore, the three-dimensional scaffold structure of the polyimide porous membrane is expected to increase the amount of substance production per cell when compared with planar culture.
  • this invention preferably includes the following aspects.
  • a method for producing a substance using a cell comprising applying the cell to a polyimide porous membrane, culturing the cell, and producing the substance by the cell.
  • the substance is selected from the group consisting of proteins, glycoproteins and viruses.
  • Aspect 3 The method according to embodiment 1 or 2, wherein the cells are cultured under stationary culture conditions.
  • Aspect 4 The method according to embodiment 1 or 2, wherein the cells are cultured under rotating culture or stirring conditions.
  • Aspect 5 The method according to embodiment 1 or 2, wherein the cells are continuously cultured.
  • the cell culture device is A culture unit containing one or more polyimide porous membranes for supporting cells, the culture unit having a medium supply port and a medium discharge port;
  • a culture medium supply unit comprising a culture medium storage container, a culture medium supply line, and a liquid feed pump for feeding the culture medium through the culture medium supply line, wherein the first end of the culture medium supply line is a culture medium storage container
  • a medium supply unit in contact with the medium in the medium, and the second end of the medium supply line communicates with the culture unit via the medium supply port of the culture unit;
  • the method of embodiment 5, comprising: [Aspect 7] The method according to aspect 6, wherein the cell culture device does not have an air supply port, an air discharge port, and an oxygen permeable membrane.
  • the polyimide porous membrane is a polyimide porous membrane containing polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine.
  • Coloring obtained by forming a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine and a colored precursor, and then heat-treating at 250 ° C. or higher.
  • the polyimide porous membrane is a multilayer porous polyimide membrane having two different surface layers and a macrovoid layer.
  • Animal cells are Chinese hamster ovary tissue-derived cells (CHO cells), African green monkey kidney-derived cell lines (Vero cells), human liver cancer-derived cells (HepG2 cells), canine kidney tubular epithelial cell-derived cell lines (MDCK cells) And the method according to aspect 15 or 16, wherein the method is selected from the group consisting of a human liver cancer tissue-derived established cell line (huGK-14).
  • the bacterium is selected from the group consisting of lactic acid bacteria, E. coli, Bacillus subtilis and cyanobacteria.
  • the present invention relates to a method for producing a substance using cells.
  • the method of the present invention includes applying cells to a polyimide porous membrane, culturing the cells, and producing substances by the cells.
  • Cells The types of cells that can be used in the method of the present invention are not particularly limited, and can be used for the growth of arbitrary cells.
  • the cells are selected from the group consisting of animal cells, insect cells, plant cells, yeasts and bacteria.
  • Animal cells are roughly classified into cells derived from animals belonging to the vertebrate phylum and cells derived from invertebrates (animals other than animals belonging to the vertebrate phylum).
  • the origin of the animal cell is not particularly limited.
  • Vertebrates include the maxilla and maxilla, and the maxilla includes mammals, birds, amphibians, reptiles, and the like.
  • it is a cell derived from an animal belonging to the mammal class generally called a mammal. Mammals are not particularly limited, but preferably include mice, rats, humans, monkeys, pigs, dogs, sheep, goats and the like.
  • animal cells are preferably, for example, Chinese hamster ovary tissue-derived cells (CHO cells), African green monkey kidney-derived cell lines (Vero cells), human hepatoma-derived cells (HepG2 cells) ), Canine kidney tubular epithelial cell-derived cell line (MDCK cell), human hepatoma tissue-derived established cell line (huGK-14), normal human fibroblast-like synoviocytes (HFLS cells), and fibers from patients with rheumatoid arthritis Cells selected from the group consisting of blast-like synoviocytes (HFLS-RA cells) are used.
  • CHO cells Chinese hamster ovary tissue-derived cells
  • Vero cells African green monkey kidney-derived cell lines
  • HepG2 cells human hepatoma-derived cells
  • MDCK cell human hepatoma tissue-derived established cell line
  • HFLS cells normal human fibroblast-like synoviocytes
  • fibers from patients with rheumatoid arthritis Cells selected from the group consisting of
  • Plant cells including moss plants, fern plants, and seed plants are targeted.
  • Plants from which seed plant cells are derived include monocotyledonous plants and dicotyledonous plants.
  • monocotyledonous plants include orchids, gramineous plants (rice, corn, barley, wheat, sorghum, etc.), cyperaceae plants, and the like.
  • Dicotyledonous plants include plants belonging to many subclasses such as Chrysanthemum, Magnolia, and Rose.
  • Algae can also be regarded as cell-derived organisms. Different from eubacteria, cyanobacteria (Cyanobacteria), eukaryotes that are unicellular (diatoms, yellow green algae, dinoflagellates, etc.) and multicellular organisms, seaweeds (red algae, brown algae, green algae) Includes groups.
  • the archaea and the types of bacteria in this specification are not particularly limited.
  • the archaea is composed of a group consisting of methane bacteria, highly halophilic bacteria, thermophilic acidophiles, hyperthermophilic bacteria, and the like.
  • the bacterium is selected from the group consisting of lactic acid bacteria, Escherichia coli, Bacillus subtilis, cyanobacteria and the like.
  • animal cells or plant cells that can be used in the method of the present invention are not limited, but are preferably selected from the group consisting of pluripotent stem cells, tissue stem cells, somatic cells, and germ cells.
  • pluripotent stem cell is intended to be a generic term for stem cells having the ability to differentiate into cells of any tissue (differentiation pluripotency).
  • the pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic germ stem cells (EG cells), germ stem cells (GS cells), and the like. .
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • EG cells embryonic germ stem cells
  • GS cells germ stem cells
  • Any known pluripotent stem cell can be used.
  • the pluripotent stem cell described in International Publication WO2009 / 123349 PCT / JP2009 / 057041
  • PCT / JP2009 / 057041 can be used.
  • tissue stem cell means a stem cell that has the ability to differentiate into various cell types (differentiated pluripotency) although the cell line that can be differentiated is limited to a specific tissue.
  • hematopoietic stem cells in the bone marrow become blood cells, and neural stem cells differentiate into nerve cells.
  • the tissue stem cells are selected from mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, neural stem cells, skin stem cells, or hematopoietic stem cells.
  • somatic cells refers to cells other than germ cells among the cells constituting multicellular organisms. In sexual reproduction, it is not passed on to the next generation.
  • the somatic cells are hepatocytes, pancreatic cells, muscle cells, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, adipocytes, skin cells, fibroblasts, pancreatic cells, kidney cells, lung cells, or , Lymphocytes, erythrocytes, leukocytes, monocytes, macrophages or megakaryocyte blood cells.
  • Reproductive cells means cells that have a role in transmitting genetic information to the next generation in reproduction. For example, it includes gametes for sexual reproduction, ie eggs, egg cells, sperm, sperm cells, follicular spores for asexual reproduction, and the like.
  • the cells may be selected from the group consisting of sarcoma cells, established cells and transformed cells.
  • “Sarcoma” is a cancer that develops in connective tissue cells derived from non-epithelial cells such as bone, cartilage, fat, muscle, blood, etc., and includes soft tissue sarcoma, malignant bone tumor and the like.
  • Sarcoma cells are cells derived from sarcomas.
  • the “established cell” means a cultured cell that has been maintained outside the body for a long period of time, has a certain stable property, and is capable of semi-permanent subculture.
  • PC12 cells derived from rat adrenal medulla
  • CHO cells derived from Chinese hamster ovary
  • HEK293 cells derived from human fetal kidney
  • HL-60 cells derived from human white blood cells
  • HeLa cells derived from human cervical cancer
  • Vero cells There are cell lines derived from various tissues of various biological species including humans (derived from African green monkey kidney epithelial cells), MDCK cells (derived from canine kidney tubular epithelial cells), HepG2 cells (derived from human liver cancer).
  • a “transformed cell” means a cell in which a nucleic acid (DNA or the like) has been introduced from the outside of the cell to change its genetic properties.
  • the cell is not particularly limited as long as it can express a desired substance.
  • the substance may be naturally expressed in the cell, or may be transformed to produce the substance by genetic engineering techniques.
  • the cell has been transformed by genetic engineering techniques to express the substance.
  • Appropriate methods are known for transformation of animal cells, plant cells, and bacteria.
  • the kind of substance that can be produced in the cell by the method of the present invention is not particularly limited as long as it can be produced naturally in the cell or by genetic engineering techniques.
  • said substance is selected from the group consisting of proteins (including polypeptides), glycoproteins and viruses.
  • proteins include bioactive proteins such as erythropoietin, insulin, albumin, tumor necrosis factor ⁇ , interleukin 6 (IL-6), interleukin 8 (IL-8), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF). ), Monoclonal antibodies including cytokines such as interferon, enzymes such as thrombin and trypsin, and antibody drugs. Preferred are bioactive proteins and monoclonal antibodies.
  • glycoproteins examples include collagen, fibronectin, hyaluronic acid and the like. Preferably, it is fibronectin.
  • viruses examples include influenza viruses, adenoviruses, etc.
  • it is an influenza virus.
  • substances naturally expressed in specific cells of the present invention include antibody drugs expressed by transformed cells, human collagen and fibronectin expressed by human skin fibroblasts.
  • Polyimide Porous Membrane Polyimide is a general term for polymers containing imide bonds in repeating units, and usually means an aromatic polyimide in which aromatic compounds are directly linked by imide bonds.
  • Aromatic polyimide has a conjugated structure through the imide bond between aromatic and aromatic, so it has a rigid and strong molecular structure, and the imide bond has a strong intermolecular force, so it has a very high level of heat. Has mechanical, mechanical and chemical properties.
  • the polyimide porous membrane used in the present invention is a polyimide porous membrane containing a polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine (as a main component), more preferably from tetracarboxylic dianhydride and diamine.
  • This is a polyimide porous membrane made of the resulting polyimide.
  • “Containing as a main component” means that a component other than polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine may be essentially not included or included as a component of the polyimide porous membrane. It means that it is an additional component that does not affect the properties of the polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine.
  • the polyimide porous membrane used in the present invention is obtained by molding a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from a tetracarboxylic acid component and a diamine component and a colored precursor, and then heat-treating the composition at 250 ° C. or higher. The resulting colored polyimide porous membrane is also included.
  • Polyamic acid A polyamic acid is obtained by polymerizing a tetracarboxylic acid component and a diamine component.
  • Polyamic acid is a polyimide precursor that can be ring-closed to form polyimide by thermal imidization or chemical imidization.
  • the polyamic acid even if a part of the amic acid is imidized, it can be used as long as it does not affect the present invention. That is, the polyamic acid may be partially thermally imidized or chemically imidized.
  • fine particles such as an imidization catalyst, an organic phosphorus-containing compound, inorganic fine particles, and organic fine particles can be added to the polyamic acid solution as necessary.
  • fine particles such as a chemical imidating agent, a dehydrating agent, inorganic fine particles, and organic fine particles, etc. can be added to a polyamic acid solution as needed. Even when the above components are added to the polyamic acid solution, it is preferable that the coloring precursor is not precipitated.
  • Colored precursor used in the present invention means a precursor that is partially or wholly carbonized by heat treatment at 250 ° C. or higher to produce a colored product.
  • the colored precursor used in the present invention is uniformly dissolved or dispersed in a polyamic acid solution or a polyimide solution, and heat treatment at 250 ° C. or higher, preferably 260 ° C. or higher, more preferably 280 ° C. or higher, more preferably 300 ° C. or higher.
  • heat treatment at 250 ° C. or higher, preferably 260 ° C. or higher, more preferably 280 ° C. or higher, more preferably 300 ° C. or higher in the presence of oxygen such as air to produce a colored product by carbonization
  • oxygen such as air
  • the carbon-based coloring precursor is not particularly limited.
  • polymers such as petroleum tar, petroleum pitch, coal tar, coal pitch, or polymers obtained from monomers including pitch, coke, and acrylonitrile, ferrocene compounds (ferrocene and ferrocene derivatives). Etc.
  • the polymer and / or ferrocene compound obtained from the monomer containing acrylonitrile are preferable, and polyacrylonitrile is preferable as a polymer obtained from the monomer containing acrylonitrile.
  • tetracarboxylic dianhydride any tetracarboxylic dianhydride can be used, and can be appropriately selected according to desired characteristics.
  • tetracarboxylic dianhydride include pyromellitic dianhydride, 3,3 ′, 4,4′-biphenyltetracarboxylic dianhydride (s-BPDA), 2,3,3 ′, 4 ′.
  • -Biphenyltetracarboxylic dianhydride such as biphenyltetracarboxylic dianhydride (a-BPDA), oxydiphthalic dianhydride, diphenylsulfone-3,4,3 ', 4'-tetracarboxylic dianhydride, bis (3,4-dicarboxyphenyl) sulfide dianhydride, 2,2-bis (3,4-dicarboxyphenyl) -1,1,1,3,3,3-hexafluoropropane dianhydride, 2, 3,3 ′, 4′-benzophenone tetracarboxylic dianhydride, 3,3 ′, 4,4′-benzophenone tetracarboxylic dianhydride, bis (3,4-dicarboxyphenyl) methane dianhydride 2,2-bis (3,4-dicarboxyphenyl) propane dianhydride, p-phenylenebis (trimellitic acid monoester acid an
  • At least one aromatic tetracarboxylic dianhydride selected from the group consisting of biphenyltetracarboxylic dianhydride and pyromellitic dianhydride is particularly preferable.
  • the biphenyltetracarboxylic dianhydride 3,3 ′, 4,4′-biphenyltetracarboxylic dianhydride can be suitably used.
  • diamines include the following. 1) One benzene nucleus such as 1,4-diaminobenzene (paraphenylenediamine), 1,3-diaminobenzene, 2,4-diaminotoluene, 2,6-diaminotoluene, etc .; 2) 4,4'-diaminodiphenyl ether, diaminodiphenyl ether such as 3,4'-diaminodiphenyl ether, 4,4'-diaminodiphenylmethane, 3,3'-dimethyl-4,4'-diaminobiphenyl, 2,2'- Dimethyl-4,4′-diaminobiphenyl, 2,2′-bis (trifluoromethyl) -4,4′-diaminobiphenyl, 3,3′-dimethyl-4,4′-diaminodiphenylmethane, 3,3′- Dicar
  • diamine to be used can be appropriately selected according to desired characteristics.
  • aromatic diamine compounds are preferable, and 3,3′-diaminodiphenyl ether, 3,4′-diaminodiphenyl ether, 4,4′-diaminodiphenyl ether and paraphenylenediamine, 1,3-bis (3-aminophenyl) Benzene, 1,3-bis (4-aminophenyl) benzene, 1,4-bis (3-aminophenyl) benzene, 1,4-bis (4-aminophenyl) benzene, 1,3-bis (4-amino) Phenoxy) benzene and 1,4-bis (3-aminophenoxy) benzene can be preferably used.
  • at least one diamine selected from the group consisting of benzenediamine, diaminodiphenyl ether and bis (aminophenoxy) phenyl is preferred.
  • the polyimide porous membrane used in the present invention is a tetracarboxylic acid having a glass transition temperature of 240 ° C. or higher or no clear transition point at 300 ° C. or higher from the viewpoint of heat resistance and dimensional stability at high temperatures. It is preferably formed from polyimide obtained by combining dianhydride and diamine.
  • the polyimide porous membrane used in the present invention is preferably a polyimide porous membrane made of the following aromatic polyimide from the viewpoints of heat resistance and dimensional stability at high temperatures.
  • an aromatic polyimide comprising at least one tetracarboxylic acid unit selected from the group consisting of a biphenyltetracarboxylic acid unit and a pyromellitic acid unit, and an aromatic diamine unit
  • an aromatic polyimide comprising a tetracarboxylic acid unit and at least one aromatic diamine unit selected from the group consisting of a benzenediamine unit, a diaminodiphenyl ether unit and a bis (aminophenoxy) phenyl unit
  • a polyimide porous film a polyimide having a multilayer structure having at least two surface layers (A surface and B surface) and a macrovoid layer sandwiched between the two surface layers Porous membranes can be used in the present invention.
  • the polyimide porous film is a film in which the macrovoid layer is surrounded by a partition wall bonded to the surface layer (A surface and B surface), and the partition wall and the surface layer (A surface and B surface).
  • a plurality of macrovoids having an average pore diameter in the plane direction of 10 to 500 ⁇ m, and the partition walls of the macrovoid layer and the surface layers (A surface and B surface) each have a thickness of 0.01 to 20 ⁇ m.
  • the polyimide porous film has a total film thickness of 5 to 500 ⁇ m and a porosity of 40% or more and less than 95%.
  • the total film thickness of the polyimide porous film used in the present invention is not limited, but may be 20 to 75 ⁇ m as one aspect. Due to the difference in film thickness, differences in cell growth rate, cell morphology, in-plane cell saturation, etc. can be observed.
  • the average hole diameter of the holes may be different from the average hole diameter of the holes existing on the B surface.
  • the average pore diameter of the holes present on the A plane is smaller than the average pore diameter of the holes present on the B plane.
  • the average pore diameter of the holes existing on the A plane is smaller than the average pore diameter of the holes existing on the B plane, and the average pore diameter of the holes existing on the A plane is 0.01 to 50 ⁇ m, 0.01 ⁇ m to 40 ⁇ m, 0 0.01 ⁇ m to 30 ⁇ m, 0.01 ⁇ m to 20 ⁇ m, or 0.01 ⁇ m to 15 ⁇ m, and the average pore diameter of the holes present on the B surface is 20 ⁇ m to 100 ⁇ m, 30 ⁇ m to 100 ⁇ m, 40 ⁇ m to 100 ⁇ m, 50 ⁇ m to 100 ⁇ m, or 60 ⁇ m to 100 ⁇ m It is.
  • the A surface has a mesh structure having small holes with an average pore diameter of 15 ⁇ m or less, for example, 0.01 ⁇ m to 15 ⁇ m
  • the B surface has a large hole structure with an average pore diameter of 20 ⁇ m or more, for example, 20 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the cells are seeded from the A surface even if they are seeded from the A surface. And preferably the cells are seeded from the A side.
  • the total film thickness of the polyimide porous membrane used in the present invention can be measured with a contact-type thickness meter.
  • the average pore diameter on the surface of the polyimide porous membrane was determined by measuring the pore area of 200 or more apertures from the scanning electron micrograph on the surface of the porous membrane, and calculating the pore size according to the following formula (1) from the average value of the pore area.
  • the average diameter when the shape is assumed to be a perfect circle can be obtained by calculation.
  • Sa means the average value of the pore area.
  • the porosity of the polyimide porous membrane used in the present invention can be determined from the mass per unit area according to the following formula (2) by measuring the thickness and mass of the porous film cut into a predetermined size.
  • S is the area of the porous film
  • d is the total film thickness
  • w is the measured mass
  • D is the polyimide density.
  • the polyimide density is 1.34 g / cm 3 ).
  • polyimide porous film described in International Publication WO2010 / 038873, JP2011-219585A, or JP2011-219586 can also be used in the present invention.
  • the polyimide porous membrane to which the cells are applied in the method of the present invention does not contain biological components other than the cells to be loaded, that is, is sterilized.
  • the method of the present invention preferably includes a step of pre-sterilizing the polyimide porous membrane.
  • the polyimide porous membrane is extremely excellent in heat resistance, is lightweight, can be freely selected in shape and size, and is easy to sterilize. Arbitrary sterilization treatments such as dry heat sterilization, steam sterilization, sterilization with a bactericide such as ethanol, and electromagnetic wave sterilization including UV and gamma rays are possible.
  • Cells seeded on the surface of the polyimide porous membrane can stably grow and proliferate on the surface and / or inside of the membrane.
  • Cells can take a variety of different forms depending on where they grow and proliferate in the membrane.
  • the cells may proliferate while changing the shape while moving on and inside the polyimide porous membrane.
  • A an embodiment comprising a step of seeding cells on the surface of the polyimide porous membrane;
  • B Place a cell suspension on the dried surface of the polyimide porous membrane, Leave or move the polyimide porous membrane to promote fluid outflow, or stimulate a portion of the surface to draw cell suspension into the membrane; and The cells in the cell suspension are retained in the membrane, and the water flows out.
  • An embodiment comprising steps; and
  • C Wet one side or both sides of the polyimide porous membrane with a cell culture medium or a sterilized liquid, Loading the wet polyimide porous membrane with a cell suspension; and The cells in the cell suspension are retained in the membrane, and the water flows out.
  • a mode comprising the steps.
  • the mode includes directly seeding cells and cell clusters on the surface of the polyimide porous membrane. Or the aspect which puts a polyimide porous membrane in a cell suspension and infiltrate a cell culture solution from the surface of a membrane is also included.
  • the cells seeded on the surface of the polyimide porous membrane adhere to the polyimide porous membrane and enter the inside of the porous body.
  • the cells spontaneously adhere to the polyimide porous membrane without any physical or chemical force applied from the outside.
  • Cells seeded on the surface of the polyimide porous membrane can grow and proliferate stably on the surface and / or inside of the membrane. Cells can take a variety of different forms depending on the location of the membrane in which they grow and multiply.
  • a cell suspension is placed on the dried surface of the polyimide porous membrane.
  • the cell suspension is sucked into the membrane, Cell suspension penetrates into the membrane. Without being bound by theory, it is considered that this is due to the properties derived from the surface shape of the polyimide porous membrane.
  • the cells are sucked and seeded at the portion of the membrane where the cell suspension is loaded.
  • one or both sides or the whole of the polyimide porous membrane is wetted with a cell culture medium or a sterilized liquid, and then the suspended polyimide porous membrane is subjected to cell suspension.
  • the liquid may be loaded. In this case, the passage speed of the cell suspension is greatly improved.
  • a method of wetting a part of the membrane electrode for the main purpose of preventing the scattering of the membrane (hereinafter referred to as “one-point wet method”) can be used.
  • the one-point wet method is substantially similar to the dry method (the embodiment (B)) that does not substantially wet the film.
  • a method in which a cell suspension is loaded into a fully porous one or both surfaces of a polyimide porous membrane hereinafter referred to as “wet membrane”).
  • this Is described as “wet film method”.
  • the passage speed of the cell suspension is greatly improved in the entire polyimide porous membrane.
  • the cells in the cell suspension are retained in the membrane and the water is allowed to flow out.
  • processing such as concentrating the concentration of cells in the cell suspension or allowing unnecessary components other than cells to flow out together with moisture.
  • the mode of (A) may be referred to as “natural sowing” (B) and the mode of (C) as “suction sowing”.
  • living cells remain selectively in the polyimide porous membrane. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, living cells remain in the polyimide porous membrane, and dead cells preferentially flow out with moisture.
  • the sterilized liquid used in the embodiment (C) is not particularly limited, but is a sterilized buffer or sterilized water.
  • the buffer include (+) and ( ⁇ ) Dulbecco ’s PBS, (+) and ( ⁇ ) Hank's Balanced Salt Solution. Examples of buffer solutions are shown in Table 1 below.
  • the application of the cells to the polyimide porous membrane is an embodiment in which cells are attached to the membrane by allowing the adhesive cells in a suspended state to coexist with the polyimide porous membrane (entanglement). )
  • a cell culture medium, cells and one or more of the polyimide porous membranes may be placed in a cell culture vessel in order to apply the cells to the polyimide porous membrane.
  • the cell culture medium is liquid
  • the polyimide porous membrane is in a suspended state in the cell culture medium. Due to the nature of the polyimide porous membrane, cells can adhere to the polyimide porous membrane.
  • the polyimide porous membrane can be cultured in a suspended state in the cell culture medium.
  • the cells spontaneously adhere to the polyimide porous membrane. “Spontaneously adheres” means that the cells remain on or inside the polyimide porous membrane without any physical or chemical force applied from the outside.
  • the present invention includes culturing cells applied to a polyimide porous membrane and producing substances by the cells.
  • cultured cells can be classified into adhesion culture cells and suspension culture cells depending on the form of cell culture.
  • Adherent culture cells are cultured cells that adhere to a culture vessel and proliferate, and the medium is changed during passage.
  • Floating culture cells are cultured cells that proliferate in a floating state in a medium. In general, dilution culture is performed without replacing the medium during passage.
  • Suspension culture can be cultured in a floating state, that is, in a liquid state, so that it can be cultured in large quantities. Compared with adherent cells that grow only on the surface of the culture vessel, it is a three-dimensional culture. There is an advantage that the number of cells that can be cultured is large.
  • the polyimide porous membrane when used in a suspended state in the cell culture medium, two or more pieces of the polyimide porous membrane may be used. Since the polyimide porous membrane is a flexible thin film, for example, it is possible to bring a polyimide porous membrane having a large surface area into a certain volume of cell culture medium by using small pieces suspended in the culture medium. Become. In the case of normal culture, the bottom area of the container is the upper limit of the cell culture area, but in the cell culture using the polyimide porous membrane of the present invention, all of the large surface area of the previously introduced polyimide porous membrane is the cell. It becomes the area that can be cultured. Since the polyimide porous membrane allows the cell culture solution to pass therethrough, for example, nutrients, oxygen and the like can be supplied into the folded membrane.
  • the size and shape of the polyimide porous membrane pieces are not particularly limited.
  • the shape can take any shape such as a circle, an ellipse, a square, a triangle, a polygon, and a string.
  • the polyimide porous membrane of the present invention has flexibility, it can be used by changing its shape.
  • the polyimide porous membrane may be processed into a three-dimensional shape instead of a flat shape.
  • a polyimide porous membrane is i) folded and ii) rolled into a roll, iii) a sheet or piece is connected with a thread-like structure, or iv) tied in a rope shape in a cell culture vessel May be suspended or fixed in the cell culture medium.
  • many polyimide porous membranes can be placed in a fixed volume of cell culture medium, as in the case of using small pieces.
  • each piece can be handled as an aggregate, cell bodies can be aggregated and moved, and the overall applicability is high.
  • two or more polyimide porous membranes may be used by being laminated in a cell culture medium vertically or horizontally.
  • Lamination also includes a mode in which the polyimide porous membranes partially overlap. Stacked culture enables cells to be cultured at high density in a narrow space. It is also possible to form a multilayer system with different types of cells by further stacking the membranes on the membrane where the cells are already grown.
  • the number of polyimide porous membranes to be laminated is not particularly limited.
  • the cell culture methods described above may be used in combination of two or more methods.
  • the cells may be first applied to the polyimide porous membrane using any one of the methods (A) to (C), and then the polyimide porous membrane to which the cells are adhered may be subjected to suspension culture.
  • any one of the methods (A) to (C) may be used in combination of two or more.
  • the cells grow and proliferate on and inside the polyimide porous membrane.
  • the cells can continue to grow for 2 days or more, more preferably 4 days or more, and even more preferably 6 days or more.
  • a large amount of cells can be efficiently cultured while the amount of the medium used for cell culture is significantly reduced as compared with the conventional method. For example, even if a part or the whole of the polyimide porous membrane is not in contact with the liquid phase of the cell culture medium, a large amount of cells can be cultured.
  • the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel can be significantly reduced as compared with the conventional method with respect to the total volume of the polyimide porous membrane including the cell survival area.
  • the cells can be cultured well over a long period of time even under conditions where the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 1000 times or less than the total volume of the polyimide porous membrane including the cell survival area. . Furthermore, even when the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture container is 100 times or less than the total volume of the polyimide porous membrane including the cell survival area, the cells can be cultured well over a long period of time. . And even if the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture container is 10 times or less than the total volume of the polyimide porous membrane including the cell survival area, the cells can be cultured well over a long period of time. .
  • cells are cultured in a polyimide porous membrane without forming a cell mass (spheroid). Under such culture conditions, the cells can grow stably for a long period of time without detachment, so that the produced substance can be obtained as a clarified liquid.
  • the polyimide porous membrane can be frozen and stored with a large amount of cells. Furthermore, the polyimide porous membrane can be thawed at any time and used for protein production without going through a pre-culture process. Even after the freezing and thawing steps, the cell's ability to produce substances does not decrease. Conventionally, in order to use thawed cells, it has been necessary to pre-cultivate the thawed cells and culture the living cells on a desired substrate or carrier.
  • the cells can be cultured, frozen, stored, thawed, and re-cultured while the cells are adhered to the polyimide porous membrane without going through a pre-culture step after thawing, which is conventionally required. Is possible. Therefore, for example, if a large amount of polyimide porous material frozen in a state of supporting cells is prepared, a large amount of cells can be used at a desired time without going through an expansion culture step. Such freezing, storage, thawing, and culturing steps can be repeated multiple times.
  • Cell culture / substance production system and culture conditions can be appropriately determined according to the cell type and the like. Culture methods suitable for animal cells, plant cells, and bacterial cells are known, and those skilled in the art can cultivate cells applied to the polyimide porous membrane using any known method. A cell culture medium can also be suitably prepared according to the kind of cell.
  • Animal cell culture methods and cell culture media are described, for example, in the cell culture media catalog of Lonza.
  • Plant cell culture methods and cell culture media are described in, for example, the plant tissue culture series from WAKO.
  • Bacterial cell culture methods and cell culture media are described in, for example, the general bacterial culture catalog of BD.
  • the cell culture medium used in the method of the present invention may be in any form such as a liquid medium, a semi-solid medium, a solid medium and the like. Alternatively, the medium may be brought into contact with the polyimide porous membrane carrying the cells by spraying a nebulized liquid medium into the cell culture container.
  • the shape and scale of the system used for culturing are not particularly limited, and it can be appropriately used from petri dishes for cell culture, flasks, plastic bags, test tubes to large tanks.
  • a cell culture dish manufactured by BD Falcon, a Nunc cell factory manufactured by Thermo Scientific, and the like are included.
  • a polyimide porous membrane in the present invention it has become possible to culture cells in a state similar to suspension culture using a suspension culture apparatus even for cells that were not inherently capable of suspension culture.
  • a spinner flask manufactured by Corning, rotary culture, or the like can be used.
  • hollow fiber culture such as FiberCell (registered trademark) System manufactured by VERITAS can be used as an environment in which similar functions can be realized.
  • the cells may be cultured under stationary culture conditions. By exchanging the medium intermittently, the produced useful substance can be isolated.
  • the stationary culture using a single-use culture bag can also improve the efficiency dramatically by applying a polyimide porous membrane.
  • the cells may be cultured under rotational culture or stirring conditions.
  • rotational culture or stirring conditions By shaking the single-use culture bag continuously, it is possible to handle very large scales.
  • stirring culture in the rotary culture and spinner flask The same applies to the stirring culture in the rotary culture and spinner flask.
  • a continuous or intermittent medium exchange system can be attached to each of these methods, and long-term culture can be directed.
  • cells may be continuously cultured.
  • the polyimide porous membrane sheet is exposed to the air by using a continuous circulation or open type apparatus in which a medium is continuously added and recovered on the polyimide porous membrane. It is also possible to execute with various types.
  • cells may be cultured in a system in which the cell culture medium is supplied into the cell culture container continuously or intermittently from a cell culture medium supply means installed outside the cell culture container.
  • the cell culture medium can be a system in which the cell culture medium is circulated between the cell culture medium supply means and the cell culture container.
  • the present invention includes an aspect including installing a cell culture device in an incubator and culturing cells.
  • the system includes a culture unit that is a cell culture container and a cell.
  • a culture medium supply unit that is a culture medium supply means, wherein the culture unit is a culture unit that houses one or more polyimide porous membranes for supporting cells,
  • the medium supply unit includes a medium storage container, a medium supply line, and a liquid feed pump for feeding the medium through the medium supply line. The first end of the line is in contact with the medium in the medium container, and the second end of the medium supply line is in communication with the culture unit through the medium supply port of the culture unit.
  • a unit may be a cell culture apparatus.
  • the culture unit may be a culture unit that does not include an air supply port and an air discharge port, or may be a culture unit that includes an air supply port and an air discharge port. Even if the culture unit does not include an air supply port and an air discharge port, oxygen and the like necessary for cell culture are sufficiently supplied to the cells through the medium. Furthermore, in the cell culture apparatus, the culture unit further includes a medium discharge line, wherein the first end of the medium discharge line is connected to the medium storage container, and the second end of the medium discharge line is the culture unit. The culture medium may be circulated between the culture medium supply unit and the culture unit by communicating with the culture unit via the culture medium outlet.
  • a desired substance is produced from a cell by culturing the cell as described above.
  • the produced substance may be a substance remaining in the cell or a substance secreted from the cell.
  • the produced substance can be recovered by a known method according to the kind and nature of the substance. In the case of substances secreted from cells, the substances can be recovered from the cell culture medium. If the produced substance remains in the cell, the cell is destroyed by a known method such as chemical treatment using a cell lysing agent, ultrasonic treatment, homogenizer, physical treatment using a disposable disposable tube, etc. By doing so, it is possible to take the substance out of the cell and collect it.
  • a method for destroying cells can be appropriately applied by those skilled in the art depending on the type of cell, the type of substance, and the like.
  • the present invention also relates to an apparatus for producing a substance by cell culture for use in the method of the present invention, including a polyimide porous membrane.
  • the polyimide porous membrane may be used in a fixed manner, or may be used suspended in a cell culture medium, or may be placed in the medium or exposed from the medium. Also good.
  • two or more polyimide porous membranes may be laminated vertically or horizontally. Laminated aggregates and aggregates may be placed in the medium or exposed from the medium.
  • the substance production apparatus by cell culture of the present invention may take any form as long as it contains a polyimide porous membrane, and a known cell culture apparatus can be used.
  • the shape, scale, etc. of the culture apparatus are not particularly limited and can be appropriately used from petri dishes, test tubes to large tanks.
  • a cell culture dish manufactured by BD Falcon, a Nunc cell factory manufactured by Thermo Scientific, and the like are included.
  • a polyimide porous membrane in the present invention it has become possible to culture cells in a state similar to suspension culture using a suspension culture apparatus even for cells that were not inherently capable of suspension culture.
  • a spinner flask manufactured by Corning, rotary culture, or the like can be used.
  • hollow fiber culture such as FiberCell® (registered trademark) ® System of VERITAS can be used.
  • the apparatus for producing a substance using cultured cells of the present invention is a continuous circulation or open type apparatus in which a medium is continuously added to a sheet on a mesh and recovered, and the porous porous membrane sheet is exposed to the air. It is also possible to execute with a model.
  • a means for recovering the substance produced by the cell of the present invention may be further provided. For example, by connecting a semi-permeable membrane directly to a circulation type culture medium, adding carbohydrates and amino acids while removing unnecessary substances such as lactic acid, and constructing an efficient long-term culture method and unnecessary substance removal method Things are also possible.
  • Kit The present invention further relates to a kit for use in the method of the present invention comprising a polyimide porous membrane.
  • the kit of the present invention may appropriately contain components necessary for cell culture, substance production, and substance recovery in addition to the polyimide porous membrane.
  • Cell disruption means eg, cell lysing agent, disruption disposer homogenizer
  • substance recovery means eg, ultrafiltration centrifuge tube, coprecipitation reagent set and tube, antibody reagent, etc.
  • kit instruction manual etc. included.
  • a sterilized polyimide porous membrane is stored alone or in a plurality of sheets in a transparent pouch, and a package containing a form that can be used for cell culture as it is, or the same
  • a sterilizing liquid is enclosed in a pouch together with a polyimide porous membrane, and includes an integrated membrane / liquid kit that enables efficient suction seeding.
  • the present invention further includes the use of a polyimide porous membrane for the above-described method of the present invention.
  • polyimide porous membrane refers to a polyimide porous membrane having a total film thickness of 25 ⁇ m and a porosity of 73%.
  • the polyimide porous membrane had two different surface layers (A surface and B surface) and a macrovoid layer sandwiched between the two surface layers.
  • the average hole diameter of the holes existing on the A surface was 6 ⁇ m
  • the average hole diameter of the holes existing on the B surface was 46 ⁇ m.
  • the polyimide porous membrane used in the following examples is 3,3 ′, 4,4′-biphenyltetracarboxylic dianhydride (s-BPDA) which is a tetracarboxylic acid component and 4 which is a diamine component. , 4′-diaminodiphenyl ether (ODA) and a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution, which is a colored precursor, and a heat treatment at 250 ° C. or higher. .
  • s-BPDA 4,4′-biphenyltetracarboxylic dianhydride
  • ODA 4′-diaminodiphenyl ether
  • a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution, which is a colored precursor, and a heat treatment at 250 ° C. or higher.
  • Example 1 Spontaneous substance production by normal human dermal fibroblasts
  • normal human dermal fibroblasts were used to inoculate a polyimide porous membrane, and after cell culture, the fibronectin in the petri dish The production amount was confirmed.
  • cell culture medium 2% FBS, Fibroblast Media, LONZA
  • a normal human dermal fibroblast suspension was prepared. The cell suspension was added to the cell culture medium in the square container at 4 ⁇ 10 4 cells / cm 2 per sheet and cultured in this square container for 14 days. In addition, 3.0 ⁇ 10 6 normal human dermal fibroblasts per 1 ml of medium (of which 2.9 ⁇ 10 6 live cells, 1.6 ⁇ 10 5 dead cells, 95% viable cell rate) A normal human dermal fibroblast suspension was prepared. 1 ml of cell culture medium was added to a 5 cm 2 petri dish, 1.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 of the above cell suspension was added and cultured for 43 days, and cell culture was performed in the petri dish.
  • Example 2 Spontaneous production of substances by normal human fibroblast-like synoviocytes HFLS and rheumatoid arthritis patient-derived fibroblast-like synoviocytes HFLS-RA
  • normal human fibroblast-like synoviocytes HFLS and After seeding on a polyimide porous membrane using fibroblast-like synoviocytes HFLS-RA derived from rheumatoid arthritis patients and performing cell culture the amount of IL-6 produced in the petri dish was confirmed.
  • a cell culture medium (10% FBS, Synobiocy Growth Medium, manufactured by CELL APPLICATIONS, INC.) was added to a 2 cm ⁇ 2 cm sterilized square container, and a mesh structure of a 1.4 cm square square polyimide porous membrane was added. Immerse in medium with side up. Separately, 1.5 ⁇ 10 6 HFLS cells (of which 1.4 ⁇ 10 6 live cells, 2.0 ⁇ 10 4 dead cells, 99% live cell rate) were suspended per ml of medium. A HFLS cell suspension was prepared. The cell suspension per sheet was added to the cell culture medium in the square container at a rate of 4.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 and cultured in this square container for 13 days.
  • a cell culture medium (10% FBS, Synobiocy Growth Medium, manufactured by CELL APPLICATIONS, INC.
  • cell culture medium 1 ml of cell culture medium was added to a 5 cm 2 petri dish, and separately 5.9 ⁇ 10 5 HFLS cells per ml of the medium (of which 5.7 ⁇ 10 5 were live cells and 2.0 ⁇ dead cells were A HFLS cell suspension in which 10 4 cells (viable cell rate 97%) were suspended was prepared. The cell suspension was added at 7 ⁇ 10 3 cells / cm 2 and cultured for 8 days, and the cells were cultured in a petri dish.
  • HFLS-RA cells (of which 2.0 ⁇ 10 6 live cells, 1.6 ⁇ 10 5 dead cells, 93% viable cell rate) per ml of medium
  • a suspended HFLS-RA cell suspension was prepared.
  • the cell suspension per sheet was added to the cell culture medium in the square container at a rate of 4.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 and cultured in this square container for 13 days.
  • 1 ml of cell culture medium was added to a 5 cm 2 petri dish, and separately, 5.8 ⁇ 10 5 HFLS-RA cells per ml of the medium (of which 5.6 ⁇ 10 5 cells were live and 2.
  • a HFLS-RA cell suspension in which 0 ⁇ 10 4 cells (viable cell rate of 97%) were suspended was prepared.
  • the cell suspension was added at 7.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 and cultured for 8 days, and the cells were cultured in a petri dish.
  • Two 5 cm 2 petri dishes were prepared, and one HFLS sheet and one HFLS-RA sheet each cultured as described above were placed therein. Furthermore, a 5 cm 2 petri dish of HFLS and HFLS-RA cultured as described above without cell sheets was prepared.
  • Table 3 shows the results of spontaneous production of IL-6 using normal human fibroblast-like synoviocytes when a polyimide porous membrane sheet and a petri dish were used as culture scaffolds, respectively.
  • the spontaneous production of IL-6 was about 25 in the case of normal human fibroblast-like synoviocytes HFLS, compared to the case of using a petri dish when the polyimide porous membrane sheet was used.
  • the number was about 5 times or more.
  • Example 3 Spontaneous albumin production by human liver cancer-derived cell line HepG2 cells
  • human liver cancer-derived cell line HepG2 cells were seeded on a polyimide porous membrane and cultured spontaneously, and then spontaneously within a certain period of time. The production amount of albumin released into the medium was confirmed.
  • cell culture medium (10% FBS, HEPG2.E.MEDIA-450, Cellular Engineering Technologies Inc.) to a sterilized square container of 2 cm ⁇ 2 cm, and a 1.4 cm square square polyimide porous membrane mesh Dip in the medium with the A side of the structure up.
  • 1.6 ⁇ 10 6 HepG2 cells (of which 1.4 ⁇ 10 6 live cells, 1.3 ⁇ 10 5 dead cells, and 92% viable cell rate) were suspended per ml of medium.
  • a HepG2 cell suspension was prepared.
  • the cell suspension per sheet was added to the cell culture medium in the square container at 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 and cultured in this square container for 21 days.
  • 2 ml of cell culture medium was added to a 10 cm 2 petri dish, 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 of the above cell suspension was added, and the cells were cultured for 21 days.
  • a 10 cm 2 petri dish containing three sheets of the cell cultured as described above and one 10 cm 2 petri dish prepared as described above was prepared.
  • the medium supernatant was discarded, 2 ml of cell culture medium was newly added to each, and incubated at 5% CO 2 and 37 ° C. for 3 hours to recover the medium supernatant.
  • the amount of albumin contained in the collected supernatant was quantified by ELISA (Tables 4 and 5).
  • Tables 4 and 5 show the results of spontaneous production of albumin using HepG2 cells when using a polyimide porous membrane sheet and a petri dish as culture scaffolds, respectively.
  • Table 4 shows the amount of albumin produced per unit area of the membrane
  • Table 5 shows the amount of albumin produced per cell. Since there is no correlation between the number of coexisting membranes and the albumin production per cell, and the production per polyimide porous membrane is constant, it is expected that substance production will progress proportionally as the number of cells increases. Is done.
  • Example 4 Substance Production by G-CSF Producing CHO-K1 Cell Line
  • the amount of G-CSF produced and released into the medium by cell culture using G-CSF producing CHO-K1 cells was measured. It was measured.
  • the culture medium supernatant of the cultured sheet was removed, and 20 ml of cell culture medium was newly added, followed by incubation at 5% CO 2 and 37 ° C. for 24 hours, and the culture medium supernatant was recovered.
  • the amount of G-CSF contained in the collected supernatant was quantified by ELISA (Table 6).
  • Example 5 Substance Production by Anti-human IL-8 Producing CHO DP-12 Cells
  • anti-human IL-8 antibody-producing CHO DP-12 cells produced by cell culture using human anti-IL-8 antibody-producing CHO DP-12 cells were released into the medium.
  • the efficiency of the cell culture system using a polyimide porous membrane was examined.
  • the production amount of the antibody in culture in a normal petri dish was investigated.
  • cell culture medium 2% FBS, IMDM, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • a sterilized 1.4 cm square square polyimide porous membrane is mesh-structured.
  • Each was immersed with the A side up. 4 ⁇ 10 4 human anti-IL-8 producing CHO DP-12 cell suspensions per sheet were each added to the sheet in the medium, and the medium was changed twice a week. Conducted continuously. After culturing the cells for 85 days, the number of cells was measured using CCK8.
  • Example 6 Substance Production by Anti-human IL-8 Producing CHO DP-12 Cells
  • the cultured cells together with the polyimide porous membrane sheet were cultured.
  • freezing, thawing again, and culturing it was examined whether the amount of anti-human IL-8 antibody produced when normal culture was continued and released into the medium was changed.
  • the sheets were placed one by one in a 10 cm 2 petri dish, 2 ml of each cell culture medium was added and incubated at 5% CO 2 and 37 ° C. for 24 hours, and the medium supernatant was collected.
  • the amount of anti-human IL-8 antibody contained in the collected supernatant was quantified by ELISA (frozen sheets 1 to 4 in Table 8). No change in anti-IL-8 production due to freezing was observed.
  • Example 7 Confirmation of Growth by Gas Phase Passage during Long-term Culture of Human Skin Fibroblasts
  • 4 ⁇ 10 4 human dermal fibroblasts were seeded per sheet and cultured for 1 month. Thereafter, the sheet was cut into a quarter and further cultured for 230 days in total. Thereafter, three 1.4 cm square stainless steel meshes are placed in the center of the 3.5 cm dish, and the polyimide porous membrane is placed on the sterilized 1.4 cm square empty polyimide porous membrane 2.
  • each sheet was divided into one sheet and the culture was continued as a single sheet.
  • 10 days, 16 days, 21 days, 28 days, 42 days and 56 days the number of cells was measured using CCK8, and the original sheet and the empty polyimide porous membrane grounded later were The growth behavior was observed using the staining method with CCK8. From the polyimide porous membrane in which human skin fibroblasts were cultured for a long period of time, it was observed that the cells efficiently migrated to the empty polyimide porous membrane and continuously proliferated. The results are shown in FIG.
  • a human dermal fibroblast culture sheet that has been cultured for 294 days on a polyimide porous membrane without undergoing gas phase passage, and a base sheet that has been subjected to gas phase passage on the 230th day for the same period and gas phase culture.
  • Fibronectin produced by inhabiting human skin fibroblasts was compared in the amount of fibronectin released in 24 hours into the medium in which the sheet was cultured, on the upper and lower sheets cultured for 56 days after passage. . Stable fibronectin production was confirmed regardless of the culture period and gas phase passage.
  • the results are shown in Table 9. As a comparison object, the amount of fibronectin produced from two sheets cultured for 13 days in a polyimide porous membrane is also shown.
  • Example 8 Freezing of human skin fibroblasts and production of substances 0.5 ml of cell culture medium was added to a 2 cm ⁇ 2 cm sterilized square container, and a sterilized 1.4 cm square polyimide porous membrane was formed into a mesh structure A. Each was soaked face up. 4 ⁇ 10 4 human skin fibroblast suspensions per sheet were added onto the medium sheet, and culture was started in a CO 2 incubator. Cell culture was continuously carried out by changing the medium twice a week. After 49 days of cell culture, the number of cells was measured using CCK8 and found to be 9.1 ⁇ 10 4 cells.
  • This cell-grown sheet is placed in a frozen storage bag with 3 ml of cell bunker, frozen at ⁇ 80 ° C. every 10 minutes in a program freezer, frozen at ⁇ 80 ° C., and stored at ⁇ 80 ° C. for 24 hours. And moved into liquid nitrogen. After 5 days, the bag was heated to 37 ° C. to melt the contents, and 2 ml of the medium was added and left in the incubator for 24 hours. After 24 hours, 5 days, 8 days, 13 days, 21 days, 29 days, and 35 days, the number of cells was measured using CCK8. The specific activities after 24 hours, 8 days, 21 days and 35 days were 34%, 91%, 105% and 152%.

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Abstract

　本発明は、細胞を用いて物質を産生する方法であって、細胞をポリイミド多孔質膜に適用し細胞を培養し、細胞により物質を産生させること、を含む方法に関する。

Description

物質の産生方法
　本発明は、細胞を用いて物質を産生する方法に関する。
　細胞培養と物質産生
　細胞は生体内では一般に三次元的な構造をとった集団として存在する。一方で、細胞を人工環境において培養する場合は、細胞が培養容器底面に単層状に張り付く形で二次元的に培養される古典的な平面培養法や、液体培養液中に細胞を分散させた状態で培養する浮遊培養法が一般的に用いられる。平面培養法に用いられる細胞については、比較的接着性の高い細胞が適しているが、適した細胞を用いた場合でも、培養環境の違いにより、細胞の性質が大きく変化することがある。浮遊培養法についても、適した細胞と適さない細胞が存在する。
　ワクチン、酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン等、医療用途に用いられる生体内タンパク質等への需要が高まるにつれ、細胞培養を用いた生体内タンパク質等の大量産生が注目を集めている。大腸菌等の浮遊細胞については、大型培養槽で大量培養する技術が研究されてきた。大型培養槽を用いた浮遊細胞の大量培養では、多量の培養液と撹拌装置が必要になる。一方、付着細胞を用いて物質産生を行なう研究も、使用する細胞の研究の進展と相まって、多くの注目を集めた。付着細胞の場合、古典的な平面培養法では、細胞は二次元的にしか展開しないため、多くの培養面積が必要になる。生体内タンパク質等の大量産生のために、より立体的に大量の細胞を培養すべく、細胞培養担体とバイオリアクターの研究も数多く取り組まれている。
　代表的な細胞培養用担体としては、細胞が付着育成出来る小粒子であるマイクロキャリアが広く研究対象となっている（特許文献３）。様々な種類のマイクロキャリアが研究・開発され、市販されているものも多い。ワクチンやタンパク質の製造にも多く用いられ、スケールアップにも耐えるシステムとして、広く方法論として採用されている。しかしながら、マイクロキャリア培養においては、マイクロキャリアが十分に攪拌・拡散され凝集しない必要がある為、細胞培養の量的な上限がある。その上、例えば物質産生を行なう場合、キャリアそのものを分離する為には細かな粒子を分別するフィルター等で分離させる必要があるなど、方法論的にも煩雑な作業が必要となる。同時に、マイクロキャリア培養では、マイクロキャリアという粒子状物質に形状が限定される事から、形状から来る性質を免れ得ない。
　マイクロキャリア培養とは異なる方法としては、メチルセルロースやジェランガムを用いる３次元培養法でスフェロイド形状の細胞を継続的に大量培養する方法も見出されている。セルローススポンジを用いるバイオリアクター等では、確かに大量の細胞培養が可能である。しかしながら、システムとして大きな閉鎖系となり、培養環境には簡単に接触出来ない等、作業上の制限も多い。
　簡便かつ自動化に向いたシステムで、量的に多くの物質を効率良く細胞に産生させ得る為に、新規なシステムの構築が希求されていた。
　ポリイミド多孔質膜
　ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称である。芳香族ポリイミドは、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された高分子を意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
　ポリイミド多孔質膜は、本発明前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献６～８は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。
特公平６－３０５７０ 特許２６８３９４６ ＷＯ２００３／０５４１７４ 特開２００９－２６１４１０ ＷＯ２０００／０６８３７１ ＷＯ２０１０／０３８８７３ 特開２０１１－２１９５８５ 特開２０１１－２１９５８６
Hogwood et al., Current Opinion in Biotechnology 2014, 30:153-160 Kurokawa et al., Journal of Bioscience and Bioengineering VOL. 111 No. 5, 600-604, 2011
　本発明は、細胞を用いて物質を産生する方法、物質産生装置、キット、及び使用を提供することを目的とする。
　本発明者らは、物質を簡便かつ効率良く細胞に産生させることが可能な方法、システムを提供する、という課題の解決のために、鋭意研究に勤めた結果、ポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養を行う事で、特別な前処理等を行なう事無く、大量の細胞を限定的空間で培養し、その高密度培養特性を活用して、効率的物質産生を実現することができることを見出し、本発明を想到した。よって、本発明は、ポリイミド多孔質膜を用いて細胞を培養すること、を特徴の１つとする。
　細胞は、ポリイミド多孔質膜の有する、細胞が通過可能な大口径連結孔を活用して安定的かつ立体的に生育し、平面培養に比較して大量の細胞を含む状態となっても、その連結孔が培地との接触を確保する事により、安定に生育を継続する事ができる。タンパク質やウイルスの様な物質産生においても同様の構造特性が寄与し、培地に対し効率的に産生物質を供給し得る。更に、ポリイミド多孔質膜の持つ、薄膜特性・フレキシブル特性・形状安定性・自由形態性により、小さな単位空間に多量のシートを共存させたり多数の膜を積層したりする事が可能となる上に、ポリイミド多孔質膜の有する超耐熱性・耐溶剤性の為、複数の手段で簡便かつ迅速にシートの滅菌が可能である。更に、ポリイミド多孔質膜の有する立体的足場構造により、平面的な培養と比較した場合、一つの細胞あたりの物質産生量が向上する可能性も期待される。
　限定されるわけではないが、本発明は好ましくは以下の態様を含む。
［態様１］
　細胞を用いて物質を産生する方法であって、細胞をポリイミド多孔質膜に適用し細胞を培養し、細胞により物質を産生させること、を含む前記方法。
［態様２］
　前記物質が、タンパク質、糖タンパク質及びウイルスからなる群から選択される、態様１に記載の方法。
［態様３］
　細胞を、静置培養条件下で培養する、態様１又は２に記載の方法。
［態様４］
　細胞を、回転培養又は攪拌条件下で培養する、態様１又は２に記載の方法。
［態様５］
　細胞を、連続的に培養する、態様１又は２に記載の方法。
［態様６］
　細胞培養装置をインキュベータ内に設置し、細胞を培養することを含む、
　ここにおいて、前記細胞培養装置は、
　　細胞を担持するための１又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットと、
　　培地供給ユニットであって、培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットと、
を含む、態様５に記載の方法。
［態様７］
　前記細胞培養装置が、空気供給口、空気排出口及び酸素透過膜を有しない、態様６に記載の方法。
［態様８］
　前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、態様１～７のいずれか１つに記載の方法。
［態様９］
　前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理する事により得られる着色したポリイミド多孔質膜である、態様８に記載の方法。
［態様１０］
　前記ポリイミド多孔質膜が、２つの異なる表層面とマクロボイド層を有する多層構造のポリイミド多孔質膜である、態様８又は９に記載の方法。
［態様１１］
　前記ポリイミド多孔質膜の膜厚が７５μｍ以下である、態様１０に記載の方法。
［態様１２］
　前記ポリイミド多孔質膜を
　ｉ）折り畳んで、
　ｉｉ)ロール状に巻き込んで、
　ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
　ｉｖ）縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させる、態様１～１１のいずれか１つに記載の方法。
［態様１３］
　２以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、態様１～１２のいずれか１つに記載の方法。
［態様１４］
　細胞が、物質を発現するように遺伝子工学技術により形質転換されている、態様１～１３のいずれか１つに記載の方法。
［態様１５］
　細胞が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、態様１～１４のいずれか１つに記載の方法。
［態様１６］
　動物細胞が、脊椎動物門に属する動物由来の細胞である、態様１５に記載の方法。
［態様１７］
　動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣組織由来細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓由来株化細胞（Ｖｅｒｏ細胞）、ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２細胞）、イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来の細胞株（ＭＤＣＫ細胞）及びヒト肝癌組織由来樹立細胞株（ｈｕＧＫ-１４）からなる群から選択される、態様１５又は１６に記載の方法。
［態様１８］
　細菌が、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアからなる群から選択される、態様１５に記載の方法。
［態様１９］
　ポリイミド多孔質膜を含む、態様１～１８のいずれか１つに記載の方法に使用するための物質産生装置。
［態様２０］
　２以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層している、態様１９に記載の物質産生装置。
［態様２１］
　ポリイミド多孔質膜を含む、態様１～１８のいずれか１つに記載の方法に使用するためのキット。
［態様２２］
　ポリイミド多孔質膜の態様１～１８のいずれか１つに記載の方法のための使用。
　本発明の方法、装置、キットによりポリイミド多孔質膜を用いて細胞培養を実施すると、様々な形態で１又は複数のシートを限定的な空間に共存させることにより、大量の細胞を効率良く培養することができる。本発明の方法により、効率的かつ簡便な細胞培養による物質産生が可能となった。
ヒト皮膚線維芽細胞の長期培養後における、気相継代時の細胞数変化を示す。
　Ｉ．物質を産生する方法
　本発明は、細胞を用いて物質を産生する方法に関する。本発明の方法は、細胞をポリイミド多孔質膜に適用し細胞を培養し、細胞により物質を産生させること、を含む。
　１．細胞
　本発明の方法に利用し得る細胞の種類は特に限定されず、任意の細胞の増殖に利用可能である。
　例えば、細胞は、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。動物細胞は、脊椎動物門に属する動物由来の細胞と無脊椎動物（脊椎動物門に属する動物以外の動物）由来の細胞とに大別される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。
　限定されるわけではないが、動物細胞としては好ましくは例えば、動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣組織由来細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓由来株化細胞（Ｖｅｒｏ細胞）、ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２細胞）、イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来の細胞株（ＭＤＣＫ細胞）、ヒト肝癌組織由来樹立細胞株（ｈｕＧＫ-１４）、正常ヒト線維芽細胞様滑膜細胞（ＨＦＬＳ細胞）及び慢性関節リウマチ患者由来線維芽細胞様滑膜細胞（ＨＦＬＳ－ＲＡ細胞）からなる群から選択される、細胞が使用される。
　本明細書における植物細胞の由来は特に限定されない。コケ植物、シダ植物、種子植物を含む植物の細胞が対象となる。
　種子植物細胞が由来する植物は、単子葉植物、双子葉植物のいずれも含まれる。限定されるわけではないが、単子葉植物には、ラン科植物、イネ科植物（イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ソルガム等）、カヤツリグサ科植物などが含まれる。双子葉植物には、キク亜綱、モクレン亜綱、バラ亜綱など多くの亜綱に属する植物が含まれる。
　藻類も、細胞由来生物として見なす事が出来る。真正細菌であるシアノバクテリア（藍藻）から、真核生物で単細胞生物であるもの（珪藻、黄緑藻、渦鞭毛藻など）及び多細胞生物である海藻類（紅藻、褐藻、緑藻）などの異なるグループを含む。
　本明細書における古細菌及び細菌の種類も特に限定されない。古細菌は、メタン菌・高度好塩菌・好熱好酸菌・超好熱菌等からなる群から構成される。細菌は、例えば、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアなどからなる群から選択される。
　本発明の方法に利用しうる動物細胞又は植物細胞の種類は、限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及び生殖細胞からなる群から選択される。
　本発明において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開ＷＯ２００９／１２３３４９（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
　「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。
　「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。
　「生殖細胞」は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞を意味する。例えば、有性生殖のための配偶子、即ち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための 胞子などを含む。
　細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択してもよい。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌で、軟部肉腫、悪性骨腫瘍などを含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」とは、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ－６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する細胞株が存在する。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。
　細胞は、所望の物質を発現しうる細胞であれば特に限定されない。細胞内は当該物質を天然に発現してもよく、あるいは、は遺伝子工学技術により当該物質を産生するように形質転換されていてもよい。好ましくは細胞は、物質を発現するように遺伝子工学技術により形質転換されているものである。動物細胞、植物細胞、細菌の形質転換については、各々適した方法が公知である。（例えば、MOLECULAR CLONING: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Michael R Green and Joseph Sambrook, 2012, (Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Mutation Research 760 (2014) 36-45, Reviews in Mutation Research）
　２．物質
　本発明の方法によって細胞に産生されうる物質の種類は、細胞内で天然に又は遺伝子工学技術により産生されうる物質であれば特に限定されない。好ましくは、前記物質は、タンパク質（ポリペプチドを含む）、糖タンパク質及びウイルスからなる群から選択される。
　タンパク質の例は、エリスロポイエチン、インスリン、アルブミン等の生理活性タンパク質、腫瘍壊死因子α、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターフェロン等のサイトカイン、トロンビン、トリプシンなどの酵素及び抗体医薬を含むモノクローナル抗体等を含む。好ましくは、生理活性タンパク質、モノクローナル抗体である。
　糖タンパク質の例は、コラーゲン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸などを含む。好ましくは、フィブロネクチンである。
　ウイルスの例は、インフルエンザウィルス、アデノウィルスなどを含む。好ましくは、インフルエンザウィルスである。
　本発明の、特定の細胞において天然に発現される物質の例は、形質転換細胞によって発現される抗体医薬品、ヒト皮膚線維芽細胞によって発現されるヒトコラーゲンやフィブロネクチンを含む。
　３．ポリイミド多孔質膜
　ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
　本発明において用いるポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。
　本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理する事により得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。
　ポリアミック酸
　ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
　ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。
　ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。
　着色前駆体
　本発明において用いられる着色前駆体とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
　本発明において用いられる着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。
　着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。
　炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。
　テトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ－ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ－ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２－ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’－ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’－ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２－ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ－フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ－ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ－ターフェニル－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、ｐ－ターフェニル－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、１，３－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２－ビス〔（３，４－ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７－ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８－ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’－（２，２－ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’－ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
　これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
　ジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
　１）１，４－ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３－ジアミノベンゼン、２，４－ジアミノトルエン、２，６－ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
　２）４，４’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’－ジメチル－４，４’－ジアミノビフェニル、２，２’－ジメチル－４，４’－ジアミノビフェニル、２，２’－ビス（トリフルオロメチル）－４，４’－ジアミノビフェニル、３，３’－ジメチル－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’－ジカルボキシ－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’－テトラメチル－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、ビス（４－アミノフェニル）スルフィド、４，４’－ジアミノベンズアニリド、３，３’－ジクロロベンジジン、３，３’－ジメチルベンジジン、２，２’－ジメチルベンジジン、３，３’－ジメトキシベンジジン、２，２’－ジメトキシベンジジン、３，３’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルエーテル、３，３’－ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’－ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’－ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’－ジアミノジフェニルスルホン、３，４’－ジアミノジフェニルスルホン、４，４’－ジアミノジフェニルスルホン、３，３’－ジアミノベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジクロロベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジメトキシベンゾフェノン、３，３’－ジアミノジフェニルメタン、３，４’－ジアミノジフェニルメタン、４，４’－ジアミノジフェニルメタン、２，２－ビス（３－アミノフェニル）プロパン、２，２－ビス（４－アミノフェニル）プロパン、２，２－ビス（３－アミノフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス（４－アミノフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、３，３’－ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’－ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’－ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
　３）１，３－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３－ビス（３－アミノフェノキシ）－４－トリフルオロメチルベンゼン、３，３’－ジアミノ－４－（４－フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジ（４－フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３－ビス（３－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３－ビス（３－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３－ビス〔２－（４－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４－ビス〔２－（３－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４－ビス〔２－（４－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
　４）３，３’－ビス（３－アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’－ビス（４－アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’－ビス（３－アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’－ビス（４－アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２－ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
　これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
　これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
　本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
　本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
　（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
　（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
　（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
　限定されるわけではないが、ポリイミド多孔質膜として、少なくとも、２つの表面層（Ａ面及びＢ面）と、当該２つの表面層の間に挟まれたマクロボイド層とを有する多層構造のポリイミド多孔質膜を、本発明に使用することが可能である。好ましくは、ポリイミド多孔質膜は、前記マクロボイド層が、前記表面層（Ａ面及びＢ面）に結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層（Ａ面及びＢ面）に囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０～５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、前記のマクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層（Ａ面及びＢ面）はそれぞれ、厚さが０．０１～２０μｍであり、平均孔径０．０１～１００μｍの複数の孔を有し、当該細孔同士が連通しても良く、更に前記マクロボイドに連通して部分的あるいは全面的に多層構造を有しており、そして、総膜厚が５～５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。
　本発明において用いられるポリイミド多孔質膜の総膜厚は、限定されるわけではないが、一態様として、２０～７５μｍとしてもよい。膜厚の相違により、細胞の増殖速度、細胞の形態、面内における細胞の飽和度等に相違が観察されうる。
　本発明において、２つの異なる表面層（Ａ面及びＢ面）と、当該２つの表面層の間に挟まれたマクロボイド層とを有するポリイミド多孔質膜が使用される場合、Ａ面に存在する孔の平均孔径は、Ｂ面に存在する孔の平均孔径と差があってもよい。好ましくは、Ａ面に存在する孔の平均孔径は、Ｂ面に存在する孔の平均孔径よりも小さい。より好ましくは、Ａ面に存在する孔の平均孔径がＢ面に存在する孔の平均孔径よりも小さく、Ａ面に存在する孔の平均孔径が０．０１～５０μｍ、０．０１μｍ～４０μｍ、０．０１μｍ～３０μｍ、０．０１μｍ～２０μｍ、又は０．０１μｍ～１５μｍであり、Ｂ面に存在する孔の平均孔径が２０μｍ～１００μｍ、３０μｍ～１００μｍ、４０μｍ～１００μｍ、５０μｍ～１００μｍ、又は６０μｍ～１００μｍである。特に好ましくは、Ａ面が平均孔径１５μｍ以下の、例えば０．０１μｍ～１５μｍの小さい穴を有するメッシュ構造であり、Ｂ面が平均孔径２０μｍ以上の、例えば２０μｍ～１００μｍの大穴構造である。本発明の方法において、Ａ面に存在する孔の平均孔径が、Ｂ面に存在する孔の平均孔径よりも小さいポリイミド多孔質膜が使用される場合、細胞はＡ面から播種されてもＢ面から播種されてもよく、好ましくは、細胞はＡ面から播種される。
　本発明において用いられるポリイミド多孔質膜の総膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
　ポリイミド多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、２００点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式（１）に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 （式中、Ｓａは孔面積の平均値を意味する。）
　本発明において用いられるポリイミド多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式（２）に従って求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 （式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは総膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリイミドの密度をそれぞれ意味する。ポリイミドの密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
　例えば、国際公開　ＷＯ２０１０／０３８８７３、特開２０１１－２１９５８５、又は特開２０１１－２１９５８６に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。
　本発明の方法において細胞を適用するポリイミド多孔質膜は、当然、装填する細胞以外の生体成分を含まない状態、即ち、滅菌されていることが好ましい。本発明の方法は、好ましくは、ポリイミド多孔質膜を予め滅菌する工程を含む。ポリイミド多孔質膜は、耐熱性に極めて優れており、軽量であり、形・大きさも自由に選択可能であり、滅菌処理が容易である。乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等殺菌剤による滅菌、ＵＶやガンマ線を含む電磁波滅菌等任意の滅菌処理が可能である。
　ポリイミド多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は膜中の生育・増殖する位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。本発明の一態様において、細胞の種類に応じて、ポリイミド多孔質膜の表面及び内部を移動しながら、形状を変化させながら増殖することもある。
　４．細胞のポリイミド多孔質膜への適用
　細胞のポリイミド多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリイミド多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
　（Ａ）細胞を前記ポリイミド多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
　（Ｂ）前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
　放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
　細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
　（Ｃ）前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
　前記湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
　細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
　（Ａ）の態様は、ポリイミド多孔質膜の表面に細胞、細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリイミド多孔質膜を細胞縣濁液中に入れて、膜の表面から細胞培養液を浸潤させる態様も含む。
　ポリイミド多孔質膜の表面に播種された細胞は、ポリイミド多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞はポリイミド多孔質膜に自発的に接着する。ポリイミド多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。
　（Ｂ）の態様において、ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せる。ポリイミド多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませることにより、細胞縣濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリイミド多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の細胞縣濁液が装填された箇所に細胞が吸い込まれて播種される。
　あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填してもよい。この場合、細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。
　例えば、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法（以後、これを「一点ウェット法」と記載する）を用いることができる。一点ウェット法は、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、ポリイミド多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に細胞懸濁液を装填する方法も用いることができる（以後、これを「ウェット膜法」と記載する）。この場合、ポリイミド多孔質膜の全体において、細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。
　（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる。これにより細胞縣濁液中の細胞の濃度を濃縮する、細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。
　（Ａ）の態様を「自然播種」（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。
　限定されるわけではないが、好ましくは、ポリイミド多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の好ましい態様において、生細胞が前記ポリイミド多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。
　態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、(+)及び(-)Dulbecco’s PBS 、(+)及び(-)Hank's Balanced Salt Solution等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　さらに、本発明の方法において、細胞のポリイミド多孔質膜への適用は、浮遊状態にある接着性細胞をポリイミド多孔質膜と縣濁的に共存させることにより細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の細胞の方法において、細胞をポリイミド多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリイミド多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合、ポリイミド多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である。ポリイミド多孔質膜の性質から、細胞はポリイミド多孔質膜に接着しうる。よって、生来浮遊培養に適さない細胞であっても、ポリイミド多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で培養することが可能である。好ましくは、細胞は、ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞がポリイミド多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。
　５．細胞の培養
　本発明は、ポリイミド多孔質膜に適用された細胞を培養し、細胞により物質を産生することを含む。
　ポリイミド多孔質膜に細胞を適用し、培養する、ことについては、ＰＣＴ／ＪＰ２０１４／０７０４０７に以下の通り記載されている。
　細胞培養は、細胞培養における存在形態により培養細胞は接着培養系細胞と浮遊培養系細胞に分類することができる。接着培養系細胞は培養容器に付着し増殖する培養細胞であり、継代には培地交換を行う。浮遊培養系細胞は培地中において浮遊状態で増殖する培養細胞であり、一般的には継代の際には培地交換は行わず、希釈培養を行う。浮遊培養は、浮遊状態、即ち液体中での培養が可能なため、大量培養が可能であり、培養容器表面にのみ生育する付着細胞と比較すると、立体的な培養である為に、単位空間当りの培養可能細胞数は多いという利点がある。
　本発明の方法において、ポリイミド多孔質膜を細胞培養培地中に浮遊した状態で用いる場合、２以上の前記ポリイミド多孔質膜の小片を用いてもよい。ポリイミド多孔質膜はフレキシブルな薄膜であるため、例えばその小片を培養液中に浮遊させて用いることにより、一定容量の細胞培養培地中に多くの表面積を有するポリイミド多孔質膜を持ち込むことが可能となる。通常培養の場合、容器底面積が細胞培養可能な面積の上限となるが、本発明のポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養では、先の持ち込まれたポリイミド多孔質膜の大表面積の全てが細胞培養可能な面積となる。ポリイミド多孔質膜は細胞培養液を通過させるので、例えば折りたたまれた膜内にも栄養や酸素等の供給が可能となる。
　ポリイミド多孔質膜の小片の大きさ、形状は、特に限定されない。形状は、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など任意の形をとりうる。
　本発明のポリイミド多孔質膜は柔軟性があるため形状を変化させて用いることができる。ポリイミド多孔質膜を平面状ではなく、立体状に形状を加工して用いてもよい。例えば、ポリイミド多孔質膜を、ｉ）折り畳んで、ｉｉ)ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、ｉｖ）縄状に結んで、細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させてもよい。ｉ）～ｉｖ）のように形状を加工することにより、小片を用いる場合と同様に、一定容量の細胞培養培地中に多くのポリイミド多孔質膜を入れることができる。さらに、各小片を集合体として取り扱うことができるため、細胞体を集合化して移動させることが可能となり、総合的な応用性が高い。
　小片集合体と同様の考え方として、２以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いてもよい。積層とは、ポリイミド多孔質膜が一部重なる態様も含む。積層培養により、狭いスペースで高密度に細胞を培養することが可能になる。既に細胞が育成している膜上にさらに膜を積層させて設置して別種細胞との多層系を形成することも可能である。積層するポリイミド多孔質膜の数は特に限定されない。
　上述した細胞の培養方法を、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）～（Ｃ）のいずれかの方法を用いて先ずポリイミド多孔質膜に細胞を適用し、次いで、細胞が接着したポリイミド多孔質膜を浮遊培養してもよい。あるいは、ポリイミド多孔質膜に適用する工程として、上記態様（Ａ）～（Ｃ）のいずれかの方法を２種類又はそれより多くを組み合わせて用いてもよい。
　本発明の方法において、好ましくは、細胞はポリイミド多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する。本発明の方法により、細胞は２日以上、より好ましくは４日以上、さらに好ましくは６日以上増殖し続けることができる。
　本発明の方法では、ポリイミド多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリイミド多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。
　また、本発明の方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の細胞を効率良く培養することが可能となる。たとえば、ポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の細胞を培養することができる。また、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を、従来の方法よりも著しく減らすことも可能となる。
　本発明の方法を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。
　従来、細胞の三次元培養用基材として、多孔質ポリスチレン製基材であるＡｌｖｅｔｅｘ（登録商標）（リプロセル社）、ポリカプロラクトン製基材である３Ｄ　Ｉｎｓｅｒｔ－ＰＣＬ（３Ｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ポリスチレン製基材である３Ｄ　Ｉｎｓｅｒｔ－ＰＳ（３Ｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）などが知られている。本発明の方法にしたがってポリイミド多孔質膜を用いて細胞培養した場合は、従来知られている三次元培養基材を用いて細胞培養した場合と比較して、単位体積当たりの物質産生効率が極めて高い。
　また、本発明の方法では、細胞が細胞塊（スフェロイド）を形成せずにポリイミド多孔質膜中で培養される。このような培養条件下において、細胞は剥離することなく長期間安定に生育することができるため、産生された物質を清澄液として取得することができる。
　また、細胞を大量に担持した状態でポリイミド多孔質膜を凍結、保存することが可能である。さらに、当該ポリイミド多孔質膜を任意の時に解凍し、プレ培養工程を経ることなく、タンパク質の産生に使用可能である。凍結・解凍工程を経たとしても、細胞の物質産生能力が低下することはない。従来、解凍した細胞を使用するためには、解凍した細胞をプレ培養し、生存している細胞を所望の基材又は担体に担持させて培養する必要があった。しかし、当該ポリイミド多孔質膜を使用することで、従来必要である解凍後のプレ培養工程を経ることなく、ポリイミド多孔質膜に細胞を接着させたまま培養、凍結、保存、解凍、そして再培養が可能である。そのため、例えば、細胞を担持した状態で凍結したポリイミド多孔質が大量に準備されていれば、拡大培養工程を経ずに、所望の時に大量の細胞を使用することが可能である。このような凍結、保存、解凍、及び培養の工程は複数回繰り返すことができる。
　６．細胞の培養・物質産生システム及び培養条件
　本発明の方法において、細胞の培養・物質産生システム及び培養条件は、細胞の種類等に応じて適宜決定することができる。動物細胞、植物細胞、及び細菌の各細胞に適した培養方法が公知であり、当業者は任意の公知の方法を用いてポリイミド多孔質膜に適用した細胞を培養することができる。細胞培養培地も細胞の種類に応じて適宜調製することができる。
　動物細胞の細胞培養方法、細胞培養培地は、例えば、ロンザ社の細胞培養培地カタログに記載されている。植物細胞の細胞培養方法、細胞培養培地は、例えば、ＷＡＫＯ社の植物組織培地シリーズ等に記載されている。細菌の細胞培養方法、細胞培養培地は、例えば、ＢＤ社の一般細菌用培地カタログに記載されている。本発明の方法に用いることの細胞培養培地は、液体培地、半固形培地、固形培地等のいずれの形態であってもよい。また、霧状とした液体培地を細胞培養容器中に噴霧することにより、細胞を担持したポリイミド多孔質膜に培地が接触するようにしてもよい。
　ポリイミド多孔質膜を用いる細胞の培養に関して、マイクロキャリアやセルローススポンジ等、他の浮遊型培養担体と共存させることもできる。
　本発明の方法において、培養に用いるシステムの形状、規模などは特に限定されず、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ　セルファクトリー等が含まれる。なお、本発明においてポリイミド多孔質膜を用いることにより、生来浮遊培養が可能でなかった細胞についても浮遊培養向け装置にて、浮遊培養類似状態での培養を行うことが可能になった。浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコや回転培養等が使用可能である。また、同様の機能を実現出来る環境として、ＶＥＲＩＴＡＳ社のＦｉｂｅｒＣｅｌｌ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍの様な中空糸培養も使用することが可能である。
　本発明において、細胞を、静置培養条件下で培養してもよい。間歇的に培地を交換する事で、産生された有用物質を単離する事が可能である。シングルユース培養バッグを用いる静置培養も、ポリイミド多孔質膜を適用する事で、効率面が飛躍的に向上する。
　本発明において、細胞を回転培養又は攪拌条件下で培養してもよい。シングルユース培養バッグを継続的に揺する事で、非常に大きなスケールにも対応可能となる。回転培養・スピナーフラスコでの攪拌培養も同様である。また、これらの各方法に、連続的もしくは間歇的な培地交換システムを取り付け、長期培養を指向する事も可能である。
　本発明において、細胞を連続的に培養してもよい。例えば、本発明の方法における培養は、ポリイミド多孔質膜上に連続的に培地を添加し回収するような連続循環もしくは開放型の装置を用いて、空気中にポリイミド多孔質膜シートを露出させるような型式で実行することも可能である。
　本発明において、細胞の培養は、細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系で行ってもよい。その際、細胞培養培地が細胞培養培地供給手段と細胞培養容器との間を循環する系であることができる。
　本発明は、細胞培養装置をインキュベータ内に設置し、細胞を培養することを含む、態様を含む。細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系で行う場合、その系は、細胞培養容器である培養ユニットと細胞培養培地供給手段である培地供給ユニットとを含む細胞培養装置であってよく、ここで、培養ユニットは細胞を担持するための１又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットであり、培地供給ユニットは培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットである、細胞培養装置であってよい。
　また、上記細胞培養装置において、培養ユニットは空気供給口及び空気排出口を備えない培養ユニットであってよく、また、空気供給口及び空気排出口を備えた培養ユニットであってよい。培養ユニットは空気供給口及び空気排出口を備えないものであっても、細胞の培養に必要な酸素等が培地を通じて十分に細胞に供給される。さらに、上記細胞培養装置において、培養ユニットが培地排出ラインをさらに備え、ここで培地排出ラインの第一の端部は培地収納容器に接続し、培地排出ラインの第二の端部は培養ユニットの培地排出口を介して培養ユニット内に連通し、培地が培地供給ユニットと培養ユニットとを循環可能であってよい。
　７．細胞による物質の産生
　本発明は、上述したように細胞を培養することにより、細胞より所望の物質を産生させる。産生された物質が、細胞内に留まる物質であっても、細胞から分泌される物質であってもよい。産生された物質は、物質の種類、性質に応じて公知の方法により回収することが可能である。細胞から分泌される物質の場合、細胞培養培地から物質を回収することができる。産生された物質が細胞内に留まる物質の場合、細胞溶解剤等を用いた化学的処理、超音波処理、ホモジナイザー、破砕用ディスポチューブ等を用いた物理的処理などの公知の方法により細胞を破壊することにより、物質を細胞外に出して回収することが可能である。細胞を破壊する方法は、細胞の種類、物質の種類等に応じて適宜当業者が適用可能である。
　ＩＩ．物質産生装置
　本発明はまた、ポリイミド多孔質膜を含む、本発明の方法に使用するための、細胞培養により物質を産生する装置に関する。本発明の物質産生装置において、ポリイミド多孔質膜は固定されて用いられてもよく、あるいは細胞培養培地中に浮遊して用いられてもよく、培地中に置かれても、培地から露出しても良い。物質産生装置において、２以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層されてもよい。積層された集合体や集積体は、培地中に置かれても培地から露出していてもかまわない。
　本発明の細胞培養による物質産生装置としては、ポリイミド多孔質膜を含むものであれば任意の形態を取ってよく、公知の細胞培養装置を用いることが可能である。培養装置の形状、規模などは特に限定されず、シャーレ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ　セルファクトリー等が含まれる。なお、本発明においてポリイミド多孔質膜を用いることにより、生来浮遊培養が可能でなかった細胞についても浮遊培養向け装置にて、浮遊培養類似状態での培養を行うことが可能になった。浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコや回転培養等が使用可能である。また、同様の機能を実現出来る環境として、ＶＥＲＩＴＡＳ社のFiberCell （登録商標） Systemの様な中空糸培養も使用する事が可能である。
　本発明の培養細胞による物質産生装置は、メッシュ上のシートに連続的に培地を添加し回収する様な、連続循環もしくは開放型の装置で、空気中にポリイミド多孔質膜シートを露出させる様な型式で実行する事も可能である。
　本発明の細胞産生した物質を回収するための手段をさらに設けてもよい。例えば、循環式添加培地に半透膜等を直結させる事で、乳酸等の不要物を除きながら、糖質やアミノ酸類を追加して、効率良い長時間培養法兼不要物除去法を構築する事も可能である。
　ＩＩＩ．キット
　本発明はさらに、ポリイミド多孔質膜を含む、本発明の方法に使用するためのキットに関する。
　本発明のキットは、ポリイミド多孔質膜の他に、細胞培養、物質産生、物質回収に必要な構成要素を適宜含みうる。例えば、ポリイミド多孔質膜に適用する細胞、細胞培養培地、連続的培地供給装置、連続的培地循環装置、ポリイミド多孔質膜を支持する足場もしくはモジュール、細胞培養装置、物質産生を確認する為のＥＬＩＳＡ、細胞破壊手段（例えば、細胞溶解剤、破砕用ディスポホモジナイザー）、物質回収手段（例えば、限外濾過遠心チューブ、共沈用試薬セット及びチューブ、抗体等の試薬）、キットの取り扱い説明書などが含まれる。
　限定されるわけではないが、一態様として、透明なパウチ内に滅菌されたポリイミド多孔質膜が単独で又は複数枚保存され、そのままで細胞培養に使用可能な形態を含むパッケージや、あるいは、同パウチ内にポリイミド多孔質膜と共に滅菌液体が封入されており、効率的吸込み播種が可能になっている膜・液体の一体型形態のキットを含む。
　ＩＶ．使用
　本発明はさらに、ポリイミド多孔質膜の上述した本発明の方法のための使用、を含む。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。以後、特に記述しない場合には、「ポリイミド多孔質膜」は総膜厚２５μｍ、空孔率７３％のポリイミド多孔質膜をいうものとする。当該ポリイミド多孔質膜は、２つの異なる表面層（Ａ面及びＢ面）と、当該２つの表面層の間に挟まれたマクロボイド層とを有した。Ａ面に存在する穴の平均孔径は６μｍであり、Ｂ面に存在する穴の平均孔径は４６μｍであった。
　なお、以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ－ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’－ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。
　＜使用した細胞、材料等＞
・正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＬＯＮＺＡ社　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｃｏｄｅ　ＣＣ－２５１１）
・正常ヒト線維芽細胞様滑膜細胞ＨＦＬＳ（ＣＥＬＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＩＮＣ．社）
・慢性関節リウマチ患者由来線維芽細胞様滑膜細胞ＨＦＬＳ－ＲＡ（ＣＥＬＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＩＮＣ．社）
・ＨｅｐＧ２（ＣＥＴ(Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ,　ＩＮＣ.)社、ＨＥＰＧ２－５００）
・ＣＨＯ－Ｋ１（パブリックヘルスイングランド　ｃａｔ.　８５０５１００５）
・ＣＨＯ　ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１２４４５）
・ＣＨＯ－Ｋ１用培地（和光純薬工業株式会社　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２　０８７－０８３３５）
・ＣＨＯ　ＤＰ－１２用培地（和光純薬工業株式会社　ＩＭＤＭ　０９８－０６４６５）
・Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ８（株式会社同仁化学研究所　ＣＫ０４）
・ステンレスメッシュ（久宝金属株式会社　６０メッシュ　Ｅ９１１７）
・２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　社　ｃａｔ．　１０３）
・Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ－Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ　ＢＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ(Ｘ１００)（和光純薬工業株式会社　１６１－２３１８１）
・顕微鏡名、使用した画像ソフト名
Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ　社製　ＬＳＭ　７００　使用ソフト　ＺＥＮ
　実施例１　正常ヒト皮膚線維芽細胞による自発的物質産生
　本実施例では、正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いて、ポリイミド多孔質膜への播種を行い細胞培養を行った後、シャーレ内のフィブロネクチンの産生量を確認した。
　２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器に細胞培養培地（２％ＦＢＳ、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｍｅｄｉａ、ＬＯＮＺＡ社製）１ｍｌを加え、１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜のメッシュ構造のＡ面を上にして培地に浸漬させる。別途、培地１ｍｌあたり４．２×１０6個の正常ヒト皮膚線維芽細胞（そのうち、生細胞は４．２×１０6個、死細胞は４．０×１０4個、生細胞率９９％）を懸濁した、正常ヒト皮膚線維芽細胞懸濁液を準備した。シートあたり細胞懸濁液を４×１０4個／ｃｍ2ずつ上記正方形容器中の細胞培養培地に添加し、この正方形容器中で１４日間培養した。また、培地１ｍｌあたり３．０×１０6個の正常ヒト皮膚線維芽細胞（そのうち、生細胞は２．９×１０6個、死細胞は１．６×１０5個、生細胞率９５％）を懸濁した、正常ヒト皮膚線維芽細胞懸濁液を準備した。５ｃｍ2シャーレに１ｍｌの細胞培養培地を加え上記の細胞懸濁液を１．０×１０4個／ｃｍ2添加して４３日間培養し、シャーレにおいて細胞培養を行った。
　上記で細胞培養したシートを１枚入れた５ｃｍ2シャーレおよび上記でシートを入れずに細胞培養した５ｃｍ2シャーレを準備した。
　培地上清を廃棄し新たに細胞培養培地をそれぞれに１ｍｌ加え、５％のＣＯ2、３７℃で２日間インキュベートし、培地上清を回収した。回収した上清に含まれるフィブロネクチン量をＥＬＩＳＡ法により定量した（表２）。表２は、ヒト皮膚線維芽細胞を用いたフィブロネクチンの自発的産生量について、ポリイミド多孔質膜シートとシャーレを、各々培養足場として用いた場合の結果を示している。表２に示した通り、ポリイミド多孔質膜シートを用いた場合の方がシャーレを用いた場合より、フィブロネクチンの自発的産生量は２倍以上多かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例２　正常ヒト線維芽細胞様滑膜細胞ＨＦＬＳ及び慢性関節リウマチ患者由来線維芽細胞様滑膜細胞ＨＦＬＳ－ＲＡによる自発的物質産生
　本実施例では、正常ヒト線維芽細胞様滑膜細胞ＨＦＬＳ及び慢性関節リウマチ患者由来線維芽細胞様滑膜細胞ＨＦＬＳ－ＲＡを用いて、ポリイミド多孔質膜への播種を行い細胞培養を行った後、シャーレ内のＩＬ－６の産生量を確認した。
　２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器に細胞培養培地（１０％ＦＢＳ、Ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＥＬＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＩＮＣ．社製）１ｍｌを加え、１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜のメッシュ構造のＡ面を上にして培地に浸漬させる。別途、培地１ｍｌあたり１．５×１０6個のＨＦＬＳ細胞（そのうち、生細胞は１．４×１０6個、死細胞は２．０×１０4個、生細胞率９９％）を懸濁した、ＨＦＬＳ細胞懸濁液を準備した。シートあたり細胞懸濁液を４．０×１０4個／ｃｍ2ずつ上記正方形容器中の細胞培養培地に添加し、この正方形容器中で１３日間培養した。また、５ｃｍ2シャーレに１ｍｌの細胞培養培地を加え、別途、培地１ｍｌあたり５．９×１０5個のＨＦＬＳ細胞（そのうち、生細胞は５．７×１０5個、死細胞は２．０×１０4個、生細胞率９７％）を懸濁した、ＨＦＬＳ細胞懸濁液を準備した。細胞懸濁液を７×１０3個／ｃｍ2添加して８日間培養し、シャーレにおいて細胞培養を行った。
　同様に、培地１ｍｌあたり２．２×１０6個のＨＦＬＳ－ＲＡ細胞（そのうち、生細胞は２．０×１０6個、死細胞は１．６×１０5個、生細胞率９３％）を懸濁した、ＨＦＬＳ－ＲＡ細胞懸濁液を準備した。シートあたり細胞懸濁液を４．０×１０4個／ｃｍ2ずつ上記正方形容器中の細胞培養培地に添加し、この正方形容器中で１３日間培養した。また、５ｃｍ2シャーレに１ｍｌの細胞培養培地を加え、別途、培地１ｍｌあたり５．８×１０5個のＨＦＬＳ－ＲＡ細胞（そのうち、生細胞は５．６×１０5個、死細胞は２．０×１０4個、生細胞率９７％）を懸濁した、ＨＦＬＳ－ＲＡ細胞懸濁液を準備した。細胞懸濁液を７．０×１０3個／ｃｍ2添加して８日間培養し、シャーレにおいて細胞培養を行った。
　５ｃｍ2シャーレを２つ用意し、上記で細胞培養したＨＦＬＳシート、ＨＦＬＳ－ＲＡシートをそれぞれ１枚入れた。さらに、上記でシートを入れずに細胞培養したＨＦＬＳ、ＨＦＬＳ－ＲＡの５ｃｍ2シャーレを準備した。
　培地上清を廃棄し新たに細胞培養培地をそれぞれに１ｍｌ加え、５％のＣＯ2、３７℃で３日間インキュベートし、培地上清を回収した。回収した上清に含まれるＩＬ－６量をＥＬＩＳＡ法により定量した（表３）。表３では、正常ヒト線維芽細胞様滑膜細胞を用いたＩＬ－６の自発的産生量について、ポリイミド多孔質膜シートとシャーレを、各々培養足場として用いた場合の結果を示している。表３に示した通り、ポリイミド多孔質膜シートを用いた場合の方がシャーレを用いた場合より、ＩＬ－６の自発的産生量は正常ヒト線維芽細胞様滑膜細胞ＨＦＬＳの場合で約２５倍以上、慢性関節リウマチ患者由来線維芽細胞様滑膜細胞ＨＦＬＳ－ＲＡの場合で、約５倍以上多かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例３　ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞による自発的アルブミン産生
　本実施例では、ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞をポリイミド多孔質膜へ播種して細胞培養を行った後、一定期間中に自発的に培地中へ放出されるアルブミンの産生量を確認した。
　２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器に細胞培養培地（１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＧ２．Ｅ．ＭＥＤＩＡ－４５０、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ社製）１ｍｌを加え、１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜のメッシュ構造のＡ面を上にして培地に浸漬させる。別途、培地１ｍｌあたり１．６×１０6個のＨｅｐＧ２細胞（そのうち、生細胞は１．４×１０6個、死細胞は１．３×１０5個、生細胞率９２％）を懸濁した、ＨｅｐＧ２細胞懸濁液を準備した。シートあたり細胞懸濁液を２×１０4個／ｃｍ2ずつ上記正方形容器中の細胞培養培地に添加し、この正方形容器中で２１日間培養した。また、１０ｃｍ2シャーレに２ｍｌの細胞培養培地を加え上記の細胞懸濁液を２×１０4個／ｃｍ2添加して２１日間培養し、シャーレにおいて細胞培養を行った。
　上記で細胞培養したシートを３枚、１枚入れた１０ｃｍ2シャーレおよび上記で細胞培養した１０ｃｍ2シャーレを準備した。培地上清を廃棄し新たに細胞培養培地をそれぞれに２ｍｌ加え、５％のＣＯ2、３７℃で３時間インキュベートし、培地上清を回収した。回収した上清に含まれるアルブミン量をＥＬＩＳＡ法により定量した（表４、５）。表４及び５は、ＨｅｐＧ２細胞を用いたアルブミンの自発的産生量について、ポリイミド多孔質膜シートとシャーレを、各々培養足場として用いた場合の結果を示している。表４は、膜の単位面積あたりのアルブミン産生量を、そして、表５は、１細胞あたりのアルブミンの産生量を示している。共存する膜の枚数と細胞あたりのアルブミン産生量に相関が無く、ポリイミド多孔質膜あたりの産生量は一定となっているので、細胞数の上昇と共に、物質産生が比例的に進展する事が予想される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　実施例４　Ｇ－ＣＳＦ産生ＣＨＯ－Ｋ１細胞株による物質産生
　本実施例では、Ｇ－ＣＳＦ産生ＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いた細胞培養により、産生され、培地中に放出されたＧ－ＣＳＦの量を測定した。
　培地１ｍｌあたり４．１×１０6個のＧ－ＣＳＦ産生ＣＨＯ－Ｋ１細胞（そのうち、生細胞は３．６×１０6個、死細胞は４．１×１０5個、生細胞率９０％）の懸濁液を準備した。８×１２．５ｃｍの長方形のポリイミド多孔質膜のＡ面に対しシートあたり上記細胞懸濁液を４．１×１０4個／ｃｍ2ずつ播種し、１０×１４ｃｍの滅菌された長方形容器に細胞培養培地（１％ＦＢＳ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、和光純薬工業株式会社）２０ｍｌを加え培地に浸漬させた。この長方形容器中で週２回の培地交換を行い、７日間培養した。培養したシートの培地上清を除去し、新たに細胞培養培地を２０ｍｌ加え、５％のＣＯ2、３７℃で２４時間インキュベートし、培地上清を回収した。回収した上清に含まれるＧ－ＣＳＦ量をＥＬＩＳＡ法により定量した（表６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　実施例５　抗ヒトＩＬ－８産生ＣＨＯ　ＤＰ－１２細胞による物質産生
　本実施例では、ヒト抗ＩＬ－８抗体産生ＣＨＯ　ＤＰ－１２細胞を用いた細胞培養により、産生され培地中に放出された抗ヒトＩＬ－８抗体の量を測定する事で、ポリイミド多孔質膜を用いる細胞培養システムの効率を調べた。比較例として、通常のシャーレでの培養における同抗体産生量を調査した。
　２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器に細胞培養培地（２％ＦＢＳ、ＩＭＤＭ、和光純薬工業株式会社）０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にしてそれぞれ浸漬させた。１枚のシートあたり４×１０4個のヒト抗ＩＬ－８産生ＣＨＯ　ＤＰ－１２細胞懸濁液をそれぞれ培地内シート上に添加し、１週間に２回の割合で培地交換し、細胞培養を継続的に実施した。８５日間細胞培養した後、ＣＣＫ８を用いて細胞数を測定した。細胞培養したシート２枚を１枚ずつ１０ｃｍ2シャーレに入れ、細胞培養培地をそれぞれ２ｍｌ加え、５％のＣＯ2、３７℃で２４時間インキュベートし、培地上清を回収した。回収した上清に含まれる抗ヒトＩＬ－８抗体量をＥＬＩＳＡ法により定量した（表７のポリイミド多孔質膜１およびポリイミド多孔質膜２）。
　また、６０ｃｍ2シャーレに１２ｍｌの細胞培養培地を加え、培地１ｍｌあたり５．３×１０6個のヒト抗ＩＬ－８産生ＣＨＯ　ＤＰ－１２細胞（そのうち、生細胞は５．３×１０6個、死細胞は２．８×１０5個、生細胞率９５％）の懸濁液を準備し、２．０×１０4個／ｃｍ2ずつ播種した。２４時間培養後に培地上清を回収した。回収した上清に含まれるヒト抗ＩＬ－８抗体量をＥＬＩＳＡ法により定量した（表７のシャーレ１およびシャーレ２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　驚くべきことに、培養足場としてポリイミド多孔質膜を使用した場合、シャーレを使用した場合と比較して、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の１細胞当たりの物質産生量が３倍以上増大した。
　実施例６　抗ヒトＩＬ－８産生ＣＨＯ　ＤＰ－１２細胞による物質産生
　本実施例では、ヒト抗ＩＬ－８抗体産生ＣＨＯ　ＤＰ－１２細胞を用いた細胞培養において、ポリイミド多孔質膜シートごと培養細胞を凍結し、再度融解した後、培養したケースで、通常の培養を続けた場合に産生され、培地中に放出される抗ヒトＩＬ－８抗体量と変化が生じるか否かを調べた。
　２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器に細胞培養培地（２％ＦＢＳ、ＩＭＤＭ、和光純薬工業株式会社）０．５ｍｌを加え、滅菌した６枚の１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にしてそれぞれ浸漬させた。１枚のシートあたり４×１０4個のヒト抗ＩＬ－８産生ＣＨＯ　ＤＰ－１２細胞懸濁液をそれぞれ培地内シート上に添加し、１週間に２回の割合で培地交換し、細胞培養を継続的に実施した。７８日間細胞培養した後、ＣＣＫ８を用いて細胞数を測定した。その後、細胞培養により細胞を担持したポリイミド多孔質膜シート６枚のうち２枚を、１枚ずつ１０ｃｍ2シャーレに入れ、細胞培養培地をそれぞれ２ｍｌ加え、５％のＣＯ2、３７℃で２４時間インキュベートし、培地上清を回収した。回収した上清に含まれる抗ヒトＩＬ－８抗体量をＥＬＩＳＡ法により定量した（表８の非凍結シート１及び非凍結シート２）。
　また、細胞培養により細胞を担持したポリイミド多孔質膜シート６枚のうち４枚を、滅菌条件下で凍結保存バッグ移し、そこに細胞凍結保存液であるセルバンカー３ｍｌを加えた。プログラムフリーザーで２条件（１分ごとに１℃、もしくは、１０分ごとに１℃）にて－８０℃に凍結後、－８０℃にて２４時間保存し、液体窒素中に移動させた。３日後、バックを３７℃に加温して内容物を融解し、培地２ｍｌを入れてインキュベータ内に２４時間放置した後、２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器にシートを移し、細胞培養培地１ｍｌを加え３日間培養した。その後、シートを１枚ずつ１０ｃｍ2シャーレに入れ、細胞培養培地をそれぞれ２ｍｌ加え、５％のＣＯ2、３７℃で２４時間インキュベートし、培地上清を回収した。回収した上清に含まれる抗ヒトＩＬ－８抗体量をＥＬＩＳＡ法により定量した（表８の凍結シート１～４）。凍結による抗ＩＬ－８産生量の変化は認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　実施例７　ヒト皮膚線維芽細胞長期培養時の気相継代による増殖確認
　直径６ｃｍのシャーレに２ｍｌの培地を加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜のメッシュ構造のＡ面に１枚のシートあたり４×１０4個のヒト皮膚線維芽細胞を播種し、１ヶ月培養した。その後、シートを４分の１に切断し、更に培養を継続して合計２３０日培養した。その後、３．５ｃｍディッシュ中央に、１．４ｃｍ角のステンレスメッシュを３枚重ねて設置し、その上に、前記ポリイミド多孔質膜を置き、滅菌した１．４ｃｍ角の空のポリイミド多孔質膜２枚で挟んだ。その状態で培地１ｍｌを加えると、培地は、シートと同様の高さとなった。この状態でＣＯ2インキュベータ内に移動させ、１週間に２回の割合で培地交換して細胞培養を継続的に実施した。
　培養７日後、各シートを１枚ずつに分け、単一のシートとして培養を継続した。７日、１０日、１６日、２１日、２８日、４２日、５６日後にＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、元のシートと後から接地させた空のポリイミド多孔質膜について、細胞の増殖挙動をＣＣＫ８での染色法を用いて観察した。ヒト皮膚線維芽細胞を長期間培養したポリイミド多孔質膜から、効率的に細胞が空のポリイミド多孔質膜に移動し、継続的に増殖してゆく挙動が観察された。結果を図１に示す。
　気相継代を経ずにポリイミド多孔質膜上で長期培養を２９４日間継続したヒト皮膚線維芽細胞培養シート及び気相継代を２３０日目に経て同期間培養した基盤シート及び気相培養により継代後５６日間培養した上下２枚のシートについて、生息するヒト皮膚線維芽細胞が産生するフィブロネクチンを、ＥＬＩＳＡ測定にて、シートを培養した培地中へ２４時間で放出したフィブロネクチンの量で比較した。培養期間及び気相継代に影響されず、安定なフィブロネクチンの産生を確認した。結果を表９に示す。比較対象として、ポリイミド多孔質膜にて１３日間培養したシート２枚から産生されたフィブロネクチン量を併記した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　実施例８　ヒト皮膚線維芽細胞の凍結及び物質産生
　２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器に細胞培養培地０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にしてそれぞれ浸漬させた。１枚のシートあたり４×１０4個のヒト皮膚線維芽細胞懸濁液を培地内シート上にそれぞれ添加し、ＣＯ2インキュベータ内で培養を開始した。１週間に２回の割合で培地交換して細胞培養を継続的に実施し、４９日間細胞培養した後に、ＣＣＫ８を用いて細胞数を測定したところ、９．１×１０4個であった。
　この、細胞が生育しているシートを凍結保存バックにセルバンカー３ｍｌを加えた中に入れ、プログラムフリーザーで１０分ごとに１℃下げて－８０℃に凍結後、－８０℃にて２４時間保存し、液体窒素中に移動させた。５日後、バックを３７℃に加温して内容物を融解し、培地２ｍｌ入れてインキュベータ内に２４時間放置した。２４時間後、５日後、８日後、１３日後、２１日後、２９日後及び３５日後にＣＣＫ８を用いて細胞数を測定した。２４時間後、８日後、２１日後及び３５日後の比活性は、３４％、９１％、１０５％及び１５２％であった。３５日培養後に、同シートに生育するヒト皮膚線維芽細胞のフィブロネクチン産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を表１０に示す。なお、比較対象として、凍結せずにポリイミド多孔質膜にて１３日間培養したシート２枚から産生されたフィブロネクチン量を併記した。凍結による損傷を受けず、物質産生が継続される事を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012

Claims (22)

  1. 　細胞を用いて物質を産生する方法であって、細胞をポリイミド多孔質膜に適用し細胞を培養し、細胞により物質を産生させること、を含む前記方法。
  2. 　前記物質が、タンパク質、糖タンパク質及びウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 　細胞を、静置培養条件下で培養する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　細胞を、回転培養又は攪拌条件下で培養する、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　細胞を、連続的に培養する、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　細胞培養装置をインキュベータ内に設置し、細胞を培養することを含む、
    　ここにおいて、前記細胞培養装置は、
    　　細胞を担持するための１又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットと、
    　　培地供給ユニットであって、培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットと、
    を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記細胞培養装置が、空気供給口、空気排出口及び酸素透過膜を有しない、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理する事により得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記ポリイミド多孔質膜が、２つの異なる表層面とマクロボイド層を有する多層構造のポリイミド多孔質膜である、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　前記ポリイミド多孔質膜の膜厚が７５μｍ以下である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記ポリイミド多孔質膜を
    　ｉ）折り畳んで、
    　ｉｉ)ロール状に巻き込んで、
    　ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
    　ｉｖ）縄状に結んで
    細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　２以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　細胞が、物質を発現するように遺伝子工学技術により形質転換されている、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　細胞が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　動物細胞が、脊椎動物門に属する動物由来の細胞である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣組織由来細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓由来株化細胞（Ｖｅｒｏ細胞）、ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２細胞）、イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来の細胞株（ＭＤＣＫ細胞）及びヒト肝癌組織由来樹立細胞株（ｈｕＧＫ-１４）からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 　細菌が、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  19. 　ポリイミド多孔質膜を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法に使用するための物質産生装置。
  20. 　２以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層している、請求項１９に記載の物質産生装置。
  21. 　ポリイミド多孔質膜を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法に使用するためのキット。
  22. 　ポリイミド多孔質膜の請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法のための使用。
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