JP6288312B2 - ポリイミド多孔質膜を用いる細胞の大量培養方法、装置及びキット - Google Patents
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Description
細胞は生体内では一般に三次元的な構造をとった集団として存在する。一方で、細胞を人工環境において培養する場合は、細胞が培養容器底面に単層状に張り付く形で二次元的に培養される古典的な平面培養法や、液体培養液中に細胞を分散させた状態で培養する浮遊培養法が一般的に用いられる。平面培養法に用いられる細胞については、比較的接着性の高い細胞が適しているが、適した細胞を用いた場合でも、培養環境の違いにより、細胞の性質が大きく変化することがある。浮遊培養法についても、適した細胞と適さない細胞が存在する。
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称である。芳香族ポリイミドは、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された高分子を意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
[態様1]
細胞の大量培養方法であって、
(1)細胞をポリイミド多孔質膜に適用することと、
(2)細胞を適用したポリイミド多孔質膜を細胞培養培地に適用し、培養することと
を含む、方法。
[態様2]
2以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、態様1に記載の方法。
[態様3]
ポリイミド多孔質膜を
i)折り畳んで、
ii)ロール状に巻き込んで、
iii)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
iv)縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、態様1又は2に記載の方法。
[態様4]
工程(2)における培養において、ポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない、態様1〜3のいずれか一項に記載の方法。
[態様5]
工程(2)における培養において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の10000倍又はそれより少ない、態様1〜4のいずれか一項に記載の方法。
[態様6]
工程(2)における培養において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の100倍又はそれより少ない、態様1〜5のいずれか一項に記載の方法。
[態様7]
工程(2)における培養が、細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系で行われる、態様1〜6のいずれか一項に記載の方法。
[態様8]
細胞培養培地が細胞培養培地供給手段と細胞培養容器との間を循環する、態様7に記載の方法。
[態様9]
態様7又は8に記載の方法であって、前記系が、細胞培養容器である培養ユニットと細胞培養培地供給手段である培地供給ユニットとを含む細胞培養装置であり、ここで
培養ユニットは細胞を担持するための1又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットであり、
培地供給ユニットは培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットである、
方法。
[態様10]
培養ユニットが空気供給口及び空気排出口を備えない培養ユニットである、態様9に記載の方法。
[態様11]
培養ユニットが培地排出ラインをさらに備え、ここで培地排出ラインの第一の端部は培地収納容器に接続し、培地排出ラインの第二の端部は培養ユニットの培地排出口を介して培養ユニット内に連通し、培地が培地供給ユニットと培養ユニットとを循環可能である、態様9又は10に記載の方法。
[態様12]
細胞が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、態様1〜11のいずれか一項に記載の方法。
[態様13]
動物細胞が、脊椎動物門に属する動物由来の細胞である、態様12に記載の方法。
[態様14]
細菌が、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアからなる群から選択される、態様12に記載の方法。
[態様15]
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
[態様16]
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、態様15に記載の方法。
[態様17]
ポリイミド多孔質膜が、2つの異なる表層面とマクロボイド層を有する多層構造のポリイミド多孔質膜である、態様15又は16に記載の方法。
[態様18]
ポリイミド多孔質膜を含む、態様1〜17のいずれか一項に記載の方法に使用するための細胞培養装置。
[態様19]
2以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層している、態様18に記載の細胞培養装置。
[態様20]
ポリイミド多孔質膜を含む、態様1〜17のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキット。
[態様21]
態様1〜17のいずれか一項に記載の方法のための、ポリイミド多孔質膜の使用。
[態様22]
細胞培養装置であって、
細胞を担持するための1又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットと、
培地供給ユニットであって、培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットと、
を含む細胞培養装置。
[態様23]
培養ユニットが、空気供給口、空気排出口、及び酸素交換膜を備えない、態様22に記載の細胞培養装置。
[態様24]
培養ユニットが、空気供給口及び空気排出口、又は酸素交換膜をさらに備えた、態様22に記載の細胞培養装置。
[態様25]
空気供給口及び空気排出口が、5%CO2ガス含有空気供給口及び5%CO2ガス含有空気排出口である、態様24に記載の細胞培養装置。
[態様26]
培養ユニットが、ポリイミド多孔質膜を撹拌するための手段を有さない、態様22〜25のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
[態様27]
培養ユニットが、ポリイミド多孔質膜を撹拌するための手段をさらに有する、態様22〜25のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
[態様28]
培養ユニットが培地排出ラインをさらに備え、ここで培地排出ラインの第一の端部は培地収納容器に接続し、培地排出ラインの第二の端部は培養ユニットの培地排出口を介して培養ユニット内に連通し、培地が培地供給ユニットと培養ユニットとを循環可能である、態様22〜27のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
[態様29]
培養ユニットが培地排出ラインをさらに備え、ここで培地排出ラインの第一の端部は培地回収ユニットに接続し、培地排出ラインの第二の端部は培養ユニットの培地排出口を介して培養ユニット内に連通し、排出された培地を培地回収ユニット内に回収可能である、態様22〜27のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
[態様30]
培養ユニットを振盪するための手段をさらに含む、態様22〜29のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
[態様31]
培養ユニットが可撓性バッグからなる、態様22〜30のいずれかに記載の細胞培養装置。
[態様32]
可撓性バッグがガス透過性プラスチックバッグである、態様31に記載の細胞培養装置。
[態様33]
1又は複数のポリイミド多孔質膜が、水平に対して45度以下の角度で傾斜した剛体の上に載置され、ポリイミド多孔質膜の上端部近傍から培地が供給されるよう培地供給ラインの第二の端部が設置され、ポリイミド多孔質膜の下端部近傍から培地が排出されるよう培地排出ラインの第二の端部が設置されている、態様22〜32のいずれかに記載の細胞培養装置。
[態様34]
剛体が金属メッシュである、態様33に記載の細胞培養装置。
[態様35]
1又は複数のポリイミド多孔質膜と剛体とがハウジング内に収容され、ハウジングが培養ユニット内に収容されている、態様33又は34に記載の細胞培養装置。
[態様36]
1又は複数のポリイミド多孔質膜の上面の一部又は全部を被覆するように、ポリイミド多孔質膜よりも平均孔径の大きい多孔質シートがさらに載置される、態様33〜35のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
[態様37]
多孔質シートが不織布、ガーゼ、及びスポンジからなる群より選択される、態様36に記載の細胞培養装置。
[態様38]
培地供給ラインの第二の端部の近傍に脱泡ユニットがさらに設置されている、態様33〜37のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
[態様39]
2以上のポリイミド多孔質膜が上下に積層される、態様22〜38のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
[態様40]
1又は複数のポリイミド多孔質膜が折り畳まれている、態様22〜39のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
[態様41]
1又は複数のポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、培地によって湿潤している、態様22〜40のいずれかに記載の細胞培養装置。
[態様42]
1又は複数のポリイミド多孔質膜表面の一部分又は全体が、培地の液相に接触していない、態様22〜41のいずれかに記載の細胞培養装置。
[態様43]
培養ユニット内に含まれる培地の体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の10000倍又はそれより少ない、態様22〜42のいずれかに記載の細胞培養装置。
[態様44]
培養ユニット内に含まれる培地の体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の100倍又はそれより少ない、態様22〜43のいずれかに記載の細胞培養装置。
[態様45]
培養ユニット内に含まれる培地の体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の5倍又はそれより少ない、態様22〜43のいずれかに記載の細胞培養装置。
[態様46]
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、態様22〜45のいずれかに記載の細胞培養装置。
[態様47]
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理する事により得られる着色したポリイミド多孔質膜である、態様46に記載の細胞培養装置。
[態様48]
態様22〜47のいずれか一項に記載の細胞培養装置をインキュベータ内に設置し、細胞を培養することを含む、細胞の培養方法。
[態様49]
態様22〜47のいずれかに記載の細胞培養装置をインキュベータ内に設置し、細胞を培養すること、及び
細胞に接触した培地を連続的又は間歇的に回収すること
を含む、細胞によって産生された物質を回収するための方法。
[態様50]
態様22〜47のいずれか一項に記載の細胞培養装置のためのポリイミド多孔質膜の使用。
[態様51]
細胞によって産生された物質を回収するための、態様22〜47のいずれか一項に記載の細胞培養装置の使用。
ポリイミド多孔質膜は微親水性の多孔質特性を有するため、ポリイミド多孔質膜内に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境が保たれる。そのため、従来の細胞培養装置と比較しても極めて少量の培地でも、細胞の生存及び増殖を達成することができる。
また、本発明では、ポリイミド多孔質膜に近接して連続的又は間歇的に培地を供給することにより、培地を滞留させることなく連続的に細胞を培養することも可能となる。
本発明は、細胞の大量培養方法に関する。なお、国際出願番号PCT/JP2014/070407の全内容を、参照により本明細書に援用する。
細胞のポリイミド多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリイミド多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
(B)前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を乗せ、
放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様;並びに、
(C)前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
限定されるわけではないが、好ましくは、ポリイミド多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の好ましい態様において、生細胞が前記ポリイミド多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。
本発明の方法に利用し得る細胞の種類は特に限定されず、任意の細胞の増殖に利用可能である。
種子植物細胞が由来する植物は、単子葉植物、双子葉植物のいずれも含まれる。限定されるわけではないが、単子葉植物には、ラン科植物、イネ科植物(イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ソルガム等)、カヤツリグサ科植物などが含まれる。双子葉植物には、キク亜綱、モクレン亜綱、バラ亜綱など多くの亜綱に属する植物が含まれる。
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
本発明において着色前駆体とは、250℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
1)1,4−ジアミノベンゼン(パラフェニレンジアミン)、1,3−ジアミノベンゼン、2,4−ジアミノトルエン、2,6−ジアミノトルエンなどのベンゼン核1つのべンゼンジアミン;
2)4,4’−ジアミノジフェニルエーテル、3,4’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’−ジメチル−4,4’−ジアミノビフェニル、2,2’−ジメチル−4,4’−ジアミノビフェニル、2,2’−ビス(トリフルオロメチル)−4,4’−ジアミノビフェニル、3,3’−ジメチル−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’−ジカルボキシ−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’,5,5’−テトラメチル−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、ビス(4−アミノフェニル)スルフィド、4,4’−ジアミノベンズアニリド、3,3’−ジクロロベンジジン、3,3’−ジメチルベンジジン、2,2’−ジメチルベンジジン、3,3’−ジメトキシベンジジン、2,2’−ジメトキシベンジジン、3,3’−ジアミノジフェニルエーテル、3,4’−ジアミノジフェニルエーテル、4,4’−ジアミノジフェニルエーテル、3,3’−ジアミノジフェニルスルフィド、3,4’−ジアミノジフェニルスルフィド、4,4’−ジアミノジフェニルスルフィド、3,3’−ジアミノジフェニルスルホン、3,4’−ジアミノジフェニルスルホン、4,4’−ジアミノジフェニルスルホン、3,3’−ジアミノベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジクロロベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジメトキシベンゾフェノン、3,3’−ジアミノジフェニルメタン、3,4’−ジアミノジフェニルメタン、4,4’−ジアミノジフェニルメタン、2,2−ビス(3−アミノフェニル)プロパン、2,2−ビス(4−アミノフェニル)プロパン、2,2−ビス(3−アミノフェニル)−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス(4−アミノフェニル)−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、3,3’−ジアミノジフェニルスルホキシド、3,4’−ジアミノジフェニルスルホキシド、4,4’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核2つのジアミン;
3)1,3−ビス(3−アミノフェニル)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニル)ベンゼン、1,4−ビス(3−アミノフェニル)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニル)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,4−ビス(3−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,3−ビス(3−アミノフェノキシ)−4−トリフルオロメチルベンゼン、3,3’−ジアミノ−4−(4−フェニル)フェノキシベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジ(4−フェニルフェノキシ)ベンゾフェノン、1,3−ビス(3−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,3−ビス(3−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,3−ビス〔2−(4−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼン、1,4−ビス〔2−(3−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼン、1,4−ビス〔2−(4−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核3つのジアミン;
4)3,3’−ビス(3−アミノフェノキシ)ビフェニル、3,3’−ビス(4−アミノフェノキシ)ビフェニル、4,4’−ビス(3−アミノフェノキシ)ビフェニル、4,4’−ビス(4−アミノフェノキシ)ビフェニル、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、2,2−ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核4つのジアミン。
これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、3,3’−ジアミノジフェニルエーテル、3,4’−ジアミノジフェニルエーテル、4,4’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、1,3−ビス(3−アミノフェニル)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニル)ベンゼン、1,4−ビス(3−アミノフェニル)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニル)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,4−ビス(3−アミノフェノキシ)ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス(アミノフェノキシ)フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
(i)ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
(ii)テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス(アミノフェノキシ)フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び/又は、
(iii)ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス(アミノフェノキシ)フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
ポリイミド多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、200点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式(1)に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
ポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図1に示す。図1は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の方法では、ポリイミド多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリイミド多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の細胞を培養することが可能となる。たとえば、ポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の細胞を培養することができる。また、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を、従来の方法よりも著しく減らすことも可能となる。
本発明の方法において、細胞の培養システム及び培養条件は、細胞の種類等に応じて適宜決定することができる。動物細胞、植物細胞、及び細菌の各細胞に適した培養方法が公知であり、当業者は任意の公知の方法を用いてポリイミド多孔質膜に適用した細胞を培養することができる。細胞培養培地も細胞の種類に応じて適宜調製することができる。
本発明の方法において、培養に用いるシステムの形状、規模などは特に限定されず、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、BD Falcon社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のNunc セルファクトリー等が含まれる。なお、本発明においてポリイミド多孔質膜を用いることにより、生来浮遊培養が可能でなかった細胞についても浮遊培養向け装置にて、浮遊培養類似状態での培養を行うことが可能になった。浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコや回転培養等が使用可能である。また、同様の機能を実現出来る環境として、VERITAS社のFiberCell(登録商標)Systemの様な中空糸培養も使用することが可能である。
培養ユニットは細胞を担持するための1又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットであり、
培地供給ユニットは培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットである
細胞培養装置であってよい。
本発明は、細胞培養装置であって、
細胞を担持するための1又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットと、
培地供給ユニットであって、培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットと、
を含む細胞培養装置に関する。なお、国際出願番号PCT/JP2014/070407の全内容を、参照により援用する。
本発明の細胞培養装置は、細胞を担持するための1又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットおよび培地供給ユニットを含む。
本発明はさらに、ポリイミド多孔質膜を含む、細胞の培養方法に使用するためのキットに関する。
IV.細胞によって産生された物質を回収するための方法
本発明は、上述した細胞培養装置をインキュベータ内に設置し、細胞を培養すること、及び、細胞に接触した培地を連続的又は間歇的に回収することを含む、細胞によって産生された物質を回収するための方法にも関する。本発明の方法によれば、細胞はポリイミド多孔質に保持されたままであるため、従来、細胞又は細胞から産生されたデブリス等を除くために行われる遠心分離操作や、フィルター等を用いることが必要なく、培養上清のみを回収することが可能となる。
V.細胞培養装置の使用
本発明は、細胞を培養するための、上述した細胞培養装置の使用にも関する。また、本発明は、細胞によって産生された物質を回収するための、上述した細胞培養装置の使用にも関する。
・ヒト線維芽細胞(LONZA社 product code CC−2511)
・CHO−K1(パブリックヘルスイングランド cat. 85051005)
・CHO DP−12(ATCC CRL−12445)
・ヒト線維芽細胞用培地(LONZA社 product code CC−3132)
・CHO−K1用培地(和光純薬工業株式会社 Ham’s F−12 087−08335)
・CHO DP−12用培地(和光純薬工業株式会社 IMDM 098−06465)
・3.5cmシャーレ(Falcon社 cat. 353001)
・20cm2シャーレ(Falcon社 cat. 353004)
・Cell Counting Kit 8(CCK8、株式会社同仁化学研究所 CK04)
・クライオチューブ(Thermo Fisher Scientific 社 1.8ml cat. 377267)
・2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific 社 cat. 103)
・Penicillin−Streptomycin−Amphotericin BSuspension(X100)(和光純薬工業株式会社 161−23181)
・顕微鏡名、使用した画像ソフト名
Carl Zeiss 社製 LSM 700 使用ソフト ZEN
・ヒトGCSF産生CHO−K1細胞株
委託業務により、以下の手順でヒトGCSF(顆粒球コロニー刺激因子)産生CHO−K1細胞株を得た。使用した細胞は、CHO−K1(パブリックヘルスイングランド cat. 85051005)である。以下工程に従い、ヒトGCSFを安定して発現する細胞株を入手した。
手順(i) ネオマイシン耐性遺伝子と合成ヒトGCSF遺伝子を導入したプラスミドの設計及び製造
手順(ii) トランスフェクショングレードプラスミド大量調製
手順(iii) 一過性遺伝子発現細胞の作成
手順(iv) 遺伝子安定発現株の作成、Real Time PCRによる発現遺伝子確認及びシングルクローン化
手順(v) 各クローンの目的タンパク質発現のELISAによる確認
こうして得られた細胞株から、産生が良好な細胞株;#42を選択し、以降の実験に使用した。
ヒト皮膚線維芽細胞を用いて、ポリイミド多孔質膜への播種を行った後、シャーレ内で大量培養を実施した。
本実施例では、CHO−K1細胞を用いて、ポリイミド多孔質膜への播種を行った後、シャーレ内で大量培養を実施した。
本実施例では、CHO−K1細胞を用いて、ポリイミド多孔質膜への播種を行った後、連続培養装置を用いて大量連続培養を実施した。
4cm×10cm角の正方形のポリイミド多孔質膜10枚を180℃30分で乾熱滅菌し、メッシュ構造のA面を上にして滅菌プレート上に置いた。別途、培地1mlあたり2.4×106個の0.5%FBSに馴化したCHO−K1細胞(そのうち、生細胞は2.3×106個、死細胞は9.0×104個、生細胞率96%)を懸濁した、CHO−K1細胞懸濁液5mlを準備した。細胞懸濁液を0.5mlずつ、上記の滅菌したポリイミド多孔質膜10枚にそれぞれ添加し、セルスクレーパーにて平準化した。数分間放置した後、シートを少し動かして懸濁液を通過させ、その後に、シートと同型の金属メッシュ上に細胞播種を完了したシート10枚を積層した。その後、積層したシート上に不織布を乗せ、培養装置内部に設置し、その上に培地供給ラインを据えて、37℃に設定したタイテック社製強制通気式CO2インキュベータに培養装置全体を移し、培養準備を完了した。
培養開始から12日目に培地循環を終了し、ポリイミド多孔質膜及び不織布を取り外した。取り外したポリイミド多孔質膜を集合体のまま、CCK8にてセルカウントを実施した所、合計で、2.6×108個の細胞を確認した。概算の細胞培養密度としては、1.7×108個/mlであった。細胞の育成したポリイミド多孔質膜を一部切り取ってホルマリン固定し、核(DAPI)、細胞膜(セルマスク)、及びアクチン(ファロイジン)染色を行った後の蛍光顕微鏡写真を図6に示す。馴化細胞を用いても、良好な細胞の増殖が確認された。
実施例4から引き続き、CHO−K1細胞の付着した4cm×10cm角の長方形のポリイミド多孔質膜10枚を基準シートとし、滅菌した同サイズのポリイミド多孔質膜10枚のメッシュ構造のA面を全て上にして、基準シート上面に積層させた。また、同じくポリイミド多孔質膜10枚のメッシュ構造のA面を全て上にして、基準シート下面に積層させた。その後、積層した30枚のシート上に不織布を乗せ、実施例4で使用した培養装置(図2)内部に設置し、その上に培地供給ラインを据えて、37℃に設定したタイテック社製強制通気式CO2インキュベータに培養装置全体を移し、培養準備を完了した。
ヒトG−CSF遺伝子を導入したCHO−K1細胞を用いて、市販3次元培養用足場への播種を行った後、シャーレ内で大量培養を実施した。
Alvetex(登録商標)(リプロセル社、cat.AVP004)の直径約2.2cm(播種面積:約3.8cm2)のインサートセルに1mlのCHO−K1細胞用培地;10%FBSを含むHam‘s−F12培地を添加し、足場シートの単位面積当たり2.0×104/cm2となるように、ヒトG−CSF遺伝子組換えCHO−K1細胞を5.0×104個播種した。
3D Insert−PCL/−PS(3D Biotek,LLC、cat.PS152012−6)の直径約2.1cm(播種面積:約3.5cm2)のセルに1ml、外側容器に4mlのCHO−K1細胞用培地;10%FBSを含むHam‘s−F12培地を添加し、足場シートの単位面積当たり2.0×104/cm2となるように、ヒトG−CSF遺伝子組換えCHO−K1細胞を7.0×104個播種した。
2cm×2cmの滅菌された正方形容器にCHO−K1細胞用培地;10%FBSを含むHam‘s−F12培地0.5mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形のポリイミド多孔質膜10枚(播種面積;2cm2)のA面を上側に向けて培地に浸漬する。シートの単位面積当たり2.0×104/cm2となるように、ヒトG−CSF遺伝子組換えCHO−K1細胞を4.0×104個播種した。
それぞれの部材は、面積及び厚みに差異があり、そのままで細胞培養効率を比較する事は困難である為、面積及び厚みを揃え、体積的効率として比較する事が必要となる。その為、各部材の細胞数を1cm2及び25μmに面積・厚みを換算し、その体積内に培養される細胞について図10に比較した。
Alvetex(登録商標)(リプロセル社、cat.AVP004)の直径約2.2cm(播種面積:約3.8cm2)のインサートセルに1mlの細胞培養培地(2%FBS、Fibroblast Media、LONZA社製)を添加し、ヒト皮膚線維芽細胞(5.0×104個)懸濁液を播種した。
3D Insert−PCL/−PS(3D Biotek,LLC社、cat.PS152012−6)の直径約2.1cm(播種面積:約3.5cm2)のセルに1ml、外側容器に4mlの細胞培養培地(2%FBS、Fibroblast Media、LONZA社製)を添加し、足場シートの単位面積当たり2.0×104/cm2となるように、ヒト皮膚線維芽細胞(7.0×104個)懸濁液を播種した。
2cm×2cmの滅菌された正方形容器に細胞培養培地1mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形のポリイミド多孔質膜(播種面積;2cm2)のA面を上側に向けて培地に浸漬する。ヒト皮膚線維芽細胞をシートの単位面積当たり2×104/cm2となるように播種した。
それぞれの部材は、面積及び厚みに差異があり、そのままで細胞培養効率を比較する事は困難である為、面積及び厚みを揃え、体積的効率として比較する事が必要となる。その為、各部材の細胞数を1cm2及び25μmに面積・厚みを換算し、その体積内に培養される細胞について図11に比較した。
Claims (50)
- 細胞の大量培養方法であって、
(1)細胞をポリイミド多孔質膜に適用することと、
(2)細胞を適用したポリイミド多孔質膜を細胞培養培地に適用し、培養することと
を含む、方法であって、
ここで、前記ポリイミド多孔質膜が、少なくとも、2つの表面層(A面及びB面)と、前記2つの表面層(A面及びB面)の間に挟まれたマクロボイド層とを有する多層構造のポリイミド多孔質膜であって、前記A面に存在する孔の平均孔径は、前記B面に存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層が、表面層(A面及びB面)に結合した隔壁と、前記隔壁並びに前記表面層(A面及びB面)に囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
ここで、前記細胞の数が、細胞培養培地1ミリリットルあたり、1.0×106個以上となるまで培養する、又は、前記ポリイミド多孔質膜1平方センチメートルあたり、1.0×105個以上となるまで培養する、方法。 - 2以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、請求項1に記載の方法。
- ポリイミド多孔質膜を
i)折り畳んで、
ii)ロール状に巻き込んで、
iii)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
iv)縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、請求項1又は2に記載の方法。 - 工程(2)における培養において、ポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(2)における培養において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の10000倍又はそれより少ない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(2)における培養において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の100倍又はそれより少ない、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(2)における培養が、細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系で行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が細胞培養培地供給手段と細胞培養容器との間を循環する、請求項7に記載の方法。
- 請求項7又は8に記載の方法であって、前記系が、細胞培養容器である培養ユニットと細胞培養培地供給手段である培地供給ユニットとを含む細胞培養装置であり、ここで
培養ユニットは細胞を担持するための1又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットであり、
培地供給ユニットは培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットである、
方法。 - 培養ユニットが空気供給口及び空気排出口を備えない培養ユニットである、請求項9に記載の方法。
- 培養ユニットが培地排出ラインをさらに備え、ここで培地排出ラインの第一の端部は培地収納容器に接続し、培地排出ラインの第二の端部は培養ユニットの培地排出口を介して培養ユニット内に連通し、培地が培地供給ユニットと培養ユニットとを循環可能である、請求項9又は10に記載の方法。
- 細胞が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 動物細胞が、脊椎動物門に属する動物由来の細胞である、請求項12に記載の方法。
- 細菌が、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項15に記載の方法。
- ポリイミド多孔質膜を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法に使用するための細胞培養装置であって、
前記ポリイミド多孔質膜と、前記ポリイミド多孔質膜を収容する細胞培養容器と、前記細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段と、を備えた細胞培養装置であって、
ここで、前記ポリイミド多孔質膜が、少なくとも、2つの表面層(A面及びB面)と、前記2つの表面層(A面及びB面)の間に挟まれたマクロボイド層とを有する多層構造のポリイミド多孔質膜であって、前記A面に存在する孔の平均孔径は、前記B面に存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層が、表面層(A面及びB面)に結合した隔壁と、前記隔壁並びに前記表面層(A面及びB面)に囲まれた複数のマクロボイドとを有する、
細胞培養装置。 - 2以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層している、請求項17に記載の細胞培養装置。
- ポリイミド多孔質膜を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
ここで、前記ポリイミド多孔質膜が、少なくとも、2つの表面層(A面及びB面)と、前記2つの表面層(A面及びB面)の間に挟まれたマクロボイド層とを有する多層構造のポリイミド多孔質膜であって、前記A面に存在する孔の平均孔径は、前記B面に存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層が、表面層(A面及びB面)に結合した隔壁と、前記隔壁並びに前記表面層(A面及びB面)に囲まれた複数のマクロボイドとを有する、
前記キット。 - 請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法のための、ポリイミド多孔質膜の使用であって、
ここで、前記ポリイミド多孔質膜が、少なくとも、2つの表面層(A面及びB面)と、前記2つの表面層(A面及びB面)の間に挟まれたマクロボイド層とを有する多層構造のポリイミド多孔質膜であって、前記A面に存在する孔の平均孔径は、前記B面に存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層が、表面層(A面及びB面)に結合した隔壁と、前記隔壁並びに前記表面層(A面及びB面)に囲まれた複数のマクロボイドとを有する、
前記使用。 - 細胞培養装置であって、
細胞を担持するための1又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットと、
培地供給ユニットであって、培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットと、
を含む細胞培養装置であって、
ここで、前記ポリイミド多孔質膜が、少なくとも、2つの表面層(A面及びB面)と、前記2つの表面層(A面及びB面)の間に挟まれたマクロボイド層とを有する多層構造のポリイミド多孔質膜であって、前記A面に存在する孔の平均孔径は、前記B面に存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層が、表面層(A面及びB面)に結合した隔壁と、前記隔壁並びに前記表面層(A面及びB面)に囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
前記細胞の数が、培地1ミリリットルあたり1.0×106個以上、又は、前記ポリイミド多孔質膜1平方センチメートルあたり1.0×105個以上となるまで培養可能である、細胞培養装置。 - 培養ユニットが、空気供給口、空気排出口、及び酸素交換膜を備えない、請求項21に記載の細胞培養装置。
- 培養ユニットが、空気供給口及び空気排出口、又は酸素交換膜をさらに備えた、請求項21に記載の細胞培養装置。
- 空気供給口及び空気排出口が、5%CO2ガス含有空気供給口及び5%CO2ガス含有空気排出口である、請求項23に記載の細胞培養装置。
- 培養ユニットが、ポリイミド多孔質膜を撹拌するための手段を有さない、請求項21〜24のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 培養ユニットが、ポリイミド多孔質膜を撹拌するための手段をさらに収容する、請求項21〜24のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 培養ユニットが培地排出ラインをさらに備え、ここで培地排出ラインの第一の端部は培地収納容器に接続し、培地排出ラインの第二の端部は培養ユニットの培地排出口を介して培養ユニット内に連通し、培地が培地供給ユニットと培養ユニットとを循環可能である、請求項21〜26のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 培養ユニットが培地排出ラインをさらに備え、ここで培地排出ラインの第一の端部は培地回収ユニットに接続し、培地排出ラインの第二の端部は培養ユニットの培地排出口を介して培養ユニット内に連通し、排出された培地を培地回収ユニット内に回収可能である、請求項21〜26のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 培養ユニットを振盪するための手段をさらに含む、請求項21〜28のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 培養ユニットが可撓性バッグからなる、請求項21〜29のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 可撓性バッグがガス透過性プラスチックバッグである、請求項30に記載の細胞培養装置。
- 1又は複数のポリイミド多孔質膜が、水平に対して45度以下の角度で傾斜した剛体の上に載置され、ポリイミド多孔質膜の上端部近傍から培地が供給されるよう培地供給ラインの第二の端部が設置され、ポリイミド多孔質膜の下端部近傍から培地が排出されるよう培地排出ラインの第二の端部が設置されている、請求項21〜31のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 剛体が金属メッシュである、請求項32に記載の細胞培養装置。
- 1又は複数のポリイミド多孔質膜と剛体とがハウジング内に収容され、ハウジングが培養ユニット内に収容されている、請求項32又は33に記載の細胞培養装置。
- 1又は複数のポリイミド多孔質膜の上面の一部又は全部を被覆するように、ポリイミド多孔質膜よりも平均孔径の大きい多孔質シートがさらに載置される、請求項32〜34のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 多孔質シートが不織布、ガーゼ、及びスポンジからなる群より選択される、請求項35に記載の細胞培養装置。
- 培地供給ラインの第二の端部の近傍に脱泡ユニットがさらに設置されている、請求項32〜36のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 2以上のポリイミド多孔質膜が上下に積層される、請求項21〜37のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 1又は複数のポリイミド多孔質膜が折り畳まれている、請求項21〜38のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 1又は複数のポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、培地によって湿潤している、請求項21〜39のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 1又は複数のポリイミド多孔質膜表面の一部分又は全体が、培地の液相に接触していない、請求項21〜40のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 培養ユニット内に含まれる培地の体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の10000倍又はそれより少ない、請求項21〜41のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 培養ユニット内に含まれる培地の体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の100倍又はそれより少ない、請求項21〜42のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 培養ユニット内に含まれる培地の体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の5倍又はそれより少ない、請求項21〜42のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項21〜44のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理する事により得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項45に記載の細胞培養装置。
- 請求項21〜46のいずれか一項に記載の細胞培養装置をインキュベータ内に設置し、細胞を培養することを含む、細胞の培養方法。
- 請求項21〜46のいずれか一項に記載の細胞培養装置をインキュベータ内に設置し、細胞を培養すること、及び
細胞に接触した培地を連続的又は間歇的に回収すること
を含む、細胞によって産生された物質を回収するための方法。 - 請求項21〜46のいずれか一項に記載の細胞培養装置のためのポリイミド多孔質膜の使用。
- 細胞によって産生された物質を回収するための、請求項21〜46のいずれか一項に記載の細胞培養装置の使用。
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