JPWO2016121771A1 - 骨髄類似構造を利用した細胞培養法、及び骨損傷部位の治療のためのポリイミド多孔質膜 - Google Patents
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Abstract
Description
細胞は生体内では一般に三次元的な集団として存在するが、古典的な平面培養では、細胞が容器に張り付く形で単層状に培養される。培養環境の相違により、細胞の性質も大きく異なることが数多く報告されている。
骨折及び骨欠損を含む骨損傷の治癒は、患者QOLの観点から、古くより、プレートやスクリューで患部を固定するなどの方法により、数多くの器具や手段を用いる術式等が試みられている。近年、様々な構造的特長・機能的特長・生体親和的特長を備えた骨疾患治癒素材や器具が創製され、医療に利用されている(非特許文献3、特許文献4)。更に、再生医療的視点からも骨折及び骨欠損を含む骨損傷の治癒を促進するための方法が試みられており、例えば、コラーゲンやアパタイト等の生体材料もしくは生体吸収材料に間葉系幹細胞等の細胞を培養した複合物を患部に補完する方法等が報告されている(特許文献5及び6)。また、幹細胞の共存が治療有効性に関して貢献しうるか否かが、多数論じられている(非特許文献4)。
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称である。芳香族ポリイミドは、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された高分子を意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
[態様1]
骨髄細胞をポリイミド多孔質膜に適用し、培養することを含む、骨髄細胞の培養方法。
[態様2]
骨髄細胞が骨髄間質細胞である、態様1に記載の方法。
[態様3]
骨髄細胞が骨髄由来血液細胞である、態様1に記載の方法。
[態様4]
骨髄細胞が、哺乳動物の骨髄から採取された細胞である、態様1〜3のいずれか一つに記載の方法。
[態様5]
骨髄細胞が、哺乳動物の骨髄から採取された細胞の初代培養細胞である、態様1〜3のいずれか一つに記載の方法。
[態様6]
培養によって骨髄細胞を血球系細胞に分化させることをさらに含む、態様1〜5のいずれか一つに記載の方法。
[態様7]
骨髄細胞をポリイミド多孔質膜に適用した後、分化誘導促進物質を添加して培養し、骨髄細胞から血球系細胞への分化をポリイミド多孔質膜の立体構造特異的に促進することをさらに含む、態様1〜6のいずれか一つに記載の方法。
[態様8]
態様6又は7に記載の方法を用いて得られた血球系細胞を回収することを含む、血球系細胞の調製方法。
[態様9]
血球系細胞が赤血球前駆細胞又は赤血球である、態様6〜8のいずれか一つに記載の方法。
[態様10]
骨髄細胞の培養方法であって、
(1)第一の細胞群をポリイミド多孔質膜に適用し、培養する工程、及び
(2)工程(1)の培養後のポリイミド多孔質膜に第二の細胞群を適用し、培養する工程
を含み、ここで第二の細胞群は骨髄細胞である、方法。
[態様11]
第一の細胞群が動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、態様10に記載の方法。
[態様12]
第一の細胞群が哺乳動物由来の骨髄細胞である、態様11に記載の方法。
[態様13]
工程(2)の培養によって骨髄細胞を血球系細胞に分化させることをさらに含む、態様10〜12のいずれか一つに記載の方法。
[態様14]
工程(2)において第二の細胞群をポリイミド多孔質膜に適用した後、分化誘導促進物質を添加して培養し、第二の細胞群である骨髄細胞から血球系細胞への分化をポリイミド多孔質膜の立体構造特異的に促進することをさらに含む、態様10〜13のいずれか一つに記載の方法。
[態様15]
態様13又は14のいずれか一つに記載の方法を用いて得られた血球系細胞を回収することを含む、血球系細胞の調製方法。
[態様16]
血球系細胞が赤血球前駆細胞又は赤血球である、態様13〜15のいずれか一つに記載の方法。
[態様17]
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、態様1〜16のいずれか一つに記載の方法。
[態様18]
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理する事により得られる着色したポリイミド多孔質膜である、態様17に記載の方法。
[態様19]
前記ポリイミド多孔質膜が、2つの異なる表層面とマクロボイド層を有する多層構造のポリイミド多孔質膜である、態様17又は18に記載の方法。
[態様20]
2以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、態様1〜19のいずれか一つに記載の方法。
[態様21]
ポリイミド多孔質膜を
i)折り畳んで、
ii)ロール状に巻き込んで、
iii)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
iv)縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、態様1〜20のいずれか一つに記載の方法。
[態様22]
ポリイミド多孔質膜を含む、態様1〜21のいずれか一つに記載の方法に使用するためのキット。
[態様23]
態様1〜21のいずれか一項に記載の方法のための、ポリイミド多孔質膜の使用。
[態様24]
骨損傷部位の治療のためのポリイミド多孔質膜。
[態様25]
骨損傷が骨折である、態様24に記載のポリイミド多孔質膜。
[態様26]
骨損傷が骨欠損である、態様24に記載のポリイミド多孔質膜。
[態様27]
骨損傷患部に接するよう生体内に移植して用いられる、態様24〜26のいずれか1つに記載のポリイミド多孔質膜。
[態様28]
テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、態様24〜27のいずれか一つに記載のポリイミド多孔質膜。
[態様29]
テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理する事により得られる着色したポリイミド多孔質膜である、態様28に記載のポリイミド多孔質膜。
[態様30]
2つの異なる表層面とマクロボイド層を有する多層構造のポリイミド多孔質膜である、態様28又は29に記載のポリイミド多孔質膜。
[態様31]
前記2つの異なる表層面のうち、より平均孔径の小さい面が骨損傷患部に接するよう生体内に移植して用いられる、態様30に記載のポリイミド多孔質膜。
[態様32]
ポリイミド多孔質膜の膜厚が100マイクロメートル以下である、態様24〜31のいずれか一つに記載のポリイミド多孔質膜。
[態様33]
ポリイミド多孔質膜の表面が、その物理的特性を変更する工程によって処理されている、態様24〜32のいずれかに一つ記載のポリイミド多孔質膜。
[態様34]
ポリイミド多孔質膜の表面の物理的特性を変更する工程が、ポリイミド多孔質膜の表面をアルカリ処理する工程、カルシウム処理する工程、生体適合性材料で被覆する工程、及び1以上のこれらの組み合わせからなる群より選択される、態様33に記載のポリイミド膜。
[態様35]
生体適合性材料が、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリラクチド−コ−カプロラクトン、ポリカーボネート、生体分解性ポリウレタン、ポリエーテルエステル、ポリエステルアミド、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンとβ−TCPとの複合体及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、態様34に記載の方法。
[態様36]
あらかじめ細胞を担持させた、態様24〜35のいずれかに記載のポリイミド多孔質膜。
[態様37]
細胞が、哺乳類由来の多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞である、態様36に記載のポリイミド多孔質膜。
[態様38]
細胞が哺乳動物由来骨髄細胞を含む、態様37に記載のポリイミド多孔質膜。
[態様39]
態様24〜38のいずれか一項に記載のポリイミド多孔質膜を含む、骨損傷部位の治療用キット。
[態様40]
骨損傷部位の治療のための、態様24〜38のいずれか一つに記載のポリイミド多孔質膜の使用。
[態様41]
骨髄細胞をポリイミド多孔質膜に担持させることを含む、骨損傷部位の治療のためのポリイミド多孔質膜の製造方法。
[態様42]
骨髄細胞が、骨損傷部位の治療の対象から採取されたものである、態様41に記載の製造方法。
[態様43]
態様24〜38のいずれか一つに記載のポリイミド多孔質膜を骨損傷部位に適用することを含む、骨損傷部位の治療方法。
本発明は、I.骨髄細胞の培養方法、II.骨髄細胞を2段階にわけてポリイミド多孔質膜に適用し、培養する骨髄細胞の培養方法、III.骨髄細胞の培養方法に使用するためのキット、IV.骨髄細胞の培養方法のための、ポリイミド多孔質膜の使用、V.骨損傷部位の治療のためのポリイミド多孔質膜、VI.骨損傷部位の治療用キット、VII.骨損傷の治療のための、ポリイミド多孔質膜の使用、VIII.骨損傷部位の治療のためのポリイミド多孔質膜の製造方法、及びIX.骨損傷部位の治療方法に関する。いずれの発明においても、ポリイミド多孔質膜が用いられる点で共通する。
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
本発明において用いられる着色前駆体とは、250℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
1)1,4−ジアミノベンゼン(パラフェニレンジアミン)、1,3−ジアミノベンゼン、2,4−ジアミノトルエン、2,6−ジアミノトルエンなどのベンゼン核1つのべンゼンジアミン;
2)4,4’−ジアミノジフェニルエーテル、3,4’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’−ジメチル−4,4’−ジアミノビフェニル、2,2’−ジメチル−4,4’−ジアミノビフェニル、2,2’−ビス(トリフルオロメチル)−4,4’−ジアミノビフェニル、3,3’−ジメチル−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’−ジカルボキシ−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’,5,5’−テトラメチル−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、ビス(4−アミノフェニル)スルフィド、4,4’−ジアミノベンズアニリド、3,3’−ジクロロベンジジン、3,3’−ジメチルベンジジン、2,2’−ジメチルベンジジン、3,3’−ジメトキシベンジジン、2,2’−ジメトキシベンジジン、3,3’−ジアミノジフェニルエーテル、3,4’−ジアミノジフェニルエーテル、4,4’−ジアミノジフェニルエーテル、3,3’−ジアミノジフェニルスルフィド、3,4’−ジアミノジフェニルスルフィド、4,4’−ジアミノジフェニルスルフィド、3,3’−ジアミノジフェニルスルホン、3,4’−ジアミノジフェニルスルホン、4,4’−ジアミノジフェニルスルホン、3,3’−ジアミノベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジクロロベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジメトキシベンゾフェノン、3,3’−ジアミノジフェニルメタン、3,4’−ジアミノジフェニルメタン、4,4’−ジアミノジフェニルメタン、2,2−ビス(3−アミノフェニル)プロパン、2,2−ビス(4−アミノフェニル)プロパン、2,2−ビス(3−アミノフェニル)−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス(4−アミノフェニル)−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、3,3’−ジアミノジフェニルスルホキシド、3,4’−ジアミノジフェニルスルホキシド、4,4’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核2つのジアミン;
3)1,3−ビス(3−アミノフェニル)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニル)ベンゼン、1,4−ビス(3−アミノフェニル)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニル)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,4−ビス(3−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,3−ビス(3−アミノフェノキシ)−4−トリフルオロメチルベンゼン、3,3’−ジアミノ−4−(4−フェニル)フェノキシベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジ(4−フェニルフェノキシ)ベンゾフェノン、1,3−ビス(3−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,3−ビス(3−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,3−ビス〔2−(4−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼン、1,4−ビス〔2−(3−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼン、1,4−ビス〔2−(4−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核3つのジアミン;
4)3,3’−ビス(3−アミノフェノキシ)ビフェニル、3,3’−ビス(4−アミノフェノキシ)ビフェニル、4,4’−ビス(3−アミノフェノキシ)ビフェニル、4,4’−ビス(4−アミノフェノキシ)ビフェニル、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、2,2−ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核4つのジアミン。
(i)ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
(ii)テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス(アミノフェノキシ)フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び/又は、
(iii)ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス(アミノフェノキシ)フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
ポリイミド多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、200点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式(1)に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
本発明は、骨髄細胞をポリイミド多孔質膜に適用し、培養することを含む、骨髄細胞の培養方法に関する。なお、国際出願番号PCT/JP2014/070407の全内容を、参照により本明細書に援用する。
本明細書において、骨髄細胞とは、骨髄に存在する細胞をいう。骨髄細胞には、骨髄間質細胞・骨髄由来血球前駆細胞と骨髄由来血液細胞が含まれる。骨髄間質細胞は、骨髄由来血液細胞を支持する細胞をいう。骨髄由来血球前駆細胞は、分裂分化の後血球もしくは血液細胞に分化しうる細胞をいう。骨髄由来血液細胞は、骨髄に含まれる血液細胞をいうものとする。
本発明の骨髄細胞の培養方法において、骨髄細胞のポリイミド多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、骨髄細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、骨髄細胞のポリイミド多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
(B)前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に骨髄細胞縣濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、骨髄細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
骨髄細胞縣濁液中の骨髄細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様;並びに、
(C)前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、骨髄細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリイミド多孔質膜に骨髄細胞縣濁液を装填し、そして、
骨髄細胞縣濁液中の骨髄細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
培養ユニットは細胞を担持するための1又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットであり、
培地供給ユニットは培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットである
細胞培養装置であってよい。
本発明は、培養によって骨髄細胞を血球系細胞に分化させることをさらに含む、骨髄細胞の培養方法にも関する。
本発明は、骨髄細胞の培養方法であって、
(1)第一の細胞群をポリイミド多孔質膜に適用し、培養する工程、及び
(2)工程(1)の培養後のポリイミド多孔質膜に第二の細胞群を適用し、培養する工程
を含み、ここで第二の細胞群は骨髄細胞である、方法にも関する。
本発明はさらに、ポリイミド多孔質膜を含む、上述した骨髄細胞の培養方法に使用するためのキットに関する。
本発明は、上記骨髄細胞の培養方法のための、ポリイミド多孔質膜の使用にも関する。
本発明は、骨損傷部位の治療のためのポリイミド多孔質膜に関する。
本明細書において、骨損傷とは、外傷、疲労、または疾病等に起因して、骨組織が損傷された状態をいうものとし、たとえば骨組織の表面のみが損傷した状態、骨折、骨欠損等を含む。本明細書において骨折とは、骨が完全に連続性を失った完全骨折、及び骨が連続性を完全に失っていない不全骨折を含む。骨折の態様には、骨折部が体外に開放されていない閉鎖骨折(単純骨折)、骨折部が体外に開放されている開放骨折(複雑骨折)、一つの骨が一個所でのみ離断している単独骨折、及び一つの骨が複数個所で離断している複合骨折(重複骨折)等がある。本発明のポリイミド多孔質膜は、いずれの態様の骨折にも適用してよい。
本発明のポリイミド多孔質膜は、その表面が、その物理的特性を変更する工程によって部分的又は全体的に処理されているものであってよい。ポリイミド多孔質膜の表面の物理的特性を変更する工程は、骨損傷部位の治療を阻害するものでない限り、目的に応じて任意の工程を選択することができるが、たとえばポリイミド多孔質膜の表面をアルカリ処理する工程、カルシウム処理する工程、生体適合性材料で被覆する工程、及び1以上のこれらの組み合わせが例示される。
本発明のポリイミド多孔質膜は、あらかじめ細胞を担持させたものであってよい。本発明のポリイミド多孔質膜は、その固有の立体構造の中に細胞を保持し、生育させることができるという特長を有する。ポリイミド多孔質膜に目的に応じた細胞を担持させて骨損傷部位に適用することにより、骨損傷部位の治療を促進することも可能となる。
(A)細胞を前記ポリイミド多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様;
(B)前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様;並びに、
(C)前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
(1)第一の細胞群をポリイミド多孔質膜に適用し、培養する工程、及び
(2)工程(1)の培養後のポリイミド多孔質膜に第二の細胞群を適用し、培養し、担持させる工程、ここで第二の細胞群は骨髄細胞である。
本発明のポリイミド多孔質膜は、骨損傷患部に適用することにより、骨損傷部位を治療することができる。
本発明は、上述したポリイミド多孔質膜を含む、骨損傷部位の治療用キットにも関する。本発明のキットは、ポリイミド多孔質膜の他に、骨損傷治療手術に必要な材料、キットの取扱説明書などを含んでいてよい。
本発明は、骨損傷の治療のための、上述したポリイミド多孔質膜の使用にも関する。
本発明は、骨髄細胞をポリイミド多孔質膜に担持させることを含む、骨損傷部位の治療のためのポリイミド多孔質膜の製造方法にも関する。ここで、骨髄細胞は、骨損傷部位の治療の対象から採取されたものであってよい。
本発明は、上述したポリイミド多孔質膜を骨損傷部位に適用することを含む、骨損傷部位の治療方法にも関する。
11〜14週齢の雄C57BL/6マウスの大腿骨、頸骨を摘出し、近遠心骨端を切除して,10%FBS含有DMEM液にて洗浄し骨髄を採取する。細胞数は、5.0×106 個であった。この細胞を、乾熱滅菌した1cm角の正方形のポリイミド多孔質膜のA面を上にしてA面側から播種する(図2)。5日間培養してから培地を交換し、さらに2日間培養する。同種同週齢同性のGFPトランスジェニックマウスより、前述と同様の方法で、先に7日間細胞培養を行った細胞の生息するポリイミド多孔質膜シートに、2回目の播種を行う。更に7日間培養してから4%ホルマリン溶液を用いて細胞を固定し、免疫染色にて、標本の解析を進めた。GFP陽性の細胞が固定標本より観察されると共に、ポリイミド多孔質膜のB面大穴構造の周りに、CD45陽性細胞の集団が観察された(図3)。
上記実施例1と同様の方法にて、2回の骨髄由来細胞の播種を実施する。2回目の播種から7日間培養後、エリスロポイエチンを1ml当り1ユニット、2ユニット及び5ユニットを追加した。エリスロポイエチン未添加のコントロール群では変化が生じなかったが、エリスロポイエチン添加群では、時間及び容量に応じて、前赤芽球細胞(TER119陽性)が、構造特異的に場所毎で集合体を作っている事が観察された(図4)。
9週齢のLEWラットを2〜3%イソフルレンにて全身麻酔後、術野に1万分の1エピネフリン含有リドカインによる浸潤麻酔を施す。切開部より広い範囲を除毛した後、術野が十分明示できるよう頭頂部に骨膜下まで直線上に切開を加える。皮膚骨膜弁を剥離し頭頂骨を露出した後、トレフィンバーを用い滅菌生理食塩水による注水下に4mm径円形の骨欠損部を2個形成した。欠損部を滅菌したポリイミド多孔質膜で被覆した後、皮膚骨膜弁を復位し、ナイロン糸にて縫合した。この際、ポリイミド多孔質膜のメッシュ面(A面)を創部に接地させて作製したモデルと大穴面(B面)を接地させたモデルをそれぞれ作製した。2週間後、4週間後、8週間後に欠損部の治癒状況を測定した。測定項目は、骨密度(BMD)(mg/cm3)、骨塩量(BMC)(mg)、新生骨体積(BV)(cm3)、設定したROIの体積(TV)(cm3)、新生骨の割合(BV/TV)(%)、臨床的なBMD(BMC/TV)(mg/cm3)である。メッシュ面接地のモデルにて、早期の骨形成に関し、メッシュ面を創部に接地したモデルが有意に骨形成を促進する結果が確認された。結果を図7に示す。図7において、コントロール群とは骨欠損部をポリイミド多孔質膜で被覆しなかった群のことである。
8週齢のGFP transgenic ratより大腿骨および頸骨を採取し、それぞれの骨の両端をカットして、FBSを10%添加したDMEM培地でフラッシュすることで骨髄細胞隗を採取した。細胞塊をピペテッィングにより粉砕し、1.5cm四方のポリイミド多孔質膜のメッシュ面(A面)に1.0×106個の骨髄細胞を播種し、10%FBSを添加したDMEM培地で5日間静置培養した。6日目に、細胞が付着したポリイミド多孔質膜を燐酸バッファーで洗浄し、培地をDMEMのみに変更して更に1日間培養した。9週齢のヌードラットを2〜3%イソフルレンにて全身麻酔後、術野に1万分の1エピネフリン含有リドカインによる浸潤麻酔を施す。切開部より広い範囲を除毛した後、術野が十分明示できるよう頭頂部に骨膜下まで直線上に切開を加える。皮膚骨膜弁を剥離し頭頂骨を露出した後、トレフィンバーを用い滅菌生理食塩水による注水下に4mm径円形の骨欠損部を2個形成した。欠損部に、メッシュ面(A面)が創部に接地する様にして、上記の細胞を付着させその後培養したポリイミド多孔質膜にて欠損部を被覆した。2週、4週、8週後に欠損部治癒状況を測定し、経時的な創部の治癒を確認した。結果を図8に示す。
8週齢のGFP transgenic ratより大腿骨および頸骨を採取し、それぞれの骨の両端をカットして、FBSを10%添加したDMEM培地でフラッシュすることで骨髄細胞隗を採取した。細胞塊をピペテッィングにより粉砕し、1.5cm四方のポリイミド多孔質膜のメッシュ面(A面)に1.0×106個の骨髄細胞を播種し、10%FBSを添加したDMEM培地で5日間静置培養した。DMEM培地を交換した後、更に1日間培養した。その後、ポリイミド多孔質膜のメッシュ面(A面)に1.0×106個の骨髄細胞を播種し、10%FBSを添加したDMEM培地で5日間静置培養した。6日目に、細胞が付着したポリイミド多孔質膜を燐酸バッファーで洗浄し、培地をDMEMのみに変更して更に1日間培養した。得られたポリイミド多孔質膜を、9週齢のヌードラットを2〜3%イソフルレンにて全身麻酔後、術野に1万分の1エピネフリン含有リドカインによる浸潤麻酔を施す。切開部より広い範囲を除毛した後、術野が十分明示できるよう頭頂部に骨膜下まで直線上に切開を加える。皮膚骨膜弁を剥離し頭頂骨を露出した後、トレフィンバーを用い滅菌生理食塩水による注水下に4mm径円形の骨欠損部を2個形成した。欠損部に、メッシュ面(A面)が創部に接地する様にして、上記の細胞を付着させその後培養したポリイミド多孔質膜にて欠損部を被覆した。2週、4週、8週後に欠損部治癒状況を測定し、経時的な創部の治癒を確認した。結果を図9〜11に示す。
Claims (42)
- 骨髄細胞をポリイミド多孔質膜に適用し、培養することを含む、骨髄細胞の培養方法。
- 骨髄細胞が骨髄間質細胞である、請求項1に記載の方法。
- 骨髄細胞が骨髄由来血液細胞である、請求項1に記載の方法。
- 骨髄細胞が、哺乳動物の骨髄から採取された細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 骨髄細胞が、哺乳動物の骨髄から採取された細胞の初代培養細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 培養によって骨髄細胞を血球系細胞に分化させることをさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 骨髄細胞をポリイミド多孔質膜に適用した後、分化誘導促進物質を添加して培養し、骨髄細胞から血球系細胞への分化をポリイミド多孔質膜の立体構造特異的に促進することをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項6又は7に記載の方法を用いて得られた血球系細胞を回収することを含む、血球系細胞の調製方法。
- 血球系細胞が赤血球前駆細胞又は赤血球である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 骨髄細胞の培養方法であって、
(1)第一の細胞群をポリイミド多孔質膜に適用し、培養する工程、及び
(2)工程(1)の培養後のポリイミド多孔質膜に第二の細胞群を適用し、培養する工程
を含み、ここで第二の細胞群は骨髄細胞である、方法。 - 第一の細胞群が動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 第一の細胞群が哺乳動物由来の骨髄細胞である、請求項11に記載の方法。
- 工程(2)の培養によって骨髄細胞を血球系細胞に分化させることをさらに含む、請求項10〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(2)において第二の細胞群をポリイミド多孔質膜に適用した後、分化誘導促進物質を添加して培養し、第二の細胞群である骨髄細胞から血球系細胞への分化をポリイミド多孔質膜の立体構造特異的に促進することをさらに含む、請求項10〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項13又は14のいずれか一項に記載の方法を用いて得られた血球系細胞を回収することを含む、血球系細胞の調製方法。
- 血球系細胞が赤血球前駆細胞又は赤血球である、請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
- ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理する事により得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項17に記載の方法。
- 前記ポリイミド多孔質膜が、2つの異なる表層面とマクロボイド層を有する多層構造のポリイミド多孔質膜である、請求項17又は18に記載の方法。
- 2以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- ポリイミド多孔質膜を
i)折り畳んで、
ii)ロール状に巻き込んで、
iii)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
iv)縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。 - ポリイミド多孔質膜を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキット。
- 請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法のための、ポリイミド多孔質膜の使用。
- 骨損傷部位の治療のためのポリイミド多孔質膜。
- 骨損傷が骨折である、請求項24に記載のポリイミド多孔質膜。
- 骨損傷が骨欠損である、請求項24に記載のポリイミド多孔質膜。
- 骨損傷患部に接するよう生体内に移植して用いられる、請求項24〜26のいずれか一項に記載のポリイミド多孔質膜。
- テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項24〜27のいずれか一項に記載のポリイミド多孔質膜。
- テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理する事により得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項28に記載のポリイミド多孔質膜。
- 2つの異なる表層面とマクロボイド層を有する多層構造のポリイミド多孔質膜である、請求項28又は29に記載のポリイミド多孔質膜。
- 前記2つの異なる表層面のうち、より平均孔径の小さい面が骨損傷患部に接するよう生体内に移植して用いられる、請求項30記載のポリイミド多孔質膜。
- ポリイミド多孔質膜の膜厚が100マイクロメートル以下である、請求項24〜31のいずれか一項に記載のポリイミド多孔質膜。
- ポリイミド多孔質膜の表面が、その物理的特性を変更する工程によって処理されている、請求項24〜32のいずれか一項に記載のポリイミド多孔質膜。
- ポリイミド多孔質膜の表面の物理的特性を変更する工程が、ポリイミド多孔質膜の表面をアルカリ処理する工程、カルシウム処理する工程、生体適合性材料で被覆する工程、及び1以上のこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項33に記載のポリイミド膜。
- 生体適合性材料が、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリラクチド−コ−カプロラクトン、ポリカーボネート、生体分解性ポリウレタン、ポリエーテルエステル、ポリエステルアミド、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンとβ−TCPとの複合体及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
- あらかじめ細胞を担持させた、請求項24〜35のいずれかに記載のポリイミド多孔質膜。
- 細胞が、哺乳類由来の多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞である、請求項36に記載のポリイミド多孔質膜。
- 細胞が哺乳動物由来骨髄細胞を含む、請求項37に記載のポリイミド多孔質膜。
- 請求項24〜38のいずれか一項に記載のポリイミド多孔質膜を含む、骨損傷部位の治療用キット。
- 骨損傷部位の治療のための、請求項24〜38のいずれか一項に記載のポリイミド多孔質膜の使用。
- 骨髄細胞をポリイミド多孔質膜に担持させることを含む、骨損傷部位の治療のためのポリイミド多孔質膜の製造方法。
- 骨髄細胞が、骨損傷部位の治療の対象から採取されたものである、請求項41に記載の製造方法。
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