CN107208058A - 利用骨髓类似结构的细胞培养方法、和用于骨损伤部位的治疗的聚酰亚胺多孔膜 - Google Patents

利用骨髓类似结构的细胞培养方法、和用于骨损伤部位的治疗的聚酰亚胺多孔膜 Download PDF

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Abstract

本发明涉及骨髓细胞的培养方法，包括将骨髓细胞施加到聚酰亚胺多孔膜，培养。此外，本发明涉及用于骨损伤部位的治疗的聚酰亚胺多孔膜。

Description

利用骨髓类似结构的细胞培养方法、和用于骨损伤部位的治 疗的聚酰亚胺多孔膜
技术领域
本发明涉及使用包括在三维培养载体骨髓类似结构的细胞培养物。具体而言涉及使用骨髓类似结构的聚酰亚胺多孔膜细胞培养物。此外，本发明涉及一种用于骨损伤部位的治疗的柔性多孔片材。具体而言涉及用于骨损伤部位的治疗的聚酰亚胺多孔膜
背景技术
细胞培养
细胞存在作为体内一般三维群，在经典的平面培养是在细胞粘到容器的形式单层培养。在培养环境的差异是报告的细胞的性质非常不同批次。
在培养环境骨髓相关细胞，强烈的倾向，从脚手架增长的影响，这样的情况经常报道使用三维培养载体，以促进细胞培养。在专利文献1中，通过使用非织造纤维基质形成纤维的三维网络中，造血干细胞或造血前体细胞通过增加/保持在体外的方法分离的未分化从体内它已被证明生物反应器。使用类似的非织造材料在非专利文献1中示出。此外，虽然造血干细胞的干细胞已知是易受丢失，非专利文献2中，以合成的多孔水凝胶，通过在其上培养造血干细胞，该细胞来源特异性的造血干细胞可见，能保持严厉。此外，更直接的情况下，如专利文献2所示，由接种骨髓干细胞的磷酸钙化合物构成的载体的表面，显示出有效的粘合性的情况下的细胞已经报道。从由三月培养形成小鼠骨髓空间支架，收集另外，在专利文献3中，大岛筑波等人，接种胶原处理过的聚乙烯夹细胞移植它到小鼠的背部通过，有报道可作为人造骨髓造血功能。然而，足以用于实际应用的方法尚未建立的今天。
此外，在以前的发明的例子，其中可以清楚地看到的三维结构是紧密正比于功能和效率，尽管三维脚手架结构的重要性已被示出，它是被称为大的封闭概念“构象”和或骨髓类似组合物中，并且保持在多孔结构的大小控制的观点出发，从形态学和解剖学的观点来看，形态结构未从视点前进时，它类倪于。更有效和为建立高方法实用的，并建立呈现的一个新的观点，需要存在的骨髓细胞培养方法的。
骨损伤与治愈
骨折和骨治愈损害，包括骨缺损，考虑到患者的QOL，比老，通过固定用板和螺钉受影响的区域的方法已经尝试使用大量的仪器和装置的的手术技术。近年、骨病治愈材料和设备具有多种结构特征和功能特征，创建生物友好特征，其被用于医疗(非专利文献3、专利文献4)。此外，从再生医疗的观点和方法已经尝试以促进骨损伤，包括骨折和骨缺损治愈，例如，生物材料或生物可吸收的材料如胶原和磷灰石如间质干细胞它报告给复合培养的细胞补充到受影响的区域等的方法(专利文献5和6)。此外，是否干细胞可用于治疗功效的贡献是共存讨论了一些(非专利文献4)。
这些方法，以及生物材料，包括生物材料和细胞，该材料包括细胞，并通过使用活体自我分解物质的组合，虽然一大特点，可以补充病变或缺陷，箱子和非常耗时的情况下这是不适合于响应于一个大的部分的损坏，丢失或复杂的形状时。
在另一方面，在牙科领域，治疗的方式在表面上形成的膜，以留出空间创伤部的已进行(非专利文献5)。这是为了避免在创伤部上皮过早手术技术，而不是一个方法可以是适合于在骨再生一般用途。
适应不同的创伤部，包括大量缺损部位和复杂形状部位，治疗装置简单而有效的骨损伤已经期望。
聚酰亚胺多孔膜
聚酰亚胺是在重复细胞群中包含酰亚胺键的高分子(聚合物)的总称，通常是指芳族化合物通过直接酰亚胺键连接的芳族聚酰亚胺。芳族聚酰亚胺具有芳族和芳族通过酰亚胺键的共轭结构，具有刚硬、牢固的分子结构，并且酰亚胺键具有强的分子间力，因此，具有非常高水平的热的、机械的、化学的性质。
聚酰亚胺多孔膜过滤器在本发明前更多地用于滤器，低介电常数膜，燃料电池电解质膜，特别地以电池关系中心的用途。专利文献7-9中记载了，特别是在气体等物质透过性中是优异的，孔隙率高，两个表面的平滑性优异，相对强度高，孔隙率高，但是对于膜厚度方向的压缩应力耐力优良的具有大量大孔隙的聚酰亚胺多孔膜。
每个这些是经由酰胺酸制备的聚酰亚胺多孔膜。
现有技术文献
专利文献
【专利文献1】国际公开(国際公開)WO 2000/046349
【专利文献2】特许(特許)第4393908号
【专利文献3】特许(特許)第3421741号
【专利文献4】特许(特許)第3029266号
【专利文献5】特许(特許)第4412537号
【专利文献6】特许(特許)第4950269号
【专利文献7】WO 2010/038873
【专利文献8】特开(特開)2011－219585
【专利文献9】特开(特開)2011－219586
【非专利文献】
【非专利文献1】フナコシニュース2012年10月1日号
【非专利文献2】A.Raic等人./Biomaterials 35(2014)929-940
【非专利文献3】F.G.Lyons等人./Biomaterials 31(2010)9232-9243
【非专利文献4】S.Wu等人./Materials Science and Engineering R 80(2014)1-36
【非专利文献5】株式会社ジーシージーシーメンブレンマニュアル
发明概述
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供一种更有效的和高度实用的骨髓细胞培养物的方法。本发明是与不同的创伤部表面兼容的，其目的在于提供一种治疗简单而有效的骨损伤的手段。
用于解决课题的手段
本发明人已经发现，具有该聚酰亚胺多孔膜的三维结构是一种有机薄膜时，近似形态骨髓结构。然后，通过培养使用聚酰亚胺多孔膜的骨髓细胞，我们发现，有可能生长的CD45阳性细胞。令人惊讶地，当使用聚酰亚胺多孔膜，根据聚酰亚胺多孔膜的三维结构培养的骨髓细胞中还发现，具有类似特性的分化骨髓细胞块发生。然后，通过使用分化诱导启动子，培养的细胞，我们发现，有可能分化成红细胞前体细胞的聚酰亚胺多孔膜。
本发明人的聚酰亚胺多孔膜构象接近于形态骨髓结构被发现可用于骨损伤部位的治疗。
不存在限制，但是，本发明优选包括以下几个方面。
[方式1]
骨髓细胞的培养方法，包括将骨髓细胞施加到聚酰亚胺多孔膜，进行培养。
[方式2]
方式1中记载的方法，骨髓细胞是骨髓基质细胞。
[方式3]
方式1中记载的方法，骨髓细胞是骨髓来源的血液细胞(血细胞)。
[方式4]
方式1～3的任一项中记载的方法，骨髓细胞是从哺乳动物的骨髓采取的细胞。
[方式5]
方式1～3的任一项中记载的方法，骨髓细胞是从哺乳动物骨髓采取的细胞的原代培养细胞。
[方式6]
方式1～5的任一项中记载的方法，进一步包括，通过培养将骨髓细胞分化成造血细胞(血细胞株细胞)。
[方式7]
方式1～6的任一项中记载的方法，进一步包括，将骨髓细胞施加至聚酰亚胺多孔膜后，添加分化诱导促进物质和培养，促进骨髓细胞向造血细胞(血细胞株细胞)的分化，使得其具有聚酰亚胺多孔膜的立体结构特异性。
[方式8]
方式6或7中记载的方法，包括回收使用权利要求6或7中记载的方法获得的造血细胞(血细胞株细胞)。
[方式9]
方式6-8的任一项中记载的方法，造血细胞(血细胞株细胞)是红细胞前体细胞或红细胞。
[方式10]
骨髓细胞的培养方法，其包括
(1)将第一细胞群施加到聚酰亚胺多孔膜、培养的工序和，
(2)将第二细胞群施加到工序(1)的培养后的聚酰亚胺多孔膜、培养的工序
其中，所述第二细胞群是骨髓细胞。
[方式11]
方式10中记载的方法，第一细胞群选自由以下组成的组：动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母菌和细菌。
[方式12]
方式11中记载的方法，第一细胞群是哺乳动物来源的骨髓细胞。
[方式13]
方式10～12的任一项中记载的方法，进一步包括，通过工序(2)的培养使骨髓细胞分化成造血细胞(血细胞株细胞)。
[方式14]
方式10～13的任一项中记载的方法进一步包括，在工序(2)中将第二细胞群施加至聚酰亚胺多孔膜后，添加分化诱导促进物质和培养，促进是第二细胞群的骨髓细胞向造血细胞(血细胞株细胞)的分化，使得其具有聚酰亚胺多孔膜的立体结构特异性。
[方式15]
造血细胞(血细胞株细胞)的制备方法，包括回收使用方式13或14中任一项中记载的方法获得的造血细胞(血细胞株细胞)。
[方式16]
方式13～15的任一项中记载的方法，造血细胞(血细胞株细胞)是红细胞前体细胞或红细胞。
[方式17]
方式1～16的任一项中记载的方法，聚酰亚胺多孔膜是，包含从四羧酸二酐和二胺获得的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜。
[方式18]
方式17中记载的方法，聚酰亚胺多孔膜是，使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后、在250℃以上进行热处理、由此得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。
[方式19]
方式17或18中记载的方法，前述聚酰亚胺多孔膜是具有两个不同的表层面和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔膜。
[方式20]
方式1～19的任一项中记载的方法，将两个以上(两种以上)聚酰亚胺多孔膜，在细胞培养基中上下或左右地层叠地使用。
[方式21]
方式1～20的任一项中记载的方法，将聚酰亚胺多孔膜
i)折叠，
ii)卷成卷状，
iii)将片材或小片通过丝状结构体连接，或
iv)系成绳状，
悬浮或固定在细胞培养容器中的细胞培养培养基中而使用。
[方式22]
用于在方式1～21中任一项中记载的方法中使用的试剂盒，含有聚酰亚胺多孔膜。
[方式23]
聚酰亚胺多孔膜在方式1～21任一项中记载的方法中的用途。
[方式24]
聚酰亚胺多孔膜，用于骨损伤部位的治疗。
[方式25]
方式24中记载的聚酰亚胺多孔膜，骨损伤是骨折。
[方式26]
方式24中记载的聚酰亚胺多孔膜，骨损伤是骨缺损。
[方式27]
方式24-26任一项中记载聚酰亚胺多孔膜，用于移植到活体内，以接触骨损伤患处。
[方式28]
方式24～27的任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜，其是含有从四羧酸二酐和二胺获得的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜。
[方式29]
方式28中记载的聚酰亚胺多孔膜，其是使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后、在250℃以上进行热处理、由此得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。
[方式30]
方式28或29中记载的聚酰亚胺多孔膜，其是具有两个不同的表层面和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔膜。
[方式31]
方式30中记载的聚酰亚胺多孔膜，用于植入在活体中，以使得前述两个不同的表层面中平均孔径更小的面接触所述骨损伤患处。
[方式32]
方式24～31的任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜，聚酰亚胺多孔膜的厚度为100微米以下。
[方式33]
方式24～32的任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜，聚酰亚胺多孔膜的表面，通过改变它的物理性质的工序进行处理。
[方式34]
方式33中记载的聚酰亚胺多孔膜，改变聚酰亚胺多孔膜的表面的物理性质的工序选自由以下组成的组：将聚酰亚胺多孔膜进行碱处理的工序，钙处理的工序，用生物适合性材料涂覆的工序，和这些中一个以上的组合。
[方式35]
方式34中记载的方法，生物适合性材料选自由以下组成的组：胶原蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，聚赖氨酸，聚交酯，聚乙醇酸交酯，聚已酸内酯，聚羟基丁酸酯，聚丙交酯-共-己内酯，聚碳酸酯，可生物降解的聚氨酯(聚氨基甲酸乙酯,聚氨基甲酸酯)，聚醚酯(ポリエーテルエステル)，聚酯酰胺，羟基磷灰石，胶原蛋白和β-TCP的复合体以及前述这些的组合。
[方式36]
方式24～35的任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜，其预先承载细胞。
[方式37]
方式36中记载的聚酰亚胺多膜，细胞选自由以下组成的组：哺乳动物(哺乳类)来源的多能干细胞，组织干细胞，体细胞，和前述这些的组合。
[方式38]
方式37中记载的聚酰亚胺多孔膜，细胞包括哺乳动物来源的骨髓细胞。
[方式39]
骨损伤部位的治疗用试剂盒，包括方式24-38任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜。
[方式40]
方式24-38任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜在骨损伤部位的治疗中的用途。
[方式41]
用于骨损伤部位的治疗的聚酰亚胺多孔膜的制造方法，包括使聚酰亚胺多孔膜承载骨髓细胞。
[方式42]
方式41中记载的方法，骨髓细胞是从骨损伤部位的治疗的对象采取的。
[方式43]
治疗骨损伤部位的方法，包括将方式24～38的任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜施加至骨损伤部位。
发明的效果
本发明中，通过利用类似于形态骨髓结构的聚酰亚胺多孔膜的三维结构，以允许有效的骨髓细胞的培养。此外，根据本发明，根据具有一聚酰亚胺多孔膜独特的三维结构，能够得到具有在骨髓中类似分化特征的细胞。材料具有这样的功能尚未迄今报道。此外，根据本发明，培养的细胞，能够分化成在聚酰亚胺多孔膜红细胞前体细胞。根据本发明能够应用到提供血液成分具有降低的感染风险和免疫排斥的风险。
此外，在本发明中，通过使用聚酰亚胺多孔膜是柔性多孔质片材，适合于不同的创伤部，包括大量缺损部位和复杂形状部位，可以容易地处理和有效的骨损伤而成。在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜，大孔结构化表面的两个结构被称为网状结构表面和B面称为A表面是由不同的大孔径比表面包围，形成了内的多方面的空隙结构部的薄膜是，富含耐热性和柔韧性，其具有优异的形状的灵活性。此外，在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜具有使细胞维持在特定的三维结构可以生长的优点。通过根据由支撑施加到骨损伤部位的目的聚酰亚胺多孔膜的细胞，也能够以促进骨损伤部位的治疗。
附图的简要说明
[图1]图1示出了具有骨髓类似的结构的聚酰亚胺多孔膜的扫描电子显微照片。是横截面和聚酰亚胺多孔膜(网状结构表面)·B平面(大孔结构的表面)的表面A的扫描电子显微照片。作为对比，非专利文献1(船越2012号新闻十月一日)的扫描电子显微照片，其中所述骨髓(图(b))。
[图2]图2显示了骨髓细胞培养物的一个概念图。上放置于培养容器的聚酰亚胺多孔膜，它们是从骨髓和从骨髓收集培养，然后，类似地接种细胞收获接种的细胞。此外，继续培养，每个电池的聚酰亚胺多孔膜是固定的，并通过染色或类似分析。诱导分化的刺激也可以使用。
[图3]图3示出了从小鼠骨髓细胞吸收，使用聚酰亚胺多孔膜培养的结果。该加法运算后的面板培养7天的上部聚酰亚胺多孔膜固定图像(蓝色；核，绿色：GFP)显示出较低的面板B表面大孔结构和CD45阳性细胞(蓝色；核，绿色；GFP，红；CD45)示出了。
[图4]图4中的两个骨髓来源的细胞的接种后，示出了由促红细胞生成素诱导分化的结果。之后，从第二次接种培养7天后，红细胞生成素添加后5个单位示出了在24小时后的荧光显微镜图像。
[图5]图5显示了大鼠颅骨缺损模型。
[图6]图6是大鼠颅骨缺损模型，缺损部位示出的过程的照片用于涂覆聚酰亚胺多孔膜片。
[图7]图7中，在涂敷聚酰亚胺多孔膜大鼠颅骨缺损模型的骨损伤部位，表现出骨损伤的治愈的情况下。
[图8]图8示出了大鼠颅骨缺损模型的骨损伤部位，在涂敷聚酰亚胺多孔膜的情况下，通过接种骨髓细胞一次培养，治愈骨损伤具有支撑在其上。
[图9]图9是骨损伤部位的大鼠颅骨缺损模型的，在涂敷聚酰亚胺多孔膜的情况下，通过接种骨髓细胞一次或两次培养，新骨体积具有支撑在其上(BV它显示的时间过程)。
[图10]图10是大鼠颅骨缺损模型的骨损伤部位，在涂敷聚酰亚胺多孔膜的情况下，通过接种骨髓细胞一次或两次培养，骨矿物质含量具有支撑在其上(BMC它显示的时间过程)。
[图11]图11大鼠颅骨缺损模型的骨损伤部位，在涂敷聚酰亚胺多孔膜的情况下具有由接种骨髓细胞一次或两次培养支撑在其上，骨矿物质密度(BMD)这表明随着时间的变化。
用于实施发明的方式
对于聚酰亚胺多孔膜
本发明是，I.培养骨髓细胞，II方法。在两个阶段中分开的骨髓细胞被施加到聚酰亚胺多孔膜，骨髓细胞的培养方法进行培养，III。试剂盒用于在培养的骨髓细胞的方法，使用IV。用于骨髓细胞的培养方法，利用聚酰亚胺多孔膜，V.聚酰亚胺多孔膜，用于骨损伤部位，VI的治疗。骨损伤部位专用夹具疗用试剂盒，VII。用于骨损伤，使用聚酰亚胺多孔膜，VIII的治疗。过程用于骨损伤部位和IX的治疗生产聚酰亚胺多孔膜。骨的损伤部位涉及一种用于治疗的方法。在任一发明中，常见的是，聚酰亚胺多孔膜用于。
聚酰亚胺是在重复细胞群中包含酰亚胺键的高分子(聚合物)的总称，通常是指芳族化合物通过直接酰亚胺键连接的芳族聚酰亚胺。芳族聚酰亚胺具有芳族和芳族通过酰亚胺键的共轭结构，具有刚硬、牢固的分子结构，并且酰亚胺键具有强的分子间力，因此，具有非常高水平的热的、机械的、化学的性质。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜是，包括由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺(作为主要成分)的聚酰亚胺多孔膜，更优选为由通过四羧酸二酐和二胺所得到的聚酰亚胺形成的聚酰亚胺多孔膜。所述“作为主要组分包括”意指，作为聚酰亚胺多孔膜的构成成分，从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺以外的成分是基本上不被包含的，或者即使被包含，也是不影响由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质的另外的成分。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜，包括从四羧酸成分和二胺组分得到的聚酰胺酸溶液与着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后，在250℃以上仅限热处理，由此得到的的聚酰亚胺多孔膜也被包括。
聚酰胺酸
聚酰胺酸是通过聚合四羧酸成分和二胺成分而获得。聚酰胺酸是，通过热酰亚胺化或化学酰亚胺化的闭环、可以成为聚酰亚胺的聚酰亚胺前体。
聚酰胺酸，即使酰胺酸的部分被酰亚胺化，只要它不影响本发明，也可以使用。即，聚酰胺酸的一部分可以被热酰亚胺化或者化学酰亚胺化。
在将聚酰胺酸热酰亚胺化的情况下，根据需要，酰亚胺化催化剂，有机含磷化合物，无机微粒，有机微粒等的微粒等可被添加到聚酰胺酸溶液。此外，如果将聚酰胺酸化学酰亚胺化，根据需要，化学酰亚胺化剂，脱水剂，无机微粒，有机微粒等的微粒等可被添加到聚酰胺酸溶液。聚酰胺酸溶液中即使混合前述成分、在着色前体不析出的条件下进行也是优选的。
着色前体
着色在本发明中使用的前体，这意味着前体的一部分或全部来产生有色的产物在高于250℃下通过热处理碳化。
在本发明中使用的着色前体，均匀地溶解或分散在聚酰胺酸溶液或聚酰亚胺溶液，250℃或更高，优选260℃或更高，更优选280℃或更高，更优选高于300℃下的热处理的那些，优选高于250℃下在氧存在下，如空气，优选260℃或更高，更优选280℃或更高，并且由更优选为300℃以上的热处理的热分解，以通过碳化产生有色产物它是优选的，更优选的是那些产生有色产物黑色的，更优选基于碳的前体的着色。
着色前体如果进行加热则变得可以一下就看到碳化物，但是，在组织(结构)中包括除碳之外的不同元素，包括层结构，芳族交联结构，含有四面体碳的无序结构。
碳系着色前体，没有特别限定，可以列举，例如，石油焦油、石油沥青、煤焦油、煤沥青等的焦油、或沥青、焦炭、从含有丙烯腈的单体而得到的聚合物、二茂铁化合物(二茂铁和二茂铁衍生物)等。其中，从含有丙烯腈的单体得到的聚合物和/或二茂铁化合物是优选的，作为由含有丙烯腈的单体得到的聚合物，聚丙烯腈是优选的。
四羧酸二酐可以使用任何四羧酸二酐，可以根据所期望的性质来适当地选择。作为四羧酸二酐的具体例子，可以列举苯均四酸二酐、3，3’，4，4’－联苯四羧酸二酐(s－BPDA)、2，3，3’，4’－联苯四羧酸二酐(a－BPDA)等的联苯四羧酸二酐、氧双邻苯二甲酸二酐、二苯砜－3，4，3’，4’－四羧酸二酐、双(3，4－二羧基苯基)硫化物二酐、2，2－双(3，4－二羧基苯基)－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷二酐、2，3，3’，4’－二苯甲酮四羧酸二酐、3，3’，4，4’－二苯甲酮四羧酸二酐、双(3，4－二羧基苯基)甲烷二酐、2，2－双(3，4－二羧基苯基)丙烷二酐、p－苯撑双(偏苯三酸单酯酸酐)、p－双苯撑双(偏苯三酸单酯酸酐)、m－三联苯基－3，4，3’，4’－四羧酸二酐、p－三联苯基－3，4，3’，4’－四羧酸二酐、1，3－双(3，4－二羧基苯氧基)苯二酐、1，4－双(3，4－二羧基苯氧基)苯二酐、1，4－双(3，4－二羧基苯氧基)双苯基二酐、2，2－双[(3，4－二羧基苯氧基)苯基]丙烷二酐、2，3，6，7－萘四羧酸二酐、1，4，5，8－萘四羧酸二酐、4，4’－(2，2－六氟亚异丙基)二苯二甲酸二酐等。此外，优选使用2，3，3’，4’－二苯砜四羧酸等的芳香族四羧酸。前述这些可以单独使用，也可以两种以上组合使用。
在这些中，特别优选的是，从由联苯四羧酸二酐和均苯四羧酸二酐组成的组中选择的至少一种芳族四羧酸二酐。作为联苯四羧酸二酐，可以适当地使用3，3’，4，4’－联苯四羧酸二酐。
二胺可以使用任何二胺。作为二胺的具体例子，可以举出以下。
1)1，4－二氨基苯(对苯撑二胺)、1，3－二氨基苯、2，4－二氨基甲苯、2，6－二氨基甲苯等的苯核1个的苯二胺；
2)4，4’－二氨基二苯醚、3，4’－二氨基二苯醚等的二氨基二苯醚、4，4’－二氨基二苯基甲烷、3，3’－二甲基－4，4’－二氨基联苯，2，2’－二甲基－4，4’－二氨基联苯，2，2’－双(三氟甲基)－4，4’－二氨基联苯，3，3’－二甲基－4，4’－二氨基二苯基甲烷、3，3’－二羧基－4，4’－二氨基二苯基甲烷、3，3’，5，5’－四甲基－4，4’－二氨基二苯基甲烷、双(4－氨基苯基)硫化物、4，4’－二氨基苯甲酰苯胺、3，3’－二氯联苯胺、3，3’－二甲基联苯胺、2，2’－二甲基联苯胺、3，3’－二甲氧基联苯胺、2，2’－二甲氧基联苯胺、3，3’－二氨基二苯醚、3，4’－二氨基二苯醚、4，4’－二氨基二苯醚、3，3’－二氨基二苯基硫化物、3，4’－二氨基二苯基硫化物、4，4’－二氨基二苯基硫化物、3，3’－二氨基二苯砜、3，4’－二氨基二苯砜、4，4’－二氨基二苯砜、3，3’－二氨基二苯甲酮、3，3’－二氨基－4，4’－二氯二苯甲酮、3，3’－二氨基－4，4’－二甲氧基二苯甲酮、3，3’－二氨基二苯基甲烷、3，4’－二氨基二苯基甲烷、4，4’－二氨基二苯基甲烷、2，2－双(3－氨基苯基)丙烷、2，2－双(4－氨基苯基)丙烷、2，2－双(3－氨基苯基)－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷、2，2－双(4－氨基苯基)－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷、3，3’－二氨基二苯基亚砜、3，4’－二氨基二苯基亚砜、4，4’－二氨基二苯基亚砜等的苯核2个的二胺；
3)1，3－双(3－氨基苯基)苯、1，3－双(4－氨基苯基)苯、1，4－双(3－氨基苯基)苯、1，4－双(4－氨基苯基)苯、1，3－双(4-氨基苯氧基)苯、1，4－双(3-氨基苯氧基)苯、1，4－双(4-氨基苯氧基)苯、1，3－双(3-氨基苯氧基)－4－三氟甲基苯、3，3’－二氨基－4－(4－苯基)苯氧基二苯甲酮、3，3’－二氨基－4，4’－二(4－苯基苯氧基)二苯甲酮、1，3－双(3－氨基苯基硫化物)苯、1，3－双(4－氨基苯基硫化物)苯、1，4－双(4－氨基苯基硫化物)苯、1，3－双(3－氨基苯基砜)苯、1，3－双(4－氨基苯基砜)苯、1，4－双(4－氨基苯基砜)苯、1，3－双[2－(4－氨基苯基)异丙基]苯、1，4－双[2－(3－氨基苯基)异丙基]苯、1，4－双[2－(4－氨基苯基)异丙基]苯等的苯核3个的二胺；
4)3，3’－双(3-氨基苯氧基)联苯，3，3’－双(4-氨基苯氧基)联苯，4，4’－双(3-氨基苯氧基)联苯，4，4’－双(4-氨基苯氧基)联苯，双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]醚、双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]醚、双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]醚、双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]醚、双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]酮、双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]酮、双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]酮、双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]酮、双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]硫化物、双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]硫化物、双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]硫化物、双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]硫化物、双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]砜、双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]砜、双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]砜、双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]砜、双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]甲烷、2，2－双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2，2－双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2，2－双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2，2－双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2，2－双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷、2，2－双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷、2，2－双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷、2，2－双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷等的苯核4个的二胺。
前述这些可以单独施用，也可以两种以上混合使用。使用的二胺可以根据所期望的特性适当地选择。
在这些中，芳族二胺化合物是优选的，3，3’－二氨基二苯醚、3，4’－二氨基二苯醚、4，4’－二氨基二苯醚以及对苯撑二胺、1，3－双(3－氨基苯基)苯、1，3－双(4－氨基苯基)苯、1，4－双(3－氨基苯基)苯、1，4－双(4－氨基苯基)苯、1，3－双(4-氨基苯氧基)苯、1，4－双(3-氨基苯氧基)苯可以适当地使用。特特别是，从苯二胺，二氨基二苯醚和双(氨基苯氧基)苯基组成的组中选择的至少一种二胺是优选的。
本发明中使用的从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点来看，从组合玻璃化转变温度是240℃以上、或300℃以上的没有明确的转变温度的四羧酸二酐和二胺而获得的聚酰亚胺形成是优选的。
本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜，从耐热性，高温下的尺寸稳定性的观点出发，优选为聚酰亚胺多孔膜由芳族聚酰亚胺的。
(i)由选自联苯基四羧酸细胞群和均苯四酸细胞群组成的组中选择的至少一种四羧酸细胞群与，芳族二胺细胞群形成的芳香族聚酰亚胺、
(ii)由四羧酸细胞群与，从苯二胺细胞群、二氨基二苯基醚细胞群和双(氨基苯氧基)苯基细胞群组成的组中选择的至少一种芳族二胺细胞群形成的芳族聚酰亚胺、
和/或，
(iii)由选自联苯四羧酸细胞群和均苯四酸细胞群组成的组中的至少一种四羧酸细胞群与，从苯二胺细胞群、二氨基二苯基醚细胞群和双(氨基苯氧基)苯基细胞群组成的组中选择的至少一种芳族二胺细胞群形成的芳族聚酰亚胺。
不存在限制，但是，聚酰亚胺多孔膜，至少具有两个表面层和(A侧和B面)，和夹在这两个表面层之间的空隙宏层的聚酰亚胺多层结构多孔膜可以在本发明中使用。优选地，聚酰亚胺多孔膜具有以下多层结构，前述大空隙层具有，结合到前述表面层(A面和B面)的隔壁(隔板、隔膜)，由所述隔壁(隔板、隔膜)和前述表面层(A面和B面)所包围的、膜平面方向的平均孔径是10～500微米(μm)的多个大空隙，前述大空隙层的隔壁(隔板、隔膜)和前述表面层(A面和B面)各自厚度是0.01～20微米，具有多个具有0.01～100微米的平均孔直径的孔，所述细孔(微孔)可以相互连通，还可以与前述大空隙部分或完全连通的多层结构，并且总的膜厚度为5～500微米，孔隙率为40％以上而小于95％，的聚酰亚胺多孔膜。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜的总厚度包括不存在限制，但是，可以是25～75微米的一个方式。根据膜厚度的差异，细胞的增殖速度，细胞形态，面内的细胞饱和度等的差异可被观察到
在本发明中，在具有两个不同的表面层(A面和B面)、所述两个表面层之间夹的大空隙层的聚酰亚胺多孔膜被使用的情况下，A面中存在的孔的平均孔径，与B面中存在的孔的平均孔径可以存在差异。优选地，A面中存在的孔的平均孔径，小于B面中存在的孔的平均孔径。更优选地，A面中存在的孔的平均孔径，小于B面中存在的孔的平均孔径，A面中存在的孔的平均孔径为0.01～50μm，0.01μm～40μm，0.01μm～30μm，0.01μm～20μm或0.01μm～15μm，B面中存在的孔的平均孔径为20μm～100μm，30μm～100μm，40μm～100μm，50μm～100μm或60μm～100μm。特别优选地，聚酰亚胺多孔膜的A面为具有平均孔径15μm以下，例如0.01μm～15μm的小孔的网状结构，B面为具有平均孔径20μm或更大的孔的表面上，例如在20μm～100μm的大孔结构。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜的总厚度的测定通过接触式的厚度计进行。
聚酰亚胺多孔膜表面的平均孔径如下求得，通过多孔膜表面的扫描式电子显微照片，测定200点以上的开孔部的孔面积，根据所述孔面积按照下式(1)计算孔形状为正圆时的平均直径。
[数学公式1]
(式中、Sa指孔面积的平均值。)
本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜的孔隙率可以如下求得，测量切割成预定尺寸的多孔膜的厚度和质量，从观察到的质量根据下式(2)来求得。
[数学公式2]
孔隙率(％)＝(1-w/(S×d×D))×100 (2)
(式中分别地、S意指多孔膜的面积，d意指总的膜厚度，w意指所测定的质量，D意指聚酰亚胺的密度。聚酰亚胺的密度为1.34克/厘米3。)
例如，国际公开WO2010/038873，特开2011-219585，或特开2011-219586中记载的聚酰亚胺多孔膜也可以在本发明的方法中使用。
接种于聚酰亚胺多孔膜的表面的细胞在膜的表面和/或内部可稳定地生长和增殖。细胞根据在膜中生长、增殖的位置，可以采取各种不同的形式。在本发明的一个方式中，取决于细胞种类，一边移动聚酰亚胺多孔膜的表面和内部，一边改变形状而进行增殖的情况也存在。
本发明的方法中添加细胞的聚酰亚胺多孔膜，当然优选，不含施加以外的细胞的状态，即，优选是无菌的。本发明的方法优选包括将聚酰亚胺多孔膜预先灭菌的工序。聚酰亚胺多孔膜的耐热性非常优异，重量轻，形状和尺寸也可自由选择，容易进行灭菌处理。干热灭菌，蒸汽灭菌，通过乙醇等消毒剂灭菌，紫外线或γ射线等的电磁波灭菌等任意的灭菌处理都是可能的。
I.骨髓细胞培养方法
本发明涉及骨髓细胞的培养方法，包括将骨髓细胞施加到聚酰亚胺多孔膜，培养。顺便提及，国际申请号PCT/JP2014/070407的全部内容，通过引用并入本文。
培养本发明的骨髓细胞的方法，包括将骨髓细胞施加到聚酰亚胺多孔膜并培养。本发明的方法被应用到的骨髓细胞到聚酰亚胺多孔膜，其特征在于它包括上或在聚酰亚胺膜的内部培养骨髓细胞。
1.骨髓细胞
另外，在本说明书中，骨髓细胞，是指存在于骨髓中的细胞。的骨髓细胞，包括骨髓基质细胞，骨髓来源的血液前体细胞和骨髓来源的血细胞。骨髓基质细胞，是指支持骨髓来源的血细胞的细胞。骨髓来源的血液前体细胞，是指可分裂分化后分化成血或血细胞的细胞。骨髓来源的血液细胞(血细胞)应被解释为包含在骨髓血细胞。
在方法用于培养本发明的骨髓细胞的骨髓细胞，如果动物衍生属于哺乳纲称为哺乳动物限于获得不是唯一的，小鼠，大鼠，人，猴，猪，狗细胞它可以是例示的绵羊，山羊等。
在本发明的骨髓细胞的培养方法中使用的骨髓细胞可从哺乳动物的骨髓采取细胞。从骨髓采集骨髓细胞可以使用冲洗等公知的方法骨髓穿刺或骨髓中进行。此外，骨髓细胞用于本发明中使用的可以是从哺乳动物骨髓的细胞，原代培养细胞。
2。骨髓施加到达细胞的方式聚酰亚胺膜
在本发明中，骨髓细胞的方式聚酰亚胺膜的方式应用方式特定的加工机构死亡色JP别的限制系统的骨髓细胞的培养方法。本文描述的过程，或者它可以采用适合用于施加骨髓细胞成膜状载体的任何方法。不存在限制，但是，在本发明的方法中，施加到聚酰亚胺多孔膜的骨髓细胞中，例如，包括以下几个方面。
(A)骨髄细胞包括接种聚酰亚胺多孔膜的表面的工序中，方式；
(B)放置骨髓细胞悬浮液以干燥聚酰亚胺多孔膜的表面上，
或站，或者是否通过移动聚酰亚胺多孔膜，以促进液体的流出，或刺激表面的一部分，和素骨髓细胞悬浮液到膜上，并且，
紧固骨髓细胞悬浮液的骨髓细胞中，所述膜，水分流出，
包括工序：方式；而且，
(C)一种或聚酰亚胺多孔膜的两面用骨髓细胞培养物或无菌液体润湿，
骨髓细胞悬浮液装载到一聚酰亚胺多孔膜的湿润，和，
紧固骨髓细胞悬浮液的骨髓细胞中，所述膜，水分流出，
包括工序：方式。
(A)的方式，骨髓细胞的聚酰亚胺多孔膜的表面上，包括直接播种骨髓细胞块。或者，在把聚酰亚胺多孔膜骨髓细胞悬浮液，其中包括从所述膜的表面浸润骨髓细胞培养物中的方面。
接种的聚酰亚胺多孔膜的表面上的骨髓细胞粘附到聚酰亚胺多孔膜，它将渗透到多孔的内部。优选地，不添加物理或化学力的，特别是从外部，骨髓细胞自发地粘附到聚酰亚胺多孔膜。接种该膜的表面上的聚酰亚胺多孔骨髓细胞可稳定地生长和增殖的表面和/或所述膜的内部。骨髓细胞根据薄膜生长和增殖的位置，它可以采取各种不同的形式。
(B)的方式中，后骨髓细胞悬浮液以干燥聚酰亚胺多孔膜的表面。要么离开的聚酰亚胺多孔膜，或是否通过移动聚酰亚胺多孔膜，以促进液体的流出，或刺激表面的一部分，通过吸入骨髓细胞悬浮液到膜，骨髓细胞悬浮液渗透到膜。不受理论的束缚，据信这是由于从聚酰亚胺多孔膜的各表面形状的性质。本实施方式中，骨髓细胞接种在一位置处的细胞悬浮液被吸入装在膜中。
可替代地，如在(C)的实施例中，聚酰亚胺多孔一个或一部分或全部的薄膜的两侧，用骨髓细胞培养物或无菌液体，骨髓细胞湿润后润湿聚酰亚胺多孔膜悬浮液可以装载有。在这种情况下，将细胞悬液的通过的速度大大提高。
例如，以防膜的飞散为主要目的、润湿膜端一部分(膜極一部)的方法(在下文中，这被称为“单点湿法”)可以使用。单点湿法，非常接近那些基本上不润湿膜的干法((B)的方式)。但是，润湿的小部分认为骨髓细胞流体的膜透性变快。此外，那些充分润湿整个一个表面或聚酰亚胺多孔膜(以下，这被称为“湿膜”简称)的两个表面可用于加载骨髓细胞悬浮液的方法(下文中，这被描述为“湿Makuho”)。在这种情况下，在整个聚酰亚胺多孔膜，骨髓细胞悬浮液的通路的速率显著改善。
在(B)和(C)的方案，骨髓细胞悬浮液的紧固骨髓细胞中，所述膜，水分流失。在从而浓缩骨髓细胞的浓度在骨髓细胞悬浮液，除骨髓细胞等与水一起进行流动的不必要的分量，能够Hitoshiteki处理。
有时将(A)方式称为“自然接种”，将方式(B)和(C)称为“吸入接种”。
虽然不受限制，但是优选地，在聚酰亚胺多孔膜中活细胞选择性地停留。因此，在本发明的一个优选实施方案中，活细胞停留在前述聚酰亚胺多孔膜内，死细胞优先与水分一起流出。
在本实施方式(C)中使用的经灭菌的液体没有特别的限定，是经灭菌的缓冲液或无菌水。缓冲液为，例如，(+)和(-)Dulbecco PBS(Dulbecco’s PBS)、(+)和(-)Hank氏平衡盐溶液(Hank′s Balanced Salt Solution)等。缓冲液的例子在下面的表1中显示。
【表1】
成分 浓度(mmol/L) 浓度(g/L)
NaCl 137 8.00
KCl 2.7 0.20
Na2HPO4 10 1.44
KH2PO4 1.76 0.24
pH(-) 7.4 7.4
此外，在本发明的骨髓细胞的培养方法方面中，应用到骨髓细胞的聚酰亚胺多孔膜，以便在对细胞粘附到由膜的浮置状态的细胞共存的聚酰亚胺多孔膜和悬挂的方式(合股线向上)也被包括在内。例如，在本发明的细胞培养方法，为了将骨髓细胞施加到聚酰亚胺多孔膜，在细胞培养容器中，将细胞培养基，把骨髓细胞和一种或多种聚酰亚胺多孔膜的它可能是。如果细胞培养培养基是液体聚酰亚胺多孔膜处于被悬浮在细胞培养基中的状态。聚酰亚胺多孔膜的性质，骨髓细胞可粘附到聚酰亚胺多孔膜。因此，即使一个细胞不适合原生悬浮培养物，聚酰亚胺多孔膜可以是悬浮在细胞培养基中培养。优选地，骨髓细胞自发地结合到聚酰亚胺多孔膜。通过“自发地附着”，不添加物理或化学力的，特别是从外部，这意味着该骨髓细胞保持在表面或聚酰亚胺多孔膜的内部。
在培养基中培养本发明的骨髓细胞的方法中，使用聚酰亚胺悬浮在细胞培养基中的多孔膜时，可以使用一个小片的两个或更多个聚酰亚胺多孔膜的。聚酰亚胺多孔膜是柔性膜，因此，例如通过使其小片悬浮在培养基中而使用，由此在一定容量的细胞培养培养基中可以带入具有许多表面积的聚酰亚胺多孔膜。对于通常的培养，容器底面积是细胞培养可能的面积的上限，但是，使用本发明的聚酰亚胺多孔膜的细胞培养，先前带入的聚酰亚胺多孔膜的大表面积的整体成为细胞培养可能的面积。由于聚酰亚胺多孔膜使得细胞培养液通过，例如在折叠的膜内也可以供给营养，氧等。
聚酰亚胺多孔膜的小片的尺寸，形状没有特别的限制。形状可以采用圆形，椭圆形，四角形(四方形)，三角形，多边形，带状等任何形状。
在该方法中用于培养本发明的骨髓细胞聚酰亚胺多孔膜可以通过改变，因为灵活性的形状可以使用。本发明的聚酰亚胺多孔膜因为柔性可以通过改变形状来使用。的聚酰亚胺多孔膜不采用平面状，也可以在将形状加工成立体状来使用。例如，将聚酰亚胺多孔膜，i)折叠，ii)卷成卷状，iii)将片材或小片通过丝状结构体连接，或ⅳ)系成绳状，在细胞培养容器的细胞培养培养基中悬浮或固定。通过如i)～iv)加工形状，与使用小片的情况同样地，在一定容量的细胞培养培养基中，可以放入大量聚酰亚胺多孔膜。此外，有可能将各小片作为集合体而处理，因此，能够将细胞集合化而移动，综合性的适用性高。
作为与小片集合体相同的看法，两个以上(两种以上)的聚酰亚胺多孔膜可以在细胞培养培养基中上下或左右地层叠。层叠还包括重叠聚酰亚胺多孔膜部分的方式。通过层叠培养，在狭窄的空间也能够以高密度培养细胞。另外，也可以在细胞已经生长的膜上进一步层叠膜而放置膜，从而形成与其它种类细胞的多层系统。层叠的聚酰亚胺多孔膜的数目没有特别的限制。
可以以两种或多种方式组合使用用于培养上述本发明的骨髓细胞的方法。例如，使用方案(A)～(C)具体仁阿一项，则聚酰亚胺多孔膜的骨髓细胞附着可以是悬浮培养物的方法将所述的细胞与第一聚酰亚胺多孔膜。或者，作为施加至聚酰亚胺多孔膜的工序，也可以将上述方式(A)～(C)中任一项的方法中两个以上(两种以上)组合使用。
在培养基中培养本发明的骨髓细胞的方法中使用的聚酰亚胺聚酰亚胺多孔膜多孔膜有两个不同的表面层(A侧和B面)，和夹在这两个表面层之间的空隙宏层质量膜中，存在于一个平面中的孔的平均孔径，比存在于所述表面B上的孔的平均直径小，骨髓细胞可以从表面B被施加从一个表面上。优选地，骨髓细胞从所述的表面上。
在培养基中培养本发明的骨髓细胞的方法，优选地，骨髓细胞生长的表面上，并且所述聚酰亚胺多孔膜增殖的内部。
在培养基中培养本发明的骨髓细胞的方法，所述培养系统和培养条件的骨髓细胞，可以适当地根据细胞的种类来确定。本领域的技术人员可以通过使用任何已知的方法是培养的细胞施加到聚酰亚胺多孔膜。是以是细胞培养基础上也适这里制备决于细胞种类系统注-。
在本发明中，液体介质的骨髓细胞的培养方法中使用的细胞培养基，半固体培养基可以是任何形式，例如固体培养基。此外，通过将液滴状液体培养基喷雾在细胞培养容器中，可以使承载细胞的聚酰亚胺多孔膜接触培养基。
对于使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的培养，微载体、纤维素海绵等、其他悬浮型培养载体可以一起存在。
在培养基中培养本发明的骨髓细胞的方法中，用于培养该系统的形状没有特别的限制，例如刻度，是适当地提供菜用于细胞培养，烧瓶，塑料袋，从试管到大罐中。培养中使用的系统的形状、规模等没有特别的限制，从细胞培养用的培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)、烧瓶、塑料袋、试管到大型的罐都可适当利用。例如，BD Falcon公司制的セルカルチャーディッシュ、サーモサイエンティフィック公司制的Nuncセルファクトリー等被包括。顺便提及，通过在本发明中使用聚酰亚胺多孔膜，即使对于生来不可能悬浮培养的细胞，在靶向悬浮培养的装置中，也可能以悬浮培养类似的状态下进行培养。作为悬浮培养装置，可用例如，Corning公司(コーニング社)制的转瓶(旋转烧瓶)或旋转培养等。此外，作为可以提供相同的功能的环境，VERITAS公司的Fiber Cell(注册商标)System这样的中空纤维培养也可以使。
培养在培养的骨髓细胞中的本发明的，使用连续循环或开放式设备例如添加在聚酰亚胺多孔膜恢复连续介质的，在空气中暴露的聚酰亚胺多孔膜片的方法它也能够执行种类如。
在培养基中培养本发明的骨髓细胞的方法，培养的细胞，从所安装的细胞培养基中进行供应指细胞培养容器连续地或间歇基于细胞培养基被供给到细胞培养容器外部它可能是。其中可以细胞培养基是细胞培养培养基供给手段(装置)和细胞培养容器之间循环的系统。
在细胞的培养通过从在细胞培养容器外设置的细胞培养培养基供给手段(装置)连续或间歇地将细胞培养培养基供给到细胞培养容器中的系统而进行的情况下，该系统可以是细胞培养装置，其包括是细胞培养容器的培养细胞群(培养部件)以及是细胞培养培养基供给手段(装置)的培养基供给细胞群(培养基供给部件)，此处
培养细胞群(培养部件)是容纳用于承载细胞的一个或多个(一种或多种)聚酰亚胺多孔膜的培养细胞群(培养部件)，是具有培养基供给口和培养基排出口的培养细胞群(培养部件)，
培养基供给细胞群(培养基供给部件)是，具备培养基供给线、经由培养基供给线连续地或间歇地将培养基送液的送液泵，其中，培养基供给线的第一端部与在培养液收纳容器内的培养基接触，培养基供给线的第二端部经由所述培养细胞群(培养部件)的培养基供给口与培养细胞群(培养部件)内连通的培养细胞群(培养部件)
可以是细胞培养装置。
此外，在该细胞培养装置中，培养细胞群(培养部件)可以是不具有空气供给口、空气排出口和氧交换膜的培养细胞群(培养部件)，此外可以是具备空气供给口和空气排出口、或氧交换膜的培养细胞群(培养部件)。培养细胞群(培养部件)可以是不具有空气供给口和空气排出口，以及氧交换膜的培养细胞群(培养部件)，将细胞培养必要的氧等通入培养基而充分地供给至细胞。此外，在上述细胞培养装置中，进一步具备培养细胞群(培养部件)的培养基排出线，此处培养基排出线的第一端部连接到培养基收纳容器，培养基排出线的第二端部经由培养细胞群(培养部件)的培养基排出口与培养细胞群(培养部件)内连通，培养基可以在培养基供给细胞群(培养基供给部件)和培养细胞群(培养部件)之间循环。
3.骨髓细胞分化成血细胞
本发明还涉及-还原包容，培养骨髓细胞向骨髓细胞的方法来分化成造血细胞(血细胞株细胞)通过培养。
在本说明书中的血细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞，单核细胞，白细胞，巨噬细胞，红细胞，血小板，肥大细胞，树突状细胞，以及它们的前体细胞等等。
通过将骨髓细胞到聚酰亚胺多孔膜继续培养，骨髓细胞的一部分可以分化成血细胞。虽然不希望被理论所束缚，由于具有聚酰亚胺多孔膜中的三维结构是接近骨髓的三维结构，可根据聚酰亚胺多孔膜的三维结构，具有在骨髓类似分化特征的细胞它坐落，增殖。因此，由骨髓的体内结构它大致与一聚酰亚胺多孔膜再现诱导分化成血细胞。另外，在本说明书中，由骨髓的体内结构它大致与一聚酰亚胺多孔膜再现时，被诱导分化成造血细胞(血细胞株细胞)，特定的聚酰亚胺多孔膜的三维结构骨髓细胞分化成血细胞。
用于培养本发明的骨髓细胞，将所述骨髓细胞到聚酰亚胺多孔膜后，分化诱导促进物质中加入，从构象特异性骨髓细胞分化的方法，聚酰亚胺多孔膜的血细胞可以加速。分化诱导促进物质，可以适当地使用根据用途的公知材料，集落刺激因子，粒细胞集落刺激因子，干细胞因子，干细胞生长因子α，促红细胞生成素，血小板生成素，除它可以例举白细胞介素等，但不限于此。在本发明的方法中，可以单独使用促进物质的一种种类的分化诱导的，或者可以以多种种类的分化诱导促进物质的组合使用。
本发明涉及此外，并回收通过培养上述的骨髓细胞的方法获得的血细胞，一种用于造血细胞(血细胞株细胞)的制备。
II.在两个阶段中分开的骨髓细胞被施加到聚酰亚胺多孔膜，骨髓培养的培养细胞的方法
本发明提供用于骨髓细胞的培养方法，
(1)将第一细胞群施加到聚酰亚胺多孔膜、培养的工序和，
(2)第二细胞群步骤(1)中，培养步骤的温育之后施加到聚酰亚胺多孔膜
提示，其中所述细胞的所述第二组是骨髓细胞，还涉及一种方法。
其中，所述第一细胞组的种类可以是任何细胞，例如，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，它可以是那些选自由酵母和细菌组成的组中。在本说明书中动物细胞，例如，细胞选自由动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母菌和细菌组成的组中。动物细胞大致分为，来源于属于脊椎动物门的细胞和来源于无脊椎动物(属于脊椎动物动物门的动物以外的动物)的细胞。在本说明书中，动物细胞的来源没有特别的限制。优选地，意味着来源于属于脊椎动物门的动物的细胞。脊椎动物门包括无颚纲和有颔纲，有颔纲包括哺乳纲，鸟纲，两栖纲，爬行纲等。优选地，在一般情况下，是来源于属于称为哺乳动物的哺乳纲的动物的细胞。本说明书中哺乳动物包括，但不特别限于，优选小鼠，大鼠，人，猴，猪，狗，绵羊，山羊等。
在本说明书中植物细胞的来源没有特别的限制。包括苔藓植物，蕨类植物，种子植物的植物的细胞成为对象。
本说明书中植植物种子细胞来源的植物包括，单子叶植物、双子叶植物的任一种。单子叶植物中包括，不存在限制，但是，兰科植物，禾本科植物(稻，玉米，大麦，小麦，高粱等)，莎草科植物等等。在双子叶植物中，包括属于菊亚纲，木兰亚纲，蔷薇亚纲等的多种亚纲的植物。
本说明书中藻类，可视为细胞来源生物。从是真细菌的蓝细菌(蓝绿藻(蓝藻))，在真核生物中是单细胞生物的(硅藻，黄绿藻，涡鞭藻甲藻等)和是多细胞生物的海藻类(红藻，褐藻，绿藻)等的不同组被包括。
在本说明书中的古细菌和细菌种类没有特别限制。古细菌包括产甲烷菌，极度嗜盐菌，嗜热嗜酸菌，超嗜热菌等。细菌选自由以下组成的组：例如，乳酸菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和蓝细菌。
动物细胞或植物细胞的种类可以在本发明的骨髓细胞的培养方法一起使用，不存在限制，但是，优选从多能干细胞，组织干细胞，由体细胞的组，和生殖细胞它被选中。
如本文所使用的术语“多能干细胞”意在一般干具有分化成任何组织细胞的能力(多能)细胞。多能干细胞包括，不存在限制，但是，胚胎干细胞(ES细胞)，人工多能干细胞(诱导多能干细胞)(iPS细胞)，胚胎生殖干细胞(EG细胞)，生殖干细胞(GS细胞)等。优选的是，ES细胞或iPS细胞。iPS细胞是特别优选的，其原因是不存在伦理问题等的理由。作为多能干细胞可以使用任何已知的，例如，可以使用在国际公开WO2009/123349(PCT/JP2009/057041)中记载的多能干细胞。
本说明书中作为“组织干细胞”，可分化细胞株列已经限定于特定的组织，这意味着有可向多种细胞种类分化的能力(分化多能性)的干细胞。例如，在骨髓中的造血干细胞成为血细胞的来源，神经干细胞分化为神经细胞。除此之外，存在构造肝脏的肝干细胞，成为皮肤组织的皮肤干细胞等的不同的种类。优选地，组织干细胞选自，间质干细胞，肝干细胞，胰干细胞，神经干细胞，皮肤干细胞，或造血干细胞。
本说明书中术作为“体细胞”，意指构成多细胞生物的细胞中除生殖细胞以外的细胞。在有性繁殖中没有被下一代继承。优选地，体细胞选自，肝细胞，胰细胞，肌细胞，骨细胞，成骨细胞，破骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，皮肤细胞，成纤维细胞，胰细胞，肾细胞，肺细胞，或淋巴细胞，红细胞，白细胞，单核细胞，巨噬细胞或巨核细胞的血细胞。
本说明书中“生殖细胞”指的是具有在生殖中将遗传信息传递给下一代的作用的细胞。例如，包括用于有性生殖的配子、即卵子、卵细胞、精子、精子细胞，用于无性繁殖的孢子。
本说明书中细胞也可以选自由以下组成的组:肉瘤细胞，确立细胞和转化的细胞。作为“肉瘤”，包括骨、软骨、脂肪、肌肉、血液等非上皮细胞来源的结缔组织细胞中发生的癌症，软组织肉瘤，恶性骨肿瘤等。肉瘤细胞是肉瘤来源的细胞。“确立细胞”是指，长期间在体内外保持的、具有一定稳定的性质、可以半永久性传代培养的培养细胞。PC12细胞(来自大鼠肾上腺髓质)，CHO细胞(来自中国仓鼠卵巢)，HEK293细胞(来自人胎儿肾脏)，HL-60细胞(来自人白细胞)，HeLa细胞(来自人宫颈癌)，Vero细胞(来自非洲绿猴肾上皮细胞)，MDCK细胞(来自犬肾小管上皮细胞)，HepG2细胞(来自人肝癌)等的包括人类的不同物种的各种组织来源的细胞株存在。“转化的细胞”意味着，从细胞外部导入核酸(DNA等)，改变遗传性质的细胞。对于动物细胞、植物细胞、细菌的转化，各个适合的方法是公知的。
在培养基中培养本发明的骨髓细胞的方法，所述第一细胞组优选是骨髓细胞。
可以如上描述为应用程序的方法中相同的方式进行对骨髓细胞的聚酰亚胺多孔膜上面如何应用聚酰亚胺多孔膜所描述的细胞的第一组。
划分的骨髓细胞在两个阶段中施加到聚酰亚胺多孔膜，培养骨髓细胞进行培养的方法中，第一细胞组被施加到聚酰亚胺多孔膜，温育后，将其聚酰亚胺多孔膜施加第二细胞组，包括培养的步骤，其中所述细胞的所述第二组是骨髓细胞。
在两个阶段中分开的骨髓细胞被施加到聚酰亚胺多孔膜，在骨髓细胞的培养方法中的第二细胞组的应用和培养后待培养，和骨髓细胞中，通过上述方法来分化成血细胞它可能是。此外，然后，可以加入回收的血细胞的步骤。
例如，正常骨髓细胞作为第一细胞组被施加到聚酰亚胺多孔膜，温育后，向聚酰亚胺多孔膜，施加GFP转基因小鼠来源的骨髓细胞，为第二细胞组，它可以是培养的。同时检查可视化细胞通过GFP，能够监视分化成从骨髓细胞的造血细胞(血细胞株细胞)。
III.骨髄试剂盒用于培养细胞的方法
本发明还包括聚酰亚胺多孔膜，在培养上述的骨髓细胞的方法中使用的试剂盒。
本发明的试剂盒中，除了聚酰亚胺多孔膜，可适当包括细胞培养必需的构成要素。例如，试剂盒包括，施加到聚酰亚胺多孔膜的细胞，细胞培养培养基，连续培养基供给装置，连续培养基循环装置，用于支撑聚酰亚胺多孔膜的支架或模块，细胞培养装置，以及试剂盒的使用说明书。
不存在限制，作为一个方式，包括在透明的袋(小袋)内保存单独或多个经灭菌的聚酰亚胺多孔膜，保持其原样地在细胞培养中可使用形式的包装，或在相同袋(小袋)内封入聚酰亚胺多孔膜与灭菌液体，使得有效地吸式接种成为可能的膜-液体集成形式的试剂盒。
IV.用于培养骨髓细胞，所述聚酰亚胺多孔膜的应用的方法
本发明中，用于骨髓细胞的培养方法，还涉及使用聚酰亚胺多孔膜。
V.骨损伤部位的治疗聚酰亚胺多孔膜
本发明涉及一种聚酰亚胺多孔膜用于骨损伤部位的治疗。
1.骨质破坏
另外，在本说明书中，骨损伤，外伤，由于疲劳，或疾病等，假定一种状态，其中骨组织被破坏，例如，其中只有骨组织的表面被破坏的状态下，骨折，骨缺陷等包括。裂缝此全部骨折骨已经完全失去连续性，和骨折骨不完全丧失连续性。裂缝的方面中，闭合的断裂断裂未打开到主体(单纯骨折)的外侧，开放性骨折断裂是开放的主体的外侧(裂缝)，骨中的一个只在一个地方横断单独骨折，和一个骨骨折复合在多个位置(重叠骨折)等，它们是被横切。本发明的聚酰亚胺多孔膜可以应用于任一实施例的骨折。
本文骨损伤部位，骨损害和身体部分或整体改善的局部损伤病症的治疗意味着修复或恢复。骨折部位的治疗是指骨横断到该网站或不足到该站点部分或完全改善，修复或恢复。此外，促进骨损伤的治疗，提高身体部位骨骼的损坏情况被破坏，修复，或缩短周期恢复或改善受损的状况，修复或扩大地盘恢复说。
促进治疗或治疗骨损伤部位的，横断粘附骨，减少骨缺损面积或体积的指标、骨密度(Bone Mineral Density。BMD)、骨矿质量(Bone Mineral Content。BMC)、骨量(BoneMass)、新生骨体积(BV)等可以适当地使用。
2.聚酰亚胺多孔膜的表面的处理
本发明的聚酰亚胺多孔膜，该表面可以是一种部分或全部通过改变它的物理性质的方法处理。改变聚酰亚胺多孔膜的表面的物理性质的步骤，除非它们抑制骨损伤部位的治疗中，可以根据目的选择的任意步骤中，例如，所述聚酰亚胺多孔膜的表面碱处理，涂层的钙处理步骤的具有生物相容材料的步骤，和一个或多个组合的步骤是示例。
聚酰亚胺多孔膜作为碱处理的步骤，例如，聚酰亚胺多孔膜的表面上的表面上，施加碱性物质，如氢氧化钠或氢氧化钾，所述聚酰亚胺多孔膜的表面的物理性质虽然改变的步骤包括，但不限于。
钙处理的步骤的聚酰亚胺多孔膜的表面，例如，氯化钙的聚酰亚胺多孔膜的表面上，应用磷酸钙，含钙如氟化钙，所述聚酰亚胺多孔膜的物理表面的材料它包括改变所述特性的步骤，但不限于此。
下列碱处理的工序中的聚酰亚胺多孔膜的表面，所述聚酰亚胺多孔膜的表面可以被钙处理。
此外，可以使用在涂布的步骤中的聚酰亚胺多孔膜的表面与生物适合性材料，胶原蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，聚赖氨酸，聚交酯，聚乙醇酸交酯，聚已酸内酯，聚羟基丁酸酯的生物相容材料，聚丙交酯-共-己内酯，聚碳酸酯，可生物降解的聚氨酯(聚氨基甲酸乙酯,聚氨基甲酸酯)，聚醚酯(ポリエーテルエステル)，聚酯酰胺，羟基磷灰石，包括但复杂和这些胶原和β-TCP(β-磷酸三钙)的组合，这些但不局限于。涂层的与生物适合性材料的方法，可以适当地使用公知的本领域技术人员的方法。
用碱和/或治疗钙可以用生物相容的材料进一步涂覆表面处理的聚酰亚胺多孔膜的表面之后。
3。提前细胞聚酰亚胺多孔膜分别进行
本发明的聚酰亚胺多孔膜可以通过那些支撑在其上预先的细胞获得。本发明的聚酰亚胺多孔膜具有使细胞维持在特定的三维结构的优点是可以生长。通过根据由支撑施加到骨损伤部位的目的聚酰亚胺多孔膜的细胞，也能够以促进骨损伤部位的治疗。本发明的作为使聚酰亚胺多孔膜承载细胞的方法，可以使用任何方法，但可以使用如以下的方法。
(A)包括将细胞接种到前述聚酰亚胺多孔膜的表面的工序的方式；
(B)包括使聚酰亚胺多孔膜干燥的表面承载细胞悬浮液、
放置，或者通过移动前述聚酰亚胺多孔膜，以促进液体的流出，或刺激表面的一部分，使细胞悬浮液被吸入至前述膜，并且，
使细胞悬浮液中的细胞停留在前述膜内，使水分流出的工序的方式；以及，
(C)包括将前述聚酰亚胺多孔膜的一个面或两个面用细胞培养物或经灭菌的液体湿润，
将细胞悬浮液装填到前述经湿润的聚酰亚胺多孔膜，并且，
使细胞悬浮液中的细胞停留在前述膜内，使水分流出的工序的方式。
本发明的接种于聚酰亚胺多孔膜的表面的细胞附着到聚酰亚胺多孔膜，进入多孔的内部。优选地，即使在不特别添加来自外部的物理力或化学力的情况下，所述细胞也自发地附着到聚酰亚胺多孔膜。接种于聚酰亚胺多孔膜的表面的细胞在膜的表面和/或内部可稳定地生长和增殖。根据细胞生长和增殖的膜的位置，可以采取各种不同的形式。
本发明中，两个不同的表面层(A侧和B面)的聚酰亚胺多孔膜，其具有在两个表面层之间的夹宏空隙层的聚酰亚胺多孔膜，A面现有的孔的平均孔径大于存在于表面B上的孔的平均直径小，细胞可以从表面B被施加表面A上。优选地，所述细胞是从A面上。
本发明的聚酰亚胺多孔膜的表面上接种细胞之后，将细胞可以根据目的是聚酰亚胺多孔膜进行培养。培养的细胞被支撑在聚酰亚胺多孔膜。
细胞的种类，以在本发明没有特别限制的聚酰亚胺多孔膜来进行的，但可以是任何细胞，属于哺乳纲通常，它被用来动物细胞，其对哺乳动物所述最好。哺乳动物包括，但不特别限于，优选小鼠，大鼠，人，猴，猪，狗，绵羊，山羊等。
被支撑在本发明的聚酰亚胺多孔膜的动物细胞的种类，不存在限制，但是，优选地，多能干细胞，组织干细胞，体细胞，并且选自的组中选择这一点。
将要在本发明的聚酰亚胺多孔膜可从哺乳动物骨髓的细胞，支持骨髓细胞。从骨髓采集骨髓细胞可以使用冲洗等公知的方法骨髓穿刺或骨髓中进行。此外，骨髓细胞携带本发明的聚酰亚胺多孔膜可以是从哺乳动物骨髓的细胞，原代培养细胞。
本发明的聚酰亚胺多孔膜具有本实施例的一个独特的三维结构是相似的骨髓结构。本发明人，当通过接种骨髓细胞到聚酰亚胺多孔膜培养，它能够生长CD45阳性细胞，并按照与所述聚酰亚胺多孔膜的三维结构，具有在骨髓类似分化特征的细胞结果发现，在质量发生。可在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜可以通过培养通过接种骨髓细胞来获得。介质用于培养可以适当地使用公知的。
本发明的一个方面包括聚酰亚胺多孔膜的骨髓细胞得到了支持从骨损伤的治疗的受试者服用。通过使用骨损伤的治疗，不仅骨损伤部位的结构互补，例如聚酰亚胺多孔膜，有可能恢复骨功能，包括造血。
此外，作为承载细胞的本发明的聚酰亚胺多孔膜的方法，例如，一种方法可使用包括以下步骤。
(1)将第一细胞群施加到聚酰亚胺多孔膜、培养的工序和，
(2)第二细胞群步骤(1)中，并培养，承载的步骤，其中所述细胞的所述第二组是骨髓细胞的温育之后施加到聚酰亚胺多孔膜。
在细胞负载的方法，所述第一细胞组的种类可以是任何细胞，例如，动物细胞，昆虫细胞，其包含一种选自植物细胞，酵母和细菌组成的组中良好。动物细胞，动物细胞和无脊椎动物属于脊椎动物(比属于脊椎动物动物其他动物)大致分为衍生自的细胞。第一细胞组优选是骨髓细胞。
4。骨损伤部位的治疗聚酰亚胺多孔膜
本发明的聚酰亚胺多孔膜，通过向骨损伤患处，因此能够治疗骨损伤部位。
本发明的聚酰亚胺多孔膜中含有丰富的耐热性和柔韧性，因为它具有优异的形状的灵活性，切割成任何形状根据骨损伤影响部分的状态，模制或加工的用过这是可能的。
用于施加到骨损害本发明的聚酰亚胺多孔膜的受影响部分可以采取根据目的任意的方法，优选地，在活体移植的聚酰亚胺多孔膜，以便接触所述骨损伤患处到。它可以是聚酰亚胺多孔膜与整个骨损伤患处接触，可以是聚酰亚胺多孔膜与所述骨损伤执行的一部分接触。本发明的聚酰亚胺多孔膜时具有两个不同的表面层的多层结构的聚酰亚胺多孔膜和大孔层中，两个表面层的不同，较小面骨损伤患处的更平均孔径它优选的是使用植入到活体中以接触所述。
本发明的聚酰亚胺多孔膜可以有效地在大的骨缺损部位的或复杂的骨折部位的治疗这是不可能用常规的技术来使用。本发明的聚酰亚胺多孔膜可施加到包覆所有或骨损伤患部的一部分，它是没有必要的修复特别是在使用其它材料的聚酰亚胺多孔膜。然而，根据目的，缝线，缝钉，使用生物相容的螺钉等，聚酰亚胺多孔膜可被固定到所述身体组织。
VI。对于骨损伤部位试剂的治疗盒
上述的本发明包含聚酰亚胺多孔膜还涉及一种骨损伤部位专用夹具疗用试剂盒。本发明的试剂盒中，除了聚酰亚胺多孔膜可以包括必要的骨损伤的治疗手术材料，以及使用说明书的试剂盒。
不存在限制，但是，作为一个方面，单独存储或多个灭菌聚酰亚胺多孔膜以清除袋，包和包括在骨损伤的治疗可用形式本身，或，并用的聚酰亚胺多孔膜无菌液体被封装内，该袋包括膜-液体高效细胞接种的试剂盒的一个集成的形式被使能。
VII.用于骨损伤，聚酰亚胺多孔膜应用的治疗
本发明中，用于骨损伤的治疗，还涉及使用上述的聚酰亚胺多孔膜的。
VIII.用于骨损伤部位的治疗制造聚酰亚胺多孔膜的方法
本发明涉及支持骨髓细胞到聚酰亚胺多孔膜，还涉及一种方法，用于骨损伤部位的治疗生产聚酰亚胺多孔膜。在这里，骨髓细胞可能是那些从治疗骨损伤部位的对象获取。
IX。治疗骨损伤部位的方法
本发明中，以上所述方法包括向所述骨损伤部位中所述的聚酰亚胺多孔膜，还涉及一种治疗骨损伤部位的方法。
以下、基于实施例对本发明更具体地描述。本发明不限于这些实施例。本领域技术人员基于本说明书中的描述可以容易地对本发明添加修改和改变，它们被包括在本发明的技术范围内。此后，当没有特别描述时，“聚酰亚胺多孔膜”是指，总厚度25μm，孔隙率73％的聚酰亚胺多孔膜。所述聚酰亚胺多孔膜具有，两个不同的表面层(A面和B面)，夹在两个表面层之间的大空隙层。存在于A面的孔的平均孔径为6μm，存在于在B面的孔的平均孔径为46μm。
顺便说一下，在以下实施例中使用的聚酰亚胺多孔膜如下制成，包括从为四羧酸成分的3，3’，4，4’－联苯四羧酸二酐(s－BPDA)与为二胺成分的二胺成分的4，4’－二氨基二苯醚(ODA)得到的聚酰胺酸溶液以及是着色前体的聚丙烯酰胺的聚酰胺酸溶液组合物成形后，在250℃以上进行加热处理，由此进行制备。
[实施例]
实施例1
将11-14周龄的雄性C57BL/6小鼠股骨、胫骨摘出，将近中远骨端切除，然后用含有10％FBS的DMEM洗涤采取的骨髓。细胞数为5.0×106个。将这种细胞在从干热灭菌的1厘米角的正方形的聚酰亚胺多孔膜A面上从A面侧接种(图2)。培养5天，更换培养基，再培养2天。通过来自相同种类相同年龄相同性别的GFP转基因小鼠，以与前述相同的方法，向先前进行7天细胞培养的细胞生长的聚酰亚胺多孔膜片材，进行第二次播种。进一步培养7天，将细胞用4％福尔马林溶液固定细胞，通过免疫染色，进行样本分析。GFP阳性细胞通过固定化标本被观察到以及，在聚酰亚胺多孔膜的B面大孔结构的周围中，CD45阳性细胞群被观察到(图3)。
实施例2
在与实施例1相同的方式中，实现两次骨髓来源的细胞的传播。从第二次播种培养七天后，将促红细胞生成素的溶液每1毫升追加，1个单位，2个单位和5个单位。促红细胞生成素不添加的对照组中未发生变化，促红细胞生成素添加组中，取决于时间和体积，前成红血细胞(前赤芽球細胞)(TER119阳性)在结构特异性地在每个位置形成集合体的情况被观察到(图4)。
实施例3
将9周龄LEW大鼠用2-3％异氟醚全身麻醉后，通过在手术区含有万分之一的肾上腺素的利多卡因进行浸润麻醉。将比切开部更宽范围除毛后，在头顶部直到骨膜在直线上施加切开，使得手术区足够清楚。剥去皮肤骨膜瓣暴露头顶骨后，使用Torefinba(トレフィンバー)通过无菌盐水灌注使得直径4mm圆形的骨缺损部形成两个。将缺损部用灭菌的聚酰亚胺多孔膜包覆之后，使皮肤骨膜瓣复位，并用尼龙线缝合。在这种情况下，将聚酰亚胺多孔膜网面(A面)和创伤部接地(连接)而制备的模型以及，使大孔面(B面)接地(连接)的模型分别被制备。2周后，4周后，8周后测定缺损部的治愈状态。测量项目为，骨密度(BMD)(mg/cm3)、骨矿质量(BMC)(mg)、新生骨体积(BV)(cm3)、设定的ROI的体积(TV)(cm3)、新生骨的比例(BV/TV)(％)、临床的BMD(BMC/TV)(mg/cm3)。在网面接地(连接)的模型中，对于早期骨形成，使网面接地(连接)到创伤部的模型显著促进骨形成的结果得到证实。结果示于图7。如图7所示，对照组是骨缺损部不被聚酰亚胺多孔膜包覆的组。
实施例4
从8周龄GFP转基因大鼠采取股骨和胫骨，切割各骨的两端，通过用加入10％FBS的DMEM培养基冲洗，采取骨髓细胞块。细胞块用ピペテッィング粉碎，向1.5厘米四方形(正方形)聚酰亚胺多孔膜的网面(A面)接种1.0×106个骨髓细胞，通过添加有10％FBS的DMEM培养基静置培养5天。在第6天，将细胞附着的聚酰亚胺多孔膜用磷酸缓冲液，并且将培养基更换为唯一的DMEM，再培养1天。将9周龄裸大鼠通过2-3％异氟醚全身麻醉后，通过在手术区含有万分之一的肾上腺素的利多卡因进行浸润麻醉。将比切开部更宽范围除毛后，在头顶部直到骨膜在直线上施加切开，使得手术区足够清楚。剥去皮肤骨膜瓣暴露头顶骨后，使用Torefinba(トレフィンバー)通过无菌盐水灌注使得直径4mm圆形的骨缺损部形成两个。在缺损部，使得筛网面(A面)接地(连接)到创伤部，通过上述附着了细胞、之后培养的聚酰亚胺多孔膜包覆缺损部。2周，4周，8周后测量缺损部治愈情况，确认了随着时间的推移创伤部的治愈。结果示于图8。
实施例5
从8周龄GFP转基因大鼠采取股骨和胫骨，切割各骨的两端，通过用加入10％FBS溶液的DMEM培养基冲洗，采取骨髓细胞块。细胞块用ピペテッィング，向1.5厘米四方形(正方形)聚酰亚胺多孔膜(A面)接种1.0×106个骨髓细胞，在添加了10％FBS的DMEM培养基中静置培养5天。更换DMEM培养基后，再培养一天。然后将1.0×106个骨髓细胞接种至聚酰亚胺多孔膜的网面(A面)，并在添加了10％FBS的DMEM培养基中静置培养5天。在第6天，将附着了细胞的聚酰亚胺多孔膜用磷酸缓冲液洗涤，并且将仅培养基更换为唯一的DMEM，再培养1天。将所得的聚酰亚胺多孔膜，9周龄裸大鼠用2-3％异氟醚全身麻醉后，通过在手术区含有万分之一的肾上腺素的利多卡因进行浸润麻醉。将比切开部更宽范围除毛后，在头顶部直到骨膜在直线上施加切开，使得手术区足够清楚。剥去皮肤骨膜瓣暴露头顶骨后，使用Torefinba(トレフィンバー)通过无菌盐水灌注使得直径4mm圆形的骨缺损部形成两个。在缺损部，使得筛网面(A面)接地(连接)到创伤部，通过上述附着了细胞、之后培养的聚酰亚胺多孔膜包覆缺损部。2周，4周，8周后测量缺损部治愈情况，确认了随着时间的推移创伤部的治愈。结果示于图9-11。

Claims (42)

1.骨髓细胞的培养方法，包括将骨髓细胞施加到聚酰亚胺多孔膜，进行培养。
2.权利要求1中记载的方法，骨髓细胞是骨髓基质细胞。
3.权利要求1中记载的方法，骨髓细胞是骨髓来源的血液细胞(血细胞)。
4.权利要求1-3的任一项中记载的方法，骨髓细胞是从哺乳动物的骨髓采取的细胞。
5.权利要求1-3的任一项中记载的方法，骨髓细胞是从哺乳动物骨髓采取的细胞的原代培养细胞。
6.权利要求1-5的任一项中记载的方法，进一步包括，通过培养将骨髓细胞分化成造血细胞(血细胞株细胞)。
7.权利要求1-6的任一项中记载的方法，进一步包括，将骨髓细胞施加至聚酰亚胺多孔膜后，添加分化诱导促进物质和培养，促进骨髓细胞向造血细胞(血细胞株细胞)的分化，使得其具有聚酰亚胺多孔膜的立体结构特异性。
8.造血细胞(血细胞株细胞)的制备方法，包括回收使用权利要求6或7中记载的方法获得的造血细胞(血细胞株细胞)。
9.权利要求6-8的任一项中记载的方法，造血细胞(血细胞株细胞)是红细胞前体细胞或红细胞。
10.骨髓细胞的培养方法，其包括
(1)将第一细胞群施加到聚酰亚胺多孔膜、培养的工序和，
(2)将第二细胞群施加到工序(1)的培养后的聚酰亚胺多孔膜、培养的工序
其中，所述第二细胞群是骨髓细胞。
11.权利要求10中记载的方法，第一细胞群选自由以下组成的组：动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母菌和细菌。
12.权利要求11中记载的方法，第一细胞群是哺乳动物来源的骨髓细胞。
13.权利要求10-12的任一项中记载的方法，进一步包括，通过工序(2)的培养使骨髓细胞分化成造血细胞(血细胞株细胞)。
14.权利要求10-14的任一项中记载的方法，进一步包括，在工序(2)中将第二细胞群施加至聚酰亚胺多孔膜后，添加分化诱导促进物质和培养，促进是第二细胞群的骨髓细胞向造血细胞(血细胞株细胞)的分化，使得其具有聚酰亚胺多孔膜的立体结构特异性。
15.造血细胞(血细胞株细胞)的制备方法，包括回收使用权利要求13或14中任一项中记载的方法获得的造血细胞(血细胞株细胞)。
16.权利要求13-15任一项中记载的方法，造血细胞(血细胞株细胞)是红细胞前体细胞或红细胞。
17.权利要求1-16任一项中记载的方法，聚酰亚胺多孔膜是，包含从四羧酸二酐和二胺获得的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜。
18.权利要求17记载的方法，聚酰亚胺多孔膜是，使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后、在250℃以上进行热处理、由此得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。
19.权利要求17或18中记载的方法，前述聚酰亚胺多孔膜是具有两个不同的表层面和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔膜。
20.权利要求1～19中任一项中记载的方法，将两个以上(两种以上)聚酰亚胺多孔膜，在细胞培养基中上下或左右地层叠地使用。
21.权利要求1～20任一项中记载的方法，将聚酰亚胺多孔膜
i)折叠，
ii)卷成卷状，
iii)将片材或小片通过丝状结构体连接，或
iv)系成绳状，
悬浮或固定在细胞培养容器中的细胞培养培养基中而使用。
22.用于在权利要求1～21中任一项中记载的方法中使用的试剂盒，含有聚酰亚胺多孔膜。
23.聚酰亚胺多孔膜在权利要求1～21任一项中记载的方法中的用途。
24.聚酰亚胺多孔膜，用于骨损伤部位的治疗。
25.权利要求24中记载的聚酰亚胺多孔膜，骨损伤是骨折。
26.权利要求24中记载的聚酰亚胺多孔膜，骨损伤是骨缺损。
27.权利要求24-26任一项中记载聚酰亚胺多孔膜，用于移植到活体内，以接触骨损伤患处。
28.权利要求24-27任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜，其是含有从四羧酸二酐和二胺获得的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜。
29.权利要求28中记载的聚酰亚胺多孔膜，其是使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后、在250℃以上进行热处理、由此得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。
30.权利要求28或29中记载的聚酰亚胺多孔膜，其是具有两个不同的表层面和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔膜。
31.权利要求30中记载的聚酰亚胺多孔膜，用于植入在活体中，以使得前述两个不同的表层面中平均孔径更小的面接触所述骨损伤患处。
32.权利要求24-31任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜，聚酰亚胺多孔膜的厚度为100微米以下。
33.权利要求24-32任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜，聚酰亚胺多孔膜的表面，通过改变它的物理性质的工序进行处理。
34.权利要求33中记载的聚酰亚胺膜，改变聚酰亚胺多孔膜的表面的物理性质的工序选自由以下组成的组：将聚酰亚胺多孔膜进行碱处理的工序，钙处理的工序，用生物适合性材料涂覆的工序，和这些中一个以上的组合。
35.权利要求34中记载的方法，生物适合性材料选自由以下组成的组：胶原蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，聚赖氨酸，聚交酯，聚乙醇酸交酯，聚已酸内酯，聚羟基丁酸酯，聚丙交酯-共-己内酯，聚碳酸酯，可生物降解的聚氨酯(聚氨基甲酸乙酯,聚氨基甲酸酯)，聚醚酯(ポリエーテルエステル)，聚酯酰胺，羟基磷灰石，胶原蛋白和β-TCP的复合体以及前述这些的组合。
36.权利要求24-35任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜，其预先承载细胞。
37.权利要求36中记载的聚酰亚胺多孔膜，细胞选自由以下组成的组：哺乳动物(哺乳类)来源的多能干细胞，组织干细胞，体细胞，和前述这些的组合。
38.权利要求37中记载的聚酰亚胺多孔膜，细胞包括哺乳动物来源的骨髓细胞。
39.骨损伤部位的治疗用试剂盒，包括权利要求24-38任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜。
40.权利要求24-38任一项中记载的聚酰亚胺多孔膜在骨损伤部位的治疗中的用途。
41.用于骨损伤部位的治疗的聚酰亚胺多孔膜的制造方法，包括使聚酰亚胺多孔膜承载骨髓细胞。
42.权利要求41中记载的方法，骨髓细胞是从骨损伤部位的治疗的对象采取的。
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