JP4393908B2 - 細胞接着方法 - Google Patents
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Description
(1) 少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に、付着依存性細胞を接着させる細胞接着方法であって、
前記担体の表面に、CCN2(結合組織成長因子)を主成分とするタンパク質を80〜100ng/mL含む第1の液体を接触させることにより、前記タンパク質を吸着させる第1の工程と、
前記担体の表面に、前記付着依存性細胞として骨髄幹細胞を含む第2の液体を接触させることにより、前記付着依存性細胞を接着させる第2の工程とを有することを特徴とする細胞接着方法。
これにより、付着依存性細胞を、効率良く担体に接着させることができる。
また、前記第1の液体中における前記タンパク質の濃度を、80〜100ng/mLとすることにより、CCN2を、担体に十分に吸着させることができ、第2の工程において、付着依存性細胞を、より効率よく担体に接着させることができる。
また、前記タンパク質を、CCN2を主成分とするものとすることにより、付着依存性細胞を、より効率よく担体に接着させることができる。また、この付着依存性細胞が接着した担体を生体内に移植したときに、CCN2により血管新生が促進され、付着依存性細胞に十分に養分を供給することができる。
また、前記付着依存性細胞を、骨髄幹細胞とすると、骨髄幹細胞を担体に付着させた後に、培養する際の条件を適宜設定することにより、各種細胞に分化させることができる。このような細胞が接着した担体は、例えば医療(治療)や基礎研究等の幅広い分野に用いることができる。
これにより、付着依存性細胞を、より効率よく担体に接着させることができる。
骨髄幹細胞の中でも、間葉系幹細胞は、特に利用価値が高いものである。
これにより、担体に高い生体親和性を付与することができる。
図1〜図3は、本発明の細胞接着方法で用いる担体を示す斜視図である。
担体1としては、少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものであればよい。
まず、カルシウム源とリン酸源とを反応させて、ハイドロキシアパタイト(HAp)を合成する。なお、ここで、ハイドロキシアパタイトとは、Ca/Pモル比が1.60〜1.70のものを指す。
次に、得られた粉体(またはこれを予め所望の形状に圧粉成形したもの)に対し、圧力を加え、圧密化する。
次に、必要に応じて、得られた圧粉体の形状または寸法を整える。
以上のようにして得られた圧粉体は、例えば焼成炉内で、大気の酸素分圧より高い酸素分圧の酸素含有雰囲気中で焼結(焼成)され、焼結体とされる。
次に、得られた焼結体の両面を、それぞれ、目的に応じた研磨材により研磨する。
次に、担体1の表面に、CCN1およびCCN2の少なくとも一方を主成分とするタンパク質(以下、単に「吸着タンパク質」と言う。)を含む第1の液体を接触させる。これにより、吸着タンパク質を担体1の表面に吸着させる。
pH調整剤としては、例えば炭酸塩、リン酸塩等が挙げられる。
次に、担体1の表面に、付着依存性細胞を含む第2の液体を接触させる。これにより、吸着タンパク質を介して担体1の表面に付着依存性細胞を接着させる。
1.担体への細胞の接着
<1>タンパク質吸着工程
まず、ハイドロキシアパタイトをディスク状に成型、焼結することによって得られた担体(ペンタックス社製 商品名APP−600)を用意した。
次に、4℃で2日間インキュベートした後、第1の液体を6%BSA溶液に交換し、室温で1時間ブロッキングを行った。さらに、PBS(−)による洗浄を3回行った。
次に、ヒト由来骨髄幹細胞(付着依存性細胞)を、FBS非添加のMesenchymal Stem Cell Basal Medium(MSCBM;TAKARA社製)に懸濁させて、第2の液体を調整した。
以上の工程により、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
第1の液体におけるCCN2の濃度を表1に示すように変更した以外は、実施例1と同様にして、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
第1の液体として、CCN2の代わりに、骨の増殖因子であるヒトリコンビナントbFGF(KCB−1:科研製薬株式会社より供与)を用いた以外は、実施例1と同様にして、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
第1の液体におけるbFGFの濃度を表1に示すように変更した以外は、比較例1と同様にして、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
第1の液体として、CCN2の代わりに、骨の増殖因子であるヒト精製TGF−β1(R&D System社製)を用いた以外は、実施例1と同様にして、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
第1の液体におけるTGF−β1の濃度を表1に示すように変更した以外は、比較例4と同様にして、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
第1の液体として、CCN2を含有しない0.1%BSA溶液を使用した以外は、実施例1と同様にして、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
各実施例および各比較例について、担体に接着した細胞の数を測定した。
その後、培養プレートを、5%CO2気相下、37℃で1時間インキュベートした。
この測定結果を図4に示す。
Claims (8)
- 少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に、付着依存性細胞を接着させる細胞接着方法であって、
前記担体の表面に、CCN2(結合組織成長因子)を主成分とするタンパク質を80〜100ng/mL含む第1の液体を接触させることにより、前記タンパク質を吸着させる第1の工程と、
前記担体の表面に、前記付着依存性細胞として骨髄幹細胞を含む第2の液体を接触させることにより、前記付着依存性細胞を接着させる第2の工程とを有することを特徴とする細胞接着方法。 - 前記第1の液体を前記担体に接触させる時間は、0.1〜10日間である請求項1に記載の細胞接着方法。
- 前記第1の液体の温度は、0〜10℃である請求項1または2に記載の細胞接着方法。
- 前記第2の液体を前記担体に接触させる時間は、60〜420分間である請求項1ないし3のいずれかに記載の細胞接着方法。
- 前記第2の液体の温度は、30〜40℃である請求項1ないし4のいずれかに記載の細胞接着方法。
- 前記第2の液体は、培地を含む請求項1ないし5のいずれかに記載の細胞接着方法。
- 前記骨髄幹細胞は、間葉系幹細胞である請求項1ないし6のいずれかに記載の細胞接着方法。
- 前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトおよびリン酸三カルシウムの少なくとも一方を主成分とするものである請求項1ないし7のいずれかに記載の細胞接着方法。
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