ES2283078T3 - Procedimiento para inducir la diferenciacion osteoblastica de celulas de tejido adiposo estramedular humano. - Google Patents
Procedimiento para inducir la diferenciacion osteoblastica de celulas de tejido adiposo estramedular humano. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para inducir una diferenciación osteoblástica y/o para obtener células implicadas en la diferenciación osteoblástica, a partir de células de tejido adiposo extramedular, en el cual se incuban durante un período de tiempo suficiente dichas células de partida en un medio nutritivo líquido que permite el desarrollo en cultivo de dichas células, conteniendo dicho medio nutritivo al menos un glucocorticoide, caracterizado porque dicho medio nutritivo está libre de factor adipogénico y de factor osteoinductor para implicar a dichas células en la diferenciación osteoblástica y porque dichas células de partida son células humanas.
Description
Procedimiento para inducir la diferenciación
osteoblástica de células de tejido adiposo extramedular humano.
La invención se refiere a un procedimiento para
obtener células con fenotipo osteoblástico a partir de células
presentes en el tejido adiposo extramedular humano. Las células
obtenidas pueden utilizarse en la realización de implantes
óseos.
Se dice que para remediar pérdidas de tejido
óseo como consecuencia de heridas o de operaciones quirúrgicas,
puede implantarse material de sustitución o de relleno. Estos
materiales pueden ser injertos óseos o productos artificiales tales
como cerámicas porosas, o incluso productos naturales tales como
esqueleto de coral.
La realización de aloinjertos conlleva
particularmente riesgo de transmisión de ciertas enfermedades
víricas graves. La realización de autoinjertos es más satisfactoria
desde este punto de vista, pero la extracción del injerto requiere
una intervención quirúrgica que presenta importantes riesgos de
morbilidad.
Por estas razones, se recomienda la utilización
de implantes a base de materiales biocompatibles, opcionalmente
biodegradables, como fosfato tricálcico, hidroxiapatita, yeso,
coral, polímeros a base de poli(ácido láctico), etc. Los materiales
macroporosos son particularmente interesantes, ya que la presencia
de poros favorece la reposición ósea.
Desde hace varios años, la investigación se
dirige hacia la utilización de células con potencial osteogénico
combinadas o no con biomateriales; véase por ejemplo la patente
francesa nº 2 679 250, que prevé el cultivo de osteoblastos en un
soporte sólido tridimensional poroso compuesto por esqueleto de
coral con vistas a un implante en pacientes que padecen una pérdida
de sustancia ósea, ya realizado o previsible (cuando está prevista
una resección quirúrgica).
El interés de dichos métodos es, evidentemente,
permitir la realización de implantes con ayuda de células
autólogas.
En este campo, la investigación se orienta hacia
la utilización de células de médula ósea que son capaces de
diferenciarse en osteoblastos, particularmente influenciados por
ciertos factores de crecimiento que tienen efecto osteoinductor. En
efecto, se sabe que los cultivos celulares de médula ósea son
capaces de orientarse particularmente hacia el desarrollo de
fenotipos osteoblásticos.
Sin embargo, la extracción de médula ósea
presenta los mismos inconvenientes que la extracción de injertos
óseos.
Los estudios realizados en conejo han demostrado
que las células del compartimento
estromático-vascular del tejido adiposo extramedular
son capaces de diferenciarse en osteoblastos en cultivos in
vitro en presencia del factor osteoinductor BMP2 y de
dexametasona; véase el documento de L.Lecoeur et al.,
Cellular Engineering; Vol 2, nº 2, 1-7 (1997). La
dexametasona en solitario no permite esta diferenciación.
Actualmente se ha descubierto que por el
contrario, el cultivo in vitro de ciertas células del tejido
adiposo extramedular humano puede producir una diferenciación
osteoblástica en presencia de un glucocorticoide en solitario, por
ejemplo en presencia de dexametasona en solitario, es decir no
asociada a un factor osteoinductor. La utilización de dichos
factores, que son productos costosos, no es necesaria.
Entre los factores osteoinductores, pueden
mencionarse el mediador proteico denominado "Bone Morphogenetic
Protein" (BMP), descrito por URIST M.R. et al., P.N.A.S.
USA 76: 1828-1832 (1979). De hecho, esta
denominación abarca varios factores proteicos osteoinductores (de
BMP2 a BMP9); véase por ejemplo el documento YAMAGUCHI et
al., Sem. Cell. Biol. 6, 165-173 (1993).
La invención se refiere por tanto a un
procedimiento para inducir una diferenciación osteoblástica y/o para
obtener células implicadas en esta diferenciación, a partir de
células de tejido adiposo extramedular humano, que comprende la
etapa que consiste en incubar, durante un período de tiempo
suficiente, dichas células de partida en un medio nutritivo líquido
que permite el desarrollo de dichas células, conteniendo dicho medio
nutritivo en solución al menos un glucocorticoide y estando libre de
factor adipogénico y en particular libre de insulina, así como de
factor osteoinductor.
Dicho de otro modo, el procedimiento de la
invención es un procedimiento en el que se cultivan las células de
partida y en el que, para inducir una diferenciación osteoblástica
y/o para obtener células implicadas en esta diferenciación, se añade
al medio de cultivo al menos un glucocorticoide.
HAUNER H. et al., J. Clin. Invest. 84:
1663-1670 (1989) han descrito la diferenciación en
adipocitos de células de tejido adiposo subcutáneo humano mediante
cultivo en presencia de insulina y de glucocorticoides.
Las células utilizadas como células de partida
en el procedimiento de la invención son células que, al contrario
que las células de la médula ósea, son capaces de diferenciarse en
adipocitos en presencia de insulina; véase particularmente el
documento GREENBERGER J.S., IN VITRO, vol. 15, nº 10,
823-828 (1979).
Las células que, de acuerdo con el procedimiento
de la invención, se orientan hacia la diferenciación osteoblástica
no son adipocitos maduros, que ya están diferenciados. Por esta
razón, se prefiere la utilización de células de partida
seleccionadas entre el conjunto de células separadas de los
adipocitos maduros. Se trata de células
estromáticas-vasculares que pueden obtenerse
particularmente mediante disociación del tejido adiposo con ayuda
de colagenasa y después eliminación de los adipocitos maduros, por
ejemplo mediante centrifugado: en efecto, los adipocitos maduros
tienen una menor densidad que las otras células presentes en el
tejido adiposo de partida y por tanto pueden eliminarse mediante
centrifugado.
En la práctica, pueden utilizarse como células
de partida las células que, por ejemplo después de la disociación
del tejido adiposo mediante una colagenasa y la eliminación de los
adipocitos maduros, son capaces de adherirse a superficies de
poliestireno.
Se incuban las células en el medio de cultivo,
en condiciones convencionales que permiten su desarrollo, es decir
no solamente su supervivencia sino también su proliferación y/o su
diferenciación. Las condiciones convencionales de cultivo de
células humanas se conocen: por ejemplo temperatura de
aproximadamente 37ºC; atmósfera aire-CO_{2} 95:5;
pH cercano a la neutralidad.
El medio de cultivo utilizado es un medio
nutritivo líquido clásico que contiene los ingredientes necesarios
para el desarrollo de células de mamífero. Estos ingredientes se
conocen. Estos son principalmente sales minerales (particularmente
Na, K, Mg, Ca y opcionalmente Cu, Fe, Zn), ácidos aminados,
vitaminas y fuentes de carbono (por ejemplo glucosa). Puede
utilizarse particularmente un medio nutritivo tal como el medio
mínimo esencial MEM de EAGLE, complementado con suero fetal bovino
o, preferiblemente, con suero humano autólogo.
También pueden utilizarse medios nutritivos más
elaborados, del tipo DME (medio de EAGLE modificado por DOLBECCO),
opcionalmente mezclados con el medio F12 de HAM, con o sin suero, y
preferiblemente en presencia de suero autólogo.
A estos medios de cultivo pueden añadírseles
factores osteoinductores, como factores BMP, pero, como se ha
indicado anteriormente, estos factores no son necesarios para
inducir la diferenciación osteoblástica de las células humanas
utilizadas en el procedimiento de la invención. De acuerdo con los
resultados obtenidos en la parte experimental que se muestra a
continuación, la presencia de un factor osteoinductor (al menos de
algunos de ellos) puede ser incluso un efecto desfavorable. Por
tanto pueden utilizarse medios libres de factores
osteoinductores.
Preferiblemente, a los medio de cultivo
utilizados se les ha añadido factores osteopromotores tales como
ácido ascórbico y beta-glicerofosfatos (por ejemplo
de sodio o de calcio).
Por otro lado, los medios de cultivo utilizados
en el procedimiento de la invención están libres de factores
adipogénicos, y en particular libres de insulina. Se observará en
relación con esto que los glucocorticoides solamente tienen efecto
adipogénico, sobre las células de la fracción
estromática-vascular del tejido adiposo
extramedular, en presencia de insulina; véase el documento de HAUNER
et al., artículo mencionado anteriormente.
El cultivo puede realizarse en placas de cultivo
convencionales. El cultivo también puede realizarse en un soporte
sólido tridimensional biocompatible sumergido en el medio de cultivo
líquido.
Las células pueden incubarse con el
glucocorticoide desde el inicio del cultivo, justo después de la
siembra, o posteriormente, por ejemplo después de que las células
han llegado a confluencia, o en cualquier momento entre estos dos
sucesos.
Los glucocorticoides adecuados son los que
permiten obtener, después de la incubación de las células durante un
período de tiempo suficiente en presencia del glucocorticoide
ensayado, cultivos que contienen células implicadas en una
diferenciación osteoblástica.
En la presente solicitud, se considera que las
células están implicadas en una diferenciación osteoblástica, cuando
cumplen al menos las dos primeras de las siguientes condiciones:
- -
- producción de fosfatasa alcalina de tipo hueso-hígado-riñón,
- -
- producción de colágeno de tipo I,
- -
- producción de osteocalcina.
Dichas células, que se también denominan
"células con fenotipo osteoblástico", están suficientemente
implicadas en la diferenciación osteoblástica para que la
consecución de su incubación en el medio nutritivo y/o su implante
permita que al menos una parte de dichas células avance en la
diferenciación, hasta la diferenciación terminal (con producción de
una matriz extracelular mineralizada). La prueba de las propiedades
características de estas células (a saber, producción de fosfatasa
alcalina, de colágeno de tipo I, y opcionalmente producción de
osteocalcina) puede realizarse de forma convencional, por ejemplo
con ayuda de los ensayos mencionados en la parte experimental que se
muestra a continuación.
\newpage
Conviene recordar en este documento que en seres
humanos existen tres isoenzimas de la fosfatasa alcalina,
codificadas por tres genes diferentes, a saber:
- -
- una isoenzima de tipo hueso-hígado-riñón,
- -
- una isoenzima de tipo placentario,
- -
- una isoenzima de tipo intestinal.
La fosfatasa alcalina de tipo
hueso-hígado-riñón es muy sensible
al levamisol.
La concentración de levamisol que conlleva una
inhibición del 50% de la actividad de la fosfatasa alcalina de tipo
hueso-hígado-riñón es del orden de
0,03 mM, mientras que para las otras fosfatasas alcalinas, la
inhibición del 50% de la actividad solamente se obtiene con
concentraciones de levamisol del orden de 1 mM para el tipo
placentario y de 3 mM para el tipo intestinal.
El ensayo de inhibición mediante levamisol
permite por tanto distinguir de forma inequívoca la fosfatasa
alcalina de tipo hueso-hígado-riñón.
Esto puede ponerse en práctica de la siguiente forma. Se prelavan
los extractos celulares (50 microlitros) y se incuban en 100
microlitros de una solución que contiene
2-amino-2-metil-1-propanol
1,5 mM, de pH 10,3 y 100 microlitros de una solución de fosfato de
para-nitrofenol 14 mM, en presencia de
concentraciones crecientes de levamisol, que van desde 10^{-6} M a
10^{-4} M. La reacción se realiza a 37ºC y se detiene al cabo de
20 minutos mediante la adición de 100 microlitros de una solución de
NaOH 0,33 M. De este modo, puede determinarse la concentración de
levamisol que produce una inhibición del 50%.
Gracias a los ensayos descritos en la presente
solicitud, se pueden determinar por tanto mediante experimentos
rutinarios los glucocorticoides naturales, o sus análogos de
síntesis, que son adecuados, así como las concentraciones de
glucocorticoide a utilizar y el periodo de incubación suficiente
para las células en presencia del glucocorticoide.
Entre los glucocorticoides, pueden mencionarse
particularmente dexametasona, hidrocortisona, prednisolona,
metilprednisolona, prednisona, triamcinolona, corticosterona,
fluocinolona, cortisona, betametasona, etc.
El período de incubación es al menos igual al
período necesario para obtener células que responden al menos a las
dos primeras condiciones mencionadas anteriormente. Este período es
generalmente del orden de 15 minutos. Para obtener células que
además producen osteocalcina, el periodo de duración del tratamiento
es del orden de 30 días. Para obtener células aún más avanzadas en
la diferenciación y que producen una matriz extracelular
mineralizada, se precisan en general de 35 a 50 días, en las
condiciones que se han ensayado.
Las concentraciones de glucocorticoide depende
particularmente de la naturaleza del glucocorticoide. Estas
concentraciones pueden determinarse en cada caso con anterioridad
mediante experimentos rutinarios sencillos. Generalmente, se
utilizan concentraciones del orden de 10^{-5} a 10^{-10} M, en
particular de 10^{-6} a 10^{-8} M.
El procedimiento de la invención puede ponerse
en práctica realizando el cultivo en placas de cultivo
convencionales o en un soporte sólido tridimensional biocompatible,
poroso o no poroso, sumergido en un medio líquido. El procedimiento
también puede ponerse en práctica mediante el cultivo preliminar en
placas de cultivo convencionales (opcionalmente en presencia de un
glucocorticoide), y después la transferencia de las células
obtenidas a un soporte sólido tridimensional sumergido en un medio
de cultivo líquido.
Antes de implicarse en la diferenciación, las
células de partida generalmente comienzan proliferando, hasta
confluencia. Durante esta fase de proliferación, es posible añadir
un glucocorticoide al medio de cultivo, lo que en general tiene un
efecto de aceleración del proceso de diferenciación. Después de la
confluencia, cuando ésta es observable (caso de cultivos en placas
de cultivo o en un soporte sólido tridimensional no poroso), o
después de un período de cultivo predeterminado (en el caso de
cultivos en un soporte sólido tridimensional poroso), comienza la
fase de diferenciación propiamente dicha durante la que se incuban
las células en presencia, obligatoria en esta etapa, de un
glucocorticoide.
Las células que han proliferado, o en vías de
diferenciación en las placas de cultivo pueden transferirse a
soportes sólidos tridimensionales con el objetivo de hacer que se
multipliquen y/o continúen el proceso de diferenciación mediante
incubación del soporte sólido en un medio nutritivo líquido que
contendría, si fuera necesario, un glucocorticoide. Las células
implicadas en la diferenciación osteoblástica, obtenidas en placas
de cultivo, pueden transferirse a un soporte sólido tridimensional,
por ejemplo mediante impregnación de dicho soporte con una
suspensión líquida que contenga dichas células. Los soportes
impregnados obtenidos de este modo pueden implantarse en un ser
humano (particularmente en el donante del tejido adiposo utilizado
como producto de partida). Estos soportes impregnados pueden también
dejarse en cultivo y sumergiéndolos en un medio de cultivo líquido,
opcionalmente en presencia de un glucocorticoide (particularmente
cuando las células transferidas siguen conteniendo células no
diferenciadas), antes de implantarse finalmente.
El soporte sólido tridimensional debe ser
biocompatible, para que pueda implantarse en un ser humano. Puede
presentarse en cualquier forma adecuada tal como cilindros, esferas,
placas, o piezas de cualquier forma.
Entre los materiales para el soporte sólido
tridimensional biocompatible, pueden mencionarse particularmente
carbonato cálcico, y en particular aragonita, particularmente en
forma de esqueleto de coral, cerámicas porosas a base de alúmina,
de circonia, de fosfato tricálcico y/o de hidroxiapatita, réplicas
de esqueleto de coral obtenidas mediante intercambio hidrotérmico
que permite la transformación del carbonato cálcico en
hidroxiapatita (patente francesa nº 2 223 325) o incluso cerámicas
vítreas de apatita-wollastonita, cerámicas vítreas
bioactivas tales como los vidrios Bioglass® (KITSUGI et al.,
J. Biomed. Mater. Res. 21: 1255-1271 (1987),
etc.
Puede obtenerse y/o cultivarse, de acuerdo con
la invención, células implicadas en la transformación osteoblástica
en la superficie de los soportes sólidos tridimensionales, si no son
porosos, o en la superficie y en los poros de los sólidos
tridimensionales porosos.
La utilización de un soporte a base de coral es
particularmente interesante. En efecto, se dice que el coral puede
constituir una prótesis ósea progresivamente biodegradable, cuya
rehabitación por hueso a medida que se produce la degradación
(véase por ejemplo la patente francesa nº 2 460 657) estará
potenciada por las células con fenotipo osteoblástico obtenidas de
acuerdo con la presente invención. El cultivo de células en un
soporte de coral se describe particularmente en la patente francesa
nº 2 679 250 y en la patente de Estados Unidos correspondiente nº
5480827.
Preferiblemente, se utiliza como material de
soporte poroso un material que tiene diámetros de poro comprendidos
entre 50 y 250 \mum, con una porosidad comprendida generalmente
entre el 20 y el 80%. Este es, particularmente, el caso del coral de
los géneros Porites, Acropora, Goniopora, Lobophyllia, Symphillia y
Millipora.
La invención también se refiere a la utilización
de un glucocorticoide, en un medio de cultivo líquido que permite
el desarrollo en cultivo de células humanas, como aditivo para
inducir la diferenciación osteoblástica de células de tejido
adiposo extramedular humano en cultivo en dicho medio. Se da por
supuesto que el medio de cultivo está libre de factor
adipogénico.
La invención también se refiere a células
implicadas en la diferenciación osteoblástica obtenidas de acuerdo
con el procedimiento descrito anteriormente, respondiendo estas
células al menos a las dos primeras de las siguientes
condiciones:
- -
- producción de fosfatasa alcalina de tipo hueso-hígado-riñón,
- -
- producción de colágeno de tipo I,
- -
- opcionalmente producción de osteocalcina,
- -
- y opcionalmente producción de una matriz extracelular mineralizada.
Estas células pueden presentarse en forma de un
cultivo que tapiza los poros y/o la superficie de un soporte sólido
tridimensional biocompatible, como se ha indicado anteriormente.
Cuando están en forma de células obtenidas en
las placas de cultivo convencionales, pueden utilizarse para
sembrar dichos soportes sólidos tridimensionales porosos y
biocompatibles. También se pueden sembrar aquellos soportes sólidos
tridimensionales sobre los que ya se ha cultivado una primera capa
de células tales como fibroblastos que pueden ser de origen autólogo
(véase particularmente la patente francesa nº 2 679 250), sirviendo
esta primera capa como base para las células con fenotipo
osteoblástico que se desea obtener y/o cultivar.
Las células obtenidas de acuerdo con la
invención, en particular en forma de soporte tridimensional
impregnado con ayuda de una suspensión que contiene dichas células,
pueden utilizarse en la realización de un implante óseo. Para esto,
los soportes tridimensionales porosos biocompatibles cargados de
células, pueden colocarse como implantes formadores de hueso. Pueden
implantarse particularmente como piezas de sustitución o de relleno
de un tejido óseo y son colonizados progresivamente por un tejido
óseo neoformado. Dichos soportes también pueden implantarse en un
ser humano, particularmente en el donante de las células de tejido
extramedular adiposo utilizadas como células de partida,
preferiblemente después de la impregnación del soporte sólido poroso
tridimensional con un factor de crecimiento osteoinductor en un
punto no óseo, por ejemplo en un tejido conjuntivo, donde darán
origen a un tejido óseo utilizable posteriormente como material de
autoinjerto óseo.
Las células implicadas en la diferenciación
osteoblástica obtenidas de acuerdo con la invención pueden
utilizarse por tanto para obtener un producto sólido tridimensional
que puede servir como implante óseo, como se ha descrito
anteriormente. Dicha utilización forma parte de la invención.
A continuación se describirán algunos
experimentos que se realizan en la presente invención.
Se han prelavado las biopsias de tejido adiposo
obtenidas durante plastias abdominales practicadas en pacientes
sanos, de edades comprendidas entre 25 y 50 años.
Los tejidos prelavados se cortan en pequeños
fragmentos y se digieren durante 90 minutos con colagenasa
(2 mg/ml) en tampón Krebs Ringer a 37ºC. Se filtran sobre un tamiz que tiene un tamaño de poro de 100 \mum, el filtrado se recoge y se centrifuga a 1000 revoluciones por minuto durante 5 minutos. Se elimina el sobrenadante y el residuo celular se lava varias veces en tampón Krebs Ringer. Las etapas de lavado y de centrifugado se repiten varias veces, eliminado cada vez el sobrenadante que contiene adipocitos maduros. Las células obtenidas se suspenden en medio de cultivo DME/F12 (SIGMA CHEMICAL Co., St Louis, Mo, USA; referencia D-6905) que contiene suero fetal bovino al 10%, 100 \mug/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina.
(2 mg/ml) en tampón Krebs Ringer a 37ºC. Se filtran sobre un tamiz que tiene un tamaño de poro de 100 \mum, el filtrado se recoge y se centrifuga a 1000 revoluciones por minuto durante 5 minutos. Se elimina el sobrenadante y el residuo celular se lava varias veces en tampón Krebs Ringer. Las etapas de lavado y de centrifugado se repiten varias veces, eliminado cada vez el sobrenadante que contiene adipocitos maduros. Las células obtenidas se suspenden en medio de cultivo DME/F12 (SIGMA CHEMICAL Co., St Louis, Mo, USA; referencia D-6905) que contiene suero fetal bovino al 10%, 100 \mug/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina.
Se siembran placas de cultivo de poliestireno
("Tissue culture flasks" comercializados por
BECTON-DICKINSON con las referencias 3013, 3028 y
3084) con la suspensión celular obtenida de este modo, y se incuban
a 37ºC en atmósfera de aire húmedo con la adición de CO_{2} al
5%.
Al cabo de 12 horas, se eliminan las células no
adherentes mediante lavado con tampón PBS.
A continuación se cultivan las células
adherentes en el medio de cultivo mencionado anteriormente,
cambiando el medio cada 3 días, hasta confluencia.
A continuación las células se tripsinizan y se
resiembran en placas multipocillo a razón de 2 x 10^{4}
células/ml, en un medio DME/F12 que contiene suero fetal bovino al
10%, complementado con 50 \mug/ml de ácido ascórbico y con
beta-glicerofosfato disódico a una concentración de
10 mM, y que contiene estreptomicina y penicilina a las
concentraciones indicadas anteriormente. Esto se incuba a 37ºC.
A confluencia, las células reciben uno de los
siguientes tratamientos:
- - Tratamiento n^{o} 1:
- adición de rhBMP2 (BMP2 recombinante humano proporcionado por GENETIC INSTITUTE, Cambridge, Massachusetts, USA) a razón de 200 ng/ml,
- - Tratamiento n^{o} 2:
- adición de dexametasona hasta una concentración de 10^{-7} M
- - Tratamiento n^{o} 3:
- adición de rhBMP2 200 ng/ml + dexametasona 10^{-7} M,
- - Controles no tratados:
- incubación en el medio de cultivo (libre de rhBMP2 y libre de dexametasona).
Los cultivos continúan durante 30 días o más,
renovando los medios de cultivo o de tratamiento cada 3 días.
Se han analizado muestras de cultivos tratados y
no tratados para determinar la actividad de fosfatasa alcalina, la
expresión de colágeno de tipo I y de osteocalcina. Además, se ha
investigado la mineralización opcional de la matriz
extracelular.
La determinación de la actividad de fosfatasa
alcalina se ha realizado utilizando fosfato de paranitrofenol como
sustrato, de acuerdo con la técnica descrita por L. Lecoeur y J.P.
Ouhayoun, Biomaterials 18, 989-993 (1997). La
cantidad de paranitrofenol formado mediante hidrólisis del sustrato
se determina midiendo la absorbancia a 410 nm, lo que se convierte
en nanomoles de enzima con ayuda de una curva patrón establecida a
partir de concentraciones conocidas de paranitrofenol.
Se ha realizado también un ensayo que permite
detectar in situ la actividad de fosfatasa alcalina sobre los
cultivos celulares fijados con ayuda de formaldehído, utilizando un
kit para la detección histoquímica semi-cuantitativa
de fosfatasa alcalina (kit comercializado por SIGMA CHEMICAL Co.,
referencia 86R). La actividad de fosfatasa alcalina se visualiza
sobre el tapiz celular mediante una coloración rojiza.
Por otro lado, los ensayos de inhibición
mediante levamisol han demostrado que la fosfatasa alcalina
producida es del tipo
hueso-hígado-riñón.
Se ha investigado también, en células fijadas
con formaldehído, la presencia de colágenos (de tipo I y de tipo II)
y de osteocalcina, así como la presencia de una mineralización
opcional.
Se ha analizado la síntesis de colágeno después
de 30 días de tratamiento, con ayuda de anticuerpos (IgG)
anti-colágeno, comercializados por SOUTHERN
BIOTECHNOLOGY ASSOCIATES, USA.
Análogamente, se ha investigado la síntesis de
osteocalcina con ayuda de un anticuerpo (IgG)
anti-osteocalcina comercializado por BIOMEDICAL
TECHNOLOGIES INC., USA.
Las determinaciones con los anticuerpos se han
realizado con inmunofluorescencia, utilizando para el revelado un
anticuerpo anti-IgG acoplado a la fluoresceína.
La investigación de la mineralización opcional
de la matriz extracelular se ha realizado mediante el ensayo de
tinción de von Kossa, realizado de acuerdo con la técnica descrita
por Cheng et al., Endocrinology 134: 277-285
(1994).
Los resultados observados se describen a
continuación:
Los cultivos tratados con rhBMP2 en solitario a
la concentración de 200 ng/ml no presentan fuerte actividad
fosfatasa alcalina. En la mayoría de los casos, esta actividad es
inferior o igual a la que presentan los cultivos de control, incluso
después de 35 días de incubación.
En todos los casos, las actividades de fosfatasa
alcalina más elevadas se han obtenido en los cultivos tratados que
se han sometido al tratamiento nº 2 y los cultivos que se han
sometido al tratamiento nº 3. Con el tratamiento nº 2, en la
quasi-totalidad de los casos se ha observado una
actividad al menos igual a 200 nanomoles de
para-nitrofenol/30 min./pocillo, y que puede
alcanzar 700 nanomoles/30 min./pocillo.
Con el ensayo citoenzimático, la investigación
de la actividad de fosfatasa alcalina descubierta en cultivos
celulares fijados mediante formol, después de 30 días de
tratamiento, ha dado los siguientes resultados: los cultivos que se
han sometido al tratamiento nº 2 o al tratamiento nº 3 presentan una
mayoría de células que tienen una actividad de fosfatasa alcalina
positiva. Las células que presentan esta actividad tienen una
morfología en forma de estrella. Los cultivos que se han sometido al
tratamiento nº 1 solamente presentan una proporción reducida de
células positivas a fosfatasa alcalina, y estas células tienen una
morfología en forma de huso. En los cultivos de control, las células
que expresan actividad de fosfatasa alcalina son raras.
Los cultivos realizados, durante 30 días, con el
medio de cultivo en solitario (controles no tratados) solamente
presentan una reacción débil con el anticuerpo
anti-colágeno de tipo I. Los cultivos que se han
sometido al tratamiento nº 1 también reaccionan débilmente con este
anticuerpo. Los cultivos que se han sometido tratamiento nº 2
desarrollan estructuras nodulares muy fluorescentes. El tratamiento
nº 3 no induce dichas estructuras y solamente se ha localizado una
fluorescencia reducida al nivel de algunos agrupamientos
celulares.
Al cabo de 30 días, los cultivos tratados
solamente presentan un marcado fluorescente débil, al igual que los
cultivos de control.
Los cultivos de control, o los cultivos que se
han sometido al tratamiento nº 1, reaccionan muy débilmente con el
anticuerpo anti-osteocalcina. Los cultivos que se
han sometido al tratamiento nº 3 presentan algunas zonas con un
marcado ligeramente más intenso. La reacción más fuerte se ha
obtenido con los cultivos tratados con dexametasona en solitario.
Las estructuras nodulares inducidas en estos cultivos presentan un
marcado fluorescente muy intenso. En cambio, el tapiz celular que lo
rodea no se ha marcado y la síntesis de osteocalcina parece
restringida a estas estructuras nodulares.
Las células de control incubadas con el medio de
cultivo en solitario presentan un aspecto homogéneo, con una
morfología bastante masiva. Las células que se han sometido al
tratamiento nº 1 presentan una morfología más alargada. Los
cultivos que se han sometido al tratamiento nº 3 han desarrollado
células con un aspecto más heterogéneo y una morfología irregular.
En los cultivos que se han sometido al tratamiento nº 2, la
microscopía electrónica de barrido ha demostrado la presencia de
estructuras nodulares.
Al cabo de 30 días, los cultivos tratados o no
tratados no habían desarrollado matriz extracelular
mineralizada.
Al cabo de 45 días, en las células no tratadas,
solamente se observan puntos de mineralización muy raros. Con las
células que se han sometido al tratamiento nº 1 o al tratamiento nº
3, no se ha podido detectar ningún punto de mineralización. En los
cultivos que se han sometido al tratamiento nº 3 se han observado
numerosos focos de mineralización que comprenden nódulos
mineralizados.
Claims (10)
1. Procedimiento para inducir una
diferenciación osteoblástica y/o para obtener células implicadas en
la diferenciación osteoblástica, a partir de células de tejido
adiposo extramedular, en el cual se incuban durante un período de
tiempo suficiente dichas células de partida en un medio nutritivo
líquido que permite el desarrollo en cultivo de dichas células,
conteniendo dicho medio nutritivo al menos un glucocorticoide,
caracterizado porque dicho medio nutritivo está libre de
factor adipogénico y de factor osteoinductor para implicar a dichas
células en la diferenciación osteoblástica y porque dichas células
de partida son células humanas.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho medio de cultivo está libre de
insulina.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que dichas células de partida se separan
de los adipocitos maduros y/o son capaces de adherirse a una
superficie de poliestireno.
4. Procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se incuban
células durante un período de tiempo suficiente para obtener un
cultivo que presenta el menos las dos primeras de las siguientes
características:
- -
- producción de fosfatasa alcalina de tipo hueso-hígado-riñón,
- -
- producción de colágeno de tipo I,
- -
- producción de osteocalcina,
- -
- producción de una matriz extracelular mineralizada.
5. Procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el
glucocorticoide se selecciona entre dexametasona, hidrocortisona,
prednisolona, metilprednisolona, prednisona, triamcinolona,
corticosterona, fluocinolona, cortisona y betametasona.
6. Procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se impregna un
soporte sólido tridimensional biocompatible con una suspensión de
células de partida y se realiza dicha incubación sumergiendo el
soporte impregnado de este modo en dicho medio de cultivo.
7. Procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se recogen las
células implicadas en la diferenciación osteoblástica obtenidas y
después se impregna un soporte sólido tridimensional biocompatible,
con una suspensión que contiene las células recogidas y, si se
desea, se cultivan dichas células recogidas.
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6 ó 7, en el que el soporte sólido tridimensional
está hecho de al menos un material seleccionado entre carbonato
cálcico, hidroxiapatita, carbonato cálcico recubierto en superficie
por hidroxiapatita, y cerámicas.
9. Utilización, como aditivo, de un
medio nutritivo líquido que permite el desarrollo en cultivo de
células humanas, de al menos un glucocorticoide como único aditivo
necesario para inducir la transformación osteoblástica de células de
tejido adiposo extramedular humano cultivadas en dicho medio, medio
de cultivo que está libre de proteínas con efecto osteoinductor y de
factor adipogénico.
10. Procedimiento de preparación de un
implante que comprende las siguientes etapas:
- a)
- obtención células implicadas en la diferenciación osteoblástica de acuerdo con el procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 8;
- b)
- realización del implante óseo a partir de las células obtenidas de este modo.
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