CN112940940A - 细胞的培养方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞的培养方法及试剂盒。具体而言，涉及使用露出到空气的载体的细胞的培养方法及试剂盒。另外，涉及使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法。

Description

细胞的培养方法及试剂盒

本申请是2016年1月26日提交的同名发明专利申请201680007030.2的分案申请。

【技术领域】

本发明涉及细胞的培养方法及试剂盒。具体而言，涉及使用露出到空气的载体的细胞的培养方法及试剂盒。另外，涉及使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法。

【背景技术】

【细胞培养】

细胞在生物体内一般作为三维的集团存在，但在经典的平面培养中，细胞粘着到容器的形式单层状培养。多数报告由培养环境的差异而细胞的性质也大不同。另外，对于在液体培养基中培养细胞的悬浮培养而言，不仅有适宜于悬浮培养的细胞，也有不适宜的细胞。

近年，使用培养细胞的疫苗、酶、激素、抗体、细胞因子等生物体内蛋白质等的产生或在再生医疗中的细胞移植等受到关注，与此伴随，效率并且简便地培养大量的细胞的方法论受到关注。在细胞培养中，不管使用不使用细胞培养用载体，另外，不管是悬浮细胞还是附着性细胞，除厌氧性细菌外，氧供给对于细胞的健全的培育而言是重要的课题。例如，当使用培养皿或板或室平面培养附着性细胞时，对于培养容器的面积而培养基量的适当范围有限制。因此，在不必要地使用大量的培养基时，不充分的氧供给于细胞，发生由低氧引起的障碍的情况或细胞死至的情况也可发生。另外知，当细胞组形成球形时，其尺寸变过大，则内部的细胞陷于氧不足(非专利文献1)。对于这样的氧供给课题，进行由微气泡的利用的氧浓度的提高(专利文献1)或在微载体培养中的均一的氧供给方法(专利文献2)等的尝试。

也进行将细胞培养用载体露出到气相而培养的方法的尝试。例如，对于中空丝培养中的液相/气相露出生物反应器(专利文献3)介绍了细胞生息的中空丝旋转交替露出于气相和液相的系统。另外，在实施细胞培养之上，关于操作等上优良的片型载体，也介绍了整体露出于气相的系统(专利文献4)，但具体的实施方式未特别指定。

如果载体在细胞培养时能暴露于气相，会由于大大改善细胞培养中的氧供给的问题，从而可成为对于确立有效的培养方法而言非常有魅力的方法论。但是，由于作为已知的细胞培养载体的纤维性原料无法避免干燥等，期望确立含该原料的新的“载体可暴露于气相的培养方法”。

细胞由其生存形态的特长，大分为悬浮细胞和附着性细胞的2种。在附着性细胞的培养中，在细胞分裂－增殖的过程中，由于该细胞成育的支架上存在有限的范围，进行增殖则自然无法免达其支架的增殖界限。这即使在标准的培养皿等的平面培养的情况中，即使是使用介质的3维培养，也都真实。

为了推进细胞的增殖，传代是必要不可或缺的，不管何用途－方法均是重要的作业，但用胰蛋白酶或胶原酶等处理细胞而从支架拆下，经细胞悬浮液再次接种的作业是伴随污染等的风险的大量作业的工，也有对细胞的应激也无法忽视的想法。

在作为利用介质的培养方法称为代表性的微载体培养中，达成在载体间的细胞的互动，终究是在微载体培养之中的处理，不是可跳出微载体所具有的形状或尺寸的规定性的方法，限于微载体的形态。

近年，在此微载体培养中，由京都大学－日产化学·NIPRO等的发明发明使用胶凝糖胶的ES及iPS细胞的大量培养法，发现了不经细胞悬浮液而使细胞传代的方法。其中，一边使称为球形的细胞块的形成在液中悬浮，一边进行，通过重复此球形的扩大和小块化，不经悬浮液而实现细胞培养，但限于形成球形的细胞，另外，为了防球形的集合化而需要详细的时机控制等，由于变得需要较多的工，不仅难说有效率，本质上也解决不了关于微载体培养所具有的形状的规定性。

一方面，在一般的培养方法中，知使用能拆下的橡胶状材料包被培养细胞的培养面的一部分，将向其移动的细胞连同包被拆下，移送到培养皿等而培养的方法论，但不过是能暂时移送，从称为向继续并且大量的细胞培养的展开的着眼点来看，未应对，也未解决课题。

为了使细胞大量地培养－增殖，符合用途而有效地生育，优选以不经细胞悬浮液的形式，可由简便并且趋于自动化，还不被形状或大小束缚的适应性高的系统传代细胞。再者，希求可将其方法论与定常的细胞培养直接关联的新颖的系统的构建。

【聚酰亚胺多孔质膜】

聚酰亚胺是指在重复单位中含酰亚胺键的高分子的总称。芳香族聚酰亚胺是芳香族化合物直接由酰亚胺键连接的高分子。芳香族聚酰亚胺由于是芳香族和芳香族经酰亚胺键具有共价结构，具有刚直且强固的分子结构，并且，由于酰亚胺键具有强的分子间力而有非常高的水平的热的、机械的、化学性质。

聚酰亚胺多孔质膜在本发明前常作为滤器、低介电常数膜、燃料电池用电解质膜等，特别以电池关系作为中心的用途而被利用。专利文献8～10特别记载了，气体等的物质透过性优良，空孔率高的，两表面的平滑性优良，相对强度高的，也不涉及高空孔率，多数有对于向膜厚度方向的压缩应力的耐力优良的大空隙的聚酰亚胺多孔质膜。这些均是经由酰胺酸制成的聚酰亚胺多孔质膜。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：专利第5549209号

专利文献2：专利第5460241号

专利文献3：WO2005/121311

专利文献4：特开2001-190270

专利文献5：特开平7-313151

专利文献6：特开平5-335368

专利文献7：特开2003-180337

专利文献8：WO2010/038873

专利文献9：特开2011-219585

专利文献10：特开2011-219586

【非专利文献】

非专利文献1：黑泽寻,生物工程学第91卷、2013年第11号646-653

非专利文献2：Otsuji et al.,Stem Cell Reports,Vol.2,734-745,May 6,2014

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明以提供细胞的培养方法及试剂盒作为目的。具体而言，以提供在露出到空气的载体上培养细胞的方法及试剂盒作为目的。

【解决课题的技术方案】

本发明人发现如聚酰亚胺多孔质膜一样的片状细胞培养载体适宜于细胞的粘接、培养，由此想到本发明。本发明人发现，在如聚酰亚胺多孔质膜一样的片状细胞培养载体培养细胞，通过与气相直接接触，可用非常地小的体积培养多个细胞的可能性，验证应用范围。通过使载体与气相直接接触，期待氧供给的效率大改善，由于也推定由培养基的枯渴的细胞死亡，在各种条件下验证其可能性，完成本发明。再者，通过载体暴露于气相，膜彼此的紧密附着性提高，也发现细胞在片间自由移动的可能性，还期待根据细胞发生优选的大的立体空间。

另外，本发明人为了提供称为以不经细胞悬浮液的形式，由适应性高的系统使细胞传代的方法的课题的解决，经锐意研究的结果发现，通过利用使用聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养，得到了优选的结果，想到本发明。具体而言，在使用聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养中，由于活用膜具有的细胞能通过的大口径连接孔而在此空间细胞稳定生息，只要是膜彼此紧密附着，就细胞在某程度不仅自由地在膜内，还可在膜间移动。通过活用此特性，使细胞不成育的聚酰亚胺多孔质膜紧密附着于细胞成育的介质(培养皿、皿、培养板、微载体、氧化硅多孔体、纤维素海绵、聚酰亚胺多孔质膜及其他细胞培养介质)引发细胞的移动，可继续并且简便地继续细胞培养和传代。

虽不限定，但本发明优选含以下的实施方式。

[1]

细胞的培养方法，其包括：

(1)使1个或多个片状多孔质载体负载细胞的工序、

(2)向负载细胞的片状多孔质载体应用培养基，作为片状多孔质载体的孔的一部分或全部中所含培养基的状态，将片状多孔质载体用培养基润湿的工序、

(3)在收容培养基的培养容器中，以用培养基润湿的片状多孔质载体表面的一部分或整体暴露于气相的方式配置片状多孔质载体的工序、及

(4)将培养容器设置到温育器内而培养细胞的工序

其中通过培养保持片状多孔质载体表面及内部的润湿状态。

[2]

[1]所述的培养方法，其中在工序(4)中，培养基连续或间歇供给于培养容器内，其中通过培养而用培养基润湿的片状多孔质载体的一部分或整体暴露于气相。

[3]

[1]或[2]所述的方法，其中在工序(4)中，培养细胞的工序是一边用供给氧的手段供给氧，一边培养的工序。

[4]

[1]～[3]之任一项所述的方法，其中在工序(3)中，在刚体之上装载片状多孔质载体。

[5]

[4]所述的方法，其中刚体是金属网。

[6]

[1]～[5]之任一项所述的方法，其中在工序(3)中，以包被1个或多个片状多孔质载体的上表面的一部分或全部的方式装载平均孔径比片状多孔质载体大的多孔质片。

[7]

[6]所述的方法，其中平均孔径比片状多孔质载体大的多孔质片选自无纺布、纱布、及海绵。

[8]

[1]～[7]之任一项所述的方法，其中培养容器是开放容器。

[9]

[1]～[7]之任一项所述的方法，其中培养容器是封闭容器。

[10]

[1]～[9]之任一项所述的方法，其中在工序(3)中，上下积层配置2个以上的片状多孔质载体。

[11]

[1]～[10]之任一项所述的方法，其中在工序(3)中，将1个或多个片状多孔质载体折叠配置。

[12]

[1]～[11]之任一项所述的方法，其中1个或多个片状多孔质载体是聚酰亚胺多孔质膜。

[13]

[12]所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的，聚酰亚胺多孔质膜。

[14]

[13]所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是通过使含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上热处理得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。

[15]

[13]或[14]所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是有2个不同的表层面和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔质膜。

[16]

[1]～[15]之任一项所述的方法，其中细胞以表达物质的方式由基因工程学技术转化。

[17]

[1]～[16]之任一项所述的方法，其中细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌及细菌。

[18]

[17]所述的方法，其中动物细胞是属于脊椎动物门的动物来源的细胞。

[19]

[18]所述的方法，其中细胞选自CHO细胞、CHO-K1细胞、Vero细胞、及MDCK细胞。

[20]

用于在[1]～[19]之任一项所述的方法中使用的试剂盒，其含聚酰亚胺多孔质膜。

[21]

聚酰亚胺多孔质膜用于[1]～[19]之任一项所述的方法的用途。

[22]

使细胞向聚酰亚胺多孔质膜上移动而进行培养的方法，其包括：通过使聚酰亚胺多孔质膜接触于培养细胞的细胞培养介质使细胞从细胞培养介质移动至聚酰亚胺多孔质膜，进而，对移动至聚酰亚胺多孔质膜的细胞进行培养。

[23]

[22]所述的方法，其中细胞培养介质选自培养皿、皿、培养板、培养瓶、微孔板及玻璃底皿，进而包括使聚酰亚胺多孔质膜与细胞培养介质的上表面接触。

[24]

[22]所述的方法，其中细胞培养介质选自微载体、氧化硅多孔体、纤维素海绵、无纺布及中空丝，还包括从所述细胞培养介质的上部、下部或其双方，使单数或多个聚酰亚胺多孔质膜接触。

[25]

使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法，其包括：通过从培养细胞的第1聚酰亚胺多孔质膜的上表面、下表面或其双方，使未培养细胞的第2聚酰亚胺多孔质膜接触，从而使细胞从第1聚酰亚胺多孔质膜向第2多孔质膜移动，进而，培养移动至第2聚酰亚胺多孔质膜的细胞。

[26]

[25]所述的方法，其包括：在第1聚酰亚胺多孔质膜和第2聚酰亚胺多孔质膜接触的状态下将膜集合体提举到气相。

[27]

[25]或[26]所述的方法，其还包括向未培养细胞的空的第1聚酰亚胺多孔质膜应用细胞，用第1聚酰亚胺多孔质膜培养细胞的工序。

[28]

[27]所述的方法，其通过使空的第1聚酰亚胺多孔质膜接触于培养细胞的细胞培养介质而使细胞从细胞培养介质移动至聚酰亚胺多孔质膜，向第1聚酰亚胺多孔质膜应用细胞。

[29]

使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法，其包括：通过使含细胞的生物体试样与聚酰亚胺多孔质膜的上表面、下表面或其双方接触，使细胞从生物体试样移动至聚酰亚胺多孔质膜，进而，对移动至聚酰亚胺多孔质膜的细胞进行培养。

[30]

[22]～[29]之任一项所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的，聚酰亚胺多孔质膜。

[31]

[30]所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是通过使含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上热处理得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。

[32]

[30]或[31]所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是有2个不同的表层面和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔质膜。

[33]

[32]所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜的膜厚是75μm以下。

[34]

[22]～[33]之任一项所述的方法，其中将移动有细胞的2个以上的聚酰亚胺多孔质膜在细胞培养基中上下或左右积层而培养细胞。

[35]

[22]～[34]之任一项所述的方法，其包括：将从培养细胞的细胞培养介质、含细胞的生物体试样、或者，培养细胞的聚酰亚胺多孔质膜向未培养细胞的聚酰亚胺多孔质膜的细胞的移动重复2次以上。

[36]

用于在[22]～[35]之任一项所述的方法中使用的试剂盒，其含聚酰亚胺多孔质膜。

[37]

聚酰亚胺多孔质膜用于[22]～[35]之任一项所述的方法的用途。

【发明效果】

本发明使用如聚酰亚胺多孔质膜一样的片状多孔质载体培养细胞，此时、通过在保持片状多孔质载体内部及表面的润湿环境的状态下，将片状多孔质载体表面的一部分或整体露出到气相，向细胞的有效的空气的供给变得可能。由本发明，即使是大的规模的细胞培养系，不以用于氧供给的特别的装置作为必要。另外，在本发明中，由于片状多孔质载体未深沉入培养基内，在培养基更换中，没必要非得移动片状多孔质载体。例如，通过在片状多孔质载体的上部或下部制造连续或间歇的培养基的流，进行培养基更换变得可能。另外，在使用本发明的细胞培养系统中由于不以搅拌等的可动部作为必要，也可提供坚牢性优良，稳定度高的细胞培养系。

另外，通过由本发明的方法使用聚酰亚胺多孔质膜，以不经细胞悬浮液的形式，简便并且有效传代细胞变得可能。

再者，由本发明，在即使是以往附着细胞中传代变得必要的汇合的状态时，通过将未接种细胞的，及/或，有细胞植活的空间的聚酰亚胺多孔质膜与汇合或亚汇合的细胞培养载体紧密附着(例如，挟持的，积层的等)，不使用以往使用的胰蛋白酶等，扩大培养变得可能。

【附图说明】

【图1】图1显示在实施例3中，研究将培养细胞的聚酰亚胺多孔质膜用上下各1个空的聚酰亚胺多孔质膜夹而接触，将它们的集合体露出到气相而使紧密附着时的细胞的移动的结果。

【图2】图2是显示作为本发明的一实施方式的“从聚酰亚胺多孔质膜向空的聚酰亚胺多孔质膜的细胞的移动”的模式图。将培养细胞的聚酰亚胺多孔质膜(第1聚酰亚胺多孔质膜)用空的聚酰亚胺多孔质膜(第2聚酰亚胺多孔质膜)数个从上下或何方或一方夹入，准备积层的集合体。通过将准备的积层集合体，例如，以不锈钢网和玻璃立方体作为重物沉到培养皿底部，使双方接触，从细胞生长的聚酰亚胺多孔质膜使细胞向空的同膜移动。此时，细胞不是由物理下押力强制剥取，而是由细胞的自发运动，能动地发生移动。

【图3】图3显示在实施例4中，研究将培养人皮肤成纤维细胞的聚酰亚胺多孔质用上下各1个空的聚酰亚胺多孔质膜夹而沉入培养基中，使用重物使接触时的细胞的移动的结果。

【图4】图4显示使用极小培养基的细胞培养的例。从在培养皿内实施细胞培养的聚酰亚胺多孔质膜除去培养基。从培养皿内在不实质上改变培养基的状态下返回温育器，继续培养。

【图5】图5显示在实施例6中，当将培养CHO细胞的聚酰亚胺多孔质用上下各1个空的聚酰亚胺多孔质膜夹而使接触的“3段重叠”时，及，用上下各2个空的聚酰亚胺多孔质膜夹而使接触的“5段重叠”时的实验的概观照片。

【图6】图6显示在实施例6中将培养CHO细胞的聚酰亚胺多孔质用上下各1个空的聚酰亚胺多孔质膜夹而使接触的“3段重叠”时的细胞的增殖结果。

【图7】图7显示在实施例6中将培养CHO细胞的聚酰亚胺多孔质用上下各2个空的聚酰亚胺多孔质膜夹而使接触的“5段重叠”时的细胞的增殖结果。

【图8】图8显示在实施例7中，使培养细胞的聚酰亚胺多孔质以各种各样的形态多重积层，使细胞传代－增殖时的实验概念图。

【图9】图9显示仅使用培养基供给装置的载体的培养的例。通过积层装载向金属网之上接种细胞的聚酰亚胺多孔质膜，从其上连续或间歇添加培养基，可继续培养细胞。由于在无培养基贮存的状态下培养细胞，所以仅管是简便的装置，在小的空间也可培养极大量的细胞。在实际的运用中，具备用于除去成为细胞培养的障碍的泡的除沫单位，或并记用于在表面的偏流防止的无纺布、包装等的具体图。

【图10】图10作为培养5天后的结果示对于用在图9中作为概念图示的连续培养装置培养的情况，各自每片的细胞培育状况。横轴的编号是指从上数的积层片的编号。关于实施例8。

【图11】将使用本发明的细胞培养装置的CHO-K1细胞的培养结果作为荧光显微镜照片示。

【图12】以使用本发明的细胞培养装置的驯化CHO-K1细胞的培养结果作为荧光显微镜照片示。

【图13】是显示使用本发明的细胞培养装置的CHO-K1细胞的培养结果的图。

【图14】是显示使用本发明的方法的MDCK细胞的培养结果的图。

【图15】是显示使用本发明的方法的人皮肤成纤维细胞的培养结果的图。

【实施方式】

【I.细胞的培养方法】

本发明涉及细胞的培养方法。再者，将国际申请编号PCT/JP2014/070407的全内容由参照援用到本说明书中。

本发明的细胞的培养方法包括使细胞如聚酰亚胺多孔质膜一样的片状多孔质载体负载，培养。本发明人发现，片状多孔质载体适宜于细胞的粘接、培养，想到本发明。本发明的方法以包括向片状多孔质载体应用细胞，用聚酰亚胺膜的表面或内部培养细胞作为特征。

【1.片状多孔质载体】

在本发明中使用的片状多孔质载体只要是有可保持细胞的孔的片状的载体，就使用任何均可，例如，可例示无纺布、聚合性质多孔质膜、聚酰亚胺多孔质膜等。特别是，可适宜地使用聚酰亚胺多孔质膜。在本发明中，用于负载细胞的如聚酰亚胺多孔质膜一样的片状多孔质载体当然优选不含装填的以外的细胞的状态、即，灭菌的。本发明的方法优选为，包括预先灭菌如聚酰亚胺多孔质膜一样的片状多孔质载体的工序。聚酰亚胺多孔质膜耐热性极优良，轻量，形－大小也能自由选择，灭菌处理容易。由干热灭菌、蒸气灭菌、乙醇等消毒剂的灭菌、紫外线或γ线等的电磁波灭菌等任意的灭菌处理是可能的。

聚酰亚胺是指在重复单位含酰亚胺键的高分子的总称，通常是芳香族化合物直接经酰亚胺键连接的芳香族聚酰亚胺。芳香族聚酰亚胺由于芳香族和芳香族经酰亚胺键而具有共价结构，具有刚直且强固的分子结构，并且，由于酰亚胺键具有强的分子间力而有非常地高的水平的热的、机械的、化学性质。

在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜是含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺(作为主要的成分)的聚酰亚胺多孔质膜，更优选为由从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺构成的聚酰亚胺多孔质膜。“作为主要的成分含”是指，作为聚酰亚胺多孔质膜的构成成分，从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺以外的成分是基本不含的，或者也可含，但是不给从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质带来影响的附加的成分。

通过使含从四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，也包括在250℃以上热处理得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。

【聚酰胺酸】

聚酰胺酸是将四羧酸成分和二胺成分聚合而得到。聚酰胺酸是可通过热亚胺化或化学亚胺化闭环而变成聚酰亚胺的聚酰亚胺前体。

聚酰胺酸即使酰胺酸的一部分被亚胺化，只要是不给本发明带来影响的范围，就可使用。即，聚酰胺酸也可被部分热亚胺化或化学亚胺化。

当使聚酰胺酸热亚胺化时，可根据需要，向聚酰胺酸溶液添加亚胺化催化剂、含有有机磷的化合物、无机微粒子、有机微粒子等的微粒子等。另外，当使聚酰胺酸化学亚胺化时，可根据需要，向聚酰胺酸溶液添加化学亚胺化剂、脱水剂、无机微粒子、有机微粒子等的微粒子等。优选即使向聚酰胺酸溶液配合上述成分，在着色前体不析出的条件下进行。

【着色前体】

在本发明中着色前体是指由250℃以上的热处理而一部分或全部碳化而生成着色化物的前体。

作为在本发明中使用的着色前体，均一地溶解或分散于聚酰胺酸溶液或聚酰亚胺溶液，由250℃以上、优选为260℃以上、再优选为280℃以上、更优选为300℃以上的热处理、优选为空气等的氧存在下的250℃以上、优选为260℃以上、再优选为280℃以上、更优选为300℃以上的热处理热分解，优选碳化生成着色化物的更优选生成黑色系的着色化物的，更优选碳系着色前体。

着色前体在加热时表面看起来可见到碳化物，但组织上含碳以外的异元素，含层结构、芳香族交联结构、含四面体碳的无秩序结构的。

碳系着色前体不特别限制，例如，可举出石油焦油、石油沥青、煤焦油、煤沥青等的焦油或沥青、焦炭、从含丙烯腈的单体得到的聚合物、二茂铁化合物(二茂铁及二茂铁衍生物)等。在这些之中，优选从含丙烯腈的单体得到的聚合物及/或二茂铁化合物，作为从含丙烯腈的单体得到的聚合物，优选聚丙烯酸类树脂腈。

四羧酸二酐可使用任意的四羧酸二酐，可根据期望的特性等适宜选择。作为四羧酸二酐的具体例，可举苯均四酸二酐、3,3’，4,4’-联苯基四羧酸二酐(s-BPDA)、2,3,3’，4’-联苯基四羧酸二酐(a-BPDA)等的联苯基四羧酸二酐、氧基二酞酸二酐、二苯基砜-3,4,3’，4’-四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)硫化物二无水物、2,2-双(3,4-二羧基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷二无水物、2,3,3’，4’-二苯甲酮四羧酸二酐、3,3’，4,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)甲烷二无水物、2,2-双(3,4-二羧基苯基)丙烷二无水物、p-亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、p-双亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、m-三联苯基-3,4,3’，4’-四羧酸二酐、p-三联苯基-3,4,3’，4’-四羧酸二酐、1,3-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二无水物、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二无水物、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)联苯基二无水物、2,2-双〔(3,4-二羧基苯氧基)苯基〕丙烷二无水物、2,3,6,7-萘四羧酸二酐、1,4,5,8-萘四羧酸二酐、4,4’-(2,2-六氟异亚丙基)二酞酸二酐等。另外，也优选使用2,3,3’，4’-二苯基砜四羧酸等的芳香族四羧酸。这些可单独使用，也可使2种以上组合使用。

在这些之中，也特别优选选自联苯基四羧酸二酐及苯均四酸二酐的至少一种芳香族四羧酸二酐。作为联苯基四羧酸二酐，可适宜地使用3,3’，4,4’-联苯基四羧酸二酐。

二胺可使用任意的二胺。作为二胺的具体例，可举以下的。

(1)1,4-二氨基苯(对亚苯基二胺)、1,3-二氨基苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯等的苯核1个苯二胺；

(2)4,4’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚等的二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基联苯基、2,2’-二甲基-4,4’-二氨基联苯基、2,2’-双(三氟甲基)-4,4’-二氨基联苯基、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二羧基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’，5,5’-四甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、双(4-氨基苯基)硫化物、4,4’-二氨基苯甲酰苯胺、3,3’-二氯联苯胺、3,3’-二甲基联苯胺、2,2’-二甲基联苯胺、3,3’-二甲氧基联苯胺、2,2’-二甲氧基联苯胺、3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚、3,3’-二氨基二苯基硫化物、3,4’-二氨基二苯基硫化物、4,4’-二氨基二苯基硫化物、3,3’-二氨基二苯基砜、3,4’-二氨基二苯基砜、4,4’-二氨基二苯基砜、3,3’-二氨基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二氯二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二甲氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基二苯基甲烷、3,4’-二氨基二苯基甲烷、4,4’-二氨基二苯基甲烷、2,2-双(3-氨基苯基)丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)丙烷、2,2-双(3-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、3,3’-二氨基二苯基亚砜、3,4’-二氨基二苯基亚砜、4,4’-二氨基二苯基亚砜等的苯核2个二胺；

(3)1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯、1,4-双(4-氨基苯氧基)苯、1,3-双(3-氨基苯氧基)-4-三氟甲基苯、3,3’-二氨基-4-(4-苯基)苯氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二(4-苯基苯氧基)二苯甲酮、1,3-双(3-氨基苯基硫化物)苯、1,3-双(4-氨基苯基硫化物)苯、1,4-双(4-氨基苯基硫化物)苯、1,3-双(3-氨基苯基砜)苯、1,3-双(4-氨基苯基砜)苯、1,4-双(4-氨基苯基砜)苯、1,3-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(3-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯等的苯核3个二胺；

(4)3,3’-双(3-氨基苯氧基)联苯基、3,3’-双(4-氨基苯氧基)联苯基、4,4’-双(3-氨基苯氧基)联苯基、4,4’-双(4-氨基苯氧基)联苯基、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷等的苯核4个二胺。

这些可单独使用，也可将2种以上混合使用。使用的二胺可根据期望的特性等适宜选择。

在这些之中，也优选芳香族二胺化合物，可适宜地使用3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚及对亚苯基二胺、1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯。特别是，优选选自苯二胺、二氨基二苯基醚及双(氨基苯氧基)苯基的至少一种二胺。

聚酰亚胺多孔质膜从耐热性、在高温下的尺寸稳定性的观点来看，优选由将玻璃转移温度是240℃以上，或者在300℃以上无明确的转移点的四羧酸二酐和二胺组合而得到的聚酰亚胺形成。

本发明的聚酰亚胺多孔质膜从耐热性、在高温下的尺寸稳定性的观点来看，优选由以下的芳香族聚酰亚胺构成的聚酰亚胺多孔质膜。

(i)由选自联苯基四羧酸单位及苯均四酸单位的至少一种四羧酸单位和芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺、

(ii)由四羧酸单位和选自苯二胺单位、二氨基二苯基醚单位及双(氨基苯氧基)苯基单位的至少一种芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺、及/或

(iii)由选自联苯基四羧酸单位及苯均四酸单位的至少一种四羧酸单位和选自苯二胺单位、二氨基二苯基醚单位及双(氨基苯氧基)苯基单位的至少一种芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺。

虽不限定，但作为聚酰亚胺多孔质膜，在本发明的方法中使用至少有2个表面层(A面及B面)和被夹在所述2个表面层之间的大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔质膜是可能的。优选为，聚酰亚胺多孔质膜是上述大空隙层有与上述表面层(A面及B面)结合的隔壁，和被所述隔壁以及上述表面层(A面及B面)包围的膜平面方向的平均孔径10～500μm的多个大空隙，上述的大空隙层的隔壁、以及上述表面层(A面及B面)各自，有厚度0.01～20μm，平均孔径0.01～100μm的多个孔，所述细孔彼此可连通，再者连通到上述大空隙而部分或全面地有多层结构，进而，总膜厚是5～500μm，空孔率是40％以上不足95％的，聚酰亚胺多孔质膜。

在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜的总膜厚，虽不限定，但作为一实施方式，也可作为20～75μm。由膜厚的差异，可在细胞的增殖速度、细胞的形态、在面内的细胞的饱和度等方面观察到差异。

在本发明中，当使用有2个不同的表面层(A面及B面)和被夹在所述2个表面层之间的大空隙层的聚酰亚胺多孔质膜时，在A面存在的孔的平均孔径也可与在B面存在的孔的平均孔径有差。优选为，在A面存在的孔的平均孔径比在B面存在的孔的平均孔径小。更优选为，在A面存在的孔的平均孔径比在B面存在的孔的平均孔径小，在A面存在的孔的平均孔径是0.01～50μm、0.01μm～40μm、0.01μm～30μm、0.01μm～20μm、或者0.01μm～15μm，在B面存在的孔的平均孔径是20μm～100μm、30μm～100μm、40μm～100μm、50μm～100μm、或者60μm～100μm。特别优选为，聚酰亚胺多孔质膜的A面是有平均孔径15μm以下的，例如0.01μm～15μm的小的孔的网结构，B面是平均孔径20μm以上的，例如20μm～100μm的大孔结构。

在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜的总膜厚的测定可用接触式的厚度计进行。

聚酰亚胺多孔质膜表面的平均孔径，由多孔质膜表面的扫描型电子显微镜照片，对于200分以上的开孔部测定孔面积，可从该孔面积的平均值根据下式(1)计算求出设孔的形状是正圆时的平均直径。

【数1】

(式中，Sa表示孔面积的平均值。)

在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜的空孔率可测定切成指定的大小的多孔质膜的膜厚及质量，从单位面积重量质量根据下式(2)求出。

【数2】

空孔率(％)＝(1-w/(S×d×D))×100(2)

(式中，S表示多孔质膜的面积、d表示总膜厚、w表示测定的质量、D表示聚酰亚胺的密度。聚酰亚胺的密度设为1.34g/cm³。)

例如，国际公开WO2010/038873、特开2011-219585、或者特开2011-219586中记载的聚酰亚胺多孔质膜也能在本发明中使用。

接种到聚酰亚胺多孔质膜的表面上的细胞在膜的表面及/或内部稳定生长－增殖变得可能。细胞根据膜中的生长－增殖的位置，可取各种的不同的形态。在本发明的一实施方式中，有根据细胞的种类，一边移动聚酰亚胺多孔质膜的表面及内部，一边使形状变化一边增殖的。

【2.在片状多孔质载体中的细胞的负载】

在本说明书中，在片状多孔质载体中的细胞的负载是指在片状多孔质载体的表面、内部、或者表面及内部的一部分或全部保持细胞。用于将细胞负载到片状多孔质载体的具体的工序不特别限定。采用本说明书中记载的工序、或者，适宜于将细胞应用于膜状的载体的任意的方法是可能的。虽不限定，但在本发明的方法中，当作为片状多孔质载体使用聚酰亚胺多孔质膜时，细胞向聚酰亚胺多孔质膜的应用，例如，含如下所述的实施方式。

(A)包括向上述聚酰亚胺多孔质膜的表面接种细胞的工序的实施方式；

(B)包括以下工序的，实施方式：

在上述聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面加载细胞悬浮液，

放置或移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出，或刺激表面的一部分而细胞悬浮液吸入上述膜，进而

在上述膜内蓄积细胞悬浮液中的细胞，水分流出；以及，

(C)包括以下工序的，实施方式：

将上述聚酰亚胺多孔质膜的一面或两面用细胞培养液或灭菌的液体润湿，

向上述润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液，进而

在上述膜内蓄积细胞悬浮液中的细胞，水分流出。

(A)的实施方式也包括含向聚酰亚胺多孔质膜的表面直接接种细胞、细胞块。或者，向细胞悬浮液中放入聚酰亚胺多孔质膜，从膜的表面浸润细胞培养液的实施方式。

接种到聚酰亚胺多孔质膜的表面上的细胞粘接到聚酰亚胺多孔质膜，进入多孔的内部。优选为，即使不特别从外部加物理的或化学的力，细胞也自发粘接到聚酰亚胺多孔质膜。接种到聚酰亚胺多孔质膜的表面上的细胞能在膜的表面及/或内部稳定生长－增殖。细胞根据生长－增殖的膜的位置，可取各种的不同的形态。

在(B)的实施方式中，在聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面加载细胞悬浮液。通过放置聚酰亚胺多孔质膜，或移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出，或刺激表面的一部分而使细胞悬浮液被吸入上述膜，细胞悬浮液渗透到膜中。不被理论束缚，这被认为是由于来源于聚酰亚胺多孔质膜的各表面形状等的性质。由本实施方式，细胞被吸入装填膜的细胞悬浮液的位置而被接种。

或者，(C)的如实施方式一样，也可将上述聚酰亚胺多孔质膜的一面或两面的部分或整体用细胞培养液或灭菌的液体润湿，之后向润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液。此时，细胞悬浮液的通过速度大大提高。

例如，可使用以膜的飞散防止作为主目的润湿膜极一部分的方法(之后，将其记作“一分湿法”)。一分湿法与基本上不使膜润湿的干法((B)的实施方式)大致接近。但是，对于润湿的小部分，认为细胞液的膜透过变得迅速。另外，也可使用向使聚酰亚胺多孔质膜的一面或两面的整体充分地润湿的(之后，将其记作“湿膜”)装填细胞悬浮液的方法(之后，将其记作“湿膜法”)。此时，在聚酰亚胺多孔质膜的整体中，细胞悬浮液的通过速度大大提高。

在(B)及(C)的实施方式中，在上述膜内蓄积细胞悬浮液中的细胞，水分流出。由此，浓缩细胞悬浮液中的细胞的浓度的，使细胞以外的不要的成分与水分一同流出的，等的处理也变得可能。

有时将(A)的实施方式称为“自然播种”，将(B)及(C)的实施方式称为“吸入播种”。

虽不限定，但优选为，活细胞选择性地停留在聚酰亚胺多孔质膜上。从而，在本发明的优选的实施方式中，活细胞在上述聚酰亚胺多孔质膜内停留，死细胞优先与水分一同流出。

在实施方式(C)中使用的灭菌的液体不特别限定，是灭菌的缓冲液或灭菌水。缓冲液是例如，(+)及(-)Dulbecco’s PBS、(+)及(-)Hank氏平衡盐等。缓冲液的例示于以下的表1。

【表1】

再者，在本发明的方法中，细胞向聚酰亚胺多孔质膜的应用也包括通过将有悬浮状态的粘接性细胞与聚酰亚胺多孔质膜悬浮共存将细胞附着于膜上的实施方式(附着上)。例如，为了在本发明的细胞的培养方法中，也可将细胞应用于聚酰亚胺多孔质膜，向细胞培养容器中放入细胞培养基、细胞及1或其以上的上述聚酰亚胺多孔质膜。当细胞培养基是液体时，聚酰亚胺多孔质膜是在细胞培养基中悬浮的状态。从聚酰亚胺多孔质膜的性质，细胞可粘接到聚酰亚胺多孔质膜。从而，即使是不先天适宜于悬浮培养的细胞，聚酰亚胺多孔质膜在细胞培养基中悬浮的状态下培养也是可能的。优选为，细胞自发粘接到聚酰亚胺多孔质膜。“自发粘接”是指即使不特别从外部加物理的或化学的力，细胞也停留在聚酰亚胺多孔质膜的表面或内部。

例如，由上述的方法，可向片状多孔质载体负载细胞。

【3.片状多孔质载体的由培养基的润湿】

本发明的方法包括将片状多孔质载体用培养基润湿的工序作为向负载细胞的片状多孔质载体应用培养基，在片状多孔质载体的孔的一部分或全部含培养基的状态。

在本说明书中，片状多孔质载体被培养基润湿的状态是指在片状多孔质载体的表面及内部存在的孔的一部分或全部中所含培养基的状态。

作为将片状多孔质载体用培养基润湿的方法，只要是可向片状多孔质载体应用培养基而作为在片状多孔质载体的表面及内部存在的孔的一部分或全部中所含培养基的状态的方法，就什么方法都可。例如，用上述的方法将细胞负载到片状多孔质载体，同时可将片状多孔质载体用培养基润湿。另外，也可经不含培养基的溶液将细胞负载到片状多孔质载体之后，向片状多孔质载体应用培养基，将片状多孔质载体中所含的液体置换为培养基。另外，也可通过将雾状的培养基向片状多孔质载体喷雾而应用。

【4.片状多孔质载体向气相的暴露(第1实施方式)】

本发明的方法包括在收容培养基的培养容器中，以用培养基润湿的片状多孔质载体表面的一部分或整体暴露于气相的方式配置片状多孔质载体的工序。以往、当以高密度培养细胞时，或当培养氧要求度高的细胞时，由于氧消费量细胞数依赖性地增加，伴随其而培养基中的溶解氧量减少了，难以在细胞密度增加的环境下培养。因此，当以高密度进行细胞培养时，用于培养基中的氧增加的控制装置是另行必要的。但是，如果使用本发明的方法，由于能向片状多孔质载体直接供给气相中的氧，用于向培养基供给氧的特别的装置变得非必须，变得能几乎无限地向培养中的细胞供给氧。另外，通常，在气相暴露时易发生的培养介质的干燥也由从聚酰亚胺多孔质膜所具有的多孔性发生的坚牢的保湿性避免，以暴露于气相的培养作为可能。本发明也可根据选择，还有向培养基供给氧的手段(例如，由鼓泡等的氧供给手段、培养基搅拌手段等)。另外，也可还有向培养容器内供给氧的手段。

另外，由本发明的以片状多孔质载体表面的一部分或整体暴露于气相的方式配置片状多孔质载体的工序，在片状多孔质载体重叠的部分片状多孔质载体彼此紧密附着，能细胞粘接的空间与片状多孔质载体的面积(体积)成比例增大，另一方面，收容该片状多孔质载体而培养的空间变得能最小化。在以往的液体培养基中的培养中使用载体、例如微载体等的载体的培养时，为了使培养的细胞数增大，有必要防载体彼此的冲击，不得不使培养基量必然增大，作为结果，收容载体而培养的空间增大了。与此相比，在本发明中，由于能使片状多孔质载体暴露于气相配置，片状多孔质载体彼此紧密附着，可使培养空间最小化，有在以往无的有利的点。当然、在积层枚数中，虽然氧及营养的供给性上发生限制，但由于片自体有称为柔性且立体性的极薄膜的特性，例如即使用30段以上的积层实施长期培养，仍可达成仅用扩散充分稳定地供给氧和营养稳定的长期细胞培养。同时聚酰亚胺多孔质膜彼此的紧密附着性由气相暴露而非常良好地提高，细胞在片间自由来往变得可能，仅由称为片的追加的简便的方法，通过向接触的空的片自由扩散增殖，可赋予与实质上的传代同样的效果。

可在本发明的方法中使用的细胞培养基(在本说明书中，有时简记作培养基)可为液体培养基、半固体培养基、固体培养基等的任何的形态，可优选使用液体培养基。另外，也可通过将作为雾状的液体培养基喷雾到细胞培养容器中，而使培养基与片状多孔质载体接触。

在本发明的培养方法中，也可使用2个以上的片状多孔质载体的小片。不使用片状多孔质载体的通常培养的情况，容器底面积成为能细胞培养的面积的上限，但在使用片状多孔质载体的细胞培养中，先前带的片状多孔质载体的大表面积的全部成为能细胞培养的面积。由于片状多孔质载体使细胞培养液通过，例如，在折叠的膜内供给营养或氧等也变得可能。

片状多孔质载体的小片的大小，形状不特别限定。形状可取圆、椭圆形、四角形、三角形、多角形、绳状等任意的形。

片状多孔质载体可使形状变化而使用。也可不将片状多孔质载体加工成平面状，而是加工成立体状的形状而使用。例如，也可将片状多孔质载体(i)折叠，(ii)卷成轮状，(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者，(iv)结成绳状，在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定。通过如(i)～(iv)一样加工形状，与使用小片时同样地，可在一定容量的细胞培养基中放入多个片状多孔质载体。再者，因为可以各小片作为集合体处理，使细胞体集合化移动变得可能，综合的应用性高。

作为与小片集合体同样的想法，也可将2个以上的片状多孔质载体在细胞培养基中上下或左右积层而使用。积层也包括片状多孔质载体一部分重叠的实施方式。由积层培养，在窄的空间以高密度培养细胞变得可能。在已经培育细胞的膜上还积层膜而设置而形成与别种细胞的多层系统也可能。积层的片状多孔质载体的数不特别限定。

作为以用培养基润湿的片状多孔质载体表面的一部分或整体暴露于气相的方式配置片状多孔质载体的方法，也可根据目的使用任意的方法。

例如，可在细胞培养容器内，从接种细胞的或者培养细胞的片状多孔质载体除去培养基，片状多孔质载体的外部实质上变成没有培养基的状态。此时，也可以包被片状多孔质载体的上表面的一部分或全部的方式装载平均孔径比片状多孔质载体大的多孔质片。只要是多孔质片相比聚酰亚胺多孔质膜平均孔径更大的，就可使用任何，可适宜地使用例如无纺布、纱布、及海绵等。通过在聚酰亚胺多孔质膜上装载相比聚酰亚胺多孔质膜平均孔径更大的多孔质片，流过聚酰亚胺多孔质膜表面上的培养基、特别是，因为可抑制液体培养基的偏流，在聚酰亚胺多孔质膜表面上均一地应用培养基，可再升高培养效率。

另外，可以向细胞培养容器内设置如金属制网一样的刚体，向其上接种细胞的，或使培养细胞的片状多孔质载体暴露于气相的方式装载。此时，也可以包被片状多孔质载体的上表面的一部分或全部的方式装载平均孔径比片状多孔质载体大的多孔质片。

再者，可使用可在接种细胞或者培养细胞的片状多孔质载体上连续或间歇应用培养基的细胞培养装置，成为片状多孔质载体的一部分或整体露出到气相的状态。此时，也可以包被片状多孔质载体的上表面的一部分或全部的方式装载平均孔径比片状多孔质载体大的多孔质片。

在本发明的方法中，在培养中使用的系统的形状、规模等不特别限定。作为培养容器，可使用开放容器，也可使用封闭容器。例如，从细胞培养用的培养皿、瓶、塑料袋、试管至大型的箱能适宜利用。例如，含BD Falcon公司制的细胞培养皿或Thermo Scientific公司制的Nunc细胞工厂等。

在本发明的方法中的培养能使用旨在向聚酰亚胺多孔质膜上连续添加培养基而回收的连续循环或开放型的装置，以在空气中露出聚酰亚胺多孔质膜片的型式执行。

在本发明中，细胞的培养也可用从设置于细胞培养容器外的细胞培养基供给手段向细胞培养容器中连续或间歇供给细胞培养基的系统进行。此时、可为细胞培养基在细胞培养基供给手段和细胞培养容器之间循环的系统。

在将细胞的培养用从设置于细胞培养容器外的细胞培养基供给手段向细胞培养容器中连续或间歇供给细胞培养基的系统进行时，该系统可为含作为细胞培养容器的培养单位和作为细胞培养基供给手段的培养基供给单位的细胞培养装置，其中

培养单位是收容用于负载细胞的1个或多个聚酰亚胺多孔质膜的培养单位，具备培养基供给口及培养基排出口的培养单位，

培养基供给单位是具备培养基收纳容器、培养基供给线和经培养基供给线连续或间歇输送培养基的送液泵，其中培养基供给线的第一端部与培养基收纳容器内的培养基接触，培养基供给线的第二端部经培养单位的培养基供给口连通到培养单位内的培养基供给单位。

另外，在上述细胞培养装置中，培养单位可不具备空气供给口、空气排出口、及氧交换膜的培养单位，另外，可为具备空气供给口及空气排出口、或者氧交换膜的培养单位。培养单位可不具备空气供给口及空气排出口、以及氧交换膜，对于细胞的培养必要的氧等通过培养基充分地供给于细胞。再者，在上述细胞培养装置中，培养单位也可还具备培养基排出线，其中培养基排出线的第一端部与培养基收纳容器连接，培养基排出线的第二端部经培养单位的培养基排出口连通到培养单位内，培养基能在培养基供给单位和培养单位循环。

【5.细胞的培养】

在本发明的方法中，如上所述以用培养基润湿的片状多孔质载体表面的一部分或整体暴露于气相的方式将配置片状多孔质载体的培养容器设置到温育器内而培养细胞。

温育器只要是可保持适宜于细胞的培养的温度的，就均可使用。也可使用除了温度之外面，还可调整湿度及CO₂浓度的温育器。当使用一般的动物细胞时，也可使用可向细胞培养装置供给5％CO₂的温育器。

在本发明的方法中，通过细胞的培养，用培养基润湿的片状多孔质载体表面的一部分或整体暴露于气相。另外，通过细胞的培养，保持片状多孔质载体表面及内部的润湿状态。

作为通过培养保持片状多孔质载体表面及内部的润湿状态的方法，可适宜使用任意的方法。例如，可将用培养基润湿的片状多孔质载体收容到封闭容器中，保持容器内部的湿度高。此时，容器内部的湿度优选设为50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或者99％以上。另外，如上所述，可在接种细胞或者培养细胞的片状多孔质载体上，通过使用可连续或间歇应用培养基的细胞培养装置，通过培养保持片状多孔质载体表面及内部的润湿状态。

【6.细胞】

可在本发明的方法中利用的细胞的种类不特别限定，能在任意的细胞的增殖中利用。

例如，细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌及细菌。动物细胞大分为属于脊椎动物门的动物来源的细胞和无脊椎动物(属于脊椎动物门的动物以外的动物)来源的细胞。在本说明书中的，动物细胞的来源不特别限定。优选为，是指属于脊椎动物门的动物来源的细胞。脊椎动物门含无颌类和有颌类，有颌类含哺乳纲、鸟纲、两栖纲、爬行纲等。优选为，一般而言，称为哺乳动物的属于哺乳纲的动物来源的细胞。哺乳动物不特别限定，优选为，含小鼠、大鼠、人、猴、猪、狗、绵羊、山羊等。

在本说明书中的植物细胞的来源不特别限定。含苔藓植物、蕨类植物、种子植物的植物的细胞成为对象。

种子植物细胞所来源的植物含单子叶植物、双子叶植物之任何。虽不限定，但在单子叶植物中，含兰科植物、稻科植物(稻、玉米、大麦、小麦、高粱等)、莎草科植物等。在双子叶植物中，含属于菊亚纲、木兰亚纲、蔷薇亚纲等多的亚纲的植物。

藻类也可作为细胞来源生物看。从作为真正细菌的蓝细菌(蓝藻)，含作为真核生物且单细胞生物的(硅藻、黄绿藻、涡鞭毛藻等)及作为多细胞生物的海藻类(红藻、褐藻、绿藻)等的不同的组。

在本说明书中的古细菌及细菌的种类也不特别限定。古细菌由甲烷菌－高度好盐菌－嗜热好酸菌－超嗜热菌等构成。细菌，例如，选自乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及蓝细菌等。

可在本发明的方法中利用的动物细胞或植物细胞的种类虽不限定，但优选为，选自多能性干细胞、组织干细胞、体细胞、及生殖细胞。

在本发明中“多能性干细胞”是指有向所有的组织的细胞分化的能力(分化多能性)的干细胞的总称。虽不限定，但多能性干细胞含胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚性生殖干细胞(EG细胞)、生殖干细胞(GS细胞)等。优选为，ES细胞或iPS细胞。iPS细胞由都无伦理的问题等的理由特别优选的。能使用作为多能性干细胞公知的任意的，例如，能使用国际公开WO2009/123349(PCT/JP2009/057041)中记载的多能性干细胞。

“组织干细胞”是指虽能分化的细胞系列限于特定的组织，但有能向多样的细胞种分化的能力(分化多能性)的干细胞。例如骨髓中的造血干细胞成为血细胞的原来，神经干细胞分化为神经细胞。此外，有制造肝脏的肝干细胞、成为皮肤组织的皮肤干细胞等各种各样的种类。优选为，组织干细胞从间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、或者造血干细胞选择。

“体细胞”是指构成多细胞生物的细胞的中生殖细胞以外的细胞的。在有性生殖中第二代不受继。优选为，体细胞从肝细胞、胰腺细胞、肌细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、成纤维细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、或者，淋巴细胞、红细胞、白细胞、单核细胞、巨噬细胞或巨核细胞的血细胞选择。

“生殖细胞”是指具有在生殖中向第二代传递遗传信息的作用的细胞。例如，含用于有性生殖的配偶子、即卵子、卵细胞、精子、精细胞、用于无性生殖的孢子等。

细胞也可选自肉瘤细胞、株化细胞及转化细胞。“肉瘤”是指骨、软骨、脂肪、肌肉、血液等的非上皮性细胞来源的结缔组织细胞发生的癌，含软部肉瘤、恶性骨肿瘤等。肉瘤细胞是来源于肉瘤的细胞。“株化细胞”是指经长期间在体外维持，至具有一定的稳定的性质，半永久的传代培养变得可能的培养细胞。存在含PC12细胞(大鼠肾上腺髓质来源)、CHO细胞(中国仓鼠卵巢来源)、HEK293细胞(人胎儿肾脏来源)、HL-60细胞(人白血细胞来源)、HeLa细胞(人子宫颈癌来源)、Vero细胞(非洲绿猴肾脏上皮细胞来源)、MDCK细胞(狗肾脏肾小管上皮细胞来源)HepG2细胞(人肝癌来源细胞株)等的来源于各种各样的生物种的各种各样的组织的细胞株。“转化细胞”是指，从细胞外部导入核酸(DNA等)，使遗传的性质变化的细胞。对于动物细胞、植物细胞、细菌的转化公知有各种适宜的方法。

【II.用于在细胞的培养方法中使用的试剂盒】

本发明也涉及含片状多孔质膜、特别聚酰亚胺多孔质膜的，用于在细胞的培养方法中使用的试剂盒。

本发明的试剂盒除聚酰亚胺多孔质膜之外，可适宜含对于细胞培养必要的构成要素。例如，含应用于聚酰亚胺多孔质膜的细胞、细胞培养基、连续培养基供给装置、连续培养基循环装置、支持细胞片的支架或模块、细胞培养装置、试剂盒的对待说明书等。

虽不限定，但作为一实施方式，含在透明的袋内单独或多个保存灭菌的聚酰亚胺多孔质膜，含能直接在细胞培养中使用的形态的包装，或者，在同袋内与聚酰亚胺多孔质膜一同封入灭菌液体，效率的吸入接种变得可能的膜－液体的一体型形态的试剂盒。

【III.片状多孔质膜用于细胞的培养方法的用途】

本发明也涉及片状多孔质膜、特别聚酰亚胺多孔质膜的，用于细胞的培养方法的使用。

本发明涉及使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法、试剂盒、使用。本发明的细胞的传代方法及培养方法含通过对于在介质(培养皿、皿、培养板、微载体、氧化硅多孔体、纤维素海绵、聚酰亚胺多孔质膜及其他细胞培养介质)上生息的细胞接触细胞不生长的新的聚酰亚胺多孔质膜，将介质上的细胞向空的聚酰亚胺多孔质膜移动，对细胞进行传代或培养。本发明人发现聚酰亚胺多孔质膜适宜于细胞的粘接、培养，想到本发明。本发明的方法的特征在于，包括通过使聚酰亚胺多孔质膜接触于已经生长细胞的各种介质，使细胞移动于聚酰亚胺膜，在其表面或内部培养细胞。由于细胞由此聚酰亚胺多孔质膜得到能增殖的大空间，实质上细胞的移动与细胞的传代有同等的意义，因为可无胰蛋白酶等的处理地实施非常地有效的细胞的增殖，除效率性之外，对细胞的损伤少。另外，可从生物体组织等多个细胞混合的状态，优先取出粘接性及运动性优良的细胞也被期待。

【IV.使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法(第2实施方式)】

本发明在一实施方式中，含通过使聚酰亚胺多孔质膜接触于培养细胞的细胞培养介质使细胞从细胞培养介质移动至聚酰亚胺多孔质膜，进而，对移动至聚酰亚胺多孔质膜的细胞进行培养。细胞从培养细胞的细胞培养介质，移动至聚酰亚胺多孔质膜。

【1.细胞】

可在本发明的方法中利用的细胞的种类不特别限定，能利用任意的细胞、例如，上述的细胞的增殖。

【2.培养细胞的细胞培养介质】

培养细胞的细胞培养介质只要是可使细胞生长(增殖、分化)的介质，就不特别限定。虽不限定，但也可选自培养皿、皿、培养板、培养瓶、微孔板及玻璃底皿。此时细胞的培养面通常是平面，在本发明中，聚酰亚胺多孔质膜与细胞培养介质的上表面接触。或者，也可选自微载体、氧化硅多孔体、纤维素海绵、无纺布及中空丝。此时，从细胞培养介质的上部、下部或其双方，使单数或多个聚酰亚胺多孔质膜接触是可能。

再者，在后述的第3实施方式中，培养细胞的第1聚酰亚胺多孔质膜自体相当于“细胞培养介质”。

关于细胞在介质的培养的具体的工序不特别限定。能采用本说明书中记载的工序、或者，适宜于将细胞应用于膜状的介质的任意的方法。

【3.聚酰亚胺多孔质膜】

在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜是上述的聚酰亚胺多孔质膜。

非限定地，在本发明中，使含细胞培养介质或细胞的试样与有具有聚酰亚胺多孔质膜的平均孔径15μm以下的小的孔的网结构的面(A面)接触。

在本发明中，装填细胞的聚酰亚胺多孔质膜当然优选不含装填的以外的细胞的状态、即，灭菌的。本发明的方法优选为，包括对聚酰亚胺多孔质膜预先灭菌的工序。聚酰亚胺多孔质膜耐热性极优良，轻量，形－大小也能自由选择，容易灭菌处理。由干热灭菌、蒸气灭菌、乙醇等消毒剂的灭菌、紫外线或γ线等的电磁波灭菌等任意的灭菌处理是可能的。

在聚酰亚胺多孔质膜的表面应用的细胞能在膜的表面及/或内部稳定生长－增殖。细胞根据膜中的生长－增殖的位置，可取各种的不同的形态。在本发明的一实施方式中，也有根据细胞的种类，一边移动聚酰亚胺多孔质膜的表面及内部，一边使形状变化一边增殖的。

【4.从细胞的细胞培养介质向聚酰亚胺多孔质膜的移动】

在含培养皿、皿、培养板、微载体、氧化硅多孔体、纤维素海绵及聚酰亚胺多孔质膜本身的各种介质上或内部生长的细胞通过与新的(由于细胞不生长，从而有大的能生长空间)聚酰亚胺多孔质膜接触，从作为以往的栖家的介质开始移动至聚酰亚胺多孔质膜，通过数小时～数天的接触，向空的聚酰亚胺多孔质膜侧移住并在该处植活。此移动由于被面彼此的接触状况大大左右，通过使有效的(实质上排除空间)接触面积变大，实现更有效的移动。由于可与移动一同也发生增殖，本现象被认为细胞与传代同等。

为了更有效率地实现接触，可利用用于固定聚酰亚胺多孔质膜的重物或固定具。另外，也可采用将聚酰亚胺多孔质膜推举到气相而扩大接触面的方法。拆下接触的聚酰亚胺多孔质膜而培养的方法也可能，能在维持接触的状态下进行培养。

细胞的培养面是平面的情况，细胞培养介质是，例如，培养皿、皿、培养板、培养瓶、微孔板、玻璃底皿等的情况，能使聚酰亚胺多孔质膜与细胞培养介质的上表面接触。细胞的培养面是三维(立体)的情况，细胞培养介质是，例如，例如，微载体、氧化硅多孔体、纤维素海绵、无纺布、中空丝等的情况，能从胞培养介质的上部、下部或其双方，使单数或多个聚酰亚胺多孔质膜接触。

【5.细胞的培养】

本发明的方法含移动至聚酰亚胺多孔质膜细胞之后，培养细胞。

向聚酰亚胺多孔质膜应用细胞，对于培养而言，在PCT/JP2014/070407中记载。公知有适宜于动物细胞、植物细胞、及细菌的各细胞的培养方法，本领域技术人员可使用任意的公知的方法在聚酰亚胺多孔质膜上培养细胞。细胞培养基也可根据细胞的种类适宜调制。

动物细胞的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在LONZA公司的细胞培养基产品目录中记载。植物细胞的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在WAKO公司的植物组织培养基系列等中记载。细菌的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在BD公司的一般细菌用培养基产品目录中记载。

关于使用聚酰亚胺多孔质膜的细胞的培养，可与微载体或纤维素海绵等其他悬浮型培养载体共存。

细胞培养由细胞培养中的存在形态而培养细胞可被分类为粘接培养系细胞和悬浮培养系细胞。粘接培养系细胞是附着于培养容器而增殖的培养细胞，在传代中进行培养基更换。悬浮培养系细胞是在培养基中在悬浮状态下增殖的培养细胞，一般而言，在传代时不进行培养基更换，进行稀释培养。悬浮培养由于能在悬浮状态、即在液体中的培养，从而能大量培养，与仅在培养容器表面生长的附着细胞比较，由于是立体的培养，有每单位空间的能培养细胞数多的益处。

在本发明的方法中，在将聚酰亚胺多孔质膜悬浮于细胞培养基中的状态下使用时，也可使用2个以上的上述聚酰亚胺多孔质膜的小片。由于聚酰亚胺多孔质膜是柔性的薄膜，例如，通过将该小片悬浮于培养液中而使用，在一定容量的细胞培养基中放入有多个表面积的聚酰亚胺多孔质膜变得可能。通常培养的情况，容器底面积成为能细胞培养的面积的上限，但在使用本发明的聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养中，先前带的聚酰亚胺多孔质膜的大表面积的全部成为能细胞培养的面积。由于聚酰亚胺多孔质膜使细胞培养液通过，例如在折叠的膜内，营养或氧等的供给变得可能。

在本发明的方法中，优选为，细胞在聚酰亚胺多孔质膜的表面及内部生长增殖。由本发明的方法，细胞可持续增殖5天以上、更优选为10天以上、再优选为30天以上。

在本发明的方法中，作为一实施方式，在培养细胞数多时，使用进行培养基的连续添加的连续培养装置也变得可能。由于连续添加培养基，一边继续润湿环境，一边保持相互的紧密附着性变得可能，可向空的聚酰亚胺多孔质膜的移动度或增殖度提高。

在本发明的方法中，作为一实施方式，使聚酰亚胺多孔质膜从培养面上部接触于培养细胞的培养皿，放置不锈钢网等，继续一定期间直接培养。一定期间后，从接触面分离聚酰亚胺多孔质膜，继续培养向同膜内移动的细胞。

【V.使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法(第3实施方式)】

本发明在一实施方式中，包括通过从培养细胞的第1聚酰亚胺多孔质膜的上表面、下表面或其双方，使未培养细胞的第2聚酰亚胺多孔质膜接触，使细胞从第1聚酰亚胺多孔质膜向第2多孔质膜移动，进而，培养移动至第2聚酰亚胺多孔质膜的细胞的，使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法。细胞从培养细胞的第1聚酰亚胺多孔质膜向未培养细胞的第2聚酰亚胺多孔质膜移动。

对于“细胞”、“聚酰亚胺多孔质膜”的定义与关于第1及第2实施方式记载的同样。

对于使接触第1聚酰亚胺多孔质膜和第2聚酰亚胺多孔质膜的实施方式也不特别限定。也可从第1聚酰亚胺多孔质膜的上表面、下表面或其双方使膜接触。第1聚酰亚胺多孔质膜可为在保持细胞的状态下冷冻保存的聚酰亚胺多孔质膜，此时，可使用用细胞生存的任意的方法融解的聚酰亚胺多孔质膜。由此，将即使进行冷冻－融解也保持生存状态的细胞向第2聚酰亚胺多孔质膜取出变得可能，直接继续培养变得可能。

例如，如图2所示，将细胞生长的聚酰亚胺多孔质膜和空的聚酰亚胺多孔质膜的复合物整体沉入培养基之中，也能使用将金属网或玻璃立方体等重叠使用而使接触的方法。也可在第1聚酰亚胺多孔质膜和第2聚酰亚胺多孔质膜接触的状态下，将膜集合体整体提举到气相。例如，如图5所示，也能使用通过积层金属网等而制作架台，在其上安排细胞生长的聚酰亚胺多孔质膜和空的聚酰亚胺多孔质膜的膜集合对整体而使相互的片紧密附着性升高，进行细胞的片间移动和增殖的方法。

在这些各实施方式中，空的聚酰亚胺多孔质膜，或者细胞生长的聚酰亚胺多孔质膜均可使用2个以上的多个数。例如，也能积层各30个集合体彼此，另外，也能交替多数积层各1个。另外，也可取将作为复合物培养的片分离为各1个而培养的形态。

在这些积层中，由于聚酰亚胺多孔质膜本身成为细胞培育的介质，使用的聚酰亚胺多孔质膜预先被充分地润湿，形成不含空气的状态变得重要。

在第3实施方式中，也可在使第2聚酰亚胺多孔质膜与第1聚酰亚胺多孔质膜接触之前，准备培养细胞的第1聚酰亚胺多孔质膜的工序、具体而言，还含向未培养细胞的空的第1聚酰亚胺多孔质膜应用细胞，用第1聚酰亚胺多孔质膜培养细胞的工序。

向未培养细胞的空的第1聚酰亚胺多孔质膜应用细胞的具体的工序不特别限定。能采用本说明书中记载的工序、或者，适宜于将细胞应用于膜状的载体的任意的方法。

虽不限定，但也可在上述第2实施方式中使用使细胞移动到聚酰亚胺多孔质膜的方法。具体而言，通过使空的第1聚酰亚胺多孔质膜接触于培养细胞的细胞培养介质，使细胞从细胞培养介质移动至聚酰亚胺多孔质膜，向第1聚酰亚胺多孔质膜应用细胞。

或者，细胞向聚酰亚胺多孔质膜的应用，例如，如在PCT/JP2014/070407中记载的一样，也可适宜使用如下所述的实施方式的任何。

(A)包括向上述聚酰亚胺多孔质膜的表面接种细胞的工序的实施方式；

(B)包括以下工序的实施方式：

在上述聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面加载细胞悬浮液，

放置或移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出，或刺激表面的一部分而将细胞悬浮液吸入上述膜，进而

在上述膜内蓄积细胞悬浮液中的细胞，水分流出；以及

(C)包括以下工序的实施方式：

将上述聚酰亚胺多孔质膜的一面或两面用细胞培养液或灭菌的液体润湿，

向上述润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液，进而

在上述膜内蓄积细胞悬浮液中的细胞，水分流出。

【VI.使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法(第4实施方式)】

本发明在一实施方式中，包括通过使含细胞的生物体试样与聚酰亚胺多孔质膜的上表面、下表面或其双方接触，使细胞从生物体试样移动至聚酰亚胺多孔质膜，进而，对移动至聚酰亚胺多孔质膜的细胞进行培养。细胞从生物体试样直接移动至聚酰亚胺多孔质膜。

对于“细胞”、“聚酰亚胺多孔质膜”的定义与关于第1实施方式～第3实施方式记载的同样。

“含细胞的生物体试样”不特别限定。例如，含从生物体单离的器官、组织等的整体或一部分。非限定地，含有含来源于肺、皮肤、肝脏等的细胞的生物体试样。

本实施方式期待可用从蓄积多种多数的细胞而生长的生物体试样向聚酰亚胺多孔质膜一气移动移动性高的细胞集团而进行培养的方法简便地达成例如各生物体器官的环境再现等困难的作业。

可在本实施方式中，也取在聚酰亚胺多孔质膜与生物体试样的接触时，从上表面及下表面或其双方接触的方法。另外，为了使试样接触于聚酰亚胺多孔质膜，向培养基沉入试样－聚酰亚胺多孔质膜复合物而将金属网或玻璃立方体等重叠使用的方法或提举到气相而使试样和聚酰亚胺多孔质膜接触的方法均能使用。

在本发明中，无论是第1实施方式～第4实施方式的任何的实施方式，在本发明中，重复2次以上从培养细胞的细胞培养介质、含细胞的生物体试样、或者，培养细胞的聚酰亚胺多孔质膜向未培养细胞的聚酰亚胺多孔质膜的细胞的移动也可能。由本发明的方法，使不使用以往使用的胰蛋白酶等，用简便的方法移动传代细胞成为可能。传代的次数不特别限定。

【VII.细胞培养装置】

本发明另外涉及含聚酰亚胺多孔质膜的，用于在本发明的方法中使用的细胞培养装置。在本发明的细胞培养装置中，聚酰亚胺多孔质膜可固定使用，或在细胞培养基中悬浮而使用，可置于培养基中，也可从培养基露出。在细胞培养装置中，2个以上的聚酰亚胺多孔质膜也可上下或左右积层。积层的集合体或蓄积体可置于培养基中，也可从培养基露出。

作为由本发明的细胞培养的细胞培养装置，只要是含聚酰亚胺多孔质膜，就可取任意的形态，能使用公知的细胞培养装置。培养装置的形状、规模等不特别限定，能从培养皿、试管至大型的箱适宜利用。例如，含BD Falcon公司制的细胞培养皿或ThermoScientific公司制的Nunc细胞工厂等。再者，在本发明中，通过使用聚酰亚胺多孔质膜，对于先天不可能悬浮培养的细胞也用向悬浮培养装置，进行在悬浮培养类似状态下的培养变得可能。作为悬浮培养用的装置，例如，能使用康宁公司制的旋转瓶或旋转培养等。另外，作为可实现同样的功能的环境，也能使用VERITAS公司的如FiberCell(注册商标)System一样的中空丝培养。

由本发明的培养细胞的细胞培养装置能用向网上的膜连续添加培养基回收方式的连续循环或开放型的装置在空气中露出聚酰亚胺多孔质膜的型式执行。

【VIII.用于在使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而培养的方法中使用的试剂盒】

本发明还涉及含聚酰亚胺多孔质膜的，用于在将本发明的细胞向聚酰亚胺多孔质膜上移动而培养的方法中使用的试剂盒。

本发明的试剂盒除聚酰亚胺多孔质膜之外，可适宜含对于细胞培养必要的构成要素。例如，含应用于聚酰亚胺多孔质膜的细胞、细胞培养基、连续培养基供给装置、连续培养基循环装置、支持聚酰亚胺多孔质膜的支架或模块、细胞培养装置、作业用的灭菌的培养皿或角型板、细胞悬浮液对待用的细胞刮具、试剂盒的对待说明书等。

虽不限定，但作为一实施方式，在透明的袋内灭菌的聚酰亚胺多孔质膜可单独或多个保存，含能直接在细胞培养中使用的形态的包装或，或者，在同袋内与聚酰亚胺多孔质膜一同封入灭菌液体，含效率的吸入接种变得可能的膜－液体的一体型形态的试剂盒。

【IX.使用】

本发明还包括聚酰亚胺多孔质膜用于上述的本发明的方法的用途。

以下，基于实施例更具体说明本发明。再者本发明不限于这些实施例。本领域技术人员可基于本说明书的记载容易地向本发明加修饰－变更，它们含在本发明的技术性范围内。之后，如不特别记述，“聚酰亚胺多孔质膜”指总膜厚25μm、空孔率73％的聚酰亚胺多孔质膜。所述聚酰亚胺多孔质膜有2个不同的表面层(A面及B面)和被夹在所述2个表面层之间的大空隙层。在A面存在的孔的平均孔径是6μm，在B面存在的孔的平均孔径是46μm。

再者，在以下的实施例中使用的聚酰亚胺多孔质膜通过使含从作为四羧酸成分的3,3’，4,4’-联苯基四羧酸二酐(s-BPDA)和作为二胺成分的4,4’-二氨基二苯基醚(ODA)得到的聚酰胺酸溶液和作为着色前体的聚丙烯酰胺的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上热处理，调制。

·人间充质干细胞(LONZA公司product code PT-2501)

·HepG2(CET(Cellular ENGINEERING TECHNOLOGIES,INC.)公司、HEPG2-500)

·人成纤维细胞(LONZA公司product code CC-2511)

·CHO-K1(Public Health England cat.85051005)

·CHO DP-12(ATCC CRL-12445)

·MDCK(Public Health England cat.85011435)

·人间充质干细胞用培养基(LONZA公司product code Pt-3238)

·HepG2用培养基(CET(Cellular ENGINEERING TECHNOLOGIES,INC.)公司cat.HEPG2.E.Media-450)

·人成纤维细胞用培养基(LONZA公司product code CC-3132)

·CHO-K1用培养基(和光纯药工业株式会社Ham’s F-12 087-08335)

·CHO DP-12用培养基(和光纯药工业株式会社IMDM 098-06465)

·MDCK用培养基(和光纯药工业株式会社E-MEM 051-07615)

·3.5cm培养皿(Falcon公司cat.353001)

·细胞计数试剂盒8(株式会社同仁化学研究所CK04)

·不锈钢网(久宝金属株式会社60目E9117)

·2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司cat.103)

·青霉素-链霉素-两性霉素B悬浮液(X100)(和光纯药工业株式会社161-23181)

·显微镜名、使用的图像软件名

Carl Zeiss公司制LSM 700使用软件ZEN

【实施例】

【实施例1：细胞生息的聚酰亚胺多孔质的气相暴露(1)】

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基1ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜5个使网结构的A面朝上而各自浸渍。每1个片各自添加4×10⁴个人间充质干细胞，以每周2次的比例更换培养基，用37℃5％CO₂温育器实施58天细胞培养，使用CCK8测定吸光度。

吸光度测定结束后，从细胞生长的聚酰亚胺多孔质膜除去培养基，在温育器内保存24小时。其后，再次使用CCK8而测定吸光度时、作为平均值确认1.0倍的吸光度。

【实施例2：细胞生息的聚酰亚胺多孔质的气相暴露(2)】

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基1ml，使灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜5个使网结构的A面朝上而各自浸渍。每1个片各自添加4×10⁴个HepG2细胞，实施31天细胞培养，使用CCK8测定吸光度。

吸光度测定结束后，从细胞生长的聚酰亚胺多孔质膜除去培养基，在温育器内保存24小时。其后，再次使用CCK8而测定吸光度时、作为平均值确认1.1倍的吸光度。

【实施例3：从聚酰亚胺多孔质向空的聚酰亚胺多孔质膜的移动(1)气相传代；其1】

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基1ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上而各自浸渍。每1个片各自添加5.2×10⁴个人皮肤成纤维细胞，实施6天细胞培养，使用CCK8测定6天时间点的细胞数。

将此细胞生长的基盘片用上下各1个空的聚酰亚胺多孔质膜夹。此时，上下的聚酰亚胺多孔质膜的A面粘接到基盘片的方式积层。使不锈钢网沉到培养皿底部，在空中片的集合体露出的状态24小时继续。其后，将各片分为单体，向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基1ml而继续培养。在分离开始时和5天后使用CCK8测量细胞数，观察增殖行为。确认在各片上细胞的植活和增殖(图1)。

【实施例4：从聚酰亚胺多孔质向空的聚酰亚胺多孔质膜的移动(2)液中接触法】

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基1ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍。每1个膜添加5.2×10⁴个人皮肤成纤维细胞，实施28天细胞培养，使用CCK8经时测定细胞数。

在将此细胞生长的膜用上下各1个聚酰亚胺多孔质膜夹至网结构的A面的空的片侧成为接触面，2cm×2cm的不锈钢网和2毫米角的玻璃立方体4个作为重物的状态下培养14天(图2)。

其后，在解下重叠之后将各膜分为每单体，在向各自2cm×2cm的灭菌的正方形容器加1ml细胞培养基的环境下继续培养。在14天、21天、28天、35天后使用CCK8测量细胞数，观察增殖行为。确认原来的上部膜及下部设置膜一同增殖至接近培养上限的细胞数(图3)。

在由与上述同样的实施方式进行培养的事例中，当将细胞的行为通过由荧光化的可视化而验证时，确认细胞相对于积层的空的膜，随时间经过而能动地移动。至少验证以不是物理剥取现象的形式发生细胞的移动。

【实施例5：从在培养皿面生长的细胞向聚酰亚胺多孔质膜的移动】

向3.5cm径培养皿接种2.0×10⁵个HepG2细胞，在CO₂温育器内，一边每周2次培养基更换，一边培养33天。

在同培养皿内，使灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝下而在培养基中悬浮。缓慢地除去培养基，在聚酰亚胺多孔质膜最大限度与底面接触时停止培养基的除去。(图4)保持直接的状态，在温育器内移动培养皿，培养24小时。24小时后，缓慢地追加培养基，其后，使聚酰亚胺多孔质膜移动而使用CCK8，测量细胞数，则以片整体，生息1.2×10⁶个细胞。

【实施例6：从聚酰亚胺多孔质向空的聚酰亚胺多孔质膜的移动(3)气相传代法】

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基1ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜9个使网结构的A面朝上而各自浸渍到培养基中。每1个片各自添加4×10⁴个CHO-K1细胞，在CO₂温育器内实施8天细胞培养，成接近最大生长量的状态。第8天的每各片的生存细胞数以平均值是1.2×10⁷。此片之内取出5个，对于各自的片，用新的同尺寸的聚酰亚胺多孔质膜上下各夹各1个片，准备5组3段重叠的聚酰亚胺多孔质膜积层体。同样地，取出4个细胞生长的片，对于各自的片，用新的同尺寸的聚酰亚胺多孔质膜上下各夹各2个片，准备4组5段重叠的聚酰亚胺多孔质膜积层体(图5)。将这些合计9组的3段重叠及5段重叠的积层体在置于培养基中的网之上与气相接触的方式放置，继续培养。继续4天此培养之后，将各自的积层体全部每1个独立，对于各聚酰亚胺多孔质膜的细胞数使用CCK8进行测定。在3重积层(图6)及5重积层(图7)的双方确认在积层体内部的细胞的移动和增殖。确认在与气相接触的环境的细胞的适宜的增殖－移动。

【实施例7：从聚酰亚胺多孔质向空的聚酰亚胺多孔质膜的移动(4)多段传代】

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基1ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜5个使网结构的A面朝上而浸渍到培养基中。每1个片添加4×10⁴个CHO细胞，在CO₂温育器内实施细胞培养8天，在培养基中重复5个而再继续培养2天。培养基更换通过培养期间整体，以每周2次步幅实施。在第10天，准备细胞不生息的新的灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜6个，在其间，交替重叠至今以来培养CHO细胞的5个片，准备合计11段的聚酰亚胺多孔质膜积层体。将准备的积层体在置于培养基中的网之上与气相接触的方式放置，保持4天该状态。其后，将得到的11个细胞的培育的片各1个独立，对于各自的片，用新的同尺寸的聚酰亚胺多孔质膜上下各夹各1个片，准备11组3段重叠的聚酰亚胺多孔质膜积层体(图8)。

将这些11组的3段重叠的积层体在置于培养基中的网之上与气相接触的方式放置，继续培养。培养基更换以每周2次的频度适宜实施。在与上述同样的气相接触的形态的3段重叠的状态下继续培养2周。置于最终的3段积层，中间片及下部片在此2周的培养中成为接近大致饱和的状态，平均细胞数各自是，在中间片上生息9.5×10⁶个细胞，另外在下段片上生息9.1×10⁶个细胞。另外，在上层片上生息1.5×10⁶个细胞。即使置于多重的积层，在聚酰亚胺多孔质膜的表面的接触使细胞充分地移动，确认进行传代－增殖。

【实施例8：大量气相暴露培养(1)】

在本实施例中，使用CHO-K1细胞，进行向聚酰亚胺多孔质膜的接种之后，使用连续培养装置实施大量连续培养。

对4cm×10cm的灭菌的聚酰亚胺多孔质膜10个进行干热灭菌，在灭菌的角型培养皿内排列。准备每5ml培养基含1.1×10⁷个CHO-K1细胞(其中，活细胞是1.1×10⁷个、死细胞是5.0×10⁵个、活细胞率96％)的悬浮液，在首先准备的聚酰亚胺多孔质膜上各自各0.5ml接种。置于片上的悬浮液用细胞刮具均一化，通过少许动片，使液通过而向聚酰亚胺多孔质膜接种细胞。将10个此片加载到同尺寸的不锈钢制金属网上，再向上部加载PE/PP混合无纺布，在塑料箱内接地含此细胞的集合体。(图9)此时，使含细胞的聚酰亚胺多孔质膜积层体约20°倾斜。从倾斜上部连续添加培养基(向加青霉素－链霉素－两性霉素B的Ham氏F-12添加10％FBS的)，以每分3ml的流速从150ml量的培养基溜循环。聚酰亚胺多孔质膜相互紧密附着而作为集合体存在。

3天后，废弃培养基溜的液后，向培养基溜添加新颖的100ml的培养基液，再继续2天培养基循环。在从接种结束起5天后停止培养基循环，使用由CCK8的呈色反应研究生长细胞数。在聚酰亚胺多孔质膜各片上生息的细胞的总和是8.9×10⁸个。向无纺布的细胞增殖是1.5×10⁷个，生息细胞密度是每1ml3.8×10⁶个。示片每的细胞生长数(图10；图中的数字是将片从上往下数)。切取一部分细胞的培育的聚酰亚胺多孔质膜而进行福尔马林固定，核(DAPI)、细胞膜(CellMask)、及肌动蛋白(鬼笔环肽)染色之后的荧光显微镜照片示于图11。

【实施例9：大量气相暴露培养(2)】

【驯化的CHO-K1细胞的使用聚酰亚胺多孔质膜的大量连续培养】

将4cm×10cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜10个于180℃干热灭菌30分钟，使网结构的A面朝上而置于灭菌板上。另行、准备每1ml培养基悬浮2.4×10⁶个用0.5％FBS驯化的CHO-K1细胞(其中，活细胞是2.3×10⁶个、死细胞是9.0×10⁴个、活细胞率96％)的CHO-K1细胞悬浮液5ml。将细胞悬浮液各0.5ml各自添加到上述的灭菌的聚酰亚胺多孔质膜10个中，用细胞刮具平准化。放置数分钟し之后，少许动片而使悬浮液通过，其后，在与片同型的金属网上积层结束细胞接种的片10个。其后，在积层的片上载乘无纺布，设置到培养装置内部，在其上安排培养基供给线，向设定于37℃的TAITEC公司制强制通气式CO₂温育器移培养装置整体，结束培养准备。

将含0.5％FBS的Ham培养基150ml用每分1ml的步幅循环，开始连续培养。在3天后除去培养基而更换为100ml新鲜的培养基，一边用同样的步幅持续培养基更换，一边还继续培养9天。

在从培养开始起第12天结束培养基循环，拆下聚酰亚胺多孔质膜及无纺布。将拆下的聚酰亚胺多孔质膜以集合体原样用CCK8实施细胞计数时，合计确认2.6×10⁸个细胞。作为概算的细胞培养密度，是1.7×10⁸个/ml。切取一部分细胞的培育的聚酰亚胺多孔质膜而进行福尔马林固定，核(DAPI)、细胞膜(CellMask)、及肌动蛋白(鬼笔环肽)染色之后的荧光显微镜照片示于图12。使用驯化细胞也确认良好的细胞的增殖。

【实施例10：大量气相暴露培养(3)大量传代】

接着实施例9，以CHO-K1细胞附着的4cm×10cm见方的长方形的聚酰亚胺多孔质膜10个作为基盘片，使灭菌的同尺寸的聚酰亚胺多孔质膜10个网结构的A面全部朝上，积层到基盘片上表面。另外，相同地使聚酰亚胺多孔质膜10个网结构的A面全部朝上，积层到基盘片下表面。其后，在积层的30个片上载乘无纺布，设置到在实施例9中使用的培养装置(图9)内部，在其上安排培养基供给线，向设定于37℃的TAITEC公司制强制通气式CO₂温育器移培养装置整体，结束培养准备。

将含0.5％FBS的Ham培养基用每分2ml的步幅循环开始连续培养。一边用图13右中所示的步幅持续培养基更换，一边还继续培养76天以上。图示培养天数和使用培养基量。将此时的葡萄糖消费量和乳酸生成量用LC/MS(Shimadzu LCMS-2020)测定。图13示其结果。

【实施例11：从聚酰亚胺多孔质向空的聚酰亚胺多孔质膜的移动(5)气相传代法】

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加培养基1ml，使灭菌的1.4cm见方的正方形的40个聚酰亚胺多孔质膜的网结构的A面朝上而浸渍到培养基中。向片上部添加每1个片2×10⁴个MDCK细胞悬浮液之后，在CO₂温育器内培养。一边经时观测细胞的生长状况，一边继续61天细胞培养。细胞数在第8天达最高值，其后，维持稳定的细胞数。第61天的每各片的生存细胞数以平均值是2.5×10⁶。

取出此片之内1个，用新的同尺寸的聚酰亚胺多孔质膜上下各夹各1个片，准备1组3段重叠的聚酰亚胺多孔质膜积层体。同样地，取出细胞生长的片1个，用新的同尺寸的聚酰亚胺多孔质膜上下各夹各2个片，准备1组5段重叠的聚酰亚胺多孔质膜积层体(图5)。将这些合计2组的3段重叠及5段重叠的积层体置于培养基中的网之上与气相接触的方式放置，在CO₂温育器内继续培养。3天后，使各自的积层体全部每1个独立，对于各聚酰亚胺多孔质膜的细胞数使用CCK8进行测定。在3重积层及5重积层的双方确认了在积层体内部的细胞的移动和增殖，在1周后成为与最高值同等的细胞数。确认由在气相的接触效率并且迅速地使细胞传代(图14)。

【实施例12：从聚酰亚胺多孔质向空的聚酰亚胺多孔质膜的移动(6)长期培养后的气相培养】

【人皮肤成纤维细胞长期培养时的由气相传代的增殖确认】

向直径6cm的培养皿加2ml的培养基，向灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜的网结构的A面接种每1个片4×10⁴个人皮肤成纤维细胞，1个月培养。其后，将片切断成4分之1，再继续培养而合计培养230天。其后，在3.5cm皿中央重叠设置3个1.4cm见方的不锈钢网，而且，放置上述聚酰亚胺多孔质膜，用灭菌的1.4cm见方的空的聚酰亚胺多孔质膜2个夹。在该状态下加培养基1ml，培养基与片变得同样的高度。在此状态下向CO₂温育器内移动，以1周2次的比例更换培养基而继续实施细胞培养。

培养7天后，将各片分为各1个，作为单一的片继续培养。在7天、10日、16天、21日、28天、42日、56天后使用CCK8测量细胞数，对于原来的片和后接地的空的聚酰亚胺多孔质膜，使用利用CCK8的染色法观察细胞的增殖行为。观察到从长期间培养人皮肤成纤维细胞的聚酰亚胺多孔质膜，细胞有效率地向空的聚酰亚胺多孔质膜移动，继续增殖的行为。结果示于图15。

对于不经气相传代而在聚酰亚胺多孔质膜上继续294天长期培养的人皮肤成纤维细胞培养片及经第230天气相传代而同期间培养的基盘片及由气相培养传代后培养56天的上下2个片，将生息的人皮肤成纤维细胞产生的纤连蛋白用ELISA测定，向培养片的培养基中释放24小时的纤连蛋白的量而比较。不影响培养期间及气相传代，确认稳定的纤连蛋白的产生。结果示于表2。作为比较对象，并记从用聚酰亚胺多孔质膜培养13天的片2个产生的纤连蛋白量。

【表2】

本说明书还包括下列内容：

1.细胞的培养方法，其包括：

(1)使1个或多个片状多孔质载体负载细胞的工序、

(2)向负载细胞的片状多孔质载体应用培养基，作为片状多孔质载体的孔的一部分或全部中所含培养基的状态，将片状多孔质载体用培养基润湿的工序、

(3)在收容培养基的培养容器中，以用培养基润湿的片状多孔质载体表面的一部分或整体暴露于气相的方式配置片状多孔质载体的工序、及

(4)将培养容器设置到温育器内而培养细胞的工序，

其中通过培养保持片状多孔质载体表面及内部的润湿状态。

2.实施方式1所述的培养方法，其中在工序(4)中，培养基连续或间歇供给于培养容器内，其中通过培养用培养基润湿的片状多孔质载体的一部分或整体暴露于气相。

3.实施方式1或2所述的方法，其中在工序(4)中，培养细胞的工序是一边用供给氧的手段供给氧，一边培养的工序。

4.实施方式1～3之任一项所述的方法，其中在工序(3)中，在刚体之上装载片状多孔质载体。

5.实施方式4所述的方法，其中刚体是金属网。

6.实施方式1～5之任一项所述的方法，其中在工序(3)中，以包被1个或多个片状多孔质载体的上表面的一部分或全部的方式装载平均孔径比片状多孔质载体大的多孔质片。

7.实施方式6所述的方法，其中平均孔径比片状多孔质载体大的多孔质片选自无纺布、纱布、及海绵。

8.实施方式1～7之任一项所述的方法，其中培养容器是开放容器。

9.实施方式1～7之任一项所述的方法，其中培养容器是封闭容器。

10.实施方式1～9之任一项所述的方法，其中在工序(3)中，上下积层配置2个以上的片状多孔质载体。

11.实施方式1～10之任一项所述的方法，其中在工序(3)中，将1个或多个片状多孔质载体折叠配置。

12.实施方式1～11之任一项所述的方法，其中1个或多个片状多孔质载体是聚酰亚胺多孔质膜。

13.实施方式12所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。

14.实施方式13所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是通过使含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上热处理得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。

15.实施方式13或14所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是有2个不同的表层面和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔质膜。

16.实施方式1～15之任一项所述的方法，其中细胞以表达物质的方式由基因工程学技术转化。

17.实施方式1～16之任一项所述的方法，其中细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌及细菌。

18.实施方式17所述的方法，其中动物细胞是属于脊椎动物门的动物来源的细胞。

19.实施方式18所述的方法，其中细胞选自CHO细胞、CHO-K1细胞、Vero细胞、及MDCK细胞。

20.用于在实施方式1～19之任一项所述的方法中使用的试剂盒，其含聚酰亚胺多孔质膜。

21.聚酰亚胺多孔质膜用于实施方式1～19之任一项所述的方法的用途。

22.使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法，其包括通过使聚酰亚胺多孔质膜接触于培养细胞的细胞培养介质来使细胞从细胞培养介质移动至聚酰亚胺多孔质膜，进而，对移动至聚酰亚胺多孔质膜的细胞进行培养。

23.实施方式22所述的方法，其中细胞培养介质选自培养皿、皿、培养板、培养瓶、微孔板及玻璃底皿，还包括使聚酰亚胺多孔质膜与细胞培养介质的上表面接触。

24.实施方式22所述的方法，其中细胞培养介质选自微载体、氧化硅多孔体、纤维素海绵、无纺布及中空丝，还包括从所述细胞培养介质的上部、下部或其双方，使单数或多个聚酰亚胺多孔质膜接触。

25.使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法，其包括通过从培养细胞的第1聚酰亚胺多孔质膜的上表面、下表面或其双方，使未培养细胞的第2聚酰亚胺多孔质膜接触，使细胞从第1聚酰亚胺多孔质膜向第2多孔质膜移动，进而，培养移动至第2聚酰亚胺多孔质膜的细胞。

26.实施方式25所述的方法，其包括：在第1聚酰亚胺多孔质膜和第2聚酰亚胺多孔质膜接触的状态下，将膜集合体提举到气相。

27.实施方式25或26所述的方法，其还包括向未培养细胞的空的第1聚酰亚胺多孔质膜应用细胞，用第1聚酰亚胺多孔质膜培养细胞的工序。

28.实施方式27所述的方法，其中通过使空的第1聚酰亚胺多孔质膜接触于培养细胞的细胞培养介质使细胞从细胞培养介质移动至聚酰亚胺多孔质膜，从而向第1聚酰亚胺多孔质膜应用细胞。

29.使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法，其包括：通过使含细胞的生物体试样与聚酰亚胺多孔质膜的上表面、下表面或其双方接触，使细胞从生物体试样移动至聚酰亚胺多孔质膜，进而，对移动至聚酰亚胺多孔质膜的细胞进行培养。

30.实施方式22～29之任一项所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。

31.实施方式30所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是通过使含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上热处理得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。

32.实施方式30或31所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是有2个不同的表层面和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔质膜。

33.实施方式32所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜的膜厚是75μm以下。

34.实施方式22～33之任一项所述的方法，其中使移动有细胞的2个以上的聚酰亚胺多孔质膜在细胞培养基中上下或左右积层而培养细胞。

35.实施方式22～34之任一项所述的方法，其包括：重复2次以上从培养细胞的细胞培养介质、含细胞的生物体试样、或者，培养细胞的聚酰亚胺多孔质膜向未培养细胞的聚酰亚胺多孔质膜的细胞的移动。

36.用于在实施方式22～35之任一项所述的方法中使用的试剂盒，其中含聚酰亚胺多孔质膜。

37.聚酰亚胺多孔质膜用于实施方式22～35之任一项所述的方法的用途。

Claims (15)

1.使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法，其包括：

通过使聚酰亚胺多孔质膜接触于培养细胞的细胞培养介质来使细胞从细胞培养介质移动至聚酰亚胺多孔质膜，进而，

对移动至聚酰亚胺多孔质膜的细胞进行培养，

其中所述聚酰亚胺多孔质膜是如下聚酰亚胺多孔质膜：

具有多层结构，所述多层结构至少具有：

2个表层面、即A面及B面，和

被夹在所述2个表层面、即A面及B面之间的大空隙层；

在所述A面存在的孔的平均孔径比在所述B面存在的孔的平均孔径小；及

所述大空隙层具有：

与作为表面层的A面及B面结合的隔壁、和

被所述隔壁以及所述作为表面层的A面及B面包围的多个大空隙。

2.权利要求1所述的方法，其中细胞培养介质选自培养皿、皿、培养板、培养瓶、微孔板及玻璃底皿，还包括使聚酰亚胺多孔质膜与细胞培养介质的上表面接触。

3.权利要求1所述的方法，其中细胞培养介质选自微载体、氧化硅多孔体、纤维素海绵、无纺布及中空丝，还包括从所述细胞培养介质的上部、下部或其双方，使单数或多个聚酰亚胺多孔质膜接触。

4.使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法，其包括：

通过从培养细胞的第1聚酰亚胺多孔质膜的上表面、下表面或其双方，使未培养细胞的第2聚酰亚胺多孔质膜接触，

使细胞从第1聚酰亚胺多孔质膜向第2多孔质膜移动，进而，

培养移动至第2聚酰亚胺多孔质膜的细胞，

其中所述聚酰亚胺多孔质膜是如下聚酰亚胺多孔质膜：

具有多层结构，所述多层结构至少具有：

2个表层面、即A面及B面，和

被夹在所述2个表层面、即A面及B面之间的大空隙层；

在所述A面存在的孔的平均孔径比在所述B面存在的孔的平均孔径小；及

所述大空隙层具有：

与作为表面层的A面及B面结合的隔壁、和

被所述隔壁以及所述作为表面层的A面及B面包围的多个大空隙。

5.权利要求4所述的方法，其包括：在第1聚酰亚胺多孔质膜和第2聚酰亚胺多孔质膜接触的状态下，将膜集合体提举到气相。

6.权利要求4所述的方法，其还包括向未培养细胞的空的第1聚酰亚胺多孔质膜应用细胞，用第1聚酰亚胺多孔质膜培养细胞的工序。

7.权利要求6所述的方法，其中通过使空的第1聚酰亚胺多孔质膜接触于培养细胞的细胞培养介质使细胞从细胞培养介质移动至聚酰亚胺多孔质膜，从而向第1聚酰亚胺多孔质膜应用细胞。

8.使细胞移动至聚酰亚胺多孔质膜上而进行培养的方法，其包括：

通过使含细胞的生物体试样与聚酰亚胺多孔质膜的上表面、下表面或其双方接触，

使细胞从生物体试样移动至聚酰亚胺多孔质膜，进而，

对移动至聚酰亚胺多孔质膜的细胞进行培养，

其中所述聚酰亚胺多孔质膜是如下聚酰亚胺多孔质膜：

具有多层结构，所述多层结构至少具有：

2个表层面、即A面及B面，和

被夹在所述2个表层面、即A面及B面之间的大空隙层；

在所述A面存在的孔的平均孔径比在所述B面存在的孔的平均孔径小；及

所述大空隙层具有：

与作为表面层的A面及B面结合的隔壁、和

被所述隔壁以及所述作为表面层的A面及B面包围的多个大空隙。

9.权利要求1、4或8所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。

10.权利要求9所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜是通过使含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上热处理得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。

11.权利要求1、4或8所述的方法，其中上述聚酰亚胺多孔质膜的膜厚是75μm以下。

12.权利要求1、4或8所述的方法，其中使移动有细胞的2个以上的聚酰亚胺多孔质膜在细胞培养基中上下或左右积层而培养细胞。

13.权利要求1、4或8所述的方法，其包括：重复2次以上从培养细胞的细胞培养介质、含细胞的生物体试样、或者，培养细胞的聚酰亚胺多孔质膜向未培养细胞的聚酰亚胺多孔质膜的细胞的移动。

14.用于在权利要求1、4或8所述的方法中使用的试剂盒，其含聚酰亚胺多孔质膜，

其中所述聚酰亚胺多孔质膜是如下聚酰亚胺多孔质膜：

具有多层结构，所述多层结构至少具有：

2个表层面、即A面及B面，和

被夹在所述2个表层面、即A面及B面之间的大空隙层；

在所述A面存在的孔的平均孔径比在所述B面存在的孔的平均孔径小；及

所述大空隙层具有：

与作为表面层的A面及B面结合的隔壁、和

被所述隔壁以及所述作为表面层的A面及B面包围的多个大空隙。

15.聚酰亚胺多孔质膜用于权利要求1、4或8所述的方法的用途，

其中所述聚酰亚胺多孔质膜是如下聚酰亚胺多孔质膜：

具有多层结构，所述多层结构至少具有：

2个表层面、即A面及B面，和

被夹在所述2个表层面、即A面及B面之间的大空隙层；

在所述A面存在的孔的平均孔径比在所述B面存在的孔的平均孔径小；及

所述大空隙层具有：

与作为表面层的A面及B面结合的隔壁、和

被所述隔壁以及所述作为表面层的A面及B面包围的多个大空隙。

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