JP5549209B2

JP5549209B2 - 付着性細胞培養装置

Info

Publication number: JP5549209B2
Application number: JP2009281647A
Authority: JP
Inventors: 克明松澤; 浩田中
Original assignee: IHI Corp
Current assignee: IHI Corp
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2009-12-11
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2029-12-11
Also published as: JP2011120535A

Description

本発明は、付着性細胞培養装置に関するものである。

従来のワクチン製造は、インフルエンザでは鶏有精卵内でウイルスを増殖、日本脳炎ではマウスの脳でウイルスを増殖させていた。これらの方法は、夾雑物を含みアレルギー等の問題があること、大量生産が難しいことが問題点として挙げられる。近年、ウイルスのワクチンを大量生産するために、培養した動物細胞にウイルスを感染させ、増殖させる方法が採られている。しかし、ウイルスを増殖できる動物細胞の多くは付着性であるため、通常の浮遊培養が適用できない場合が多い。そこで、付着性細胞の大量培養のためには、中空糸や球状物等の担体に細胞を付着させたものを培養液中で増殖させる必要がある。

ところで、細胞の培養においては、培養液の酸素溶解量が少ないと増殖が促進しない。
特許文献１には、培養液にマイクロナノバブルを含有させ、培養槽においてその培養液を、攪拌羽を回転させて攪拌することにより、酸素を槽内全体に偏りなく供給する生物反応装置が開示されている。

特開２００７−３１２６８９号公報

しかしながら、付着性細胞を培養する場合に、特許文献１のように、攪拌羽を回転させて培養液を攪拌すると、その攪拌羽の機械的なせん断力により、担体から細胞が剥離してしまう虞がある。

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、担体からの細胞の剥離を抑制して細胞培養を行うことができる付着性細胞培養装置の提供を目的とする。

上記の課題を解決するために、本発明は、マイクロバブルを含有させた培養液中で、担体に付着させた細胞を培養する培養槽を備える付着性細胞培養装置であって、上記培養槽の液中において攪拌流を形成するように、上記培養槽に上記培養液を供給する培養液供給装置を有するという構成を採用する。
この構成を採用することによって、本発明では、マイクロバブルを含有させた培養液を、付着性細胞を培養する培養槽に攪拌流を与えるように供給することで、攪拌羽を用いることなく液中を攪拌させて、酸素を槽内全体に偏りなく供給することが可能となる。

また、本発明においては、上記培養液供給装置は、上記担体への上記細胞の付着力に基づいて、上記培養槽の液中に供給する上記培養液の流速を調節する流速調節部を有するという構成を採用する。
この構成を採用することによって、本発明では、付着性細胞の担体への付着力に基づいて、培養槽内に供給される培養液の流速を調節することで、攪拌流のせん断力による担体からの細胞の剥離を抑制することができる。

また、本発明においては、上記培養液供給装置は、上記流速調節部として、上記培養槽の液中に上記培養液を吐出する吐出口に向かうに従って流路面積が拡大する吐出ノズルを有するという構成を採用する。
この構成を採用することによって、本発明では、培養液の流速を流路面積の拡大と共に減速させることができるため、攪拌流のせん断力を小さくして、担体からの細胞の剥離を抑制することができる。

また、本発明においては、上記吐出ノズルは、上記拡大した吐出口の内側に上記攪拌流を形成する整流板を有するという構成を採用する。
この構成を採用することによって、本発明では、吐出ノズルの拡大した吐出口にスペースが生まれるので、そのスペースに整流板を設けることで、培養液の吐出時において効率よく攪拌流を形成することが可能となる。

また、本発明においては、上記培養液供給装置は、上記培養槽の培養液の一部を上記細胞が付着した上記担体と濾過分離して槽外に取り出す濾過分離装置と、上記濾過分離装置によって槽外に取り出された濾過液にマイクロバブルを含有させて、上記培養槽に供給する上記培養液を生成するマイクロバブル発生装置と、を有するという構成を採用する。
この構成を採用することによって、本発明では、培養液に同伴される付着性細胞及び担体を取り込むことなく、濾過液にマイクロバブルを含有させて、それを循環させることにより培養槽の液中を攪拌することが可能となる。

また、本発明においては、上記濾過分離装置は、上記培養槽の基準液面に対応した位置において、上記培養液を濾過分離して槽外に取り出す取出口を有するという構成を採用する。
この構成を採用することによって、本発明では、例えば、培養槽の中段部から培養液を取り出すと、その水圧により濾過分離するフィルターに担体が張り付き、目詰まりを起こすので、培養槽の基準液面において取出口を設けることで、培養液の供給によるオーバーフローでの自然排出を可能とさせ、水圧によるフィルターの目詰まりを抑制する。

また、本発明においては、上記培養槽に上記培養液を供給する前に、上記マイクロバブル発生装置により生成した上記培養液を内部に導入して該培養液に含まれるバブルの一部を脱気させる脱気槽と、上記脱気槽において、上記脱気による上記内部の圧力の増圧分を減圧させると共に上記マイクロバブルの上記培養液に対する溶解量を飽和状態に維持する圧力に調節する圧力調節弁と、を有するという構成を採用する。
この構成を採用することによって、本発明では、マイクロバブル発生装置において生成された培養液に、径の大きなバブルが含まれる場合、それが培養槽に供給されると、その大きなバブルに細胞が捕まって液面まで浮上する場合があるので、培養槽に培養液を供給する前に、マイクロバブルのガス溶解量を大きくした上で、不要なバブルを脱気することで、細胞の浮上を抑制する。

本発明によれば、マイクロバブルを含有させた培養液中で、担体に付着させた細胞を培養する培養槽を備える付着性細胞培養装置であって、上記培養槽の液中において攪拌流を形成するように、上記培養槽に上記培養液を供給する培養液供給装置を有するという構成を採用し、マイクロバブルを含有させた培養液を、付着性細胞を培養する培養槽に攪拌流を与えるように供給することで、攪拌羽を用いることなく液中を攪拌させて、酸素を槽内全体に偏りなく供給することが可能となる。
したがって、本発明では、攪拌羽の機械的なせん断力を作用させることなく培養液中を攪拌できるため、担体からの細胞の剥離が抑制され、効果的な細胞培養を行うことができる。

本発明の実施形態における付着性細胞培養装置を示す構成図である。本発明の実施形態における吐出ノズルを示す斜視図である。本発明の一別実施形態における吐出ノズルを示す断面図である。本発明の一別実施形態における吐出ノズルを示す平面図である。本発明の一別実施形態における付着性細胞培養装置を示す構成図である。

以下、本発明の実施形態の付着性細胞培養装置について図面を参照して説明する。
図１は、本発明の実施形態における付着性細胞培養装置１を示す構成図である。図２は、本発明の実施形態における吐出ノズル５０を示す斜視図である。
本実施形態の付着性細胞培養装置１は、ウイルスを増殖できる動物細胞を培養槽１０で大量培養する装置である。この付着性細胞培養装置１は、図１に示すように、付着性を有する細胞２を担体３の球面に付着させ、マイクロバブルを含有させた培養液中で細胞２を増殖させる構成となっている。この培養液中で担体３の球面を覆うように増殖した細胞２は、培養槽１０から担体３と共に取り出され、担体３から剥がされて所定の処理を経た後、医薬製造現場等で使用される。なお、担体３は、再び細胞２を付着した後、培養槽１０に投入されることとなる。

ここで培養液に含まれるマイクロバブルとは、ミクロンオーダー（１μｍ以上で１０００μｍ未満）の直径を有する微細気泡のことを指す。また、マイクロバブルは、培養液中に酸素を溶解させるために、その液中で所定時間滞留できる機能を有する微細気泡のことを指し、本実施形態のように細胞２を大量培養するべく数ｍの深さを有する培養槽１０である場合には、１００秒程度の滞留時間を確保する必要がある。本実施形態のマイクロバブルとしては、１ｃｍ／ｓ程度の浮上速度、バブル直径でいえば約１００〜２００μｍ程度以下の微細気泡であることが望ましい。

付着性細胞培養装置１は、培養槽１０の液中において攪拌流を形成するように、培養槽１０にマイクロバブルを含有させた培養液を供給する培養液供給装置２０を有する。本実施形態の培養液供給装置２０は、濾過分離装置３０と、マイクロバブル発生装置４０と、吐出ノズル５０とを有する。

濾過分離装置３０は、培養槽１０の培養液の一部を細胞２が付着した担体３と濾過分離して槽外に取り出すものであり、培養槽１０の基準液面１１に対応した位置において培養液を濾過分離して槽外に取り出す取出口３１と、取出口３１で濾過分離した濾過液を貯溜するバッファタンク３２とを有する。
取出口３１は、担体３の大きさよりもメッシュ度が小さいフィルター３１ａで覆われており、このフィルター３１ａを通過した濾過液が自然落下してバッファタンク３２に導入される構成となっている。本実施形態の取出口３１は、その開口下端が基準液面１１に接するように培養槽１０の側部に設けられている。

マイクロバブル発生装置４０は、濾過分離装置３０によって槽外に取り出された濾過液にマイクロバブルを含有させて、培養槽１０に供給する培養液を生成するものであり、バッファタンク３２から濾過液を圧送するポンプ４１と、ポンプ４１によって圧送されてくる濾過液に酸素ガスを添加して、マイクロバブルを含有した培養液を生成するマイクロバブル発生部４２とを有する。
マイクロバブル発生部４２の形態としては、酸素ガスを添加した濾過液に高速の旋回流を与えることで、せん断力により酸素ガスを微細化する形態や、濾過液中に多孔質部材を介してバブリングして酸素ガスを微細化する形態等、周知の形態を採用できる。本実施形態では、マイクロバブル発生過程で高い流速が得られる前者の形態を採用している。

吐出ノズル５０は、マイクロバブル発生装置４０から高速で吐出される培養液を、培養槽１０の液中に導き入れて、攪拌流を形成する構成となっている。この吐出ノズル５０は、基準液面１１より下方であって、培養槽１０の底面中央にその吐出口５１が対向するように配置される。この吐出ノズル５０は、高速で吐出される培養液による攪拌流のせん断力を、細胞２の担体３への付着力より小さく抑えるために、培養液の流速を減速させる減速部（流速調節部）５２を有する。本実施形態の減速部５２の形態は、吐出口５１に向かうに従って培養液の流路面積を拡大させる吐出ノズル５０の形状となっている。なお、攪拌流のせん断力は、マイクロバブル発生装置４０の旋回流を与える装置構成に依存し、細胞２の担体３への付着力は、細胞２の種類に依存するため、それら仕様に応じて、吐出ノズル５０を適宜取り替えることが望ましい。
また、拡大した吐出口５１の内側には、図２に示すように、吐出される培養液の流速を均一にすると共に、その培養液に攪拌流を与えるような向きに配置された複数の整流板５３が設けられている。本実施形態の整流板５３は、４つの異なる向きの流れを与えるようにそれぞれ所定の角度で設けられている。

続いて、上記構成の付着性細胞培養装置１の動作について説明する。
培養液供給装置２０は、培養槽１０に培養液を供給すると共に、その供給量分の培養液を培養槽１０から取り出し、またそれを再び培養槽１０に供給する循環流れを形成する。

先ず、濾過分離装置３０は、取出口３１において培養槽１０の培養液の一部を、細胞２が付着した担体３と濾過分離して槽外に取り出す。これにより、担体３が、マイクロバブル発生装置４０に供給されて、担体３の破壊、あるいは、付着した細胞２の死滅を防止することができる。
取出口３１は、培養槽１０の基準液面１１に対応した位置に設けられているため、培養液の供給によるオーバーフローでの自然排出が可能となる。これにより、例えば、培養槽１０の中段部から培養液を取り出す形態のように水圧によって担体３が張り付いてフィルター３１ａが目詰まりを起こすことがなくなるので、長期間のメンテナンスフリーを実現できる。

取出口３１のフィルター３１ａを通過した濾過液は、自然落下してバッファタンク３２に導入され貯溜される。バッファタンク３２に貯溜された濾過液は、ポンプ４１によって圧送され、マイクロバブル発生部４２に供給される。マイクロバブル発生部４２は、酸素ガスの添加により、その気泡を含んだ濾過液を高速で旋回させ、気泡をせん断力で微細化し、マイクロバブルを含有した培養液を生成する。このマイクロバブル発生過程で高い流速を得た培養液は、マイクロバブル発生部４２から高速で吐出され、吐出ノズル５０を介して培養槽１０に供給される。

吐出ノズル５０は、担体３への細胞２の付着力に基づいて、培養槽１０の液中に供給する培養液の流速を調節する減速部５２を有する。減速部５２は、培養液を吐出する吐出口５１に向かうに従って流路面積を拡大させることで、培養液の流速を減速させる。これにより、吐出される培養液による攪拌流のせん断力を、細胞２の担体３への付着力より小さく抑えることで、攪拌流による担体３からの細胞２の剥離を抑制する。

吐出ノズル５０は、拡大した吐出口５１の内側に吐出される培養液による攪拌流を形成する整流板５３を有する。本実施形態では、吐出ノズル５０の拡大した吐出口５１にスペースが生まれるので、そのスペースに整流板５３を設けることができ、培養液の吐出時において効率よく攪拌流を形成することが可能となる。この整流板５３によって整流されて吐出された培養液は、液中を攪拌すると共に、同伴するマイクロバブルを槽全体に供給して液中の酸素溶解量を高め、細胞２の培養に適した環境を形成する。

したがって、上述の本実施形態によれば、マイクロバブルを含有させた培養液中で、担体３に付着させた細胞２を培養する培養槽１０を備える付着性細胞培養装置１であって、培養槽１０の液中において攪拌流を形成するように、培養槽１０に培養液を供給する培養液供給装置２０を有するという構成を採用し、マイクロバブルを含有させた培養液を、付着性細胞を培養する培養槽１０に攪拌流を与えるように供給することで、攪拌羽を用いることなく液中を攪拌させて、酸素を槽内全体に偏りなく供給することが可能となる。
したがって、本実施形態では、攪拌羽の機械的なせん断力を作用させることなく培養液中を攪拌できるため、担体３からの細胞２の剥離が抑制され、効果的な細胞培養を行うことができる。

以上、図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。上述した実施形態において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。

例えば、上記実施形態では、吐出ノズル５０から供給される培養液を、培養槽１０において下向き吐出すると説明したが、本発明はこの構成に限定されるものではなく、攪拌流を形成できれば、例えば培養槽１０において上向きに吐出する構成であってもよいし、培養槽１０の接線方向に吐出する構成であってもよい。

また、例えば、上記実施形態では、吐出ノズル５０の流路面積を拡大させて、吐出される培養液の流速を調節すると説明したが、例えば、図３に示すように、吐出ノズル５０の流路を複数に分岐させるように配管して流路面積を拡大させる構成であってもよい。
また、図４に示すように、分岐した配管を培養槽１０の内周面に沿うように曲げて、培養槽１０の底面中央を中心とした旋回流を与える向きに吐出口５１を配置する構成であってもよい。また、本構成を高さ方向に複数設けて、培養槽１０の底部だけでなく中段部等からも攪拌流を形成させる構成であってもよい。

また、例えば、図５に示す別実施形態に示すように、付着性細胞培養装置１は、培養槽１０に培養液を供給する前に、マイクロバブル発生装置４０により生成した培養液を内部に導入して該培養液に含まれるバブルの一部を脱気させる脱気槽６０と、脱気槽６０において、上記脱気による内部圧力の増圧分を減圧させると共にマイクロバブルの培養液に対する溶解量を飽和状態に維持する圧力に調節する減圧弁（圧力調節弁）６１とを備える構成を採用してもよい。この構成によれば、マイクロバブル発生装置４０において生成された培養液に、径の大きなバブルが含まれる場合、それが培養槽１０に供給されると、そのバブルに細胞２が捕まって基準液面１１まで浮上し、酸素を十分に供給できない場合があるので、培養槽１０に培養液を供給する前に、減圧弁６１によって圧力を調節した脱気槽６０において、培養液に酸素が十分に含まれる飽和状態とし、不要なバブルは脱気することで、培養液を培養槽１０に供給した際の細胞２の浮上を抑制することができる。なお、図５に示す例においては、ポンプ４１の圧送力を維持したいので、脱気槽６０においては、十分な内部圧力を維持しつつ、脱気したガスを外部へ抜き出す減圧弁６１を用いている。

１…付着性細胞培養装置、２…細胞、３…担体、１０…培養槽、１１…基準液面、２０…培養液供給装置、３０…濾過分離装置、３１…取出口、４０…マイクロバブル発生装置、５０…吐出ノズル、５１…吐出口、５２…減速部（流速調節部）、５３…整流板、６０…脱気槽、６１…減圧弁（圧力調節弁）

Claims

マイクロバブルを含有させた培養液中で、担体に付着させた細胞を培養する培養槽を備える付着性細胞培養装置であって、
前記培養槽の液中において攪拌流を形成するように、前記培養槽に前記培養液を供給する培養液供給装置を有しており、
前記培養液供給装置は、
前記培養槽の基準液面に対応した位置に設けられたフィルター付き取出口を備えて、前記培養液の供給によりオーバーフローした前記培養槽の培養液の一部を前記フィルター付き取出口にて前記細胞が付着した前記担体と濾過分離して槽外に自然排出させて取り出す濾過分離装置と、
前記濾過分離装置によって槽外に取り出された濾過液にマイクロバブルを含有させて、前記培養槽に供給する前記培養液を生成するマイクロバブル発生装置と、を有することを特徴とする付着性細胞培養装置。
前記培養液供給装置は、前記担体への前記細胞の付着力に基づいて、前記培養槽の液中に供給する前記培養液の流速を調節する流速調節部を有することを特徴とする請求項１に記載の付着性細胞培養装置。
前記培養液供給装置は、前記流速調節部として、前記培養槽の液中に前記培養液を吐出する吐出口に向かうに従って流路面積が拡大する吐出ノズルを有することを特徴とする請求項２に記載の付着性細胞培養装置。
前記吐出ノズルは、前記拡大した吐出口の内側に前記攪拌流を形成する整流板を有することを特徴とする請求項３に記載の付着性細胞培養装置。
前記培養槽に前記培養液を供給する前に、前記マイクロバブル発生装置により生成した前記培養液を内部に導入して該培養液に含まれるバブルの一部を脱気させる脱気槽と、
前記脱気槽において、前記脱気による前記内部の圧力の増圧分を減圧させると共に前記マイクロバブルの前記培養液に対する溶解量を飽和状態に維持する圧力に調節する圧力調節弁と、を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の付着性細胞培養装置。