JP2775161B2 - 液流式生化学反応装置 - Google Patents
液流式生化学反応装置Info
- Publication number
- JP2775161B2 JP2775161B2 JP63290161A JP29016188A JP2775161B2 JP 2775161 B2 JP2775161 B2 JP 2775161B2 JP 63290161 A JP63290161 A JP 63290161A JP 29016188 A JP29016188 A JP 29016188A JP 2775161 B2 JP2775161 B2 JP 2775161B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- culture
- liquid flow
- stirring
- substrate
- reactor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/06—Nozzles; Sprayers; Spargers; Diffusers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/18—External loop; Means for reintroduction of fermented biomass or liquid percolate
Landscapes
- Wood Science & Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物（糸状菌・放射菌・酵母・細菌を指
す）、動物細胞或いは植物細胞の増殖能力を残した侭、
或いは増殖能力は失活しているが生化学的物質変換能
力、即ち特定物質の変換に特に強い触媒機能を有する微
生物菌体、動物細胞或いは植物細胞を固定若しくは半固
定した粒状担体（その直径が数100ミクロンから数cmに
渉る）および上記触媒機能を有する生物体の小塊（生物
フロツクと称する）浮遊溶液の、目的の機能が充分に発
揮出来る様に創意工夫した装置に関するものである。
す）、動物細胞或いは植物細胞の増殖能力を残した侭、
或いは増殖能力は失活しているが生化学的物質変換能
力、即ち特定物質の変換に特に強い触媒機能を有する微
生物菌体、動物細胞或いは植物細胞を固定若しくは半固
定した粒状担体（その直径が数100ミクロンから数cmに
渉る）および上記触媒機能を有する生物体の小塊（生物
フロツクと称する）浮遊溶液の、目的の機能が充分に発
揮出来る様に創意工夫した装置に関するものである。
この様な生物反応装置をバイオリアクターと称する
が、バイオリアクターの形式は幾何学的な形状および構
造から槽型・管型および膜型に大別出来る。槽型反応器
としては、一般に撹拌機を備えた所謂撹拌槽が凡ゆる操
作に対して使用され、連続操作の場合には多段に用いら
れることもある。管型反応器は主に連続操作に用いら
れ、縦型で太短い場合は塔型反応器とも呼ばれている。
膜型反応器は、酵素を膜に固定した状態で用いる例が多
く、多段式で効率の良い設計も可能である。しかしなが
ら、膜型反応器は大型化が困難であり、現状では小型試
験機のレベルを脱していない。
が、バイオリアクターの形式は幾何学的な形状および構
造から槽型・管型および膜型に大別出来る。槽型反応器
としては、一般に撹拌機を備えた所謂撹拌槽が凡ゆる操
作に対して使用され、連続操作の場合には多段に用いら
れることもある。管型反応器は主に連続操作に用いら
れ、縦型で太短い場合は塔型反応器とも呼ばれている。
膜型反応器は、酵素を膜に固定した状態で用いる例が多
く、多段式で効率の良い設計も可能である。しかしなが
ら、膜型反応器は大型化が困難であり、現状では小型試
験機のレベルを脱していない。
連続操作の反応器に対しては、反応器内の流体の流れ
の状態が基質の反応効率に影響を与えるので、流れの状
態つまり流体の混合の程度を知ることが重視される。こ
の観点に立てば連続操作の反応器は２通り考えられる。
理想化された一つの形は、PFR（pulg flow reactor）と
呼ばれる、装置内を通過する物質が装置入口から出口へ
と流れに対して直角の方向に同じ速度で以て、しかも流
れの方向には混合も拡散も無く、宛かもピストンの様に
移動する押出し流れ反応器である。之に対して正反対の
理想化されたものは、CSTR（continuous stirred tank
reactor）と呼ばれる完全混合反応器であり反応器内で
凡ゆる成分の濃度が完全に何処も一様になつており、粒
子も一様に分散している様な流れの状態を指す。
の状態が基質の反応効率に影響を与えるので、流れの状
態つまり流体の混合の程度を知ることが重視される。こ
の観点に立てば連続操作の反応器は２通り考えられる。
理想化された一つの形は、PFR（pulg flow reactor）と
呼ばれる、装置内を通過する物質が装置入口から出口へ
と流れに対して直角の方向に同じ速度で以て、しかも流
れの方向には混合も拡散も無く、宛かもピストンの様に
移動する押出し流れ反応器である。之に対して正反対の
理想化されたものは、CSTR（continuous stirred tank
reactor）と呼ばれる完全混合反応器であり反応器内で
凡ゆる成分の濃度が完全に何処も一様になつており、粒
子も一様に分散している様な流れの状態を指す。
更にバイオリアクターの設計と操作のためには前述の
化学工学的原理だけでは不充分であり、之に加えて微生
物、動物細胞および植物細胞に対して次の様な要因を考
慮する必要がある。即ち、微生物や動・植物細胞の純粋
培養用バイオリアクターの備えるべき第１の条件は、雑
菌・フアージ汚染の恐れを極力少なくすることである。
之等生物の培養技術は、コンタミネーションとの絶えざ
る戦いである。特に動・植物細胞の増殖速度は遅く、培
養時間が長いだけでなく、用いる培地組成が極めて栄養
豊富である（運動細胞の場合）ので、細心の注意が必要
である。更に動物細胞は細胞膜が弱く、剪断応力により
破壊され勝ちなので、過大な剪断力を与えない様に混合
撹拌する工夫を必要とする。また植物細胞は細胞塊とし
て存在し、之が剪断力で分断され、それによつて二次代
謝産物生産生成が影響を受けるので、剪断力に特に注意
を払う必要がある。同時に植物細胞は壁増殖し易いの
で、之も解決しなければならない。
化学工学的原理だけでは不充分であり、之に加えて微生
物、動物細胞および植物細胞に対して次の様な要因を考
慮する必要がある。即ち、微生物や動・植物細胞の純粋
培養用バイオリアクターの備えるべき第１の条件は、雑
菌・フアージ汚染の恐れを極力少なくすることである。
之等生物の培養技術は、コンタミネーションとの絶えざ
る戦いである。特に動・植物細胞の増殖速度は遅く、培
養時間が長いだけでなく、用いる培地組成が極めて栄養
豊富である（運動細胞の場合）ので、細心の注意が必要
である。更に動物細胞は細胞膜が弱く、剪断応力により
破壊され勝ちなので、過大な剪断力を与えない様に混合
撹拌する工夫を必要とする。また植物細胞は細胞塊とし
て存在し、之が剪断力で分断され、それによつて二次代
謝産物生産生成が影響を受けるので、剪断力に特に注意
を払う必要がある。同時に植物細胞は壁増殖し易いの
で、之も解決しなければならない。
工業的に普及しているバイオリアクターは、CSTR型で
あり、多目的に応用されている。生体触媒が必要とする
酸素や基質の供給効率、つまり反応効率が高いのが、こ
の型の特徴である。しかしながら、反応効率を高める目
的で用いられる機械的撹拌には主に撹拌翼をモーターに
よつて駆動させる方式を用いるために、その撹拌翼は種
々工夫されているものの、その撹拌翼を中心とした物理
上に於いて剪断応力を低下させることは困難である。前
者の方法を用いずに、基質容積の５〜10倍のエアーをス
パージヤーによつて供給して撹拌効率を高める方式も考
案されているが、この様な多量のエアー供給方式はラン
ニングコストを高める。そして上記の何れかの方式も、
担体或いは生物塊の密度を基質比で10％以上に高めるこ
とは出来ない。
あり、多目的に応用されている。生体触媒が必要とする
酸素や基質の供給効率、つまり反応効率が高いのが、こ
の型の特徴である。しかしながら、反応効率を高める目
的で用いられる機械的撹拌には主に撹拌翼をモーターに
よつて駆動させる方式を用いるために、その撹拌翼は種
々工夫されているものの、その撹拌翼を中心とした物理
上に於いて剪断応力を低下させることは困難である。前
者の方法を用いずに、基質容積の５〜10倍のエアーをス
パージヤーによつて供給して撹拌効率を高める方式も考
案されているが、この様な多量のエアー供給方式はラン
ニングコストを高める。そして上記の何れかの方式も、
担体或いは生物塊の密度を基質比で10％以上に高めるこ
とは出来ない。
本発明の特徴とする処は、CSTR型の撹拌槽に於いて撹
拌方式を工夫することによつて従来方式の同程度の撹拌
方式を有し、担体或いは生物塊が受ける剪断応力を著し
く低減せしめ、更に担体或いは生物塊の密度を基質比で
50％程度に高めることを可能としたことにある。即ち、
第１図に示す断面構造を有する液送ノズルを用いて層流
（ラミナフロー）を作り出し、その液流によつて撹拌力
を生じさせる。図中１は培地、２は担体、３はラミナフ
ローを示す。担体或いは生物塊のスラリーは、循環パイ
プ内ではラミナフローによつて剪断応力を受けることが
少なく、またパイプを出た液流は、第２図の上部から見
た図面第２図Ｃの様に撹拌槽に斜入させることによつて
渦巻き流を生じせしめる。図中４はエアー、５は循環ポ
ンプを示す。また、このノズルの前部からエアーを供給
すればエアーバブルはノズル部で細かくなり、更に渦巻
き流によつてバブルの基質内滞留時間が長くなり、結果
として酵素の供給効率を高める。
拌方式を工夫することによつて従来方式の同程度の撹拌
方式を有し、担体或いは生物塊が受ける剪断応力を著し
く低減せしめ、更に担体或いは生物塊の密度を基質比で
50％程度に高めることを可能としたことにある。即ち、
第１図に示す断面構造を有する液送ノズルを用いて層流
（ラミナフロー）を作り出し、その液流によつて撹拌力
を生じさせる。図中１は培地、２は担体、３はラミナフ
ローを示す。担体或いは生物塊のスラリーは、循環パイ
プ内ではラミナフローによつて剪断応力を受けることが
少なく、またパイプを出た液流は、第２図の上部から見
た図面第２図Ｃの様に撹拌槽に斜入させることによつて
渦巻き流を生じせしめる。図中４はエアー、５は循環ポ
ンプを示す。また、このノズルの前部からエアーを供給
すればエアーバブルはノズル部で細かくなり、更に渦巻
き流によつてバブルの基質内滞留時間が長くなり、結果
として酵素の供給効率を高める。
第２図Ａは固形物除去フィルターを撹拌槽の底部に設
け、固形物フリーの培養基質をそのフィルター下部より
取り外し、循環ポンプにより液流ノズルへ圧送する。ま
た固形物を含む培養液は、循環パイプによつて撹拌槽か
ら外部へ取り出し、液流ノズルによつて押し出し流れを
創り、その液流圧によつて再び撹拌槽へ傾入させ槽内に
渦開き流れを生じせしむる。第２図Ｂは状態を説明する
側断面図である。図中６は循環パイプ、７はノズルであ
る。
け、固形物フリーの培養基質をそのフィルター下部より
取り外し、循環ポンプにより液流ノズルへ圧送する。ま
た固形物を含む培養液は、循環パイプによつて撹拌槽か
ら外部へ取り出し、液流ノズルによつて押し出し流れを
創り、その液流圧によつて再び撹拌槽へ傾入させ槽内に
渦開き流れを生じせしむる。第２図Ｂは状態を説明する
側断面図である。図中６は循環パイプ、７はノズルであ
る。
第２図Ｂは固形物を含む培養液を循環用パイプを通じ
て撹拌槽から取り出し、液流ノズルによる押し出し流れ
で液流圧を創り再び撹拌槽下部へ傾入させる。その循環
用パイプの上部に固形物を除去した培養基質を循環ポン
プに送り、そのポンプにより圧送された基質は液流ノズ
ルを通じて培養液へ戻される場合を説明する側断面図で
ある。
て撹拌槽から取り出し、液流ノズルによる押し出し流れ
で液流圧を創り再び撹拌槽下部へ傾入させる。その循環
用パイプの上部に固形物を除去した培養基質を循環ポン
プに送り、そのポンプにより圧送された基質は液流ノズ
ルを通じて培養液へ戻される場合を説明する側断面図で
ある。
第２図Ａと第２図Ｂとの差異は、固形物除去フイルタ
ーを撹拌槽内へ付帯させるか、循環パイプに付属させる
かに在る。
ーを撹拌槽内へ付帯させるか、循環パイプに付属させる
かに在る。
第２図Ｃは第２図Ａを上部より見た図を示している。
循環パイプの下部を撹拌槽に傾めに取り付けている。之
によつて培養液は、渦巻き流れを生じせしめることが出
来るのである。
循環パイプの下部を撹拌槽に傾めに取り付けている。之
によつて培養液は、渦巻き流れを生じせしめることが出
来るのである。
本発明の装置による撹拌効率と酸素移動速度を、従来
方式のCSTR型と比較したので以下に説明する。第１表は 本発明の液流式生化学反応装置とCSTR型の普及型ジヤ
ーフアメンターの撹拌効率を比較したデータである。こ
の効率の測定方式は第１表に示した条件に夫々の装置を
設定し、その基質中に最終濃度が10ppmになる様にメチ
ルオレンジを2ml注入した。槽内の任意の場所から連続
的に基質をサンプリングし、夫をLKB社製の2151VWMデイ
テクターの464nmの吸光度で測定し、レコーダー（LKB社
製の2210RE）で記録した。そして色素注入後に色素濃度
が一定になる迄に要した時間（完全混合時間）を測定
し、この時間が短いほど撹拌効果は良いと判定した。第
１表に示す測定条件に於いて、液流式リアクターの液送
量を22.5/minとしたのは、この液送量で0.1vvmのエア
ーを供給すれば酸素移動速度はジヤーフアメンターの40
0rpmの撹拌回転数の条件と同等になるためである。この
測定条件に於ける撹拌効率は液流式リアクターが20％程
高い結果を得た。液流式リアクターは撹拌原理上ジヤー
フアメンターよりは剪断応力を生じさせないためにバイ
オリアクターとしての性能はジヤーフアメンターと比較
して明らかに優れている。剪断力の比較はカラギーナン
やアルギン酸担体を用いて撹拌培養を行なつた場合、ジ
ヤーフアメンターでは担体が破壊されて培養を継続出来
ないのに反し、液流式リアクターは何等担体に損傷を与
えないで効率の良い培養を継続させ得る事実からも明ら
かである。
方式のCSTR型と比較したので以下に説明する。第１表は 本発明の液流式生化学反応装置とCSTR型の普及型ジヤ
ーフアメンターの撹拌効率を比較したデータである。こ
の効率の測定方式は第１表に示した条件に夫々の装置を
設定し、その基質中に最終濃度が10ppmになる様にメチ
ルオレンジを2ml注入した。槽内の任意の場所から連続
的に基質をサンプリングし、夫をLKB社製の2151VWMデイ
テクターの464nmの吸光度で測定し、レコーダー（LKB社
製の2210RE）で記録した。そして色素注入後に色素濃度
が一定になる迄に要した時間（完全混合時間）を測定
し、この時間が短いほど撹拌効果は良いと判定した。第
１表に示す測定条件に於いて、液流式リアクターの液送
量を22.5/minとしたのは、この液送量で0.1vvmのエア
ーを供給すれば酸素移動速度はジヤーフアメンターの40
0rpmの撹拌回転数の条件と同等になるためである。この
測定条件に於ける撹拌効率は液流式リアクターが20％程
高い結果を得た。液流式リアクターは撹拌原理上ジヤー
フアメンターよりは剪断応力を生じさせないためにバイ
オリアクターとしての性能はジヤーフアメンターと比較
して明らかに優れている。剪断力の比較はカラギーナン
やアルギン酸担体を用いて撹拌培養を行なつた場合、ジ
ヤーフアメンターでは担体が破壊されて培養を継続出来
ないのに反し、液流式リアクターは何等担体に損傷を与
えないで効率の良い培養を継続させ得る事実からも明ら
かである。
また、第３図は液流式リアクターの流体速度と酸素移
動速度との関係を示したグラフであり、第４図はジヤー
フアメンターに於ける撹拌条件と酸素移動速度との関係
を示したグラフである。酸素移動速度は、亜硫酸酸化法
により求めた。即ち亜硫酸ナトリウムは銅イオン（C
u2+）の一定濃度下では一定の速度で酸化され一定基質
内の酸素の移動速度は亜硫酸ナトリウムの消費速度に比
例することになり、次式が成立する。
動速度との関係を示したグラフであり、第４図はジヤー
フアメンターに於ける撹拌条件と酸素移動速度との関係
を示したグラフである。酸素移動速度は、亜硫酸酸化法
により求めた。即ち亜硫酸ナトリウムは銅イオン（C
u2+）の一定濃度下では一定の速度で酸化され一定基質
内の酸素の移動速度は亜硫酸ナトリウムの消費速度に比
例することになり、次式が成立する。
測定条件は、共に基質量を12にし、エアーの供給量
を0.5vvmにした。基質内に残存した亜硫酸ナトリウム
は、チオ硫酸ナトリウムで滴定した。第３図から明らか
な様に酸素移動速度は液流式リアクターに於いて有意に
高い。この結果は同時に基質の拡散速度も高いことを示
唆する。
を0.5vvmにした。基質内に残存した亜硫酸ナトリウム
は、チオ硫酸ナトリウムで滴定した。第３図から明らか
な様に酸素移動速度は液流式リアクターに於いて有意に
高い。この結果は同時に基質の拡散速度も高いことを示
唆する。
本発明は、CSTR型反応槽を利用して各種の化合物，蛋
白質，核酸などを製造している産業に適用出来る。低い
剪断応力を要求し、しかも高い酸素供給効率と基質撹拌
効率が必要な生化学反応に於いては本発明の如き装置が
有利である。
白質，核酸などを製造している産業に適用出来る。低い
剪断応力を要求し、しかも高い酸素供給効率と基質撹拌
効率が必要な生化学反応に於いては本発明の如き装置が
有利である。
実施例１ 糸状菌の一種である黒麹菌（アスペルギルス・ニガ
ー、JCM 5548株）をセルローススポンジ担体に着生固
定させ、粗糖を炭素源としてクエン酸発酵を試みた。
ー、JCM 5548株）をセルローススポンジ担体に着生固
定させ、粗糖を炭素源としてクエン酸発酵を試みた。
本発明の装置に、種培養用の基質（粗糖 ２％、硫安
0.25％、KH2PO4 0.1％、MgSO4・7H2O 0.04％）と3m
m角のセルローススポンジの体積比が1:1になる様に調整
して、全容積を12とし、121℃で１時間の湿熱滅菌
後、放冷し、上記菌の胞子を104/mlの密度になる様に接
種した。培養温度を25℃に設定し、毎分15の液流量で
0.1vvmのエアー供給を行ない、３日間種培養をした。菌
体は全てセルローススポンジ上に発育し、基質中に菌体
の漏出は認められなかつた。
0.25％、KH2PO4 0.1％、MgSO4・7H2O 0.04％）と3m
m角のセルローススポンジの体積比が1:1になる様に調整
して、全容積を12とし、121℃で１時間の湿熱滅菌
後、放冷し、上記菌の胞子を104/mlの密度になる様に接
種した。培養温度を25℃に設定し、毎分15の液流量で
0.1vvmのエアー供給を行ない、３日間種培養をした。菌
体は全てセルローススポンジ上に発育し、基質中に菌体
の漏出は認められなかつた。
種培養終了後に菌体の着生した担体を残し、主培養基
質を除去し発酵用基質（粗糖 14％、KH2PO4 １％、Mg
SO4・7H2O 0.04％）を無菌的に６添加し、毎分30
の液流量で６日間バツチ式培養を行なつた。培養温度を
30℃に設定し、エアーの供給量を0.1vvmとした。上記条
件下の培養で、糖のクエン酸転換効率は92％であつた。
質を除去し発酵用基質（粗糖 14％、KH2PO4 １％、Mg
SO4・7H2O 0.04％）を無菌的に６添加し、毎分30
の液流量で６日間バツチ式培養を行なつた。培養温度を
30℃に設定し、エアーの供給量を0.1vvmとした。上記条
件下の培養で、糖のクエン酸転換効率は92％であつた。
CSTR型反応槽の普及型であるジヤーフアメンターを用
いたクエン酸発酵例では、培養条件をほぼ同一にした場
合（同一基質組成，培養基質12，エアー供給量 0.1v
vm,培養温度 30℃，培養期間 ６〜10日）で糖のクエ
ン酸転換効率は78〜84％程度である。また、従来方式で
は、バツチ毎にクエン酸代謝活性の高い菌体を再利用出
来ないために、菌体を増殖させる種培養及びクエン酸の
代謝誘導等を行なう前培養の工程がバツチ毎に必要であ
り、本発明の方式の如く連続生産或いは半連続生産への
応用は困難であり、経済効率は低い。
いたクエン酸発酵例では、培養条件をほぼ同一にした場
合（同一基質組成，培養基質12，エアー供給量 0.1v
vm,培養温度 30℃，培養期間 ６〜10日）で糖のクエ
ン酸転換効率は78〜84％程度である。また、従来方式で
は、バツチ毎にクエン酸代謝活性の高い菌体を再利用出
来ないために、菌体を増殖させる種培養及びクエン酸の
代謝誘導等を行なう前培養の工程がバツチ毎に必要であ
り、本発明の方式の如く連続生産或いは半連続生産への
応用は困難であり、経済効率は低い。
実施例２ 放射菌の一種であるストレプトマイセス・グリセウス
（ATCC 2334株）をセルロース・スポンジ担体に着生固
定させ、本発明の装置を用いてストレプトマイシンの生
産をバツチ式培養法で試みた。
（ATCC 2334株）をセルロース・スポンジ担体に着生固
定させ、本発明の装置を用いてストレプトマイシンの生
産をバツチ式培養法で試みた。
８の種培養基質（ブドウ糖１％、酵母エキス１％）
を本発明の装置に添加し、121℃で１時間の湿熱滅菌を
行なつた後、放冷し、別に三角フラスコ（500ml容で200
mlの基質量）で培養した上記菌株を接種した。毎分15
の液流量で、30℃、２日間種培養した後、無菌的に3mm
角のセルロース・スポンジ担体を添加し、培養全容積を
12に調整した。更に２日間種培養を継続し、菌体を担
体に着生固定させた。
を本発明の装置に添加し、121℃で１時間の湿熱滅菌を
行なつた後、放冷し、別に三角フラスコ（500ml容で200
mlの基質量）で培養した上記菌株を接種した。毎分15
の液流量で、30℃、２日間種培養した後、無菌的に3mm
角のセルロース・スポンジ担体を添加し、培養全容積を
12に調整した。更に２日間種培養を継続し、菌体を担
体に着生固定させた。
種培養終了後に、着生固定した担体を残し、種培養基
質を除去した。発酵用基質（１当りブドウ糖 20g、M
gSO4・7H2O 10g、クエン酸ナトリウム 10g、NaCl 5
g、CaCl2・2H2O 0.3g、KH2PO4 0.5g、FeSO4・7H2O 2
mg、CuSO4・5H2O 1mg、ZnSO4・7H2O 1mg、Na2MoO4・2
H2O 0.1mgを含有する）を無菌的に添加し、毎分３の
液流量で25℃・８日間培養した。ストレプトマイシンの
測定はデイスク拡散法で行なつた。その結果、培養８日
目で150μg/mlの濃度のストレプトマイシンが生産され
た。
質を除去した。発酵用基質（１当りブドウ糖 20g、M
gSO4・7H2O 10g、クエン酸ナトリウム 10g、NaCl 5
g、CaCl2・2H2O 0.3g、KH2PO4 0.5g、FeSO4・7H2O 2
mg、CuSO4・5H2O 1mg、ZnSO4・7H2O 1mg、Na2MoO4・2
H2O 0.1mgを含有する）を無菌的に添加し、毎分３の
液流量で25℃・８日間培養した。ストレプトマイシンの
測定はデイスク拡散法で行なつた。その結果、培養８日
目で150μg/mlの濃度のストレプトマイシンが生産され
た。
培養条件を上記実験に出来るだけ近付けたジヤーフア
メンターによるストレプトマイシン醗酵に於いて、従来
方式のジヤーフアメンターによる該醗酵例は、本発明の
方式に比べて、ストレプトマイシンの生産効率は20％程
低い。更にジヤーフアメンターを用いた該醗酵法は、ク
エン酸醗酵と同様の問題を有しており、連続生産への応
用は困難である。
メンターによるストレプトマイシン醗酵に於いて、従来
方式のジヤーフアメンターによる該醗酵例は、本発明の
方式に比べて、ストレプトマイシンの生産効率は20％程
低い。更にジヤーフアメンターを用いた該醗酵法は、ク
エン酸醗酵と同様の問題を有しており、連続生産への応
用は困難である。
実施例３ 酵母の一種であるサツカロマイセス・カールスバーゲ
ンシス（OUT 7013株）をカラギーナン粒子に固定し本
発明の装置を用いてエチルアルコールの連続発酵生産を
試みた。
ンシス（OUT 7013株）をカラギーナン粒子に固定し本
発明の装置を用いてエチルアルコールの連続発酵生産を
試みた。
先ず酵母を500ml容の三角フラスコに200mlの前培養基
質（ブドウ糖 １％、ペプトン 0.5％、酵母 エキス
0.3％、麦芽 エキス0.3％でpH5に調整したもの）を添
加した培器に接種した。前培養は嫌気的条件下で30℃・
18時間行なつた。培養した酵母を遠心分離し、37℃の温
度下で４％のカラギーナン溶液の４に懸濁した。この
懸濁液を20℃の温度条件下で、２％のKCL溶液10に無
菌的に滴下し、直径約4mmの菌体固定カラギーナンのゲ
ル化粒子を作成した。更にこのゲル粒子を10の種培養
用基質（ブドウ糖 10％、酵母エキス 0.15％、NH4Cl
0.25％、K2HPO4 0.55％、MgSO4・7H2O 0.025％、Na
Cl 0.1％、CaCl2 0.001％、クエン酸 0.3％でpH5に
調整したもの）で好気的条件下で30℃・60時間バツチ培
養し、酵母をゲル粒子の特に表層付近で増殖せしめた。
質（ブドウ糖 １％、ペプトン 0.5％、酵母 エキス
0.3％、麦芽 エキス0.3％でpH5に調整したもの）を添
加した培器に接種した。前培養は嫌気的条件下で30℃・
18時間行なつた。培養した酵母を遠心分離し、37℃の温
度下で４％のカラギーナン溶液の４に懸濁した。この
懸濁液を20℃の温度条件下で、２％のKCL溶液10に無
菌的に滴下し、直径約4mmの菌体固定カラギーナンのゲ
ル化粒子を作成した。更にこのゲル粒子を10の種培養
用基質（ブドウ糖 10％、酵母エキス 0.15％、NH4Cl
0.25％、K2HPO4 0.55％、MgSO4・7H2O 0.025％、Na
Cl 0.1％、CaCl2 0.001％、クエン酸 0.3％でpH5に
調整したもの）で好気的条件下で30℃・60時間バツチ培
養し、酵母をゲル粒子の特に表層付近で増殖せしめた。
上記条件下で増殖した約４のゲル粒子を本発明の装
置に無菌的に移し発酵用基質（ブドウ糖10g、酵母エキ
ス 0.1g、Na3Cl 0.1g、K2HPO4 0.2％、MgSO4・7H2O
0.1％、NaCl 0.1％、CaCl2 0.001％）を同様に無菌
的に添加し、全容量を12に調整した。液流量を10に
設定し、穏やかな流速で固定化ゲル粒子を循環撹拌しな
がら、窒素ガスを0.1vvmの割合で24時間供給し、嫌気的
培養条件を創出した。24時間後に窒素ガスの供給を止
め、この嫌気的培養条件下で上記発酵基質を12／時の
流速で連続的に供給した。即ち連続培養のリテンシヨン
・タイムを１時間に調整し、30℃の培養温度下で一ヵ月
間のエチルアルコールの連続生産を行なつた。生産した
エチルアルコールの定量は常法に従い酵素法で測定し
た。
置に無菌的に移し発酵用基質（ブドウ糖10g、酵母エキ
ス 0.1g、Na3Cl 0.1g、K2HPO4 0.2％、MgSO4・7H2O
0.1％、NaCl 0.1％、CaCl2 0.001％）を同様に無菌
的に添加し、全容量を12に調整した。液流量を10に
設定し、穏やかな流速で固定化ゲル粒子を循環撹拌しな
がら、窒素ガスを0.1vvmの割合で24時間供給し、嫌気的
培養条件を創出した。24時間後に窒素ガスの供給を止
め、この嫌気的培養条件下で上記発酵基質を12／時の
流速で連続的に供給した。即ち連続培養のリテンシヨン
・タイムを１時間に調整し、30℃の培養温度下で一ヵ月
間のエチルアルコールの連続生産を行なつた。生産した
エチルアルコールの定量は常法に従い酵素法で測定し
た。
連続培養を開始して48時間後に、流出培養中のアルコ
ール濃度は48g/に達し、その後28日間48±2g/のエ
チルアルコール濃度を維持した。糖からエチルアルコー
ルへの転換効率は94％を維持したことになる。因にグル
コース180gから92.2gのエチルアルコールを生ずれば、
その転換効率は100％である。
ール濃度は48g/に達し、その後28日間48±2g/のエ
チルアルコール濃度を維持した。糖からエチルアルコー
ルへの転換効率は94％を維持したことになる。因にグル
コース180gから92.2gのエチルアルコールを生ずれば、
その転換効率は100％である。
ジヤーフアメンターを用いた菌体包括カラギーナン担
体の培養は、ジヤーフアメンターの撹拌翼による剪断力
で該担体が破壊されるために適用出来ない。現在迄の多
くの研究報告から、上記担体をPFR型醗酵槽に充填した
方式の実験結果は、本実験の結果と比べて反応効率は半
分以下である。
体の培養は、ジヤーフアメンターの撹拌翼による剪断力
で該担体が破壊されるために適用出来ない。現在迄の多
くの研究報告から、上記担体をPFR型醗酵槽に充填した
方式の実験結果は、本実験の結果と比べて反応効率は半
分以下である。
実施例４ 本発明の装置を用いて、通性嫌気性細菌の一種である
コリネバクテリウム・グルタミカム（JCM 1318株）に
よるグルタミン酸の連続発酵生産を試みた。
コリネバクテリウム・グルタミカム（JCM 1318株）に
よるグルタミン酸の連続発酵生産を試みた。
菌体の固定に実施例３で述べたカラギーナンを用い、
その固定化手技は実施例３と同様である。またこの実験
に用いた前培養培地と発酵用培地組成は第２表に示す通
りである。
その固定化手技は実施例３と同様である。またこの実験
に用いた前培養培地と発酵用培地組成は第２表に示す通
りである。
先ず第２表 に示す200mlの前培養用培地を添加した500ml容の三角フ
ラスコに上記菌株を接種し、30℃で24時間、120rpmの旋
回培養を行なつた。培養した菌体を４の４％カラギー
ナン溶液に移し、夫れを２％のKCL溶液中に滴下して菌
体固定ゲル化粒子を作成した。この固定化ゲル粒子を同
様の培地で30℃・24時間、好気的に培養しゲルの表層付
近で菌体を増殖せしめた。この菌体増殖固定化ゲル粒子
を本発明の装置に無菌的に移し、第２表に示す発酵用培
地を添加し全量を12に調整した。発酵用培地の連続供
給量を1.2／時（リテンシヨン・タイムは10時間であ
る）に設定した。エアーの供給量を0.5vvmにし、培養期
間を通じて10％尿素溶液でpHを7.0±0.2に厳しく制御
し、30℃の温度条件で好気的培養条件下で30日間連続培
養を行なつた。液流量は22.5／分に設定し、生産した
グルタミン酸の濃度は常法に従い酵素法で測定した。
ラスコに上記菌株を接種し、30℃で24時間、120rpmの旋
回培養を行なつた。培養した菌体を４の４％カラギー
ナン溶液に移し、夫れを２％のKCL溶液中に滴下して菌
体固定ゲル化粒子を作成した。この固定化ゲル粒子を同
様の培地で30℃・24時間、好気的に培養しゲルの表層付
近で菌体を増殖せしめた。この菌体増殖固定化ゲル粒子
を本発明の装置に無菌的に移し、第２表に示す発酵用培
地を添加し全量を12に調整した。発酵用培地の連続供
給量を1.2／時（リテンシヨン・タイムは10時間であ
る）に設定した。エアーの供給量を0.5vvmにし、培養期
間を通じて10％尿素溶液でpHを7.0±0.2に厳しく制御
し、30℃の温度条件で好気的培養条件下で30日間連続培
養を行なつた。液流量は22.5／分に設定し、生産した
グルタミン酸の濃度は常法に従い酵素法で測定した。
連続培養開始後５日目に、培養液中のグルタミン酸濃
度は23g/に達し、以後23.0±2.6g/の濃度域で変動
した。この値は、直ちにこの方法を工業化するのに適当
な数値とは考えられない。しかしながら、この方法を更
に改善すれば、工業化の方策が見出される可能性を示す
値だと評価出来る。
度は23g/に達し、以後23.0±2.6g/の濃度域で変動
した。この値は、直ちにこの方法を工業化するのに適当
な数値とは考えられない。しかしながら、この方法を更
に改善すれば、工業化の方策が見出される可能性を示す
値だと評価出来る。
因みに、現行のジヤーフアメンターを用いたグルタミ
ン酸の工業生産の例では２日間のバツチ式培養で150〜1
80g/の生産効率を達成している。勿論、基質中の糖濃
度やその他の培養条件も異なるので直接的な比較は出来
ないが、本発明の方式をこのグルタミン酸発酵へ適用さ
せるには、未だ多くの解決すべき培養技術面に於ける問
題が残つている。
ン酸の工業生産の例では２日間のバツチ式培養で150〜1
80g/の生産効率を達成している。勿論、基質中の糖濃
度やその他の培養条件も異なるので直接的な比較は出来
ないが、本発明の方式をこのグルタミン酸発酵へ適用さ
せるには、未だ多くの解決すべき培養技術面に於ける問
題が残つている。
実施例５ ムラサキ（リンスパーマム・エリスロリゾン）の根
（紫根）は、殺菌作用と創傷治癒作用を示す赤紫色のシ
コニン系化合物を含有し、昔から高級染料や医薬品とし
て用いられて来た。本実施例に於いては常法に従つてプ
ロトプラスト法によつてシコニン系化合物を高生産する
ムラサキの細胞培養株を選抜した該選抜株のカルスを、
本発明の装置を用いて培養しシコニンの生産を試みた。
なお本実験は三井石油化学工業（株）生物工学研究所の
藤田康宏氏の研究を参考にして行なつた。
（紫根）は、殺菌作用と創傷治癒作用を示す赤紫色のシ
コニン系化合物を含有し、昔から高級染料や医薬品とし
て用いられて来た。本実施例に於いては常法に従つてプ
ロトプラスト法によつてシコニン系化合物を高生産する
ムラサキの細胞培養株を選抜した該選抜株のカルスを、
本発明の装置を用いて培養しシコニンの生産を試みた。
なお本実験は三井石油化学工業（株）生物工学研究所の
藤田康宏氏の研究を参考にして行なつた。
まず、該選抜株のカルスを前以て大量培養し、その10
g（乾燥重量換算）第３表に示す増殖用培地２を入れ
た本発明の小型試験装置に無菌的に添加し、９日間培養
した。培養温度を25℃とし、液流量を２／分に設定し
エアーは1vvm供給した。増殖培養終了後に増殖培地を除
去し、第３表に示す生産用培地の3/4濃度を２添加し
た。生産培養期間を14日に設定し、その間漸次、生産用
培地をフイードし、生産培養終了時の14日目には、その
濃度が4/3になる様に調整した。本装置の運転条件は増
殖培養と同様にした。カルスの培養期間の合計を23日間
に設定したが、その間のカルスの増加量はカルスの小塊
が不均一で培養基中に分散するために測定出来ず、培養
終了時に乾燥重量を測定した。またカルス中のシコニン
化合物の定量は、常法に従いカルスをCHCl3溶液中で磨
細し、１日暗所にて静置した後、MgSO4を加えて濾過
し、エバポレーターで濃縮した。濃縮液は、KOH溶液で
アルカリにし、622nmで分光分析した。
g（乾燥重量換算）第３表に示す増殖用培地２を入れ
た本発明の小型試験装置に無菌的に添加し、９日間培養
した。培養温度を25℃とし、液流量を２／分に設定し
エアーは1vvm供給した。増殖培養終了後に増殖培地を除
去し、第３表に示す生産用培地の3/4濃度を２添加し
た。生産培養期間を14日に設定し、その間漸次、生産用
培地をフイードし、生産培養終了時の14日目には、その
濃度が4/3になる様に調整した。本装置の運転条件は増
殖培養と同様にした。カルスの培養期間の合計を23日間
に設定したが、その間のカルスの増加量はカルスの小塊
が不均一で培養基中に分散するために測定出来ず、培養
終了時に乾燥重量を測定した。またカルス中のシコニン
化合物の定量は、常法に従いカルスをCHCl3溶液中で磨
細し、１日暗所にて静置した後、MgSO4を加えて濾過
し、エバポレーターで濃縮した。濃縮液は、KOH溶液で
アルカリにし、622nmで分光分析した。
23日間の増殖培養および生産培養の結果、カルスは乾
燥重量で42g/2に増量し、その増加率は仕込細胞重量
の4.2倍に相当した。また、シニコン系化合物収量は5.8
26mg/2に達し、前述の藤田氏の研究結果とほぼ同等の
値を得た。23日間の培養期間中、培養液中にはカルスの
破片の小さな浮遊物は殆んど発生しなかつた。之はカル
スが受ける本装置の撹拌による剪断応力が著しく小さか
つたことを示唆し、本発明の装置は植物の組織培養に適
すると断定出来た。
燥重量で42g/2に増量し、その増加率は仕込細胞重量
の4.2倍に相当した。また、シニコン系化合物収量は5.8
26mg/2に達し、前述の藤田氏の研究結果とほぼ同等の
値を得た。23日間の培養期間中、培養液中にはカルスの
破片の小さな浮遊物は殆んど発生しなかつた。之はカル
スが受ける本装置の撹拌による剪断応力が著しく小さか
つたことを示唆し、本発明の装置は植物の組織培養に適
すると断定出来た。
第１図は本発明の液送ノズルの断面図、第２図Ａは撹拌
槽内に固形物除去フイルターを付帯させた場合、第２図
Ｂは循環パイプに固形物除去フイルターを付帯させた場
合の本発明に成る液流式生化学反応装置の側断面図、第
２図Ｃは同じく平面図、第３図は液流式リアクターの液
流速度と酸素移動速度との関係を示したグラフ、第４図
はジヤーフアメンターに於ける撹拌条件と酸素移動速度
との関係を示したグラフである。 図中 １……培地 ２……担体 ３……ラミナフロー ４……エアー ５……循環ポンプ ６……循環パイプ
槽内に固形物除去フイルターを付帯させた場合、第２図
Ｂは循環パイプに固形物除去フイルターを付帯させた場
合の本発明に成る液流式生化学反応装置の側断面図、第
２図Ｃは同じく平面図、第３図は液流式リアクターの液
流速度と酸素移動速度との関係を示したグラフ、第４図
はジヤーフアメンターに於ける撹拌条件と酸素移動速度
との関係を示したグラフである。 図中 １……培地 ２……担体 ３……ラミナフロー ４……エアー ５……循環ポンプ ６……循環パイプ
Claims (1)
- 【請求項１】管状液流ノズルの管壁に沿つて主流路とは
別に撹拌槽から培養液の一部を取出した液を吹き込む通
路を設け、主流路よりの液体と混合流出させてエゼクタ
ー作用を発揮せしめる如くした液流式生化学反応装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63290161A JP2775161B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | 液流式生化学反応装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63290161A JP2775161B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | 液流式生化学反応装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02138960A JPH02138960A (ja) | 1990-05-28 |
| JP2775161B2 true JP2775161B2 (ja) | 1998-07-16 |
Family
ID=17752551
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63290161A Expired - Lifetime JP2775161B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | 液流式生化学反応装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2775161B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5753110A (en) * | 1995-05-31 | 1998-05-19 | Biomaterial Co., Ltd. | Biochemical reactor of liquid current type, groundwater and wastewater purifying system equipped therewith, and liquid transport-stirring apparatus that employs the transport means used in said reactor and system |
| US5811259A (en) * | 1997-07-29 | 1998-09-22 | Ecomat, Inc. | Biochemical reactor |
| CN100402412C (zh) * | 2002-09-11 | 2008-07-16 | 克雷多实验室 | 材料的高剪切混合和反应方法及装置 |
| JP4804718B2 (ja) * | 2003-04-28 | 2011-11-02 | 富士フイルム株式会社 | 流体混合装置、及び、流体混合システム |
| JP2006121954A (ja) * | 2004-10-28 | 2006-05-18 | Japan Science & Technology Agency | 酵素分解物の製造方法 |
| JP5549209B2 (ja) * | 2009-12-11 | 2014-07-16 | 株式会社Ｉｈｉ | 付着性細胞培養装置 |
| WO2012070459A1 (ja) | 2010-11-24 | 2012-05-31 | 栗田工業株式会社 | 嫌気性処理方法及び装置 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5437231B2 (ja) * | 1972-05-03 | 1979-11-14 | ||
| JPS6333626U (ja) * | 1986-08-20 | 1988-03-04 |
-
1988
- 1988-11-18 JP JP63290161A patent/JP2775161B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02138960A (ja) | 1990-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4978616A (en) | Fluidized cell cultivation process | |
| Buckland et al. | The enzymatic transformation of water‐insoluble reactants in nonaqueous solvents. Conversion of cholesterol to cholest‐4‐ene‐3‐one by a Ncardia sp. | |
| JP4091052B2 (ja) | 遠心発酵プロセス | |
| US4440853A (en) | Microbiological methods using hollow fiber membrane reactor | |
| Jolicoeur et al. | Development of a helical‐ribbon impeller bioreactor for high‐density plant cell suspension culture | |
| AU2018200574A1 (en) | Method for producing compound and compound production system used in said production method | |
| US3769176A (en) | Apparatus and method for microbial fermentation in a zero gravity environment | |
| Okabe et al. | Itaconic acid production in an air-lift bioreactor using a modified draft tube | |
| EP0215820A1 (en) | Fluidized bioreactor and cell cultivation process | |
| US3969190A (en) | Apparatus and method for microbial fermentation in a zero gravity environment | |
| JP2775161B2 (ja) | 液流式生化学反応装置 | |
| Brown et al. | The effect of acid pH on the growth kinetics of Trichoderma viride | |
| JPH0584063A (ja) | 生体触媒により生体的反応を実施する反応装置 | |
| Brauer | Growth of fungi and bacteria in the reciprocating jet bioreactor | |
| US5637496A (en) | Device and method for conveying and separating a suspension with biological cells or micro-organisms | |
| US4713345A (en) | Fermentation methods and apparatus | |
| Gbewonyo et al. | Interactions of cell morphology and transport processes in the lovastatin fermentation | |
| Sato et al. | Animal cell cultivation for production of biological substances with a novel perfusion culture apparatus | |
| Van Wie et al. | A novel continuous centrifugal bioreactor for high‐density cultivation of mammalian and microbial cells | |
| US20050266548A1 (en) | Biocatalyst chamber encapsulation system for bioremediation and fermentation with improved rotor | |
| Arcuri et al. | Continuous production of thienamycin in immobilized cell systems | |
| Fukuda | Immobilized microorganism bioreactors | |
| CN110106139A (zh) | 一种基于Tubespin生物反应器的缩小模型的细胞灌流培养方法 | |
| JPH0347074A (ja) | 乳酸を指標とした動物細胞の培養方法及び装置 | |
| EP0756002A2 (en) | Interface bioreactor system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S303 | Written request for registration of pledge or change of pledge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R316303 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| S303 | Written request for registration of pledge or change of pledge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R316303 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080501 Year of fee payment: 10 |
|
| S803 | Written request for registration of cancellation of provisional registration |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R316803 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090501 Year of fee payment: 11 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| S803 | Written request for registration of cancellation of provisional registration |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R316803 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090501 Year of fee payment: 11 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090501 Year of fee payment: 11 |
|
| S303 | Written request for registration of pledge or change of pledge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R316303 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090501 Year of fee payment: 11 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090501 Year of fee payment: 11 |