JPH0347074A - 乳酸を指標とした動物細胞の培養方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は動物細胞の培養方法に関し、詳しくは乳酸濃度
を制御することにより動物細胞を効率よく培養しうる培
養方法及びそのための装置に関する。

〔従来の技術〕

動物細胞は、遺伝子組換え菌では産生できない蛋白質、
すなわちｔｉ鎖の付加したもの、高分子量のもの及び複
雑な立体構造を有するものなどの蛋白質を産生ずること
ができる。このため動物細胞を培養してこれらの蛋白質
を生産することが注目されており、なかでも動物細胞の
大量培養方法の研究が盛んとなっている。

一般的略こ、動物細胞の世代時間は数十時間であり、微
生物の平均的世代時間数十分に比べてかなり遅く、さら
に−細胞当りの有用物質の産生能が低い。従って有用物
質を効率よく生産するには、細胞を高密度で長期間培養
するのが望ましい。ところで高密度で細胞を培養する際
の技術的課題は、細胞の代謝産物である乳酸やアンモニ
ア等の増殖阻害物質の除去である。乳酸やアンモニアが
細胞の増殖を阻害することは知られており〔キムラタツ
ローら、ジャーナル　オブ　ファーメンチーシラン　チ
クロッジ−１６５巻第３号、　ｐ３４１−３４４（１９
８７））　、これらの増殖阻害物質を除去する方法とし
て、新鮮培地を連続的に供給し同時に使用済培地を抜き
出す潅流培養方法〔特公昭６１−３６９１５号。

特開昭６１−２５７１８１号〕が提案されている。この
潅流培養方法における培地供給及び抜出速度の増減は、
主に増殖速度を指標としており、増殖速度が小さくなら
た時に培地供給及び抜出速度を増加させ増殖阻害物質を
希釈するのが現状であった〔渡嘉敷通之ら、化学工学論
文集、第１４巻第３号。

ｐ３３７−３４１　（１９８８）　）。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術は、増殖阻害物質を培地供給により希釈す
る方法であるため、基質含有培地の経済性の点について
配慮がされておらず、基質含有培地の大量消費による費
用増大の問題があった。

本発明の目的は、基質含有培地の節減をはかりながら、
増殖阻害物質を効率よく低減させ、動物細胞を高密度で
培養しうる方法を提供することにある。

本発明者らは、動物細胞の培養液中に蓄積した乳酸を、
該動物細胞を栄養的に飢餓状態とすることにより該動物
細胞に同化せしめ、乳酸濃度を低下させうろことを見出
し、本発明を完成した。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、動物細胞の培養方法において、培養液中の乳
酸濃度を検知し、乳酸濃度に応じて基質の添加量を調節
することにより、乳酸濃度を設定値以下に調節すること
を特徴とする乳酸を指標とする動物細胞の培養方法であ
る。

また、本発明は培養液中の乳酸濃度を低下させる動物細
胞の培養方法にも係り、動物細胞の培養に際し、該動物
細胞を、一時的に栄養的にｆｉＪｔ峨状態にすることに
より、該動物細胞が分泌する乳酸を該動物細胞に同化せ
しめ培養液中の乳酸濃度を設定値以下に低下させる動物
細胞の培養方法である。

上記培養方法において、動物細胞としては、乳酸を同化
する酵素系の遺伝子を発現しうる細胞を使用することが
でき、乳酸を同化する酵素は心臓型乳酸デヒドロゲナー
ゼであるのが好ましい。

また、動物細胞として肝臓由来の細胞、具体的にはラッ
ト腹水肝癌細胞ＪＴＣ−１株を使用することができる。

上記本発明の培養方法においては、乳酸の設定値は、用
いる動物細胞の種類、培養時の濃度、培地の種類等によ
り変化しうるが、２．５　ｇ／　ｉ以下となるようにす
るのが好ましい。

さらに、本発明は、上記培養方法を実施するための培養
装置に係り、動物細胞の培養槽、乳酸濃度検出装置、基
質を貯留するための基質槽装置、基質を添加するための
流量可変式基質添加装置、前記乳酸濃度検出装置からの
信号に基づいて前記基質添加装置の流量を調節する信号
を出力する比較判断装置を包含することを特徴とする乳
゛酸を指標とした培養装置である。

本発明の培養方法を適用しうる動物細胞としては、乳酸
を同化する酵素系の遺伝子を発現しうる細胞であればい
ずれでもよく、乳酸を同化する酵素系としては、例えば
、心臓型乳酸デヒドロゲナ−ゼが挙げられる。動物細胞
の具体例としては肝臓由来の細胞である、ラット腹水肝
癌細胞ＪＴＣ−１株が挙げられる。

ＪＴＣ−１株はＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ＋２８巻　２号ｐ、１１
５〜１２７　（１９５８）に記載され、日本組織培養学
会の認定株であり容易に入手可能な細胞株である。

本発明を、動物細胞としてラット腹水肝癌細胞−（ＪＴ
Ｃ−１株）を用いた場合について詳細に説明する。

培養液中の乳酸濃度に応して基質の添加量を調節するこ
とにより、乳酸濃度を設定値以下に調節するには、例え
ば、次のようにすればよい。

培養開始後、乳酸濃度が設定値より低い間は、基質の添
加を続け、あるいは基質添加速度を速めてもよく、乳酸
濃度が設定値より高くなった場合は、基質の添加を停止
するか基質添加速度を遅くする。それによって乳酸が細
胞によって同化され、乳酸濃度が低下する。

乳酸濃度の設定値は、動物細胞の種類、濃度、培地の種
類等によっである程度変化するが、一般に２．５　ｇ／
　１以下が好ましい。

第１図にＪＴＣ−１株の培養結果を示す。全容量２００
ｄのタッピングカルチャーフラスコに、ｌＯ％新生仔牛
血清含有ＤＭ−１６０ＡＵ培地（極東製薬工業製）８０
ｄを仕込み、４　Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ　／　ｍｌにな
るように種細胞ＪＴＣ−１株を接種した。攪拌速度は４
００ｒｐｍ、温度は３７°Ｃとしてインキュベーターで
培養した。１．６日目及び３．２日目に培養液を遠心分
１Ｆｉｌｉ（１２００ｒｐｍ。

１０分間）することにより培地を全量交換した。毎日培
養液を２ｄずつサンプリングし、グルコース濃度と乳酸
濃度を酵素センサーで測定し、細胞濃度を血球計数盤で
計数した。その結果、細胞濃度は４日目には４　Ｘ　１
０ｂｃｅｌｌｓ／　Ｉｄとなり良好に増殖した。グルコ
ース濃度は、１．６．２．４．４．１日目に０■／ｌと
なり枯渇したが、その際明らかに乳酸濃度の減少を確認
することができた。

以上の結果より、上記細胞は基質としてのグルコース欠
乏時に明らかに乳酸を同化することが判明した。従って
、乳酸の同化を行わせるには、培養液中の乳酸濃度を検
知し、乳酸濃度が設定値よりも高くなった場合は基質添
加量を減らすか基質添加を止めることが好適である。乳
酸濃度が設定値よりも低下した時点で基質添加量を増加
させるか基質添加を開始させればよい。ここでいう基質
とは、動物細胞の培養において必要な炭素源を指し、グ
ルコース、フラクトース、ガラクトース等が例示される
。基質は固体でも液体でもよく、液体の場合は水や培地
に溶解させた状態でもよい。

次に、本発明の培養装置の一例を、第２゛図を用いて具
体的に説明する。培養槽１内には細胞あるいはマイクロ
キャリアー等へ固定化した細胞が浮遊する培養液２を含
んでおり、モーター３を用いて攪拌羽根４を回転させる
ことで懸濁させている。

酸素供給方式は、上面通気、液中通気、膜通気等いずれ
の方式でもかまわない。基質槽δには、グルコースを溶
解した培地、あるいはグルコース水溶液等を貯留する。

基質含有液を導管１１により培養槽１に供給し、供給量
を流量調節弁６で制御する。培養方式には半回分培養と
連続培養があるが、大量生産には連続培養が望ましく、
濾過法や沈降法を応用した細胞と培養液の分離手段８に
より培養上清を分離し、導管１３により培養上清送液ポ
ンプ９を用いて培養槽外へ培養上清を抜き出している。

培養液２の中の乳酸濃度測定は、酵素センサ、液体クロ
マトグラフィー等いずれを用いてもよく、これらの乳酸
濃度検出手段７を設置して測定する。測定したデータは
比較判断手段１０に入力され、流量調節弁６に出力する
ことにより基質供給量の制御を行う。乳酸がある一定濃
度まで蓄積した時には流量調節弁６で基質含有液供給量
を減少または零にするとともに、培養上清送液ポンプ９
の抜き出し量を減少または零にして乳酸を同化させる。

本発明の培養方法を、有用物質、生産細胞、例えばモノ
クローナル抗体、リンホカインを生産する細胞に用いれ
ば、有用物質を効率よく生産しうる。

〔作　用〕

動物細胞は、増殖阻害物質である乳酸を分泌し、この乳
酸は、細胞がピルビン酸から乳酸を生成する酵素である
乳酸デヒドロゲナーゼを含有しているために生成される
。

本発明では、動物細胞を一時的に栄養的飢餓状態とする
ことにより、乳酸を同化しうるようになることを見出し
、培養液中の乳酸濃度を検知して、乳酸濃度に基づき基
質の添加量を制御するものである。それにより乳酸濃度
を設定値以下とすれば、細胞は乳酸により増殖を阻害さ
れることなく増殖を続け、高密度で長時間の培養が可能
となる。また基質の添加量も節約できるので、動物細胞
の大量培養においてきわめて有利な培養方法である。

〔実施例］ 次に本発明の実施例について具体的に説明するが、本発
明はこれによりなんら限定されるものではない。

実施例１ この実施例においては、細胞が分泌する乳酸を酵素セン
サーにより検知し、培養液中の乳酸濃度が２．５ｇ／ｆ
ｆ以下になるように基質添加量を制御した。培地は、１
０％新生仔牛血清含有ＤＭ−１６０ＡＵ培地（極東製薬
工業製）を用いた。本培地８０Ｉｎｆｌを全容量２００
ｄのタッピングカルチャーフラスコへ仕込み、１．４　
Ｘ　１０ｂｃｅｌｌｓ　／　ｍｌになるように種細胞Ｊ
ＴＣ−１株（ラット腹水肝癌由来）を接種した。攪拌は
４００ｒｐｎ＋、温度は３７°ＣとしＣＯ２インキュベ
ーターで培養した。添加用の基質は１００ｇ／ｊ２のグ
ルコース水溶液を用い、乳酸濃度が２．５ｇ／！、にな
るまで毎日適量を添加した。乳酸濃度が２．５ｇ／βに
なった時点で基質の添加量を減少または中止し、培養を
続けた。毎日、基質添加前後の乳酸濃度、グルコース濃
度を酵素センサーで測定し、細胞濃度を血球計数盤を用
いて計数した。培養結果を第３図に示す、乳酸濃度は５
日目に　２．５ｇ／ｊｌ！となり、細胞濃度は５．５　
Ｘ　１０”ｃｅｌｌｓ／　ｍｌで増殖が停止した。

そこで５日目はグルコース添加量を減少させ、６日目に
はグルコースの添加を中止したところ、乳酸濃度の減少
に伴い細胞濃度の増加を確認できた。

以上の・ことから、培養液中の乳酸濃度を抑えることで
、細胞濃度を増加させることができ、かつ、基質含有培
地の消費量を低減することができた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、動物細胞の培養において、培養液中の
乳酸濃度を抑えることができるので、基質含有培地を節
約しながら、動物細胞を高密度で効率よく培養すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＪＴＣ−１株が乳酸を同化することを示す図、
第２図は培養装置の一例の概略図、第３図は乳酸を指標
としたＪＴＣ−１株の流加培養結果の一例を表わす図で
ある。 １・・・培養槽、２・・・培養液、３・・・モーター　
４・・・攪拌羽根、５・・・基質槽、６・・・流量調節
弁、７・・・乳酸濃度検出手段、８・・・細胞と培養液
の分離手段、９・・・培養上清送液ポンプ、１０・・・
比較判断手段、ＬＬ１２、１３・・・導管。 第１図 乳酸濃度 ｒｍ９／Ｊ〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、動物細胞の培養方法において、培養液中の乳酸濃度
   を検知し、乳酸濃度に応じて基質の添加量を調節するこ
   とにより、乳酸濃度を設定値以下に調節することを特徴
   とする乳酸を指標とする動物細胞の培養方法。 ２、動物細胞の培養方法において、該動物細胞を、一時
   的に栄養的に飢餓状態とすることにより、該動物細胞が
   分泌する乳酸を該動物細胞に同化せしめ培養液中の乳酸
   濃度を設定値以下に低下させることを特徴とする動物細
   胞の培養方法。 ３、動物細胞が乳酸を同化する酵素系の遺伝子を発現す
   る細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の培
   養方法。 ４、乳酸を同化する酵素が心臓型乳酸デヒドロゲナーゼ
   であることを特徴とする請求項３記載の培養方法。 ５、動物細胞が肝臓由来の細胞であることを特徴とする
   請求項１又は２記載の培養方法。６、肝臓由来の細胞が
   ラット腹水肝癌細胞ＪＴＣ−１株であることを特徴とす
   る請求項５記載の培養方法。 ７、乳酸濃度の設定値が２．５ｇ／ｌ以下であることを
   特徴とする請求項１〜６のいずれかの項記載の培養方法
   。 ８、動物細胞の培養槽、前記動物細胞が分泌する乳酸の
   濃度検出装置、前記培養槽に添加する基質を貯留するた
   めの基質槽装置、前記基質を添加するための流量可変式
   基質添加装置、前記乳酸濃度検出装置からの信号に基づ
   いて前記基質添加装置の流量を調節する信号を出力する
   比較判断装置を包含することを特徴とする乳酸を指標と
   した培養装置。