JPH05503848A - 細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞の培養方法 発明の詳細な説明 本発明は、培養細胞に気体栄養素を供給する方法および装置に関し、気体栄養素 は、培地および、マイクロキャリヤーまたは中空繊維の中または上もしくは懸濁 物中にある細胞を含む反応器（リアクター）にバブル状で放出される。

細胞を培養して成長させる方法は数多く知られている。最近までは、これらの方 法のほとんどが、培養条件に関してかなり耐性のある酵母およびバクテリアなど の微生物に関係するものだった。

最近、哺乳動物細胞、植物細胞およびある種の微生物などのより感受性の高い細 胞のための成長方法が発達してきた。

細胞の大規模な培養が、薬学的に重要な生化学物質の製造およびそれ自体最終製 品であるいくつかの細胞を製造するのに適する方法であることがわかった。

重要な生化学物質としては、とりわけ、単クローン抗体、組換え蛋白質、サイト カインなどが挙げられる。ワクチン、人工膵臓および人工肝臓は、最終製品とし て有用な細胞の例である。

細胞培養の観点から二種類の細胞があり、懸濁物中で成長できる細胞および固定 化を要する細胞である。

固定化を要する細胞は表面に付着しないと増殖しないが、ｒ＠１１細胞」には条 件がない。

固定化を要する哺乳動物細胞に対しては、多くの培養方法が記載されており、と りわけ、細胞を、多層繁殖板中か特定の膜上か中空繊維中かマイクロキャリヤー 上に固定する方法が挙げられる。

哺乳動物細胞および他の感受性の高い細胞に対しては、通常、微生物用に記載さ れた方法を大規模な細胞培養に使用する。しかし、酵母やバクテリアと違って、 哺乳動物細胞および植物細胞は、培養培地を攪拌するときや培養培地に気体栄養 素を供給するときに生じるせん断などの機械的な力に対する感受性がかなり高い 。また、固定化を要する細胞自体は多かれ少なかれ、ぜん断力から保護して培養 できるが、同様にせん断に対して感受性が高いかもしれないその生成物はせん断 力から保護されない。さらに、マイクロキャリヤーまたはマイクロキャリヤー上 で成長する固定化を要する細胞もまた、せん断に対して感受性が高いことが多い 。従って、哺乳動物細胞または植物細胞の大規模な細胞培養は、せん断に対して 感受性が高い生化学物質を製造する細胞の大規模な培養またはマイクロキャリヤ ーを使用する培養方法とともに、まだ成功には至っていない。

本発明は、懸濁物中に細胞またはマイクロキャリヤー上の細胞を含む培養培地に 気体栄養素を供給することに関する。そのような培地に気体栄養素を供給する通 常の方法としては、タンク反応器を空気に晒して攪拌して培養する方法および気 体栄養素のバブルカラムを含む反応器で培養する方法がある。

これら二つの方法には、二つの重大な欠点がある。

１）懸濁細胞がそれに対して極めて感受性である上述のせん断力が、これらの方 法を使用するときに生じる比較的大きい液体速度により引き起こされること。

２）非常に体積の大きい気体栄養素画分が液体表面から逃げることにより、泡が 生成すること。その泡の層が細胞またはマイクロキャリヤーを随伴して細胞死を 招くので、消泡剤を培地に加えなければならない。

消泡剤を添加すると細胞の成長が減少するとともに生化学物質の生産が減少し、 またそれ以降の工程を妨げる可能性がある。

さらに、薬品は厳しい純度が要求されるので、消泡剤を別の精製工程で製品から 分離しなければならない。

本発明は、培養培地に気体栄養素を供給するための、上記欠点を有しない方法お よび装置を提供するものである。

本発明は、培養培地および細胞（所望によりマイクロキャリヤーの上または中に ある）を含むバイオリアクターにバブル状の気体栄養素を供給する方法に関し、 流体表面に浸透する前にバブルは実賀的に全部溶解し、気体栄養素のほとんどが 消費される。

攪拌しないバイオリアクターに対しては、本発明に係るバブルの最初の直径が下 記式に一致しなければならないことが数学的に推論できる。

［式中、Ｄ＝気体栄養素の培地における拡散係数（ｍ２／ｓ）ΔＣ＝／＜プルで 飽和された培地における気体栄養素の理論的濃度と培地における気体栄養素の実 際の濃度との差（モル／ｍ３） η＝懸濁物における培地および細胞の粘度（Ｐａ−ｓ）Δρ＝密度の差（ｋｇ／ ｍ３） ｄｂｏ＝バブルの最初の直径（ｍ）］ この数学的推論は、付録Ｔに示す。

本発明方法に従って気体栄養素を培養培地に放出する場合、バブルが表面に到達 しないので泡は生じない。また、ストークスの法則に従って、比較的直径の小さ いバブルがゆっくり上昇するので液体速度は大きくない。

高さが約１ｍの液体カラムを有する典型的なバイオリアクターに対しては、バブ ルの最初の直径が約２００μｍ以下であると計算できる。本発明に係るバブルを 以下、マイクロバブルと言う。

上記は、培地を攪拌するバイオリアクターには当てはまらない。

マイクロバブルは、ストークスの法則による表面への上昇の他に、他の方向へ移 動させる力を受ける。移動する液体の平均速度がマイクロバブルの上昇速度より 大きい場合は、その液体がマイクロバブルを引きすることになる。このことは、 実際に使用できる全てのバイオリアクターに当てはまる。

通常、攪拌の効果は、培地における滞留時間が長くなるということである。これ は、いくつかの観察により説明できる。第一に、表面に到達するバブルは下向き の液体流に引きずられ、従って表面を押し破れないかもしれない。第二に、表面 に到達したバブルは、その表面を押し破るのにいくらか時間が必要である。また 、泡を生じる前に他のノくプルとの合体が必要でさえあるかもしれない。表記の 下に「ぶら下がっている」ときにも、下向きの液体流に引きずられるかもしれな い。

一般に、攪拌を行うと、成るバイオリアクターにおけるマイクロバブルの滞留時 間の方が、攪拌を行わないノくイオリアクターにおけるマイクロバブルの滞留時 間に比べて長くなるので、攪拌を行わない反応器に対する上記の式は、同じ高さ の培地のカラムを有する攪拌付反応器中で泡を生じないマイクロノくプルの「安 全」サイズを見積もるものである。

しかし、明らかなように、攪拌付反応器におけるマイクロノくプルの滞留時間が 攪拌しない反応器においてより長（１場合は、上記式に従って計算されるよりも 大きいマイクロノくプルを選択することができる。

攪拌付バイオリアクターを支配する乱動系におけるマイクロバブルの移動、従っ てその滞留時間に影響を及ぼす）（ラメータはた（さんあるので、マイクロノく プルの最大の大きさを正確１；計算することはできない。

しかし、培地での滞留時間に基づいてバブルの必要な平均の直径を見積もること はできる。

この関係は、数学的に下記のように推定できる。

ｄ＝（１，６ｋ　ΔＣ−ｔ　）／Ｃ，。。

ＩＨＬ　ｔ この数学的推論は、付録［Ｉに示す。

これらのマイクロバブルを作るのに適する方法は、飽和器（サチュレータ−１＋ ａｔｏ＋Ｎｏｒ　）の使用により達成可能である。

飽和器は、培養培地を含む細胞カラム反応器とは別の外側のカラムであり、実際 には細胞を含まない。この中で、培養培地の気体栄養素による飽和が、大気圧よ り高い圧力（例えば、５バール）下で行われる。飽和した培地は、細胞培養反応 器の底に移動し、そこで、圧力が低くなって過飽和になるため、気体栄養素をマ イクロバブルとして放出する。過飽和液体からのマイクロバブルの生成は、Ｐ＋ ＝！７　Ｒ，Ｈ，、Ｇ＋ｕｎ　Ｄ、、１９８ｇ。

Ｐｅｒ！ｌ’ＳＣｈ＋１Ｉｌｉｃ＋ｌ　ＥＢｉｎ＋＋＋＋’　Ｈａｎｄｂｏｏｋ 、　６ｔｈ　＋ｄｉｌｉｏｏ、　ＭｅＧ！１ｔ−Ｈｉｌｌ　Ｂｏｏｋ　ＣＯに記 載されている。今までは、マイクロバブルの生成は、これらのバブルの浮揚挙動 の研究のためのみにおこなわれており、このことは、マイクロ／くプルは表面１ こ上昇することが必然であることを意味する。

好ましい態様では、マイクロノくプルとして培地に放出される気体栄養素は、純 酸素である。

上記の酸素増加方法は、通常の外部からの酸素増加に比べて有利である。という のは、例えば５ノく−ルの加圧下では６＠も多い酸素を培地中に溶解させること ができる。すなわち、酸素の供給を、公知方法よりも少なくとも６倍遅い流速で 、新しく１培地供給内に、または消費速度に応じて再循環ル−プ中で行うことが できる。

本発明に係る方法はまた、固定化を要する細胞の培地に気体栄養素を供給するの にも非常に適している。特に、固定化を要する細胞を担体に付着することにより 懸濁物に保持して成長させる場合、例えば細胞をマイクロキャリヤーに付着させ る場合に適している。

本発明はまた、本発明方法を行うための装置に関する。装置は通常、気体栄養素 を供給するための手段（飽和器など）を備えた反応器を含む。マイクロノくプル を供給するための他の方法も含まれる。細胞の連続培養に対しては、反応器に培 養培地および細胞用の出口を備えてもよい。その出口は分離器に通じ、そこで培 地および細胞が不用の物賀および恐らく最終製品から分離され、共に新しい培地 とともに反応器へ再循環される。

培地は細胞から分離してもよく、また飽和器に送られて気体栄養素の供給を受け てもよい。反応器は攪拌装置を備えてもよいが、これは絶対必要ではない。もち ろん、連続方法では、新しい培地を再循環培地とは別に供給してもよい。本発明 に係る装置を図１に示す。

図１において、反応器（４）は、飽和器（１）で気体栄養素を飽和した培地用の 入口（３）を備えている。反応器にはまた、細胞および培地用の出口（５）があ り、そこから第一分離器（６）で細胞が分離されて反応器に戻される（７）。こ の特定の態様では、次いで培地の一部を飽和器に再循環する（９）が、飽和器に 入る直前に新しい培地（１０）と混合する。ぐ８）では、「使用済」培地を回収 する。

この特定の装置は、連続方法に使用するものである。当業者であれば、本発明の 精神を逸脱することなく、バッチ式で細胞成長を行うための装置を設計すること ができるであろう。

本発明を実施例１および２によりさらに説明する。

実施例１ 図１に記載した装ｆｆ１（ｌｉ容バイオリアクター）で、ＣＨＯ細胞（チャイニ ーズ／％ムスター卵巣細胞；１，８ｘ１０　’０個／Ｉ　）　ヲフイ’ｙ　ａキ ャリヤー（Ｃｙｔｏｄｅｘ　３　）上で培養する。装置には、低せん断速度（１ ００ｒｐｍ）で攪拌する攪拌装置が付いている。

酸素濃度は酸素電極で測定し、記録する。酸素の供給は、５バールの圧力下、飽 和器によって行う。放出する酸素量を所望の値にするには、飽和器を通る流量を 調整する。マイクロキャリヤーは、直径４４μｍの細孔を有するスクリーンフィ ルタにより、飽和器を通る流れからろ過分層した。培養培地は、５％のＦＣＳ　 （子牛の血清）を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む。反応器は、３７℃の温度に保 つ。

実施例２ 図１および実施例１に記載した酸素飽和器を備えた１０１容醗酵器中で、ｒｅｃ 、ｃＨｏ細胞を連続かん流培養により、高密度マクロポーラスマイクロキャリヤ ー（（ｕｌｔ口ｐｈｅｒ　ＧＤ　）中で成長させた。がん流速度は４０１／日で あり、酸素増加のための培地再循環速度は４１７時間だった。定常的な細胞密度 ３・１０１０個／１を２．５力月間維持した。マイクロ１＜プル中の酸素濃度が 高く、かつ恐らくは細胞−マイクロノくプルの衝突により起こる「せん断」の影 響があるにもかかわらず、マイクロバブルの存在下では、細胞を長期培養しても 、細胞成長および物質の生成速度に関して無害であることがわかった。

マイクロキャリヤー沈澱器を醗酵器の内部に置いてマイクロキャリヤーのない培 地を得、飽和器を通る再循環流に供した。

沈澱器の静止ゾーンの高さは１２ｃｍだった。

５０％空気飽和の溶解酸素テンションでの培養では、混合培養部分（２０Ｏｒｐ ｍ）および静止沈澱部分の両方とも泡の生成は観察されなかった。明らかに、マ イクロバブルは流体表面に達する前に溶解する。

８０％空気飽和の溶解酸素テンションでの培養では、沈澱器に泡の生成が観察さ れたが、混合部分では観察されなかった。

明らかに、マイクロバブルは、それが完全に溶解し、消費されるまで攪拌により 懸濁物に保持するのに充分小さかった。しかし、これらの条件下では沈澱器での 滞留時間が短すぎたのでマイクロバブルの溶解が不完全であり、バブルの流体表 面の透過が泡の生成として観察された。

その結果から以下のことがわかる。

１、マイクロバブルによる長期間の酸素増加は有効であり、細胞成長および物質 生成に対して有害ではない。

２、静止培養に適するバブルの直径は、他の条件が同等である混合培養において も適すると考えられる。

結果 酸素濃度は、所望の値（＝０．１ｍＭ）の１０％以内に調整できた。５％のＦＣ Ｓが存在するにもかかわらず、泡の生成はなく、マイクロバブルは全て、表面に 達する前に溶解し、消！仮定 １）液相物質移動係数は５ｈ＝２による。これは、淀んでいる流体における球状 バブルに対して有効である。従って、バブルの溶解に必要な時間の安全値を示す 。

２）Ｃ０゜１は高さに依存しない。

３）ΔＣは高さに依存しない。液体は理想的に混合され、圧力勾配は考慮しない 。

４〕バブルは、液体カラムの高さの８０％のところで溶解する。

５）バブルは、ストークスの法則により計算される速度で、剛球として上昇する 。

記号 ｓｈ　＝シャーラブド数（−）＝ｋ　−ｄ　／Ｄｂ Ｃ＝気体のモル濃度（モル／ｍ３） ｍｏｌ ΔＣ＝物質移動の推進力、すなわち、バブル付近の気体成分濃度とバルク濃度と の差（モル／ｍ３）Φ　＝モル流量（モル／　ｓ　） ｋ、＝物質移動係数（ｍ／　Ｓ　） Ｄ　＝拡散係数（ｍ２／３） ｄｂ　＝バブル直径（ｍ） Ａ　＝バブル面積（ｍ２） ｔ　＝時間（ｓ） ■　＝速度（ｍ／　Ｓ　） ｇ　＝重力加速度（ｍ／ｓ２） η　＝粘度（Ｐａ−５） Δρ　＝液体と気体の密度差（ｋｇ／ｍ３）−個のバブルについての物質移動方 程式はΦ　＝ｋ　−Ａ拳ΔＣであり、５ｈ＝２→ｋＬ＝２Ｄ／ｄｂｔｉ　Ｌ および　Ａ＝π・ｄ　２と仮定すると、Φ　＝２πＤｄｂΔＣとなる。

■ −ｍのバブルについての物質バランスは、ｄ　（Ｖｂ−Ｃ１ｎ０．）／ｄｔ＝− Φ。

であり、従って、Ｖ　＝（π／６）ｄｂ　を用いると、ｄ（ｄ　）／ｄｔ＝−４ ＤΔＣ／Ｃ，。ｌ　ｄｂとなり、積分・ となる。式（１）から、全溶解時間は次のようになる。

ｄ　→０神ｔ　＝（Ｃｄ　）／８ＤΔＣ（ｌｂ）ｂ　ｄｉ＋　ｍｏｌ　ｂｅ ストークスの法則により、−個のバブルの上昇速度は次のようになる。

ｖ　（ｄ　）　＝　（ｄｂ　ｇ　”Δρ）／１８η平均速度は、次のように定義 される。

（２）および（１ａ）から、ｖ　（ｔ）は次のよう（こなる。

従って、平均速度は、 となり、（５）および（１ｂ）から、次のよう１こなる。

テ＝ｇ・Δρｄｂｔｉ″／３６η バブルは表面に達する前に溶解しなければならな−）ので、ｔｄｉｉ　〈ｔ’で ある。

ｔ、、＝０．８ｔ　とすると、（１ｂ）および（７）から、６＋１ Ｃｄ　／８ＤΔＣ＝０．８ｘ　（３６Ｈ，・ｒｉ／ｍａｔ　ｂｏ ｄｇ　・　Δρ） Ｇ となる。すなわち、 の場合は、ｄｂｏ＝１８０μｍと計算できる。

最初のバブルの大きさを見積もるもう一つの方法は次の通り一個のバブルの物質 移動方程式は Φ　＝ｋ　Ｌ　−Ａ　−Δ　Ｃ（１） であり、ｋＬが直径８００μｍ未満のバブルに対して一定であると仮定する。

一個のバブルについての物質バランスは、ｄ　（Ｖ、・Ｃｍｏｌ　）／ｄｔ＝− Φ、　（２）であり、方程式（１）および（２）、ならびにＡ＝π、２、ｄ　（ ｄ、）＝−（２に、Δｃ／ｃｌｌ。、　）　ｄｔ　（３）となる。ｔ＝Ｑに対す る境界条件をｄ　＝ｄ、ｏとして積分すると、 ｄ　＝ｄ　ｂ　Ｏ＝（２ｋ　Ｌ　ΔＣ／Ｃ，。、）ｔ　（４）となり、全溶解時 間（ｄ、＝０）は次の通りである。

ｔ　＝ｄ　φＣ／２ｋＬ　−ΔＣ ６，８、。　。。１　（５） ストークスの法則により、−個のバブルの上昇速度は次のようになる。

ｖ（ｄ　）”（ｄ　２ｇ”Δρ）／１８η　（８）ｂ　ｂ 平均速度は、次のように定義される。

方程式（６）および（４）から、ｖ　（ｔ）は次のようになる。

の場合は、バブルの最初の最大直径はｄ、。２２４０μｍと計算バブルが静的培 養の８０％の高さで溶解しなくてはならないと仮定すると、バブルの最初の直径 は、０．８　Ｈ＝ｖ−ｔ　ｄｌ、　（Ｌ　Ｑ　）から計算でき、 方程式（９）および（５）を挿入すると、−＝”−’−”　−”−”゛−−−　 −ｏｇ　−要　約 本発明は、培養細胞に気体栄養素を供給するための方法および装置に関し、該栄 養素はマイクロバブル状で放出し、その大きさは、バブルが培養培地表面に達す る前にそのほとんどが溶解し、清貧されるように選択する。好ましくは、マイク ロバブルを飽和器で作る。

国際調査報告 国際調査報告 ＥＰ　９１００００１ Ｓ＾　４３６７９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも一部を培地で満たしたバイオリアクター中の細胞に、気体栄養素 をバブル状で供給する方法において、バブルの滞留時間が培地中でのその溶解時 間に等しいことを特徴とする方法。 ２．培地を撹拌しないこと、及びバブルがバイオリアクター中の培地カラムの高 さの最大８０〜９５％で溶解することを特徴とする請求項■に記載の方法。 ３．バブルの最初の直径（ｄｂ）が下記式に一致することを特徴とする請求項２ に記載の方法。 ｄ＝４√２３０・ＤΔＣＨ．η／ｇΔρＣｍｏｌ［式中、Ｄ＝抜散係数（ｍ２／ ｓ） ΔＣ＝物質移動の推進力、すなわち、バブル付近の気体成分濃度とバルク濃度と の差（そル／ｍ３）η＝粘度（Ｐａ・ｓ） Δρ＝媒体の密度−気体バブルの密度（ｋｇ／ｍ３）Ｃｍｏｌ＝気体のモル濃度 （モル／ｍ３）Ｈｒ＝リアクターの液体カラムの高さ（ｍ）］４．液体カラムの 高さが１ｍであり、バブルの最初の直径が２５０μｍ以下であることを特徴とす る請求項２または３に記載の方法。 ５．培地を撹拌すること、及びバブルの最初の直径が下記式に一致することを特 徴とする請求項１に記載の方法。 ｄｂｏ＝１．６ｋＬ・ΔＣ・ｔｌ／Ｃｍｏｌ［式中、ｋＬ＝物質移動係数（ｍ／ ｓ）ΔＣ＝物質移動の推進力、すなわち、バブル付近の気体成分濃度とバルク濃 度との差（モル／ｍ３）Ｃｍｏｌ＝気体のモル濃度（モル／ｍ３）ｔｒ＝滞留時 間］ ６．バブルの最初の直径が３００μｍ以下であることを特徴とする請求項５に記 載の方法。