JP2016002040A - 細胞培養方法、及び細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】培養液の液面に泡沫が形成されてしまうことによる問題や、気泡の破泡による衝撃、培養液中を気泡が浮上する際の乱流によるせん断応力の発生などの問題を解決しつつ、培養液中に十分な量の酸素を効率よく供給して、細胞の培養に好適な条件を維持することができる細胞培養方法、及びそのような方法を好適に実施することができる細胞培養装置を提供する。【解決手段】培養の対象となる細胞とともに、この細胞を培養するために調製された培養液２を貯えた培養槽３で細胞培養を行うにあたり、培養槽３に貯えられた培養液２を槽外に取り出して、培養槽３に戻す循環系４において、酸素ガスを培養液２にナノバブルとして含ませる。【選択図】 図１

Description

本発明は、培養液中に十分な量の酸素を効率よく供給して、細胞の培養に好適な条件を維持することができる細胞培養方法、及び細胞培養装置に関する。

近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められており、種々の細胞培養装置が知られている。そして、このような細胞培養装置の処理能力を高めるために装置を大型化する場合にあっては、大量に使用される培養液に、培養される細胞が呼吸するのに充分な量の酸素を供給して、細胞の培養に好適な条件を維持する必要がある（例えば、特許文献１，２参照）。

特開２０１１−８３２６３号公報 特開２００８−１８２８９９号公報

ところで、培養液に酸素を供給する方法としては、培養液中に空気や酸素ガスを通気させることが考えられるが、通気によって培養液中に気泡が生じてしまうと、例えば、気泡が液面に残留して形成される泡沫内に細胞が取り込まれて、培養液からの栄養分や水分が途絶えて壊死してしまったり、気泡が破泡する際の衝撃や、培養液中を気泡が浮上する際の乱流によるせん断応力などが作用して細胞が破壊されてしまったりする。

特許文献１，２は、このような問題を解決するためのものであり、特許文献１では、調製槽に貯留した培養液に酸素ガスを溶解させてから、かかる培養液を培養槽内に供給して細胞培養を行うようにして、培養槽内での気泡の発生を抑制している。
しかしながら、このような特許文献１の技術にあっては、培養液を調製槽に貯留している間に、酸素ガスによって培養液が酸化してしまうのを防ぐために、培養液を酸化しやすい成分を含む培地と酸化しにくい成分を含む培地とに分けて別々の調製槽に貯留した上で、酸化しにくい成分を含む培地に酸素ガスを溶解するという煩雑な作業を要し、そのための装置も必要になってくるという問題がある。

また、特許文献２では、二つの散気手段を備え、一方の散気手段から気泡を供給するとともに、これよりも大径の気泡を他方の散気手段から供給するようにしており、これによって、一方の散気手段から供給された気泡によって液面に形成される飛沫を、他方の散気手段から供給された大径の気泡が破泡する際の衝撃によって除去するというものである。したがって、引用文献２の技術にあっては、液面に形成された泡沫内に培養細胞が取り込まれて壊死してしまうという問題は解決できるものの、気泡が破泡する際の衝撃などによって細胞が破壊されてしまうという問題を解決するには至っていない。

本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、培養液の液面に泡沫が形成されてしまうことによる問題や、気泡の破泡による衝撃、培養液中を気泡が浮上する際の乱流によるせん断応力の発生などの問題を解決しつつ、培養液中に十分な量の酸素を効率よく供給して、細胞の培養に好適な条件を維持することができる細胞培養方法、及びそのような方法を好適に実施することができる細胞培養装置の提供を目的とする。

本発明に係る細胞培養方法は、培養細胞とともに培養液を貯えた培養槽で細胞培養を行う細胞培養方法であって、前記培養槽に貯えられた培養液を槽外に取り出して、前記培養槽に戻す循環系において、前記培養液に酸素ガスをナノバブルとして含ませる方法としてある。

また、本発明に係る細胞培養装置は、培養細胞とともに培養液を貯えて細胞培養を行う培養槽と、前記培養槽内に蓄えられた前記培養液を循環させる循環系と、前記循環系の経路内に設けられたナノバブル生成機とを備え、前記ナノバブル生成機に送られた前記培養液に、酸素ガスをナノバブルとして含ませる構成としてある。

本発明によれば、培養液中に十分な量の酸素を効率よく供給して、細胞の培養に好適な条件を維持するにあたり、培養液の液面における泡沫の形成、気泡の破泡による衝撃、培養液中を気泡が浮上する際の乱流によるせん断応力の発生などを抑制しつつ、細胞の増殖を促進することができる。

本発明の実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す説明図である。

以下、本発明に係る細胞培養方法、及び細胞培養装置の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
なお、図１は、本実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す説明図であり、本実施形態に係る細胞培養方法は、このような装置を好適に用いて実施することができる。

本実施形態において、細胞培養装置１は、培養の対象となる細胞（培養細胞）とともに、この細胞を培養するために調製された培養液（液状に調製された培地）２を貯えて細胞培養を行う培養槽３と、培養槽３内の培養液２を循環させる循環系４と、循環系４の経路内に設けられたナノバブル生成機５とを備えている。

培養槽３の形状、大きさなど、その具体的な形態は特に限定されないが、工業的規模で大量の細胞を効率良く培養することができるように、例えば、２０〜２，０００Ｌ程度の容量とすることができる。

また、図示する例において、培養槽３の上部には、槽内の滅菌状態を維持しつつ、培養の過程で細胞の呼吸によって発生した二酸化炭素を排出するなどするための吸排気弁６が設けられており、培養槽３の底部には、培養を終えて細胞が一定以上に増殖された内容液を排出するための排液弁７が設けられている。さらに、培養槽３の内部には、培養液２の成分や培養細胞などを均一に分散させるための撹拌翼８を設けることもできる。

また、培養槽３は、例えば、ステンレスなどからなる金属製の容器として形成することができる。特に図示しないが、金属製の外容器に、合成樹脂製のフィルム材を製袋するなどして形成された内容器を収容するようにして、内容器に培養液２を貯えて細胞培養を行うようにしてもよい。このようにすることで、内容器ごと培養液２を取り換えて細胞培養を行うようにして、繰り返し細胞培養を行う際の滅菌処理などの手間を軽減することができる。さらに、培養槽３は、合成樹脂製のフィルム材を製袋するなどして形成されたバッグ状の容器単体により構成してもよい。

また、培養槽３には、培養槽３内の培養液２を循環させる循環系４が接続されている。循環系４は、培養の過程で細胞の呼吸によって酸素が消費された培養液２を培養槽３から取り出して、かかる培養液２に酸素を含ませてから培養槽３内に戻すことによって、培養槽３内の培養液２が十分な量の酸素を含んだ状態に維持されるように培養液２を循環させるためのものである。

なお、培養液２の循環は継続的に行うようにしてもよく、例えば、培養液２中の溶存酸素量が減少して細胞の培養に適さない状態となったときなどに、必要に応じて断続的に行うようにしてもよい。

本実施形態において、循環系４は、培養液２の水面側に位置するように培養槽３に設けられた流出口９と、培養槽３の底部に設けられた流入口１０とに接続される。培養槽３に設けられた流出口９と流入口１０には、培養槽３内で培養している細胞が槽外に流出するのを防止するために、必要に応じて、図示しないフィルターや逆止弁などを介して循環系４が接続される。

また、循環系４の経路内には、ナノバブル生成機５が設けられている。ナノバブル生成機５は、酸素ガスボンベ１１を含み、酸素ガスをナノバブルとして培養液２に含ませるためのものである。培養槽３から取り出されて循環系４に流出した培養液２は、循環系４に取り付けられたポンプ１２によって、ナノバブル生成機５に送られる。そして、酸素ガスをナノバブルとして含ませた培養液２が培養槽３に戻される。

ナノバブルとは、気泡径がナノメートルオーダー（数ｎｍ〜数百ｎｍ）の微細な気泡をいい、培養槽３内に貯えられている培養液２の深さや、培養液２の粘性などを考慮して、ナノバブルを含ませた培養液２が培養槽３に流入すると、好ましくは０．１〜３ｃｍ／分、より好ましくは０．１〜１ｃｍ／分の速度で浮上して、培養液２の液面２ａに達するまでに、当該ナノバブルを形成する酸素ガスが培養液２に溶解して気泡径が小さくなりながら消失するように、その気泡径を適宜調整する。

また、ナノバブルが培養液２内を浮上していく過程で、培養細胞に接触したナノバブルは、培養細胞の呼吸により当該ナノバブルを形成する酸素ガスが消費されることによっても気泡径が小さくなっていく。ナノバブルの気泡径は、このことも考慮して適宜調整することができる。

このように、本実施形態によれば、酸素ガスをナノバブルとして培養液２に含ませているので、培養液２の液面２ａにおける泡沫の形成、気泡の破泡による衝撃、培養液２中を気泡が浮上する際の乱流によるせん断応力の発生などを抑制しつつ、培養液２中に十分な量の酸素を効率よく供給することができる。したがって、液面２ａに形成された泡沫内に培養細胞が取り込まれて壊死してしまうという問題や、気泡が破泡する際の衝撃、気泡が浮上する際の乱流によるせん断応力などによって細胞が破壊されてしまうという問題を解決して、細胞の培養に好適な条件を維持した状態で細胞の増殖を促進することができる。

このようなナノバブルは、例えば、酸素ガスを通気した培養液２に高速の旋回流を与えることで、せん断力により酸素ガスを微細化したり、培養液２中に多孔質部材を介してバブリングして酸素ガスを微細化したりすることによって生成することができる。

さらに、本実施形態では、ナノバブルの生成を培養槽３の外部で行い、培養槽３に貯えられた培養液２を槽外に取り出して、培養槽３に戻す循環系４において、酸素ガスを培養液２にナノバブルとして含ませるので、ナノバブルの生成に伴う細胞への影響をなくすこともできる。
循環系４において酸素ガスをナノバブルとして含ませた培養液２を培養槽３に戻す際に、その流速は０．１〜３Ｌ／分とするのが好ましく、より好ましくは０．１〜１Ｌ／分である。これにより、培養槽３内の培養液２にせん断力が作用しないようにすることで、せん断力による細胞の破壊をより効果的に抑止することも可能である。

以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。

本発明は、培養液中に十分な量の酸素を効率よく供給して、細胞の培養に好適な条件を維持しつつ、種々の細胞を培養するのに好適な技術として利用することができる。

１ 細胞培養装置
２ 培養液
３ 培養槽
４ 循環系
５ ナノバブル生成機

Claims (4)

1. 培養細胞とともに培養液を貯えた培養槽で細胞培養を行う細胞培養方法であって、
   前記培養槽に貯えられた培養液を槽外に取り出して、前記培養槽に戻す循環系において、前記培養液に酸素ガスをナノバブルとして含ませることを特徴とする細胞培養方法。
2. 前記酸素ガスをナノバブルとして含ませた培養液が前記培養槽に流入すると、当該ナノバブルが０．１〜３ｃｍ／分の速度で浮上する請求項１に記載の細胞培養方法。
3. 前記酸素ガスをナノバブルとして含ませた培養液を前記培養槽に戻す際の流速を０．１〜３Ｌ／分とする請求項１又は２に記載の細胞培養方法。
4. 培養細胞とともに培養液を貯えて細胞培養を行う培養槽と、
   前記培養槽内に蓄えられた前記培養液を循環させる循環系と、
   前記循環系の経路内に設けられたナノバブル生成機と
   を備え、
   前記ナノバブル生成機に送られた前記培養液に、酸素ガスをナノバブルとして含ませることを特徴とする細胞培養装置。

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