JPS58155092A - 細胞触媒及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、種々の酵素活性を有する固定化された微生
物の原核細胞、及び真核細胞、並びに植物細胞に基礎を
鎗〈生物変換用細胞触媒に関する。

この発明の細胞生物触媒は、工業的生物変換に使用する
ことができ、これによ）薬品工業、食品工業及び農業に
おいて重要な化合物の非連続的又は連続的型式による生
産が可能になる。

一般に、細胞を固定化する会知方法には、物理的方法、
物理化学的方法及び化学的方法があプ、細胞と担体との
結合は細胞をチル中に包埋する仁とによシ機械的に、フ
ァン・チル・ワールス（ｖａｎ　ｄｎｖ　Ｗａｌｌｍ　
）力によプ、又は極性作用もしくは共有結合により行わ
れる・改良された水力学的性質、沈降性及び固定化細胞
の分離性を有し、そして要求される酵素活性の安定性を
助長する種種の水不溶性合成又は天然の有機又は無機担
体が一般に使用される０、これら以外の細胞固定化方法
、その利点及び欠点、並びにその経済的限界について、
例えばパンダンメ（Ｖａｍｄａｎｍｅ　）　（Ｃｈｅｗ
。

１１１（１，，４２４，１０７２，１９７６年）、アー
ット（五ｂｕｔｔ　）　（Ｉｎ　：Ａｄｖａｎｃｅｓ　
Ａｐｐｌ、　Ｍｉｅｒｏｂｌｏｌ、ｓＤ、Ｐ＠ｒ１ｍｍ
ｕ　＊　２　Ｇ　ｍ　２０３　＊ムｓａｄ、　Ｐｒ＠ｓ
ｓ　＃　ニューヨーク、サンフランシスコ、ロンドン、
１９７６年）、ジャ、り（Ｊａｃｋ）及びデジツク（Ｚ
ａｊｉｓ）（Ａｄｖａｎｃｅｓ　　Ｂｉ＠＠ｈ＠ｍ、Ｅ
ｎｇ、５　＊　　１２８　　ｅ　　１９７７年）、ドウ
ランＩＰ　（Ｄｕｙａｍｄ　）及びナパロ（Ｎａｖａｒ
ｒｏ　）（Ｆｒｅ＠、Ｂｌ＠＠ｈ＠ｍ、＊　１３　ｅ　
４９　ｅ１４．１９７８年）、差びに一ジチセク（Ｖｏ
ｊｔｉｓ＠＠）等（ＩＩｉ＊ｌｏｇｉｓｋｅ　１ｉｓｔ
ｙ　ａ　４４　ｍ１９２．１９７９年）に総説されてい
る。

細胞の＊ｌ珊的固定化方法は、例えばチ！コスロパキア
ー籍許栗１１３，９０８号（寒天）、イタリア国特許第
８３６，４６２号（トリア七テートセルロース稙ｍ）、
米国特許第３，７９１．９２６号及びソ連国特許第６５
９，６１１号（アクリルアミドとメテレンーピスーアク
リルアゼドとのラジカル重合体中に細胞を包埋する方法
）に記載されている。現在、細胞の化学的同定化法に関
する１０件の特許が知られている・これらの方法におい
ては、例えば、共有結合のために檻々の合成重合体父性
天然重合体が、予備的な化学変性及び種々の薬剤による
活性化の後に使用される。多くの合成有機材料又は天然
材料、不活性又は化学的に活性な重合体、例えばメタク
リルアルデヒド、グリシジルメークリレート、ヒドロキ
シアルキルメタクリレート、天然重合体、例えばセルロ
ース及びその−導体、コラ−ダン、ゼラチン、無機材料
、例えばｆラス、チタン、ジルコニウム及びバナジウム
化合物が担体として使用される。

この種の担体は、細胞と結合した場合、低い比活性を供
し、そして得られた粒子は摩擦ＶＣ対する機械的耐性が
弱く、高価であシ、そして、その価格、入手可能性、並
びに、しばしば非常に攻撃的薬剤及び毒性薬剤を用いる
種々の化学的変性及び活性化の技法のために、固定化細
胞の製造及び工業的利用が限定される。

チ、コスロパキア発明者証＠１９７，１０１号には、細
胞結合技法の開発及びその゛工業的重要性について記載
されている。この方法は、ペニシリンアシラーゼ活性を
有する生細胞を種々の生物の細胞性担体と結合せしめる
ことから成る。未処理の及び／又は物理的、化学的又は
生化学的に処理した細胞、又はこれらの不溶性断片が担
体とし七使用される。化学的方法には、２個以上の第−
及び／又は第ニアミノ基を有する凝集剤によりあらかじ
め物理化学的に凝集せしめ良後、多官能価剤、特にグル
タルアルデヒドを用いて共有結合を生じさせるという方
法が含まれる。この固定化法においては、種々の＠酵の
後に得られる廃細胞、その破砕混合物、又は廃細胞塊を
使用することかで愈、しかもこれらの価格は通常無視す
ることができ又は零であるから、経済的限界は回避され
る。これ以外の、担体を使用しないさらに有利な化学的
細胞結合法が、チェコスロバキア国発明者証第２０３．
６０７号に記載されておプ、そして、担体を用いないで
種々の酵素活性を有する微生物原核細胞及び真核細胞を
相互に固定化するための一般的方法がチェコスロバキア
１発明者証第２０９，１６５号に記載されている。この
明細書に引用し良方法により、所望の酵素活性を有する
種々の微生物の共有結合によ）相互に架橋せしめた細胞
の非常に安定な生成物を、良好な沈降性を有する一体に
形成した粒子単位として得ることができる。原理的には
、この方法は、未処理細胞を二富能価架橋剤、特にグル
タルアルデヒドと化学的に反応せしめることによ）個々
の細胞の細胞内成分を共有結合により架橋し、そして、
これらの細胞の自然的又は人為的自己消化に対する耐性
を生じさせることから成る。次に、架橋細胞を物理的処
理、物理化学的処理又は化学的処理を単独で又は組合わ
せて施すことによ〕誼細胞に透過性を付与し、グルタル
アルデヒドと反応しない細胞表面構造の一部分を構成す
る高分子物質、ＩＩＩＫ脂質を放出することにより架橋
細胞の拡散障壁を喪失せしめる。最終段階として、反応
中に細胞が相互接触するのに都合のよめ条件例えば凍結
、遠心力、−過圧等の条件下で、２個以上の第−及び／
又は纂ニアきノ基を含有する共反応水溶性化合物、すな
わちＩリエチレンイ電ン及びヘキサメチレンジアミンの
混合物中で、遊離架橋剤、％にグルタルアルデヒドの存
在下で架橋し、そして透過性を付与したａｍを相互に共
有結合せしめる。

上に引用した同定化細胞製造方法によりすでに細胞生物
触媒を十分に経済的な形で製造することが可能となった
。しかしながら、低分子の攻撃的架橋剤の分子、例えば
グルタルアルデヒドが非常に低１ｉｌＩ蜜であっても容
易に細胞内に入る九めに、細胞中に存在する幾つかの酵
素は急速、且つ不可逆的に不活性化し、このために幾つ
かめ感受性酵素の活性が大きく低下し、上に引用した方
法は普遍的に使用できるもので杜ない、上記のような不
活性化は、おそらく、共有結合架橋の生成と、それに続
く酵素の活性部位の不可逆的な変形によって生ずるもの
と予想される。このことは％特にラセマーゼ活性及びリ
アーヤ活性を有する細胞において実験的に示されている
。

上記の欠点は、酵素活性を有する未処理細胞もしくは場
合によっては前もって透過性付与処理を施した細胞、も
しくはこれらの細烏の断片及びこれらの細胞の細胞内顆
粒；及び／又は未処理細胞と細胞断片、細胞内顆粒及び
ａｌｌｌｌ溶出成分との混合物；及び／又は個々の細胞
について架橋処理及び透過性型付与処理を施した細胞を
、２１１以上の第−及び／又は第ニアミノ基を有する水
溶性化合物、例えばポリエチレンイ２ン、ヘキサメチレ
ンジアミン、リジン及び４リリゾンと二富能価アルデヒ
ド、例えばダルタルアルデヒｙと反りせしめることによ
り生成する水溶性灰石性重合体により化学的に固定化し
、場合によってはさらに、該固定化物を透過性付与処理
しセして／又は機械的に硬化せしめることによシ得られ
るこの発明の細胞触媒を使用することによシ回避するこ
とができる。

この触媒には、細胞成分として、原核生物の細胞又は真
核生物の細胞、すなわち、グラム陽性細菌、ダラム陰性
細−及びグラム・うぜ−ル繍麿、抗酸菌、鞄線曹、酵母
、並びに糸状−のごとき他の顕微鏡的生物、並びに高等
な、すなわち寄生生物、並びに植物細胞、あるいは又、
さらにはこれらの細胞の断片及び細胞内顆粒であって、
酵素活性、すなわちヒトロラー髪、インメラーヤ、リア
ーぜ、脱炭酸酵素、酸化−還元酵素及び他の活性代謝、
ＳＶａ系、ホルモンの変換、及びアルカロイド、ソラン
アルカロイド（５ｅｌａｎ＊　ａｌｋｍｉｏ１４ｇ）、
シトステＥ２−ｋ　（ｐｈｙｔＯ＠を囃ｒｏ１ｍ　）及
び４１に麦負アルカロイドの生産を触媒する酵素系の全
部又は一部分の酵素の活性を有するものを含有せしめる
ことができる。

上記の触媒の製造方法を提供することがこの発明の目的
であり、この方法は、細胞性材料を、２１ｖＡ以上の第
−及び／又は第ニアミノ基を含有する水浴性化合物、例
えばポリエチレンイ建ンとこ官能ｆ曲アルデヒド、例え
ばグルタルアルデヒドトｔ−１Ｏ℃〜５０℃にて、水中
で、ＰＨ４，０〜１２．０の範囲において反応せしめる
ことによって得られる水溶性、且つ化学的に活性な重合
体と混合し、ナして該細＠成分と上記の重合体とを、水
性環境中−３０℃〜５０℃において、−５，０〜９．０
の範囲において、そして場合によっては凝集剤の存在下
で反応せしめ、これによシ形成された細胞固定化物又は
凝集体を反応混合物から分離し、水又は緩衝液で洗浄し
、そして場合によっては透過性付与処理及び／又は機械
的硬化処理を行うととによ多細胞成分を固定化すること
ができるという事実に基礎を置いている。

水溶性重合体の調製及び細胞性材料の前凝集のためには
、分子量１００，０００〜８００，０００の範囲内の水
溶性４リエチレンイきンが有用である。

細胞性材料と重合体との反応は、０−４５℃において、
１〜５０．０００１の相対遠心力下又は０〜５０．００
０ＫＰａＯｐ過圧下において、反応混合物を静置し、ゆ
り〈）混合し又は間欠的に混合しながら行うのが好まし
い。

固定化前の未処理細胞又は固定化後の細胞凝集体に対す
る透過性付与処理は、水性環境下、０〜７０℃、ｐＨ４
，０〜９．０において、界面活性痢及び／又は水混和性
もしくは非混和性有機溶剤、例えばアセトン、エーテル
、イソゾロ／ｌノール、石油エーテル、酢酸ブチル、ク
ロロホルム、ジオキサン、ジメチルホルムアンド又はり
メチルスルホキシドの存在下で、そして場合によっては
強酸及び／又は塩基の塩管加えることにより一時に又は
逐次にイオン強度を変化せしめながら細胞懸濁液を混合
することにより行う。

固定化し丸線脂粒子は、有機溶剤、好ましくはアセトン
により、又は場合によっては有機溶剤中もしくは有機溶
剤と水との混合物中接着剤溶液により−２０Ｃ〜２５Ｃ
にて処理して部分脱水することにエリさらに硬化せしめ
ることができ、こうして得皮固定化物はさらに一取し、
そして乾燥環１１境又は湿潤環境中で部分乾燥し、場合
によってはさらに後成形することができる。

この発明の利点は、化学的に反応性Ｏ水溶性化合物（以
下８８Ｐと略す）ｖｃよシ、高い比活性、良好な沈降性
を有する固定化細胞触媒を、高い固定１５化収率をもっ
て製造することができ、又、低分子架橋剤を使用する方
法と異な９、この発明に従って調製し九ＲＩＩＰは細胞
内に透過で龜ない程直に高分子であるので細胞表面と活
性化ＲＡＰの反応性アルデヒド基との間でのみ共有結合
（固定化）が生２０ｆｂので、チェコスロバキア発明者
証第１９７，１０１号、第２０３，６０７号及び１Ｉ２
０９，２６５号の方法を適用することができない高感受
性酵素に適用する仁とができる点にある。

化学的に活性な水溶性重合体の形成機構、例えばポリエ
チレンイ書ンと二官能価架橋剤すなわちグルタルアルデ
ヒドとの機構は、ダルタルアルデヒドの末端アルデヒド
基と４リエチレンイミンの第−又は第ニアミノ基との間
の着色シッフ塩基（Ｃ−Ｎ結合）ｔ−優先的に生成せし
めるポリエチレンイオン部分の内部架橋反応であって、
分枝した、及びおそらくポリエチレンイミン鎖の末端に
も含まれている幾つかの第−又は第ニアミノ基の同時的
化学的活性化と共にポリエチレンイオン部分の分子量が
増加する反応であると考えることができる。

こうして生成した架橋された、化学的に活性な重合体は
なお水性溶液に可溶性でＴｏ９、このＲ８Ｐ溶液は透明
で黄褐色〜赤褐色の液体である。

一般に、この発明の方法は２つの技術的操作から成りて
いるｅ　＠　１の段階においては、水性環境下で、好ま
しくは反応混合物を混合しながら、排水処理に使用され
る市販の凝集剤でありて一すエチレンイミンを含有する
もの、例えばセディプール（Ｓ＠ｄｉｐｔＩｒ　）　Ｋ
Ａ又はセディゾールＣＩ、−９３０を、二官能価架橋剤
、特にグルタルアルデヒドと共に使用することによシ化
学的に活性な水溶性重合体（Ｅｔｓｐ　）を調製する０
重合速度は、例えば、着色シック塙壜の濃度を反映する
可視スペクトルの範囲（例えばｓｓｏｍｍ）における吸
光の変化により追跡することができ、この濃度は第一に
両反応成分、すなわち架橋剤及び共反応化合物の比率に
依存し、そして、反応時間と温度に依存する。

反応は一次灰石に従って進行する・纂２の段階において
、あらかじめ培地から分離した所望の酵素活性を有する
未処理の新鮮な微生物細胞又は植物細胞を、部分的に又
は完全に反応せしめたＩＩＩＦ溶液に加える・問題の酵
素の感受性にょ〕架橋剤の遊ａＳ液の使用が許容される
場合には、架橋処理し、そして透過性付与処理した細胞
を加える。さらに、未処理細胞と細胞破砕物の懸濁液と
の混合物を加えることもできる。使用する固定化技法、
すなわち凍結、静置、ゆる中かな攪拌、−過圧効果、遠
心力、懸濁又は形成され九粒子の適漁な装置による圧搾
、及びこれに続く乾燥又は湿潤環境下での粒子の部分的
乾燥に依存して細胞固定化物の大きさ、形状、性質、多
孔性及び比活性を制御することができる。

特に、出発材料として未処理ｇ胞を使用する場合、そし
て又、固定化した粒子を処理して粒子の機械的安定性及
び耐性を付与する場合、特にア七トンもしくは他の有機
溶剤により、又は好ましくは部分乾燥後粒子表面に水不
溶性被膜の保護層を形成する有機溶剤中市販接着剤のご
とき溶液により粒子ｏ３分脱水を行う場合には、この発
明の同定化細胞の製造工程中に、固定化前の細胞の透過
性付与処理又は固定化後の細胞凝集体の透過性付与処理
を含める。

この発明の固定化細胞の製造のために、一般に、目的と
する酵素活性（一種類の酵素又は複数の酵素の）が原形
質又は細胞内領域Ｃ細胞の細胞質中）のいかなる場所に
存在するかにかかわらず、種々の種又は１株の原核微生
物細胞及び真核微生物細胞を使用することができ、さら
に植物細胞をも使用することかで龜る。一般に、酵素の
性質及び酵素により触媒される生化学的反応のタイプは
限定要因ではない、原核細胞又は真核細胞の所定のタイ
プに従って特定の固定化技法、例えば凍結法、静置法、
攪拌法等、そして特に固定化の前及び／又は後における
細胞への透過性付与技法を選択する必要がある。技法の
選択は、細胞中における酵素の存在場所、酵素の量又は
酵素により触媒される反応のタイプ、及び細胞表面の知
られている又は予想される組成〔ペプチドグリカン、脂
質蛋白質、多糖脂質、キチン、キト−サン（＊ｈ１ｔｏ
ｓａｎ））に従って行う、未処理の生細胞を固定化する
場合には、技法管上しく選択することが特に重要である
。

前記したこの発明の同定化法の技法はさらに、固定化細
胞の種類及び物理的状態により決定される細Ｊｊｌ！表
面成分である反応基の数及び利用性に従りて選択しなけ
ればならない、細胞表面の反応基の数と利用性が少ない
細胞を使用する場合には、この発明の方法は、２個以上
の第−及び／又は第ニア建ノ基を有する凝集剤により未
処理細胞懸濁液をあらかじめ凝集せしめることによって
変形することができる。あらかじめ物理化学的に形成し
たこの凝集体は吸引−取し良後又は直接ａｓｐ＠液に加
え、こうして細胞の相互接触を促進せしめる・さらに、
細胞表面は、反応基によって富化される。

この発明の固定化細胞の製造には種々の酵素を含有する
細胞、すなわち、細菌の色々な種及び株、放線菌、酵母
、糸状菌例えば不完全糸状菌、高度に寄生的な糸状菌、
並びに植物細胞を使用することができる。遺伝的改良、
選択″、集積法及び遺伝的処理により得られる、固定化
物が高い比活性を有するようにした変異生物の細胞を使
用するのが有利である。

この発明の方法によシ得られる結合細胞（粒子）の大き
さを、目盛を付した接眼レンズを使用して法により試験
した。すなわち、２．５１の湿潤標品を全容量が２５１
１７になるようにメスシリンダー中で脱塩（脱イオン）
水に懸濁し、そして粒子の定量的沈降に必要な時間を測
定する０粒子の大きさの測定にはさらに金属篩を使用し
た・Ｏ，Ｏａ■〜２．００雪の網目を有する３種類の篩
にょシ結合細＠を分離した・ 固定化物の酵素活性は、一定温度で攪拌しながら、基質
溶液中で一定量の結合細胞粒子を使用して測定した。活
性は、０次酵素反応の範囲内において測定し、そして特
にことわらない限）比活性、すなわち粒子の湿重量ダ又
はＩＩ当たシの生成物のマイクロモルＪ１ｍ・ｌとして
表わした。固定化細胞の全連鎖の酵素活性は、測定中に
シュークロースから生成するＣ０２の総量にょプ、マノ
メーターを使用して測定した０％にアルカロイド、ソラ
ンアルカロイド及びシトステルールの生成はＨＰＬＣに
よシ測定し友。

得られた固定化細胞粒子は、場合によっては有機溶剤、
好ましくはアセトンにょシ、又は市販の接着剤溶液によ
〕固形化した後、吸引−過し、そして部分乾燥し、そし
てさらに変形し、その大きさ、形状、性質、多孔性、比
活性及び沈降性を調整することがで自る。

次の例においては、２個以上の第−及び／又は第ニア建
ノ基を有する化合物として、分子量２００．０００〜３
００．０００４Ｍリエテレンイ建ンを約３０型量／容量
−含有する七ディゾール型の市販凝集剤（すなわちセデ
ィプールＣＬ−９３０又は七ディノール−にム）を使用
した。

次に、この発明をさらに詳細にｉ明するために例を記載
するが、これによ）この発明の範囲を限定するものでは
ない。

力１ 脱イオン水中セティ！−ルＣＬ−９３０（ＢＡｇＦ社製
）の１．０重量／容量−溶液１００−及び２．０重量／
容量饅溶液１００１１１を調製した。この溶液を５００
−の丸底フラスコに移し、そしてロータリーシェーカー
（２６０ｉ□）Ｋ装着した・−が６．１であるこの溶液
に、それぞれ反応混合物中の一度が０．５容量慢及び１
．０容量饅となるようにダルタルアルデヒド（メルク社
製）の２５９６水溶液を加えた０反応温金物を収容した
フラスコをアルオニウム箔で覆い、攪拌を開始し、そし
て重合速度を５５０ｍｍにおいて分光光度針〔ユニカム
（υ１１１・ａｔｍ）。

５Ｐ−５００，１０１０Ｘ１０のガラスキ、ペット〕に
より追跡した０反応は、攪拌を継続しながら２０℃にお
いて行った。所定の時間間隔における吸光を脱イオン水
と比較して測定した０両反応混合物におけるシッフ塩基
の濃度の増加を示す測定結果を第１表に示す。

以下余白 １１１１１表 Ｒ８Ｐ　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　
　２０．３０　　　　　　０．３６　　　　　　　０．
７５３．０　　　　　　　０．６４　　　　　　　１．
２６４．０　　　　　　　０．６８　　　　　　　１．
２８５．０　　　　　　　Ｇ、７　Ｇ　（＋）　　　　
　１．３２６．０　　　　　　　０．７２　　　　　　
　１．３６７゜ｏ　　　　　　　ｏ、ｙｓ　　　　　　
　１．４０２４．０　　　　　　　０．９０　　　　　
　１．６０表中（＋）印を付した数値及びそれより下方
に記載した数値はサンプルを希釈して測定した後計算し
て得た値である。

２４時間の反応の後、赤褐色に着色した−４．９・ｆル
テートアンモニウムリアーゼ活性を有するアルカリゲネ
ス・メタアルカリｒネス（ムｌ軸１１ｇＩｎ＠ｓｍ＠ｔ
ａｌｃａｌｉｇ＠ｍ＊ｓ　）の未洗浄温薗体ペースト２
５１を、強く攪拌しながら、反応せしめ７’ｔ　Ｒ８Ｐ
混合物に加え＆、Ｍ胞、の比活性は、５５０Ｊ１ｍ＠ｌ
Ｌ−アスパラギン酸／分／Ｉ温重量（３７℃、−８，５
、ｉ質１．３５Ｍフマル酸アンモニウム）であった。

それぞれの反応混合物に細胞を混合した後、均一な懸濁
液を直径２０Ｇの２債のアルミニウム板に移し、そして
−２０℃のフリーザー中に４時間置いた。＠溝層の深さ
を約１．５　ａｍとした。この時間が経過し几後板を取
シ出し、凍結物を約１００１１７の脱イオン水で覆い、
そして板を室温に１時間置いた。この解凍時間の後、形
成された凝集体を１００　ＱＷＬｌの脱イオン水を収容
したガラス容器に移し、ゆ−〈シ攪拌し、゛静置して定
量的に沈降させ、洗浄水を廃棄し、そして凝集体を１０
００−づつの飲用水で３回デカントした０次に、粒子を
繊維Ｐ材を通してフリットガラス上で十分に吸引−過し
そして重量を測定した。第１の反応混合物から１６、（
ｌの温固定化細胞が得られ、他方から１８．２Ｉの温固
定化細胞が得られた。

両タイプの固定化物を生化学的に分析し、さらに性質を
調べ九〇結果を次の第２表に示す。

第２表 ＲＩＰ　　　　　ｌ　　　Ｚ 比活性 粒子ずイズの分布（＊嵩）　　　１００〜４５０　　３
００〜６００顕微鏡的状態　　　　明瞭な板状　　明瞭
な板状肉眼的状態　　　　暗褐色粒子　　暗褐色粒子例
２゜ 例１の場合と同様にしてａｓｐｓ液（両反応成分の出発
濃度はセディグールＣＬ−９３０が２．００．グルタル
アルデヒドが１．０９１）を調製した。

例１に記載したのと同様にして２５Ｉ１７の測値細胞ｔ
−１ｏｏｄのＲ１１Ｐｉｌｌ液と激しく混合した。５１
２μｍｏｌＬ−アス・豐うイン酸／分／１１湿重量の比
活性を有する十分に吸引−過し次凝集体１７．２１を得
た。これを、Ｓ＊のカナゴム（Ｋａｍａｇ・ｍ’）を含
むあらかじめ一２０℃に冷却した。アセＦン５０１１７
Ｖｃｗ！Ａ濁した。これを室温にて３分間温合した後手
早く吸引濾過し、そして個々の粒子表面上ＯＩｉ着剤が
部分的に乾燥するまで１５分間吸引−過し良。

このあと重量を測定しく１０．５＃）、そして−８，５
の１．３５Ｍ７マル酸アンモニウム溶液Ｚｏ。

ａｊＫＩｌ濁し、８Ｃにて一夜貯蔵した・これを再度吸
引濾過し、フリットガラス上で１０００ａｊの水で洗浄
し、吸引−過し、そして重量を測定した（１３．０ＪＩ
）＊ このものの比活性は１８０Ｊ１ｍｏｌＬ−アスノ青うギ
ン酸／分／ｌ湿重量であり、平均粒手サイズが４００〜
６００　Ｊｉｍの粗伝明瞭な板状固形物から成っていた
。２分間の静置の後定量的に沈降し穴。

例３゜ Ｒ８Ｐ溶液を例１及び２と同様にして調製した。

但し、反応時間は３時間とし、他の反応条件は同じにし
た。例１及び２の場合と同様にして、１００ａＪｏＲ８
ｐ＠液に細菌細胞２５ＩＩを加え、その後の操作は例２
と同様にし友、但し、凝集体をアセトン中接着剤溶液で
処理する前に、０．１−の界面活性剤〔スロパフォール
（８１ｏｖａｆｏｌ　）　９０９　）を含有するｐ）１
８．５の１．０Ｍ硫酸アンモニウム水溶液１００１１７
中で３時間混合（３０℃、ロータリーミキサー、２６０
島物）するととによル凝禁体に透過性付与処理を施し、
この後前記の方法により吸引濾過し、１ＱＱＱｄの水で
洗浄し、再度吸引濾過し、重量を測定しく１６．０＃）
、そしてさらに例２に記載したように処理した。

２５０μｍ・ＩＬ−アス／ｆラギン酸／分／１１湿重量
の活性を有する固定化湿菌体１０ＪＩを得た。このもの
は、３００〜５５０μｍの平均粒子サイズを有する粗い
、明瞭な板状固形物であシ、３分間の静置の後定量的に
沈降した。

８．０μｍｏ１ｇ−ムＰム／時／ＩＱ湿細胞（４２℃、
ｐＨ７，６、基質としてペンジルペニシリンノカリウム
塩を使用）のペニシリンアシラーゼ活性を有するエッセ
リヒア・コリー（Ｅｓ＠に＠ｒｌ＊ｋｌａ　＊ｏｌｉ）
の未処理ＩＩＩ胞の新鮮なイースト３ｏｏＩを、例１に
記載し次方法にょシ２９Ｇのセディ！−ルＫＡ、！：１
チのダルタルアルデヒドとを３０Ｃにて２４時間反応せ
しめて得たＲ８Ｆ１１１１１０００＠ｊＫ、スチール！
ｌ！！プロペラで激しく攪拌しながら懸濁し、均一な懸
濁液を得ｆｃ、次に、履濁液を、およそ４等分しく約３
２０ＩＩｊ）、それぞれを別々にＩリエチレン袋に入れ
、袋の縁を数回折し曲げ、そして金属製クリツノで止め
、モして、この袋を一２０Ｃ〜−２５℃のフリーデーに
約ｓ４間水平に置き、水平においた反応滉合物の層の厚
さを１．５〜２．０　ｔｘとした。

この後、フリーデーから袋を取り出し、凍結した内容物
を機械的に破砕し、袋を切シ開き、そしてその内容物を
ガラス容器中の２５℃の脱イオン水１０．０００５１１
に入れ友、この内容物を、１〜２時間にわたって時々混
合しながら解凍し、得られた粒子を定量的に沈降せしめ
、洗浄水を廃棄し、５０００１１ｊづつの飲用水で３回
デカントした。そして、凝集体をＰ布によシ吸引濾過し
、５ＱＱＱ＋ａＪの飲用水で再度洗浄し、そして再度吸
引−過し湿ケーキを得た。

２１５ｊ＋の十分に吸引−過した湿ケーキを、５００−
のあらかじめ冷却したアセトン−水混合液（１１）に、
−１５℃において混合しながら懸濁し、そして室温にお
いて希釈アセ１ン中で３分間激しく混合し友、この後、
生成物を手早く吸引−過し、さらに５〜ｌＯ分間真空Ｆ
ｊｌ器で吸引−過し、約５０００・−の飲用水で洗浄し
、再度十分に吸引−過し、そしてｐＨ７，６の０．０５
Ｍ燐酸緩衝液１００　ＱａＪ中に懸濁し、そして８℃に
て一夜膨潤せしめた。

６．５＃１ｍｏ１６−ムＰム／時間／＃湿重量の４＝ｙ
リンアシラーゼ比活性を有する合計１８（ｌの湿固定化
細胞を得た。このものは平均粒子サイズが１．５０〜４
５０　Ｊｓの明瞭な小板状物てあ〕、５分間の静置の後
定量的に沈降した・ ユ ペニシリンアシラーゼ活性（比活性：　７．Ｏｊｎａｏ
ｌ！　６−　ＡＰＡ／時間／ダ湿重量）を有し、チ、コ
スロＩ量キア発明者証第２０３，６０７号に記載されて
いる方法により得た架橋処理及び透過性付与処理を施し
たイー・コリー（′Ｂ、・・１１）の湿重量２３０１の
細胞を、例１に記載した方法によシ調製したＲ８Ｐ１ｃ
１０００＋ｗｊと１合した。但し、Ｒ８Ｐ調製のための
反応時間は５時間とし友。細胞を、Ｒ８Ｐ＠液中で均一
な懸濁液が得られるまで混合した後、アセトン−水混合
液による処理を含む例４の方法に従って固定化細胞を＃
ＩＪＩｌｌシ友。

１！　ペニシリンアシラーゼ活性を有する線量１６６Ｉ
の湿固定化細胞を得た。このものは、比活性が６．０μ
ｍｏｌ　６−ＡＰＡ／時間／ダ温重量であｆｉ、１８０
〜４００μ欝の平均粒子サイズを有する明瞭な赤褐色の
小板であ〕、そして３分間の静置の後定量２Ｇ的に沈降
した・ 例６゜ 例４の場合と同様の（ニシリンアシラーぜ活性を有する
イー・コリーの新鮮な未処理製細胞４゜ｌを、例４にお
けるのと同じＲＡＰ溶液１５０１１ｊ中に均一に懸濁し
、そしてこの混合物を４リエチレン製キ、ベットに入れ
、固定化細胞粒子に所定の相対遠心力をかけた＠　２０
Ｃで３時間反応せしめた０反応後、生成物を水で２回デ
カントし、Ｆ布によシ真空吸引−過し、例４の場合と同
様にしてアセトン−水混合液で処理し、例４の場合と同
様にして一夜膨潤せしめた。そしてさらに吸引−過し、
重量を測定し、さらに性質を調べ友、結果を次の第３表
に示す。

以下余白 例７゜ β−ガラクトシン−髪酵素を含有するイー・コリーの新
鮮な未処理細胞ペーストを、例ＩＫ記載した２４時間反
応法によ）調製したＲ８Ｐ溶液１００ｄに懸濁した・但
し、両反応成分の出発濃度は、セディグールＣＬ−９３
０を５重量／容量嘩、グルタルアルデヒドを２．０容量
チとした。新鮮な未処理細胞の比活性は、０．４２μｍ
ｏｌグルコース＋ガラクトース／分／Ｉ湿重量（３７℃
、ｐＨ７，９、基質としてラクトース溶液を使用）であ
った。

均一な細胞懸濁液を室温に２時間静電することによシ反
応せしめた。この後、細胞凝集体のスＩンジ状沈澱物を
前記の方法によシ吸引−過し、得られ九湿ケーキ状の生
成物を真空Ｆ布袋に移し、袋の縁を折シ曲げて金属製ク
リｙｆで止め、この袋を２枚の金属板の間に水平に配置
し、室温にて２時間、１．２５Ｘ１０４ＫＰａ（油圧）
の−過圧をかけた。この後、円板状になった固形物を細
片に破砕し、これを食品ミキサー中の１ＱＱｉａｊの水
に移し、建キサ−のスイッチを断続しながら低速回転に
よシ小粒子に破砕し次、破砕及び均一化の後、生成物を
５００ｄの水で３回デカントし、十分に吸引濾過し、重
量を測定しく１６．２ｊＦ）、そして０．２チの界面活
性剤（スロパフオール９１０）及び１％のツメチルスル
ホキシドを含有するＩＭＮ轟ｃｔ溶液１００１ＩＬｌ中
に移し、この懸濁液を４０℃で平衡化し、そして３時間
連続混合した。透過性付与処理の後、粒子を１０００−
の飲用水で３回デカントし、前記の方法によシ十分に吸
引−過し、ｐｔ４７．０の０．１Ｍ燐酸緩衝液に移し、
そして−夜膨潤せしめた。

固定化細胞を一過し、そして洗浄し友後、非常に急速に
沈降する小塊状の不規則な暗色不定形の４竃１１１３．
２Ｊｌの湿潤物を得た。このものの比活性は０．１２μ
ｍｏｌグルコース＋ガラクトース／分／ｌ湿重量で６９
、その平均粒子サイズは０．５〜２．６露であった。

以下余白 五り 例７の場合と同様のβ−ｆラクトシダーゼ活性を有する
イー・コリーの未処理側ａ３ｏＩＩを、０．５−の界面
活性剤（スロパフォール９１Ｏ）を含有する０、５ＭＮ
ａ０Ａ溶液１００ｍに加え、この懸濁液を強力ｆ！温合
によって十分に均一化し、そして５００＠ｌの丸底フラ
スコに移し、このフラスコをアルミニウム箔で覆い、ロ
ータリーシェーカー（２６０回／分）Ｋ装着し九、未処
理細胞の懸濁液を３０℃にて２０分間連続的に温合する
ことによシ細胞に透過性を付与した０次に、こし・細胞
を遠心分離しく２０．０００ＩＩ／１０分間）、上澄液
を廃棄し、ペースト状細胞沈澱物の重量を測定し喪。

上記のように処理した濃縮１！！１２６ＪＦを、例２に
おいて記載したＲ８−溶液１００ａＪ中に懸濁し、懸濁
液を均一化し、そして例２に記載した方法に従って反応
温合物を凍結す慝゛ことにより細胞を固定化し、固定化
し丸線飄を例２’に記載また方法によシ処理し、こうし
て得九温粒子１７ＩＩをあらかじめ一２０℃に冷却した
５０−の純アセトンに懸濁した。アセトン処理を３分間
で終了し、処理物を手早くフリットカラス上で吸引−過
し、水で洗浄し、そして−７，０の０．１Ｍ燐酸緩衝液
中で、８℃にて一夜！＃関せしめた。

こうして、０．３８μｍｏｌグルコース＋ガラスドース
／分／Ｉｉａ重量のβ−ガラクトシ〆−ぜ比活性を有す
る総重量１２６Ｉｉの固定化製細胞を得た。

このものの平均粒子サイズは８５〜４００μ惰であり、
不規則な縁を有する小板状をしており、そして５分間の
静置の後定量的に沈降した。

！ム ３８アゾ力ゼイン単位／Ｉｉｍ重量（・３７℃、−７，
５、基質としてアゾカゼイン使用）を有する指数増殖期
の終了前に集菌したパシルス・メガテリウム（Ｂａｅｌ
ｌｌｕｓ　ｍ＠ｇａｔ＠ｒｉｕｍ　）の新鮮な未処理直
軸＠　２．５　ｋＩＩを、１０．０００ｍの脱塩水ＫＪ
Ｉ濁し、この懸濁液を激しい温合によシ均−化し、そし
て５℃に冷却した。この懸濁液を細孔機械的破砕機中で
２５０気圧にて３回破砕した。それぞれの破砕処理の間
に連続的に冷却し、破砕温合物の温度が３５℃を越えな
いようにした。

全量１００　ＧＷＪの破砕細ｍ層濁液の−を、連続混合
しなから２０チＮａＯＨｆｌｊ液により７．５に調整し
、破砕懸濁液中の最終濃度が０．２５容量−となるよう
に凝集剤（セディｌ−ルにム）を加えた。この懸濁液を
十分に温合し、約１時間室温に静置し、この間に細膓片
を完全に凝集せしめた。

この後、例１に記載したようにして２４時間反応によシ
調製したＲ８Ｐｉ１ｍ１２　Ｇ　、　ｔ）ＩＩｊを、１
００〇−の懸濁液に加えた。但し、例１と異表少、Ｒ８
Ｐの調製における両反応成物の出発員度は、セデイグー
ルｎを４重量／容量−、グルタルアルデヒドを２容量−
としえ、あらかじめ形成した凝集粒子が破壊されるのを
回避しながら、両成分をステンレス製攪拌棒によシゆり
く９と温合した。２時間静置した後、粘度の高い部分的
に反応した懸濁液をゆり〈ル混合し、そして約０．３ｊ
づつを１０個のポリエチレン袋に移した。さらに、例４
の場合と同様にして処理した。但し、固定化粒子は、激
しく攪拌しながら、あらかじめ−２０ＣＫ冷却したアセ
トンによ１３分間処理した。そして、この処理物を手早
く吸引−過し、水で数回デカントし、そしてｐＨ７，５
の０．１ＭＩＩＩ酸緩傭１ｌ１１ｏ　ｏ　ｏ−に移し、
そして８℃にて一夜廖潤せしめた。

こうして得た懸濁液を篩上で洗浄しながらゆっくりと処
理することにより１．２８ｋｇの温固定化粒子を得た。

この固定化物の比活性は３．６２アゾカぜ・１ン単位／
Ｉ湿重量であル、平均粒子サイズは０．４〜２，０■で
あシ、そして２分間の静置によシ粒子が定量的に沈降し
た。

例１０゜ 蛋白質分解活性を有するパシルス・メガテリウムの新鮮
な未処理湿細胞５０ＩＩを、０．０５　＊　ＮａＣｔ水
溶液１００１１４に懸濁し、この−を例９において記載
したように２０−チＮａＯＨＫよシフ、０に調製した。

懸濁液を均一化した後−を再度７．ＯＫ調整し、凍結乾
燥−した卵リゾチームを最終濃度が１００μｇΔａにな
るように添加し、３０分後、ＮａＯＨにより懸濁液の−
を注意深（８，６に調整し、そして、この懸濁液を、咳
虐濁液の粘度が急激に変化し、そして細胞壁が酵素的に
分解されるまで数分間５０℃に加熱し九〇 例９に記載した反応成分を含有するＲ８Ｐ溶液１００ｉ
１ｊを、あらがじめ凝集せしめることなく、懸濁液に加
ええ、このｌｌ濁液を漱しく混合し、さらに例８（反応
混合物の凍結）と同様に固定化し、粒子をアセトンで処
理した。

２．４アゾ力ゼイン単位／１１湿重量の活性を有する固
定化温粒子３０ｊを得え、平均粒子サイズは０．２〜１
．０■であシ、３分間の静置の後定量的に沈降し九・ 例１１゜ ０．０１７μｍｏｌグルコース＋ガラクトース／分、４
９湿重・量のβ−ガラクトシ〆−ゼ（３７℃、ＰＨ６，
０゜基質としてラクトースを使用）を含有する酵母クル
イペロζセス・フラギリス（Ｋｌｕｙマ・ｒｏｒａ＋ｙ
ｅ・−ｆｒａｇｉ山）の未処理直軸−ペースト３０ｊを
、０、１１１の界面活性剤（スロパフォール９１ｏ）及
びｌ−のりメチルスルホキシｒを含有するＰＨ７，０の
０．１Ｍ燐酸緩衝液１００ｄ中に懸濁し、そしてした。

この彼、透過性を付与し丸線膓を遠心分離しく　５００
０Ｉｉ、　１０分間）、上澄液を廃棄し、そして沈殿し
た細胞ペース）１２）重量を測定した。

透過性を付与した直軸胞２５Ｎを、例８の方法に従って
固定化した。但し、固定化後の粒子をアセトン中カナノ
ンｌ−溶液で処理した。処理及びａ１＠における他の条
件は例８に記載した通〕とした。

０．０２４ｒｎｏｌグルコ一ス士ガラクトース／分、Ｊ
Ｉｉｌ量の比活性を有する固定化温細胞１５ｊを得た。

粒子サイズの分布ａＯ，２〜１．５−の範囲であり、そ
して粒子線２分間の静置の後定量的に沈降した。＊集体
は綿状であシ、その沈澱物は比較的大であった。

例１２゜ 比活性５．９μｍｏｌ　Ｌ−リジン／時／ｑ温重量（３
７℃、Ｖｋ１７．５、Ｌ−α−ア電ノーε−力ｆｃ１ラ
クタム水溶液）ＯＬ−α−アｉノー１−ア電ツカ！ロラ
クタムヒドロラーゼ活性を有する酵母クリｌトコ、カス
・ラウレンテ４−（Ｃｒｙｐｔｏｅｏａｅｕｓｌａｕｒ
＠ｎｔ　ｉｌ　）の新鮮な未処理細＠２５Ｉを、例２の
方法に従って調製したＲ８Ｐ溶液ｔ　ｏ　Ｏｄ　Ｋ　！
ｌ　ｔｉした。１時間ゆっく〉攪拌した後、高粘性綿状
１″濁液を、例２の凍結技法を用いて固定化し、固定化
後の凝集体を例２の方法に従ってアセトン中接着剤溶液
によシ処理した。吸引−過して得られたｍｌｌ鉢体、８
ＣにおいてＰＨ７，０の燐酸緩衝液中で一夜膨１１＜Ｌ
めた。

３．２μｍ・ＩＬ−９ジン／時／ａｔｉ湿重量の比活性
を有する固定化直軸ａｌｓＪＦｔ得た。平均粒子サイズ
は０．１２５〜１．５−の範囲であ夛、この定量的沈降
は２分間の静置の後に生じ九。この固定化物は、肉眼的
Ｋｔｉ不定形の綿状構造を有し、顕微鏡的には不規則な
像を有する不規則な構造を有してい九〇 例１３゜ ７、１単位／Ｉ湿重量（１単位は３０℃、ｐＨ５，５に
おいて５分間でＬ−アス／譬うギン酸から１００μ）の
Ｃ０２を発生する酵素量である）の比活性のＬ−アスノ
母うギン酸脱員酸酵素を含有する？コパクテリウムｅエ
スピー（Ｂｆｙｔｏｂａ＊ｔ＠ｒ１ｔｚｍ　ｓｐ、　）
の新鮮な未処理細膓の湿ペース）３０ｊＦを、例２の場
合と同じＲ８ｐＨｉｌｌ　００ａＪＫ懸ｆｆ１Ｌ、均一
す懸濁液を生成せしめた。そして例２と同様にして反応
温合物を凍結し、デカントシ、洗浄し、そして吸引−過
し、そして１９．６４Ｆの固定化濃縮抱を得た。

上記の量の粒子を、０．５％の界面活性剤（スロパフｔ
　−ｋ　９１０　）を含有するＰＨ６，５のＩＭＮａＣ
Ａ溶液１００ｍ１Ｋ＠濁した。この懸濁液にクロロホル
ム（５答量Ｉｓ）を加え、そして混合しながらこの懸濁
液の温度を３５℃にし、この温度において１時間激しく
混合した。これを１０００−の水で希釈し、０．５１の
水で３回デカントし、透過性を付与した粒子を前記のよ
うに吸引−過し、あらかじめ−２５℃に冷却した５０−
のア七トンＰｃ１ｌ濁し、そして室温にて３分間激しく
温合した。粒子を再度吸引−過し、フリ、トガラス上で
十分に水洗し、ＰＩ（ｓ、ｏｏｏ、ｏｓｍ酢酸緩衝液ｔ
ｓｏｙｉｌｙｃ＠濁し、そして８℃にて−夜膨潤せしめ
た。

４、θ単位／ｇ湿重量の比活性を有する固定比況細胞１
４．２．ｐを得た。粒子サイズ分布は７５〜８００μ溝
の範囲であった。この粒子は、肉眼的には湿潤表面の少
ない不定形綿状フレーク形を有していた。固定化細胞は
はとんど自然沈降しなかった。すなわち、粒子は液の上
層に残留した。し　〜かし一過性及び吸引一過性は良好
であった。

例１４゜ 比活性１６．４単位／ｌ湿サンプル（１単位は、３０℃
、ｐＨ５，５においてＬ−リジンから！ＯＯμｊのＣＯ
２を発生せしめる酵素量）ＯＬ−リジン脱炭酸酵素を含
有するバクテリウム・キャダペリス（Ｂａｅｔ＠ｒｌｕ
ｍ　＊ａｄａｖ・ｒｌ、ｓ）の新鮮な未処理１細９３０
ｇを、例２の場合と同様のＲ８Ｐ溶液１００１１ｊに懸
濁した。さらに例２の場合と同様にして凍結、デカント
、洗浄、及び吸引−過を含む処理を行った。２４．９の
固定化１細飄を得た。

上記の量の吸引−過粒子を、０．１ｓの界面活性剤（ス
ロパフォール９０９）を含有するｐＨ６，５０３７℃に
て１時間連続混合し九、固定化し、そして通過性付与処
理を行った菌体を、例１３に記載した方法によシさらに
処理した。

１１．８単位／Ｉｍ重量の比活性を有する固定比況細胞
１９．１ｇを得た。この固定化物は、平均粒子サイズが
１８０〜６００　ｔｔｔｍであシ、粒子は櫃ｆｉｔ鏡的
には明瞭な小板状であシ、肉眼的には不定形褐色粒子で
あり、３分間の静置の後定量的に沈降した。

Ｎ１５゜ １４８単位／９湿重量（３０℃、ＩＪ（４，７５、基買
としてシー−クロースを使用）の比活性のイン””−”
を含有する１％母サツカロミセス・セレビシｚ−（５ａ
ｃｃｈａｒｏｏａｙｖｅｓ　＊＊ｒ＊ｖｉｓｉａｅ　）
の新鮮な未処ｍａａ胞２０ｊを、例２の場合と向じＲ８
Ｐ溶液１００ａＪＫｉｌ濁し均一な懸濁液を得た。

さらに、例２に記載した方法によシ、凍結及びその他の
すべての操作を含む固定化処理を行った。

細胞を例８と同様にアセトンで処理した。

９０単位／ｇ湿重量の比活性を有する固定化１細飄１２
．ｌｐを得た０粒子サイズの平均分布は０．３２〜２．
０■であシ、粒子は、−黴鏡的には縁に亀裂を有する不
規則な形状の不明瞭な構造を有し、肉眼的には淡褐色〜
ページ、色の不定形粒子でアシ、２分間の静置の後定量
的に沈降した。

例１６゜ 酵母サツカロミセス・コレアヌス（Ｓａｅ＠ｈａｒｏ−
ｍｙｅｓｍ　＠ｏｒ＠ａｎｕｓ　）を液体培養した後の
培地１１を遠心分離〔ジャネツキ（Ｊａｎ＠ｔｘｋｌ　
）　Ｓ−７０，３０００，９，１０分間コし、上澄液は
廃棄し、そして新鮮な未処理湿菌体２８ｊｌを得喪。

こうして得た量のペースト状の新鮮な酵母菌体を、例２
に記載した方法によシ調製したＲ８Ｐ溶液１００１１ｊ
Ｋ懸濁し、この懸濁液を激しく混合して十分に均一化し
、そして反応混合物を小型往復式笑験室振とう機に装着
し、温度にて１時間振とう（５００Ｉｉ）した、そして
混合を停止し、懸濁液を上記の温度にて３時間静置し喪
。この後、生成した凝集体の高粘性ス４ンノ状マッシ、
を５００４のポリエチレン製キ、ペットに移し、そして
上記のようにして遠心分離し、上澄液を謁秦し、沈濱物
は脱イオン水に遷濁し、そしてゆり＜ｌ）８合して２５
０ｄの水で３回デカントした。凝集体のデカント及び定
置的沈澱の後、固定化物を真空−過し、約１００ｍの水
で再度洗浄し、そして重量を一１１定した（１４．９）
。これをあらかじめ−２５０に１１却したアセトン２５
Ｊｌｊ中に−１して強く混合し、フリットガラス上で手
早く吸引−過しそして約１０００−の悦イオン水で洗浄
し、再度十分に吸引−過し、そして重量を測定し九（９
Ｉｉ）、得られた固定化１菌体を上記の遠心分離上澄液
（＃【迂を培養した後の培地）に懸濁し、そして室温に
て畝時間膨濶せしめた。

固定化物を再度十分に真空−過し、湿菌体１００・ダを
ワールプルグ容器に入れ、遠心分離した透明な発酵液（
ｐｉｆ４．６）を２−加え、１２．５＊シュークロース
０．５ａｌｉワーＡ−ノルグ容器の側室に入れ、第１の
対象容器には未処理未固定化菌体（Ｚｏ。

・ダの未処理湿ペースト）を入れ、そして２１１ｊの遠
心分離した発酵液を加えた。第２の対象容器には上澄液
のみ（菌体な加えない）を入れ、そしてシ、−クロース
を側室に入れ、そして１ツメ−ターを取シ付け、振とり
機のスイッチを入れ、３００にて１５分間インキ、ベー
トした。マノメーターの脱気を行い、シュークローズ溶
液を側室から注入し、そして発生するＣ０２の測定を開
始した。

第１の対象（未処理未固定化菌体）においては３．０６
４μＩ／時のｃｏ２が発生し、第２の対象（菌体を含ま
ない上澄液のみ）ではＣ０２の発生がなく、第３の測定
（第１の対象の場合と同濃度の固定化菌体を使用）にお
いては１６５μノ／時のＣＯ２が発生しえ。この量は、
最初の（固定化してない）ｄｌ１体の全代謝活性の５．
４−に相当する。

酵母固定化物は、顕微鏡的には不規則な形状の明瞭な粒
子として観察され、肉眼的に紘ページ。

色の不定形粒子として観察された。１分間の静置によシ
定量的に沈降し、粒子サイズの分布は３００〜９００ｍ
鶏でありた・ 例１　フ。

１重量（３７℃、ＰＨ５，０、基質としてＬ−アス・譬
うギンを使用）のＬ−アスノ豐うギンアイノヒドロラー
ゼ酵素を含有するエルウィニア・アロイデア（Ｅｒｗｉ
ｎｉａ　ａｒｏｉｄ＊ａ　）の新鮮な未処理湿菌体ペー
ストを、例７に記載した方法によりＲＢＰ溶液１００ａ
ｊ中に＃１４Ｌ、た。この懸濁液を漱しく混合して均一
化し、例１６の場合と同様に３０分間ゆるやかに攪拌し
、そして１時間室温においた。この後、粘稠なスポンノ
状物を５００ａＪのポリエチレン製キュベツトに注入し
、５０００Ｘｊで３０分間遠心分離し九、上澄液を廃棄
し、例７に記載したようにして沈澱物に一過圧をかけえ
、但し、沈Ａ粒を約５分間油圧手段によシ圧搾しく　Ｒ
８Ｐ　９部分を摩除する）、脆い固形物を破砕し、特殊
な鋼製の１露孔径のインサートを有する内用ホモジナイ
ザーに入れ、このインサートを通して棒状顆粒形に押出
し、この顆粒を２５℃にで約３時間空気ＪＡし、水で３
回デカントシ、脱イオン水中で一夜１−せしめた。およ
そ１〜３■の長さの棒状で不規則な粒子サイズを有する
比活性６４　Ｊｌｍｏｌ　Ｌ−アス・譬うギン酸／Ｉｍ
重量の固定化菌体の総重量８ｊｊの顆粒状固形物を得た
。このもの線数１０秒間で定量的に沈降した。

例１８゜ 比活性０．２１　＃ｔｖｓ１フラクトース／分／９温分
量９温 使用）のグルコースイソメラーゼ酵素を含有するス）レ
ット１イセス・ノ譬ニオクロモｒネス（　８ｔｒ＠ｐｔ
ｏｍｙｖ＊ｓ　ｐｈａ＠ｏ＠ｈｒｏｍｏｇ＠ａｅｓ　）
の新鮮な未処理湿菌体ペーストｓｏｇを、−７．０の０
．ＩＭＮａＣＡ溶液２　０　０１１４に懸濁し、この懸
濁液を７０℃にて１０分間連続攪拌しながら加熱した。

次に１この懸濁液を冷却し、そして遠心分離した（５０
００Ｘｊ％１５分）、上澄液は廃棄し、沈轍物竺、例會
の方法に従って調製し九Ｒ８Ｐ溶液１５０１１４ＫＩＩ
濁した。さらに、遠心分離、短時間の圧搾、破砕、及び
乾燥を含む例１７に記載した方法による固定化操作を行
うえ．但し、後成形した固定化菌体の一粒は、２−の接
着剤（カナノン）を含有するあらかじめ冷却したアセト
ン５０１Ｉｊで一２８℃にて３分間処理した。そして粒
子を手早く吸引戸通し、約１０００−の０．０５Ｍ燐酸
緩衝液で洗浄し、再度吸引−過し、そして１　０　０ｄ
の同じ緩衝液に懸濁し、そして８℃にて一夜貯蔵した。

総量２０Ｉｉの固定化菌体の顆粒状固形物を得た。比活
性は０．１μｍｏｌフラクトース／Ｉ湿重量であり、粒
子は小棒状であシ、粒子サイズは不規則でＯ１５〜３．
０−の範囲であった．固定化物は数１０秒の関に定量的
に沈降した。

約１９。

比活性０．　１　＃ｍｏｌ　Ｈ２Ｏ２／分／Ｗ９湿重量
のグルコースオキシダーゼ酵素とカタラーゼを含有する
アスペルギルスにが−（　Ａａｐ＠ｒｇｉｌｌｕｓ　ｗ
１１ｇ＠ｒ）の未処理１１体ペース）４５ＩＩを、例７
の方法により調製したＲＲＰ溶液１ｓＯｄＫ加えた。さ
らＫ。

例７に記載した方法によシ固定化処理を行った。

但し、後成形した顆粒は、室温にて２４時間、４０チ湿
度の空気（Ｈ２ＳＯ４）で乾燥した。この後、菌体を脱
イオン水に移し、そして８℃にて２４時間膨潤せしめた
。

０．０４５μｍｅｔ　Ｈ２Ｏ２／−湿菌体の比活性を有
する総計２９９の固定化湿菌体を得た。粒子サイズは不
規則で０．５〜３．０−の範囲であった０粒子の形は棒
状であった。仁の固定化物は数１０秒間に定量的に沈降
した。

例２０゜ シュークロースによる高張圧環鷹下でソランアルカロイ
ド及びシトステロールを合成する植物ソロニウム拳アピ
クラレ（８ｏ１ａｎｕｍ　ａｖｉｃｌａｒ＊　）（単細
胞培養）の新鮮な洗浄湿細胞２０ｇを、例２の方法に従
って調製したＲ８Ｐ溶液１００ａｊＫ！１濁し、準しく
混合して得た均一懸濁液をアルミニウム製皿（直後１５
　ｃｍ　）に移し、そしてこれを−１９℃のフリーザー
中に４時間置いた。凍結した反応混合物をフリーデーか
ら取り出し、そして０．７５ＭのＫＣｌを含有するＰＨ
５，７の０．０５Ｍ燐酸緩衝液約５０Ｉｌｊで覆った。

２時間室温においた後、植物細胞の凝集体を１０００＋
１ｊの上記の緩衝液に移し、常に粒子を定量的に沈降せ
しめながらこの緩＃液で数回デカントし九０次に固定化
細胞を十分に共空ｐ過し、フリ、トガラス上で緩衝液に
よシ洗浄し、再度吸引−過し、そして重量を測定し九（
１８ｇ）。

次に、粒子を、殺菌した８重量／容量−のシ。

−クロース水溶液１０Ｇ−に移し、そしてこの懸ｌ嚢液
を２０℃にて２４時間間隔で３回電磁攪拌機で撹拌した
。凝集体を分離し九後、ソランアルカ−１ド及びシトス
テロールの細；泡外生意を、シルク（Ｊｉｒ’ｋｕ）等
（Ｂｉｏｔ＠＠ｈ！１ｏ１．　Ｌ＠ｔｔ＠ｒｓ　ｅ　３
　＊Ｎｏ、　８　、４４７　、１９８１年）により記載
された方法により、ＨＰＬＣを用いて２４時間間隔で追
ｉｈシた。

２４４時間置期の間、上記の固定化細胞による上記の物
質の生産が維持された。粒子を走査電子頒直碗で＊祭し
たところ、植物細胞相互間の結合か認められた。

例２１゜ 例２０と同様の新鮮な未洗浄植物細胞３０ＪＦを、０．
７５ＭのＫＣｌｔ−含有する０、０５Ｍ燐酸緩衝液１０
０−に４濁した。混合しながら、均一な細胞層濁液に凝
集剤（セディデ−ｘ　ＫＡ　）を加えた（０．５容量ｔ
ｌＩ）。混合した後、細胞の凝集が視覚的に観察できる
ようになるまで室温に１時間置いた。この後、懸濁液を
注意深く（生成したフレークが崩壊しないようＫ）ツリ
ットガラス上に移し、そして繊維（布）を通してゆりく
シと、且つ十分に真空−過した。過剰の液を吸引除去し
、そして得られた固形物を、混合することなく、例１Ｏ
の方法に従って調製し九Ｒ８Ｐ溶液１００１１ｊＫ加え
、そしてこの懸濁液をゆり〈如攪拌することにより注意
深く均一化した。均一化し先後、懸濁液を１時間室温に
おき、さらに、例１２の方法に従って固定化した。但し
、凍結温度は一２５℃とした。

４時間凍結した後、凍結物をフリーデーから堆り出し、
そして例２０の方法に従ってその後の操作を行った。但
し、室温での解凍時間は１時間とした。固定化し、洗浄
し、そして十分に吸引ｐ過した細胞２０ｇを得た。

次に、粒子を例２０に記載したのと同じ媒体に移した。

但し、ソランアルカロイドとシトステロールの生合成は
、生物触媒床を通してシュークロース容液を５×２４時
間再循環することにより行りた。例２０に記載し九方法
により、ソランアルカロイド及びシトステロールの生産
を２４時間間隔で追跡した。

上記物質の生産及び生産周期は２４時間×Ｓ期間維持さ
れ九。

例２２゜ 分子量４０，０００〜５０．０００のぼり・リジン０．
１１重童／容量囁を含有する溶液、及び分子量２６、λ
ＯＯのポリサジ２１重量／容量嗟を含有する溶液を、そ
れぞれ２５−づつ調製した０分子量４０．０００〜５０
，０００のポリリノンは蒸留水に溶解し、分子量２６．
λＯＯの４リリジンは０．１　Ｍ　）す１ス緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に溶解した。第１の溶液（分子ｊｔ４０．ｏ
００〜ｓｏ、ｏｏｏの４リリジン溶液）においては反応
混合物中の実際の濃度が０．３容量−になるように、第
２のＳ液（分子量２６，２００のポリリノン嬉液）にお
いては０．５容量−になるように、両尋液に２５チグル
タルアルデヒド水溶液を加えた０反応混合物を収容した
容器をロータリーシ。

−斉一に装着し、反応混合物を３０℃にて１０時間連連
続音した０重合速度すなわちシッフ塩基の生成速度を、
例ＩＫ記載した方法に従って分光光度針によシ追跡しえ
、但し、４３０ａｍで測定した。

インベルターゼ活性（比活性１４声ｍｏｌダルコース／
分／ダ乾燥重量、３０℃、ｐＨ４，８、基質としてシュ
ークロースを使用）を有する酵母サツカロミセス・セレ
ビシェ−の新鮮な未処理１１体６ＪＦを、ＲＲＰ溶液に
懸濁して均一な懸濁液を調製した。

この懸濁液を往復式実験室振とり機上で１時間温合し、
そして２時間静置し、次に粒子を遠心分離しく１０分間
、ｓ、ｏｏｏＩＩ）、沈澱物を針を付けてない注射器に
とり、ペースト状固形物をアル建ニウム箔上に棒状に押
出した。未洗浄のまま後成形した粒子を室温にて６時間
乾燥し、そしておよそ同じ大きさの粒子に均一化し、５
℃にて一夜、水中で膨潤せしめえ、膨潤した粒子を真空
濾過−し、数回水洗し、十分に吸引−過し、そして重量
を測定した。

第１の場合及び第２の場合において、それぞれ２７６μ
ｍｏｌグルコース／分／ｇ１重量の比活性を有する総１
重量５．６ＩＯ粒子、及び３ｇ？、２＃ａｏｌグルコー
ス／分／７ｆｉ重量の比活性に有する製型ｉ１３．６Ｊ
Ｆの粒子を得た。いずれの場合にも、粒子は膨潤後直径
１．２■、平均畏さ１．４５〜４−の棒状固形物であり
た。この固定化物は数秒間で定量的に沈降した。

３８７．２μｍａｌ　　グルコース／分／Ｉ湿重量の比
活性を有する湿重量５ＩＩの固定化画体を、ｐＨ４，９
の０．０５Ｍ酢酸緩衝液にシ、−クー−スを溶解し７’
ｊ　Ｏ，５Ｍ溶液ｓｏｘｔＫｍｍし、シ、　−／　ｖｓ
　−ｘ　Ｏグルコースとフラクトースの温金物への転化
’ｔ、３０℃において連続混合（１００回／分で低速回
転するいか＃）！ｌ攪拌機）しなから行っ九、使用した
条件下で酵素的転化は３時間で完結した。同じパッチの
生物触媒を使用してこの方法を１ｏｌｌ繰り返した。各
反復酵素転化の後、ポリアミド綱によ）粒子を篩別し、
上記の緩衝液で洗浄し、そして上記のごとくして再使用
しえ、同じ固定化画体を１０回反復使用した場合の平均
酵素転化率は９２．６１１であった。

例２３゜ ＰＨ８，２の０．１　Ｍ　）リス緩衝液中工業用Ｌ−リ
ジン（活性成分含量８９−）の１０％溶液５０−を調製
した１反応温合物中のダルタルアルデヒドの濃度が５容
量−となるように上記の溶液にグルタルアルデヒド水溶
液（ＺＳ−）を加えた。この反応混合物を、例２２に記
載し九条件下で連続混合した。但し、反応時間線２４時
間とした。

この後、例２２に記載したのと同じ酵ｇ活性を有する同
じ微生物の温重量１２Ｉｉの新鮮な１体を、ＲＲＰの暗
褐色溶液５０１１７Ｋｌｌ濁した。この懸濁液を低速振
動攪拌器で均一化し、アルミニウム箔皿に移し、そして
２４時間−２ＧＣのフリーザーに置いた。次にこの皿を
取シ出し、この内溶物を室温にて自然解凍せしめた。高
粘性スポンジ状混合物を遠心分離しく１Ｇ、０００ｊに
て１５分間）、そして上澄液を廃衆Ｌ１沈澱物を注射器
にとり九。

これ以後の操作は例２２に記載したのと同様に行った。

但し、後成形した粒子の空気乾燥は１０時間で終了した
。

例２２に記載した方法に従って一過、洗浄及び膨潤を行
った後、比活性１８０μｍｏｌグルコース／分／９湿重
量のインベルターゼ活性と１．２〜３．７−の平均粒子
サイズを有する湿重量２．８Ｆの粒子を得た。＊ａ後後
固化化物ス４ンジ状のやや軟かい粒子であり、数秒間で
定量的に沈降した。

特許出願人 チェスコスロペンスカ　アカデンー　ベト特許出願代理
人 弁理士　　青　木　　　朗 弁理士　西舘和之 弁理士　　福　本　　　積 弁理士　　山　口　昭　之

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. １．２個以上の第−及び／又は第ニアミノ基を有する水
   溶性化合物と二官能価アルデヒドとの反応によシ生成し
   友水溶性反応性重合体により、酵素活性を有する、未処
   履細胞もしくは場合によっては透化性付与処理を施し危
   細鬼、もしくはこれらＯ細胞の断片及びｓｌｌ［内顆粒
   ；及び／又は未処理細胞と細胞断片、細患内顆粒及び細
   胞溶出成分との温合物纂及び／又は個々の細胞について
   架橋処理及び透過性付与処理を施したＪａｌｌｍｌを化
   学的に固定化し、場合によりてはさらに該固定化物に透
   過性付与処理を施し、セして／又は該固定化物を機械的
   に硬化せしめて成る生物的変換用細胞触媒。
2. ２．１１Ｌドロラーゼ、イソメラーゼ、リアーヤ、脱炭
   酸酵素、酸化還元酵素、もしくは他の酵素、及び／又は
   生化学的代謝経路の一部を成す酵素群、もしくはホルモ
   ンの生物変換ＬＬ＜はアルカ−イドの生産を触媒する酵
   素の活性を有する原核細胞もしくは真核１１ＪＩＩであ
   るグラム陽性細菌、ダラム嬢性細１もしくはグラム・ラ
   ビール細菌、抗酸醒、放線菌、酵母、来秋曹、もしくは
   植物ａｍ、又は前記の細胞の断片及び細胞内顆粒を含ん
   で成る特Ｉｆｆ請求の範囲ｗ４１項記載の細胞触媒。 ３、分子量１０Ｇ、０００〜ｓｏｏ、ｏｏｏのポリエチ
   レンイミンとグルールアルデヒドとの反応によシ生成し
   た水溶性、且つ化学的に活性な重合体により繭紀細飽性
   材料を化学的に固定化して成る特許請求の範囲第１項又
   は纂２項記載の細胞触媒。 ４、未処理ｍ１ｍもしくは場合によっては透化性付与処
   理を施した＃ＩＪＪｉ！、もしくはこれらの細胞の断片
   及び細胞内顆粒；及び／又は未処１１ＩＩＩ胞と細胞断
   片、ａ廁内顆粒及び細胞溶出成分との混合物；及び／又
   は個々の細胞について架橋処理及び透過性付与処理を施
   した細胞を、水性媒体中−３０℃〜５０℃、ｐＨ５，０
   〜９．０の範囲において、そして場合によっては凝集剤
   の存在下で、２個以上の第−及び／又は第ニアミノ基を
   含有する水溶性化合物と二富能価アルデヒドとを水性媒
   体中でθ℃〜６０℃、４４．０−１２．０におｉで反応
   せしめて得られる水溶性且つ化学的に活性な重合体と接
   触せしめることにより固定化し、反応混合物から固定化
   物を分離し、水又は緩衝液で洗浄し、そして場合によっ
   て線透過性付与処理及び／又は機械的硬化処理を行うこ
   とを特徴とする生物変換用細胞触媒の製造方法。 ５、分子量１００，０００〜ｓｏｏ、ｏｏｏの、ｌｔリ
   エチレンイミンを水溶性重合体の製造、及び場合によっ
   ては細胞類の予備ａｌ園に使用することを特徴とする特
   許請求の範囲８１４項記載の方法。 ６、前記の細胞類と前記の重合体との反応をＯＣ〜４５
   ℃において、そしてｌ〜ｓｏ、ｏｏｏｙの相対遠心力下
   、又はθ〜Ｓ　Ｑ、０００　ＫＰａＯ濾過圧下で、静置
   して、もしくはゆっ〈シ混合しながら、もしくは静置と
   混合を繰シ琳しながら行うことを特徴とする特許請求の
   範囲第４項又は第５項記載の方法・ ７、固定化前の細胞又は固定化後の細胞凝集体ｐＨ４，
   ０〜９、Ｏにおいて、界面活性剤、及び／又は水混和性
   有機溶剤及び／又は水軍温和性有機溶剤の存在下で、場
   合によっては強酸及び／又は塩基の塩を加えることによ
   シ懸濁液中のイオン強度を一時に又は逐次に変化せしめ
   ながら、細胞懸濁液を混合することによって行う仁とを
   特徴とする特ｌｆｆ−請求の範囲第４項又は第６項記載
   の方法。 ８、場合によってはさらに、有機溶剤による部分脱水に
   より、又は有機溶剤もしくは有機溶剤と水との混合物中
   接着剤溶液により、−２５℃〜２０Ｃの範囲の温度にお
   いて固定化細胞の機械的硬化を行い、そしてこの固定化
   物を吸引濾過し、そして乾燥条件下もしくは湿潤条件下
   で部分乾燥を行い、又は場合によっては適当に後成形す
   ることを特徴とする特許請求の範８１に４項又ｉ１第５
   項記載の方法。