CS209265B1 - Způsob výroby stabilních preparátů vzájemně vázaných buněk prokaiyontních a eukaryontních mikroorganismů s enzymovou aktivitou. - Google Patents
Způsob výroby stabilních preparátů vzájemně vázaných buněk prokaiyontních a eukaryontních mikroorganismů s enzymovou aktivitou. Download PDFInfo
- Publication number
- CS209265B1 CS209265B1 CS514579A CS514579A CS209265B1 CS 209265 B1 CS209265 B1 CS 209265B1 CS 514579 A CS514579 A CS 514579A CS 514579 A CS514579 A CS 514579A CS 209265 B1 CS209265 B1 CS 209265B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cells
- suspension
- activity
- water
- linked
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 119
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 31
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 claims description 31
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 29
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 24
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 7
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 claims description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 4
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 4
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 abstract description 2
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 abstract 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 244
- 239000000463 material Substances 0.000 description 61
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 53
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 29
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 26
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 25
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 23
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 22
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 21
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 20
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 19
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 18
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 18
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 18
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 14
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 14
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 11
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 9
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 9
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 9
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 9
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 9
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 8
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 6
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 6
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 6
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 6
- -1 hydroxyalkyl methacrylate Chemical compound 0.000 description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 6
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 108700016171 Aspartate ammonia-lyases Proteins 0.000 description 5
- 229920004933 Terylene® Polymers 0.000 description 5
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 5
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 5
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 5
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 3
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 3
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 3
- 235000012206 bottled water Nutrition 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 3
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 2
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000673 Ammonia-Lyases Proteins 0.000 description 2
- 102000004118 Ammonia-Lyases Human genes 0.000 description 2
- 239000001729 Ammonium fumarate Substances 0.000 description 2
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 241001630118 Chrysomphalus bifasciculatus Species 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 241000555028 Sternidius alpha Species 0.000 description 2
- 235000019297 ammonium fumarate Nutrition 0.000 description 2
- CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N azane;(e)-but-2-enedioic acid Chemical compound N.N.OC(=O)\C=C\C(O)=O CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 2
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N potassium dichromate Chemical compound [K+].[K+].[O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)benzaldehyde Chemical compound CN(C)C1=CC=C(C=O)C=C1 BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102100032948 Aspartoacylase Human genes 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 101000797251 Homo sapiens Aspartoacylase Proteins 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000235650 Kluyveromyces marxianus Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187488 Mycobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000222051 Papiliotrema laurentii Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000187411 Streptomyces phaeochromogenes Species 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 235000021110 pickles Nutrition 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Vynález chrání obecnou metodu výroby stabilních
preparátů vázaných buněk s enzymovou
aktivitou, použitelných pro nejrůznější biotransformace;
podstata spočívá v chemické reakci jednotlivých
buněk s aldehydy, čímž rezultujíjednotlivé
kovalentně prokřížené buňky, které se dále
permeabilizují působením chemických, fyzikálněchemických
nebo fyzikálních faktorů. V dalším
stupni se zesítěné a permeabilizované buňky vzájemně
chemicky spojují prostřednictvím dialdehydů
a diaminů, popřípadě za působení fyzikálních
faktorů. K vzájemné chemické vazbě buněk není
třeba žádného organického či anorganického ve
vodě nerozpustného nosiče.
Description
Vynález se týká způsobu výroby stabilních preparátů vzájemně vázaných buněk prokaryontních a eukaryontních mikroorganismů s enzymatickou aktivitou, například bakterií, kvasinek a jiných imperfektních hub, použitelných pro biotransformace.
Známé způsoby vazby uvedených buněk za vzniku stabilních preparátů; lze charakterizovat jako fyzikální, fyzikálně-chemické nebo chemické, podle toho, zda je vazba buněk s nosičem nebo enzymu v buňce zprostředkována, například mechanicky při zachycení buněk v gelu, silami van der Waalsovými, polárními interakcemi nebo kovalentní vazbou. Běžně se používárůzných, ve vodě nerozpustných syntetických nebo přírodních organických či anorganických nosičů, které především zlepšují hydrodynamické a sedimentační a tím i separační vlastnosti vázaných buněčných preparátů a přispívají ke stabilizaci požadované enzymové aktivity. Různé známé způsoby vazby buněk, jejich výhody a nevýhody a jejich ekonomické limity popisuje například Vandamme (Chem. Ind., No. 24, 1070, 1976) a Jack a Zajic (Adv. Biochem. Eng. 5, 126, 1977). Fyzikální způsob vazby různých enzymově aktivních buněk, a to zabudováním nativních buněk do gelu přírodního původu je popsán například v čs. patentu č. 113908, chemický způsob například v čs. autorském osvědčení č. 200802, využívající pro vazbu buněk sférických částic syntetických polymerů na bázi methakrylamidu, glycidylmethakrylátu, hydroxyalkylmethakrylátu apod., získaných cíleně vedenou polymerací. Tyto částice se nejprve musí předem chemicky • modifikovat připojením distálních prostorových spojek s koncovými aminoskupinami a potom teprve lze na takto modifikované polymemí částice vázat buňky pomocí polyfunkčních činidel.
Podobně postup vazby různých enzymově aktivních buněk podle DOS 2 513 929 spočívá v reakci buněk s reaktivním monomerem a v jejich následné polymeraci nebo kopolymeraci, nebo v reakci s glycidylmethakrylátovým polymerem, popřípadě v kombinaci s kovalentní fixací enzymu uvnitř buněk bifunkČním činidlem.
Nosiče těchto a podobných typů jsou nákladné přípravky, jejichž cena a dostupnost limitují průmyslové využití vázaných buněčných preparátů. Jistým pokrokem ve vývoji technologie vazby ; buněk s průmyslovým významem je způsob popsa- j ný v čs. autorském osvědčení č. 197101, jehož princip spočívá ve vazbě produkčních buněk na 1 buněčné nosiče různých druhů organismů, kterými jsou buď celé neporušené anebo fyzikálně, chemicky či biochemicky ošetřené buňky či jejich neroz- i pustné fragmenty, a to chemicky, kovalentní vazbou, použitím polyfunkčních činidel. U tohoto způsobu vazby buněk odpadá ekonomický limit ceny nosiče, neboť používanými nosiči jsou odpadní buňky (odpadní buněčná hmota) po různých fermentačních výrobách, jejichž cena je převážně zanedbatelná, resp. nulová. V uvedeném čs. autorském osvědčení je rovněž popsán způsob vazby produkčních buněk navzájem, tedy bez použití nosiče. K tomu musí být však buňky do značné míry přirozeně nebo uměle autolýzovány, aby k jejich vzájemné vazbě došlo, nehledě k tomu, že takto připravené vázané buňky mají horší mechanické a sedimentační vlastnosti a následkem předchozí parciální autolýzy i nižší specifickou aktivitu. Tuto nevýhodu řeší způsob kovalentního zesítění individuálních produkčních buněk pomocí bifunkčních aldehydů (čs. autorské osvědčení č. 195 063. Při zmíněném způsobu se však v případě opakovaného použití musí buňky izolovat pomocí odstředivek, neboť rozměry jednotlivých zesitěných buněk jsou i velmi malé (přibližně kolem 1 pm), z čehož vyplývají i jejich špatné sedimentační vlastnosti, které se významně neliší od těchto vlastností u nativních buněk. Další výhodný způsob chemické vazby produkčních buněk navzájem, bez použití nosiče, je popsán, v čs. autorském osvědčení č.
203 607. Tento způsob, stejně tak jako předchozí, je omezen na vazbu buněk s penicilinacylázovou aktivitou pro výrobu 6-aminopenicilanové kyseliny enzymovou hydrolýzou penicilinu.
Bylo nyní zjištěno, že základní princip, který byl popsán pro způsob výroby vázaných buněk s penicilinacylázovou aktivitou podle čs. autorského osvědčení č. 203 607 je po dalších modifikacích a zdokonaleních použitelný i pro vazbu buněk nejrůznějších produkčních kmenů, resp. buněk s různými enzymovými aktivitami, bez ohledu na to, zda se jedná o bakteriálního producenta, kvasinku či jinou mikroskopickou houbu a bez ohledu na to, zda je požadovaná enzymová aktivita (požadovaný enzym) lokalizována v periplazmatickém či vnitrobuněčném prostoru (v cytoplazmě). Stejně tak v dostatečně širokém rozmezí, které je dokumentováno příklady provedení, není zásadně rozhodující kvalita enzymu, resp. typ žádané enzymově katalyzované biochemické reakce. Pro daný typ prokaryontní nebo eukaryontní buňky je v návaznosti na lokalizaci požadovaného enzymu v buňce a na kvalitě enzymu, resp. na typu enzymově katalyzované biochemické reakce a známém nebo předpokládaném chemickém složení buněčných povrchů, nutno specificky volit reakční podmínky kovalentního zesítění vnitrobuněčného obsahu jednotlivých buněk a zejména technicky a reakčních podmínek jejich permeabilizace po zesítění, stejně tak jako individuální technicky, . metodických postupů a reakčních podmmek^&b i následné vzájemné vazbě zesitěných a permeabilí- i zovaných buněk s cílem získání vázaných buněčných preparátů s dostatečně vysokými specifickými aktivitami, s dobrým výtěžkem enzymové aktivity a dalšími výhodnými vlastnostmi, zejména ve vztahu k rychlostí sedimentace a k distribucí velikosti vázaných buněčných částic, k jejich hydrodynamickým vlastnostem a k jejich mechanické i a enzymové stabilitě.
Vynález se tedy týká způsobu výroby stabilních preparátů vzájemně vázaných buněk prokaryontních a eukaryontních mikroorganismů s enzymatíc3 kou aktivitou, například bakterií, kvasinek a jiných imperfektních hub, použitelných pro biotransformace. Jeho podstata spočívá v tom, že se nejprve obsah jednotlivých buněk výchozího organismu zesítí reakcí s dialdehydem, s výhodou glutardialdehydem, po této reakci se zesítěné buňky permeabilizují působením fyzikálních anebo fyzikálněchemických anebo chemických faktorů, potom se nechají reagovat ve vodném prostředí s rozpustnou sloučeninou, obsahující nejméně dvě primární anebo dvě sekundární aminové skupiny, s výhodou s polyethyleniminem nebo hexamethylendiaminem, a s dialdehydem, s výhodou s glutardialdehydem, vzniklé vzájemně vázané buňky se po oddělení promyjí vodou a popřípadě mechanicky zpevňují přechodnou parciální dehydratací působením organických s vodou mísitelných rozpouštědel, s výhodou acetonu nebo jeho směsí s vodou, při teplotě 10 až -30 °C.
Zmíněnou permeabilizaci zasítěných buněk lze provádět například mícháním buněčné suspenze ve vodném prostředí při teplotách od 0 do 70 °C, při hodnotě pH 4,0 až 9,0, v přítomnosti tenzidu anebo organického s vodou mísitelného anebo nemísitel ného rozpouštědla, například butylacetátu, chloroformu nebo dimethylsulfoxidu, popřípadě za současné nebo následné změny iontové síly suspenze.
Reakce zesítěných a permeabilizovaných buněk se sloučeninou rozpustnou ve vodě, obsahující nejméně dvě primární anebo dvě sekundární aminoskupiny, se účelně provádí při teplotách pod teplotou tání reakční směsi, popřípadě při teplotě 0 až 30 °C, při relativní odstředivé síle 1 až 50 000 G nebo při filtračním tlaku od 0 do 50 650 kPa.
Způsobem podle vynálezu se získají stabilní preparáty vzájemně vázaných buněk s velmi dobrými sedimentačními a hydrodynamickými vlastnostmi a dobrou stabilitou požadované enzymové aktivity, přičemž velikost vázaných buněčných částic lze v určitém rozsahu regulovat koncentrací buněk, podmínkami reakce a technicko-metodickým postupem. Získaný materiál se vyznačuje rovněž dobrou stabilitou při mechanickém otěru vlivem míchání a tření částic. Lze jej principiálně využít pro různé průmyslové biotransformáce, realizované jak vsádkovou, tak i semikontinuální a kontinuální technologií, podle typu reaktoru. Při volbě technologie s použitím vázaných enzymově aktivních buněk připravených ve formě stabilních preparátů způsobem podle vynálezu je třeba vycházet z typu enzymově katalyzované biochemické reakce a z reakčních podmínek. Nejvýhodnější využití preparátů podle vynálezu je v reaktorech s pevným ložem vázáných buněk. Další možnost představuje vsádková opakovaná konverze požadovaným směrem v míchaném reaktoru. Částice vzniklé ze vzájemně vázaných buněk jsou pevné, ve většině případů pískovitého charakteru, v mikroskopickém obraze patrné jako ostře ohraničené nebo neohraniéené destičky, popřípadě nepravidelné morfologie. Makroskopicky připomíná tento materiál pryskyřici světle hnědého, tmavohnědého, načervenalého nebo černého zbarvení. Tvar, velikost a zbarvení částic kolísá podle typu použitých výchozích produkčních buněk a použití techniky permeabilizace a vzájemné vazby. Výtěžek imobilizace se pohybuje v rozmezí 20 až 80 % a je závislý rovněž na dříve uvedených faktorech.
Výroba vázaných enzymově aktivních buněk podle vynálezu zahrnuje tyto operace:
1. Chemická reakce produkčních buněk v míchané vodné suspenzi s bifunkčními síťovacími činidly, čímž dojde ke kovalentnímu zesítění — prokřížení vnitrobuněěného obsahu individuálních buněk aj tím k fixaci a stabilizaci požadované aktivity klíčového enzymu (enzymů), obsaženého v periplazmatickém nebo vnitrobuněěném prostoru jednotlivých buněk a ke zvýšení odolnosti těchto buněk vůči autolýze. Zásadní faktory, které ovlivňují úspěch tohoto technologického kroku, jsou koncentrace buněk, koncentrace síťovadla, reakční doba, pH suspenze, teplota reakční směsi a intenzita míchání. Tyto faktory je třeba volit individuálně.
2. Zředění suspenze buněk po reakci vodou,, jejich oddělení odstředěním, promytí vodou a ná- f sledná permeabilizace individuálních zesítěných/ buněk v míchané vodné suspenzi vlivem fyzikálních anebo fyzikálně-chemických anebo chemických faktorů, čímž se vyplaví nezreagované povr-j chové a vnitrobuněčné komponenty převážně lipi- , dického charakteru, zlepší difúzní vlastnosti zesítěných buněk, zejména u enzymů lokalizovaných ve vnitrobuněěném prostoru a odkryjí další reakce schopné skupiny jejich povrchu a uvnitř buněčného prostoru. Základními faktory, které ovlivňují dostatečnou permeabilizaci zesítěných buněk, jsou koncentrace buněk ve vodné suspenzi, intenzita míchání,:· teplota, přítomnost vhodného tenzidu a jeho koncentrace, přítomnost či nepřítomnost vhodného organického rozpouštědla a jeho koncentrace, hodnota pH a iontová síla suspenze, doba působení jednotlivých faktorů atd. Zmíněné faktory je třeba volit u každého typu buněk individuálně, a to samostatně nebo v kombinaci.
3. Zředění suspenze zesítěných a vypraných buněk po jejich permeabilizaci vodou, oddělení odstředěním, promytí vodou a následná chemická reakce v přítomnosti ve vodě rozpustné sloučeniny, obsahující nejméně dvě primární anebo sekundární aminové skupiny spolu s bifunkčními síťovacími činidly, prováděná účelně ve většině případů za takových podmínek, kdy jednotlivé buňky jsou v co nejtěsnějším vzájemném kontaktu a v minimálním pohybu. V mnoha případech je výhodné provádět vzájemnou vazbu enzymově aktivních zesítěných a permeabilizovaných buněk při ochlazení reakční směsi pod teplotu tání nebo při relativní odstředivé síle vyšší než 100 G či při filtračním tlaku vyšším než 101 kPa. Někdy, zvláště u některých enzymově aktivních eukaryontních organismů, je výhodnější reakční směs mírně míchat nebo ponechat v klidu. Za zmíněných podmínek se po určité době vytvářejí navzájem vázané, kovalentně prokřížené buněčné částice. Základními faktory, které ovlivňují vlastnosti vázaných buněk, zejména velikost částic, požadovanou zachycenou enzymovou aktivitu, sedimentační, mechanické a hydrodynamické vlastnosti a jejich stabilitu, jako i vítěžek imobilizace, jsou koncentrace buněk, koncentrace a kvalita síťovadla, koncentrace a kvalita ve vodě rozpustné sloučeniny obsahující aminové skupiny, teplota a pH reakční směsi, reakční doba a v neposlední řadě již naznačená použitá technika vedení reakce. Tyto faktory je třeba volit též individuálně.
Po vazbě buněk se získaný produkt několikrát dekantuje vodou, v případě použití techniky vazby při teplotách pod teplotou tání reakční směsi se produkt nechá samovolně rozmrazit a rovněž se několikrát dekantuje vodou a odsaje. Dobře vakuově odsátá vlhká hmota vázaných buněk se buď suší asi při 60%ní vlhkosti vzduchu při teplotě místnosti, v některých případech je výhodné odsátý materiál vpravit za míchání do vychlazeného acetonu nebo -do jeho směsi s vodou, čímž dojde k mechanickému zpevnění částic jejich částečnou přechodnou dehydratací. Produkt se pak nechá botnat ve vodném prostředí, po nabotnání se odsaje a popřípadě suší asi při 60%ní vlhkosti vzduchu do konstantní hmotnosti při teplotě místnosti. Vázané buňky lze přechovávat v dobře uzavřených skleněných nebo polyethylenových nádobách při teplotách v rozmezí 0 až 10 °C. Obsah vody ve vázaných buněčných preparátech kolísá v rozmezí 40 až 65 % hmoty. Většina preparátů za popsaných podmínek je skladovatelná po dobu několika měsíců bez ztráty původní aktivity.
Způsobem podle vynálezu lze například získávat takové stabilní preparáty, ve kterých vázané buňky obsahují enzymy například s hydrolázovou, izomerázovou, lyázovou, dekarboxylázovou, oxidoreduktázovou nebo jinou aktivitou, a to preparáty buď s jedinou aktivitou nebo s libovolnou kombinací enzymových aktivit, podle účelu použití. Vázané buňky mohou tedy obsahovat například enzym penicilinacylázu, β-galaktozidázu, L-a-amino-e-kaprolaktam hydrolázu, L-asparagin amidohydrolázu, L-aspartát amoniak lyázu, glukózoizomerázu, dekarboxylázu kyseliny L-asparagové, dekarboxylázu L-lyzinu, glukózooxidázu aj.
Při způsobu výroby stabilních preparátů vzájemně vázaných buněk podle vynálezu lze používat produkčních buněk obsahujících různé enzymy, a to různých druhů a kmenů bakterií, aktinomycet, kvasinek a dalších imperfektních hub. Je pochopitelně výhodné využívat pro vazbu buněk mitantních organismů, získaných šlechtěním či cíleně vedenou genetickou manipulací, které obsahují vysoké množství požadovaného enzymu nebo enzymů, nebof získané vázané buňky pak mají vysokou specifickou enzymovou aktivitu.
Velikost vázaných buněk ve stabilních preparátech podle vynálezu byla posuzována mikroskopicky (optickým mikroskopem) s použitím kalibrovaného měrného okuláru. Některé preparáty byly posuzovány rastrovacím elektronovým mikroskopem. Sedimentační vlastnosti byly hodnoceny tak, že 2,5 g vlhké hmoty preparátu bylo suspendováno v celkovém objemu 25 ml demineralizované vody v kalibrovaném odměmém válci a byl sledován čas potřebný ke kvantitativní sedimentaci částic. K analýze velikosti částic bylo rovněž použito kovových sít pro sítovou analýzu a vázané buňky byly děleny podle velikosti použitím tří sad těchto sít, přičemž síta měla otvory velikosti od 0,03 až do 2,0 mm.
V některých případech byla hodnocena i mechanická stabilita vázaných buněčných preparátů na otěr a stabilitu klíčové enzymové aktivity dlouhodobým mícháním suspenze vázaných buněk, například 5 až 10 g vlhké hmoty vázaných buněk ve 100 ml demineralizované vody bylo třepáno při teplotě 30 °C v 500 ml varných baňkách na rotačním třepacím stroji o počtu otáček 260/min. Ve zvolených časových intervalech byly odebírány vzorky suspenze a hodnooena požadovaná enzymová aktivita v sedimentu a supematantu.
Například aktivita penidlinacylázy byla hodnocena spektrofotometricky barevnou reakcí p-dimethylaminobenzaldehydu s kyselinou 6-aminopenicilánovou, při použití draselné soli penicilinu jako substrátu, aktivita β-galaktosidázy chromatograficky s denzitometrickým vyhodnocením přírůstků koncentrace glukózy a galaktózy při použití laktózy jako substrátu. L-a-amino-e-kaprolaktam hydrolázová aktivita byla hodnocena měřením úbytku L-a-amino-e-kaprolaktamu jako substrátu a přírůstku produktu, L-lysinu, rovněž chromatograficky s denzitometrickým vyhodnocením. Aktivita L-asparagin amidohydrolázy byla měřena přírůstkem koncentrace amónných iontů nesslerizací kolorimetricky, při použití L-asparaginu jako substrátu. L-aspartát amoniak lyázová aktivita byla hodnocena chromatograficky s denzitometrickým vyhodnocením přírůstku koncentrací kyseliny L-asparagové při použití amonné jsoli kyseliny fumarové jako substrátu. Aktivity dekarboxylázy kyseliny L-asparagové a L-lysinu byly měřeny pomocí Warburgova přístroje zjišťováním rychlosti tvorby kysličníku uhličitého za použití příslušných aminokyselin jako substrátů. Aktivita glukózooxidázy byla stanovena kolorimetricky po oxidaci o-dianizidinu peroxidem vodíku prostřednictvím peroxidázy a aktivita glukózoizomerázy rovněž kolorimetricky stanovením fruktózy po reakci s cysteinem a karbazolem. V obou případech byla jako substrát použita glukóza.
Stabilní preparáty vzájemně chemicky vázaných buněk získané způsobem podle vynálezu představují významný technický i ekonomický pokrok v obou průmyslově realizovatelných biotranšformací.
Bližší podrobnosti vyplývají z příkladů provedení, které způsob podle vynálezu blíže objasňují, ale nijak neomezují. V příkladech je rovněž uvedena enzymová aktivita nativních a vázaných buněk.
Příklad 1
Z vlhké pasty čerstvých nativních buněk Escherichia coli obsahujících enzym penicilinacylázu o specifické aktivitě 8 pmol 6-APK/hod/mg vlhké hmoty buněk (42 °C) pH 7,6 bylo připraveno 500 ml homogenní vodné suspenze o koncentraci buněk 0,25 g v. hm./ml; pH suspenze bylo upraveno na hodnotu 7,0 20% ním roztokem NaOH. K míchané vodné suspenzi byl přidán 25 %ní vodný roztok glutardialdehydu tak, aby jeho aktuální koncentrace v reakční směsi byla 1 % (hmota/objem). Reakce probíhala 3 hodiny za nepřetržitého mícháni při teplotě 20 °C. Po této době byla suspenze zředěna pitnou vodou na celkový objem 5 litrů, promíchána a buňky odstředěny (5000 G/30 minut). Bylo získáno 110 g v. hm. jednotlivě kovalentně zesítěných, promytých buněk, jejichž specifická aktivita byla 5,1 pmol 6-APK/hod/mg v. hm.
Z takto získané vlhké pasty jednotlivě zesítěných buněk byla připravena vodná suspenze o jejich koncentraci 0,25 g v. hm./ml. K homogenní míchané suspenzi jejíž pH bylo upraveno 25%ním roztokem NaOH na hodnotu 7,0 byl přidán octan butylnatý a Slovafol 909 tak, aby jejich aktuální koncentrace v suspenzi činily 2,5 obj. % v případě prvém a 0,5 obj. % v případě druhém. Suspenze byla vytemperována ve vodní lázni na 45 °C a za nepřetržitého míchání ocelovým vrtulovým míchadlem (500 ot/min) byly zesítěné buňky permeabilizovány po dobu 3 hodin. Po této době byla suspenze ochlazena na 25 °C, zředěna pitnou vodou na celkový objem 5 litrů, promíchána a buňky odstředěny (5000 G/30 minut). Bylo získáno 78,3 g v. hm. jednotlivě zesítěných a permeabilizovaných buněk, jejichž specifická aktivita byla 6,8 μπιο! 6-APK/hod/mg v. hm.
Z části vlhké pasty popsaným způsobem získaných buněk bylo připraveno 150 mí homogenní vodné suspenze o pH 7,0 a koncentraci buněk 0,3 g v. hm/ml. Míchaná suspenze byla ochlazena na 10 °C a přidán Sedipur KA (polyethylenimin)tak, aby jeho koncentrace v suspenzi byla 0,5 obj. %. Poté byl k suspenzi přidán za míchání 25%ní vodný roztok glutardialdehydu tak, aby jeho koncentrace v suspenzi byla 1 % (hmota/objem) a prqííhíchaná reakční směs byla rozpínána do 10 ml polyethylenových kyvet a v závislosti na použité relativní odstředivé sfle byla prováděna tvorba navzájem vázaných buhěk s penicilinácylázdřou aktivitou. Reakce probíhala při 0 °C v chlázených odstředivkách Janetzki K 26 po dobu 3 hodin. Po reakci byly preparáty vázaných buněk dvakrát ďekantovány vodou, vakuově odsáty přes terylenovou (mlynářskou) plachetku a ošetřeny směsí aceton : voda (1 : 1) vychlazenou na —20 °C, znovu odsáty a ponechány 16 hodin botnat ve vodě při 10 °C. Poté znovu vakuově popsaným způsobem odsáty, zváženy a hodnocena jejich rychlost sedimentace, velikost částic, jejich objem po sedimentaci a specifická aktivita způsobem, popsaným v popisu vyná- ·. lezu. Výsleáky jsou uvedeny v rtásledující tabulce.. ' .
| Rel. odstředivá síla (G) | 1100 | 4500 « | » JO 200 . | . 28 595. | -y—.----_____ - í* ’ |
| Velikost částic (gm) | 25—150 | 75—150 | ?5—300 | 75—450 | 1—2 |
| Rychlost sed. částic (min při 1 G) | 7 | 5 | 1 | 1 | kvant, nesed. |
| Objem částic po sed. (ml) | 6,5 | 5 | . 3 | 3 | — |
| Spec. aktivita (μ,πιοί 6-APK/hod/mg v. hm. váz. buněk) | 6,2 | 5,9 | 5,1 | 4,65 | 6,8 |
| Mikroskopický obraz | neohraničené útvary | s nepravidel. okraji | jednotí. buňky | ||
| Makroskopický vzhled | hnědé amorfní částice | buněčná suspenze |
* Stání reakční směsi při teplotě 0 °C po dobu 3 hodin při J G, poté odstředění, promytí a suspendace sedimentu ve vodě.
Příklad 2
Stejná čerstvá nativní pasta buněk Escherichia coli s penicilinacylázovou aktivitou byla zesítěna jak je uvedeno v příkladu 1.
Permeabilizace vodné suspenze jednotlivě kovalentně zesítěných buněk byla provedena stejným způsobem pouze s tím rozdílem, že k permeabilizaci bylo namísto octanu butylnatého použito NaCl v koncentraci 5,8 g/litr (1 M koncentrace NaCl v suspenzi); koncentrace Slovafolu 909, reakční doba i podmínky byly stejné jak je uvedeno v příkladu 1; pH suspenze bylo upraveno na stejnou hodnotu až po přidání a rozpuštění NaCl.
Z vlhké pasty zesítěných, permeabilizovaných a promytých buněk o specifické aktivitě 6,1 μπιοί 6-APK/hod/mg v. hm. byla připravena homogenní vodná suspenze o koncentraci buněk 0,3 g v. hm./ml; pH suspenze bylo 6,9. Suspenze byla vytemperována na 40 °C a při této teplotě nepřetržitě míchána ocelovým vrtulovým míchadlem (300 ot/min) po dobu 72 hodin. Po uvedené době tepelného ošetření byla suspenze ochlazena na °C a doplněna na původní objem pitnou vodou.
Ke 100 ml této suspenze byl za míchání přidán Sedipur KA a glutardialdehyd jak je uvedeno v příkladu 1 a promíchaná suspenze nalita do sáčku z lněné kalolisové plachetky. Sáček byl uzavřen a umístěn ve vodorovné poloze mezi dvě kovové desky a na jeho obsah působeno filtračním tlakem 1,25.104 kPa pomocí hydraulického lisu při teplotě místnosti po dobu 30 minut.
Popsaným způsobem vznikla hnědočerná pevná hmota o celkové hmotnosti 25 g ve tvaru nepravidelné desky. Získaná hmota byla rozřezána na nepravidelné thenší části a pomocí kuchyňského mixeru homogenizována ve 200 ml pitné vody přerušovaně po dobu cca 15 minut při laboratorní teplotě. Po homogenizaci byl materiál dekantován dvakrát 1 litrem vody, vakuově dobře odsát přes terylenovou plachetku a zvážen.
Bylo získáno 2l g vlhké hmoty vázaných buněk *s distribucí velikosti nepravidelných částic 50 až 5000 gm; specifická aktivita homogenátu vázaných ' buněk činila 3,3 gmol 6-AKP/hod/mg v. hm. a k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 2 minutové stání. '
Příklad 3
Z vlhké zesítěné, permeabilizované a promyté pasty buněk Escherichia coli s penicilinacylázovou aktivitou o specifické aktivitě 4,64 gmol 6-APK/ hod/mg v. hm., kdy zesítění jednotlivých buněk bylo provedeno podle příkladu 1 a jejich permeabilizace a další tepelné ošetření po dobu 72 hodin podle příkladu 2, bylo připraveno 500 ml vodné suspenze o koncentraci buněk 0,25 g v. hm./ml.
K homogenní suspenzi o teplotě 15 °C a pH 7,0 byl za míchání přidán 10%ní (hmota/objem) vodný roztok hexamethylendiaminu o pH 7,0 tak, aby jeho koncentrace v suspenzi činila 0,5 % (hmota/ objem), a po 15 minutách stání byl za míchání přidán 25%ní vodný roztok glutardialdehydu tak, aby jeho koncentrace v reakční směsi byla 2 % (hmota/objem). Reakční směs byla odstředěna (10 minut/5000 G) a z takto vzniklé pasty byl zhotoven kruhový vlhký koláč o průměru 5 cm a výšce 1 cm i na podložce z kalolisové lněné tkaniny. Vlhký > koláč byl vsunut do sáčku z téhož materiálu a sáček uložen mezi dvě kovové desky ve vodorovné poloze a vystaven filtračnímu tlaku 1,25.104 kPa pomocí hydraulického lisu při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Část tmavodnědé pevné hmoty (10 g) byla rozmixována ve vodě a odsáta způsobem popsaným v příkladu 2; byly získány vázané buňky s penicilinacylázovou aktivitou s distribucí velikosti částic 100 až 1000 gm, jejichž specifická aktivita činila 2,75 gmol 6-APK/hod/mg v. hm.
a k.jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 3 minuto- j vé stání.
I!
'< Příklad 4
K 80 ml vodné suspenze zesítěných, permeabili- , zovaných a tepelně ošetřených buněk Escherichia i coli s penicilinacylázovou aktivitou (specifická aktivita byla 5,16 gmol 6-APK/hod/mg v. hm., koncentrace buněk v suspenzi 0,25 g v. hm./ml) o pH 7,0, která byla získána postupem uvedeným v příkladu 3, byl přidán 10%ní vodný roztok hexamethylendiaminu o pH 7,0 tak, aby jeho koncentrace v suspenzi činila 0,5 % (hmota/objem), směs byla krátce promíchána a poté ponechána v klidu stát při teplotě 11 °C po dobu 20 hodin. Poté byl za míchání k vodné suspenzi přidán 25%ní vodný roztok glutardialdehydu tak, aby jeho koncentrace v suspenzi činila 2 % (hmota/objem). Poté byla reakční směs vylita na kruhovou misku o průměru 14 cm zhotovenou z alobalu a miska uložena v horizontální poloze do mrazícího ; boxů; tloušťka vrstvy na misce byla cca 0,5 cm, reakce probíhala 48 hodin při teplotě —23 °C. Po této době byla miska z pražícího boxu vyjmuta a přelita cca 100 ml pitné vody a materiál ponechán při teplotě místnosti rozmrazit. Po rozmražení byly vázané buňky třikrát dekantovány 100 ml pitné vody, vakuově odsáty přes terylenovou plachetku a zváženy.
Bylo získáno 14,3 g v. hm. odsátých vázaných buněk. Toto množství bylo suspendováno ve 107 ml acetonu p. a., předem vychlazeného na teplotu — 23 °C,. pp dobu 3 minut materiál ve zchlazeném acetonu míchán a poté ihned a ostře, popsaným způsobem, vakuově odsát. Vázané buňky ponechány botnat přes noc v 0,05 M fosfátovém pufru pH 7,6 při 8 °C a poté popsaným způsobem vakuově odsáty a po dobu cca 20 minut na plachetce odsávány.
Bylo získáno 14,2 g v. hm. hnědých šupinatých vázaných buněk, které stáním kvantitativně sedimentovaly za 10 minut; distribuce velikosti částic se pohybovala v rozmezí 75 až 300, gm a jejich specifická aktivita byla 4,25 gmol 6-APK/hod/mg v, hm. Materiál byl vystaven testování stability jeho enzymové aktivity a mechanické stability částic za podmínek uvedených v popisu vynálezu. Po 528 ; hodinách (22 dnů) nepřetržitého třepání suspenze ' vázaných buněk činila jejich specifická aktivita 85 % aktivity původní při zachování 70 % celkové hmoty materiálu vztaženo na hmotnost původní.
Příklad 5 g v. hm. (pasty) čerstvých nativních buněk Alcaligenes faecalis s penicilinacylázovou aktivitou bylo suspendováno v 8Q ml pitné vody; pH suspenze bylo upraveno na hodnotu 7,0 20%ním rozto: kem NaOH. Suspenze obsahovala 0,25 g v. hm. ί nativních buněk/ml o specifické aktivitě 0,25 gmol i 6-APK/hod/mg v. hm. (42 °C) pH 7,6. i Zesítění jednotlivých buněk bylo provedeno • podle příkladu 1. Permeabilizace zesítěných buněk : podle příkladu 2. Tepelné ošetření zesítěné a permeabilizované suspenze rovněž podle příkladu 2 s tím rozdílem, že teplota míchané suspenze byla 37 °C za jinak stejných podmínek ošetření.
Ke 100 ml vodné suspenze zesítěných, permeai bilizovaných a tepelně ošetřených buněk. A, faecaΊ lis byl po jejich ochlazení na teplotu 10 °C za míchání přidán Šedipur KA (polyethylenimin)tak, aby jeho koncentrace v suspenzi činila 0,5 % (hmota/objem). Poté suspenze ponechána v klidu stát po dobu 30 minut a dále byl za míchání přidán 25%ní vodný roztók glutardialdehydu· tak, aby jeho koncentrace v suspenzi činila 1 % (hmota/objem), suspenze krátce promíchána a dále bylo postupováno stejně, jak je uvedeno v příkladu 4 s tím rozdílem, že reakční doba během mrazení činila 5 hodin.
Bylo získáno 11,8 g v. hm. tmavěhnědých vázaných buněk, které stáním sedimentovaly kvantitativně za 4 minuty; distribuce velikosti částic se pohybovala v rozmezí 150 až 300 pm a jejich specifická aktivita činila 0,23 pmol 6-APK/hod/ mg v. hm. Enzymová a mechanická stabilita částic sledovaná za podmínek uvedených v popisu vynálezu po dobu 10 dnů (240 hodin) činila za uvedenou dobu nepřetržitého třepání 100 % původní aktivity při zachovám 94 % původní hmoty materiálu.
Příklad 6
250 g v. hm. čerstvé nativní pasty buněk Escherichia coli obsahujících enzym beta-galaktosidázu bylo suspendováno v 750 ml pitné vody; byla tak připravena homogenní suspenze buněk o pH 7,0, která obsahovala 0,33 g v. hm. nativních buněk (ml o jejich specifické aktivitě 0,035 pmolů glukózy + galaktózy) min/mg v. hm. (37 °C) pH 7,0.
Kovalentní zesítění vnitrobuněčného obsahu jednotlivých buněk a jejich promytí bylo provedeno podle příkladu 1. Permeabilizace buněk byla provedena kombinovaným účinkem změny iontové síly, přítomností tenzidu a teplotou v míchané suspenzi zesítěných buněk podle příkladu 2 s tím rozdílem, že namísto Slovafolu 909 byl použit Slovafol 910 ve stejné koncentraci a teplota během 3 hodinové permeabilizace v přítomnosti 1 MNaCl byla namísto 45 °C pouze 40 °C. Bylo získáno 190 g v. hm. (pasty) zesítěných, permeabilizovaných a promytých buněk, jejichž specifická aktivita činila 0,029 pmolů glukózy + galaktózy/min/mg v. hm. Pasta těchto buněk byla suspendována v pitné vodě tak, aby koncentrace buněk činila 0,3 v. hm/ml a za míchání tepelně ošetřena při 40 °C po dobu 72 hodin rovněž jak je uvedeno v příkladu 2.
Po doplnění objemu suspenze pitnou vodou na objem původní a ochlazení suspenze na 15 °C bylo při vzájemné vazbě buněk postupováno podle příkladu 5 s tím rozdílem, že reakční doba během mražení činila 4 hodiny a že reakční směs byla po krátkém promíchání po přidání glutardialdehydu ihned rozplněna po 375 ml do polyethylenových sáčků, tyto zataveny a umístěny ve vodorovné poloze na hliníkové tácy. Způsob ošetření vázaných buněk po reakci (rozmražení, dekantace, filtrace, ošetření acetonem, botnání atd.) bylo provedeno podle příkladu 4 s tím rozdílem, že vázané buňky byly botnány přes noc v deminerali! zované vodě za jinak stejných podmínek.
Bylo získáno 110 g v. hm. vázaných buněk s beta-galaktosidázovou aktivitou o specifické aktivitě 0,021 pmolů glukózy + galaktózy/min/mg v. hm., makroskopicky připomínající tmavěhnědou pryskyřici pískovitého charakteru, mikroskopicky se jevící jako neohraniěené nepravidelné destičky s distribucí velikosti částic 75 až 300 pm. Ke kvantitativní sedimentaci částic došlo za 4 minuty'. Vlhkost preparátu činila 60 %. Materiál byl vystaven testování mechanické a enzymové stability jak je uvedeno v popisu vynálezu; po 1632 hodinách (68 dnech) nepřetržitého třepání materiálu ve vodné suspenzi činila specifická aktivita vázaných buněk 110 % aktivity původní a zůstatek celkové hmotnosti materiálu po této době činil 75 % původní hmoty. 25 % hmoty materiálu vlivem obroušení a tím zmenšení částic po uvedené době třepání prošlo plachetkou při filtraci a odsávání. Materiál vázaných buněk zůstal beze změny popsaných charakteristik včetně specifické aktivity během jeho skladování v uzavřené polyethylenové lahvi uchovávané při 10 °C po dobu 6 měsíců. Příklad 7 ;
Ze stejného ^množství vlhké hmoty čerstvých nativních buněk Escherichia coli s beta-galaktosidázovou aktivitou jako v příkladu 6 bylo vyrobeno 80 g vlhké hmoty vázaných buněk postupem uvedeným rovněž v příkladu 6 s tím rozdílem, že k permeabilizaci zesítěných buněk bylo použito namísto změny iontové síly (1 M NaCl) kombinovaného účinku stejné teploty a stejného tenzidu v přítomnosti 2,5 obj. % chloroformu a 1 obj. % dimethylsulfoxidu za jinak stejných podmínek reakce a manipulace.
Charakteristiky preparátu byly podobné jako v příkladu 6 s tím rozdílem, že specifická aktivita materiálu činila 0,028 gmolů glukózy + galaktózy/ min/mg v. hm. vázaných buněk. Stabilita materiálu za podmínek skladování uvedených v příkladu 6 se nezměnila po dobu 3 měsíců sledování.
Příklad 8
250 g v. hm. čerstvé nativní pasty buněk Escherichia coli obsahujících beta-galaktosidázu jako v příkladu 6 bylo ve vodné suspenzi zesítěno, permeabilizováno a tepelně ošetřeno postupem uvedeným rovněž v příkladu 6.‘ Vzájemná vazba buněk v přítomnosti hexamethylendiaminu a ošetření vázaných buněk po vazbě byla provedena postupem uvedeným v příkladu 4.
Bylo získáno 96 g v. hm. oranžově hnědých vázaných buněk ve tvaru šupin, které stáním sedimentovaly kvantitativně za 12 minut; distribuce velikosti částic se pohybovala v rozmezí 75 až 350 pm a jejich specifická aktivita činila 0,019 pmolů glukózy + galaktózy/min/mg vlhké hmoty materiálu.
Příklad'9
Z čerstvé nativní vlhké hmoty (pasty), buněk kvasinky Kluyveromyces fragilis obsahující enzym beta-galaktosidázu bylo připraveno 100 ml vodné suspenze v prostředí 0,05 M fosfátového pufru pH 7,0; koncentrace nativních buněk v suspenzi činila 0,35 g v. hm. (ml a specifická aktivita těchto buněk byla 0,017 μιηοΐύ glukózy + galaktózy) hod/mg v. hm. (37 °C) pH 7,0.
Kovalentní zesítění vnitrobuněčného obsahu jednotlivých buněk včetně způsobu promytí a separace vlhké zesítěné biomasy bylo provedeno podle příkladu 1. Permeabilizace 100 ml vodné suspenze kvasinek o koncentraci buněk v suspenzi 0,25 g v. hm/ml a pH 7,0 byla provedena při teplotě 40 °C v přítomnosti 1 obj. % dimethylsulfoxidu a 0,5 obj. % toluenu v nepřítomnosti tenzidu ostrým mícháním buněčné suspenze ocelovým vrtulovým míchadlem (800 ot/min) po dobu 3 hodin. Poté byla suspenze ochlazena na teplotu místnosti a naředěna pitnou vodou na celkový objem 1 litr, krátce promíchána, buňky odstředěny (5000 G/20 minut), mléčně zakalený supernatant slit a buněčný sediment suspendován ve stejném objemu pitné vody a znovu popsaným způsobem odstředěn. Bylo získáno celkem 20 g v. hm. jednotlivě zesítěných, permeabilizovaných a promytých kvasinek, jejichž specifická aktivita činila 0,022 μιηοΐύ glukózy + galaktózy/hod/mg. v. hm.
g v. hm popsaným způsobem ošetřených kvasinek bylo suspendováno v 380 ml pitné vody a za míchání upraveno pH homogenní suspenze buněk 20%ním roztokem NaOH na hodnotu 7,0. x Poté byla suspenze přelita do 1 litrové erlenmaye- v rovy baňky a přidán Sedipur KA (polyethylenimin) tak, aby jeho koncentrace v suspenzi činila 0,5 obj. %. Suspenze byla krátce promíchána a ponechána stát cca 15 minut. Poté byl za míchání přidán 25%ní vodný roztok glutardialdehydu tak, aby jeho koncentrace v reakční směsi činila 1 obj. %. Baňka byla umístěna na pomaloběžný reciproký třepací stroj o počtu kyvů 40/min. Reakce probíhala 3 hodiny při teplotě 29 °C za uvedených podmínek míchání. Po této době byla reakční směs zředěna pitnou vodou na celkový objem 2 litry a odstředěna (5000 G/10 minut). Sediment navzájem vázaných kvasinek byl suspendován v 1 litru pitné vody a vakuově na nuči odsát přes terylenovou plachetku a zvážen. 9,7 g v. hm. odsátého a promytého materiálu bylo za míchání suspendováno ve 100 ml acetonu vychlazeného na —20 °C, mícháno po dobu 3 minut a poté ihned částice vakuově popsaným způsobem ostře odsáty a poté ještě prosávány po dobu cca 10 minut načež byly suspendovány ve 100 ml 0,05 M fosfátového pufru > pH 7,0 a ponechány přes noc botnat při teplotě 10 °C. Bylo získáno 8,1 g v. hm. navzájem vázaných kvasinek s beta-galaktosidázovou aktivitou.
Specifická aktivita materiálu činila 0,009 μιηοΐύ glukózy + galaktózy/hod/mg v. hm. vázaných buněk. Distribuce velikosti částic se pohybovala v rozmezí 100 až 850 μιη a k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 2 minutové stání. Stabilita materiálu při skladování za podmínek uvedených v příkladu 6 byla konstantní po dobu 3 měsíců.
Příklad 10
470 g v. hm. čerstvých nativních buněk kvasinky Cryptococcus laurentii s L-alfa-amino-epsilonaminokaprolaktam hydrolázovou aktivitou bylo suspendováno v prostředí 0,05 M fosfátového pufru pH 7,0 na celkový objem 4,7 litru; pH homogenní suspenze bylo doupraveno 20%ním roztokem KOH na hodnotu pufru. Vznikla suspenze obsahující 0,1 g v. hm. nativních buněk/ml o specifické aktivitě 6,01 μηιοίύ L-lysinu/hod/mg v. hm. (37 °C) pH 7,5.
Kovalentní zesítění vnitrobuněčného obsahu jednotlivých kvasinek v suspenzi bylo provedeno podle příkladu 1. Po reakci bylá suspenze naředěna pitnou vodou na celkový objem 50 litrů, krátce promíchána a odstředěna na šeparátoru Sharples. Bylo získáno 320 g v. hm. zesítěných a promytých buněk ve formě vlhké pasty jejichž specifická aktivita činila 3,83 μπίθΐύ L-lysinu/hod/mg v. hm. * »
320 g v. hm. zesítěných a promytých buněk bylo suspendováno na celkový objem 3,2 litrů v pitné vodě a za ostrého míchání (800 ot/tnin) ocelovým vrtulovým míchadlem permeabilizováno v přítomnosti 1 obj. % dimethylsulfoxidu při teplotě
42,5 °C po dobu 3 hodin. Poté byla suspenze ochlazena na teplotu místnosti a zředěna na celkový objem 35 litrů pitnou vodou a odstředěna do formy vlhké buněčné pasty na šeparátoru Sharples. Bylo získáno 283 g v. hm. jednotlivě zesítěných, permeabilizovaných a promytých buněk kvasinek, jejichž specifická aktivita činila 4,15 μιηοΐύ L-lysinu/hod/mg v. hm.
Z části vlhké hmoty popsaným způsobem získaných buněk bylo připraveno 200 ml homogenní vodné suspenze jejíž pH bylo upraveno 20%ním roztokem KOH na hodnotu 7,0; suspenze obsahovala 50 mg v. hm. buněk/ml. Suspenze byla rozdělena na dvě stejné objemové části (á 100 ml) označené A a B a do každé z nich byl za míchání přidán Sedipur KA (polyethylenimin) tak, aby jeho koncentrace v suspenzi činila 0,5 obj. %, načež z nich byly různou technikou připraveny navzájem vázané enzymově aktivní buňky způsobem jak následuje:
A. Suspenze byla za míchám ochlazena na 10 °C a ponechána stát 30 minut. Poté byl přidán za míchání 25 %ní vodný roztok glutardialdehydu tak, aby jeho koncentrace v suspenzi činila 1 obj. %. Po krátkém promíchání byla vzájemná vazba buněk provedena technikou mrazení reakční směsi za podmínek uvedených v příkladu 5; způsob ošetření částic po vazbě byl proveden podle příkladu 4.
Bylo získáno 3,8 g v. hm. navzájem vázaných kvasinek s L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktam hydrolázovou aktivitou; specifická aktivita materiálu činila 0,52 μιηοΐύ L-lysinu/hod/mg v. hm. Distribuce velikosti částic se pohybovala od 75 do 1450 gm a k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 1 minutové stání. Mikroskopicky posuzováno tvořily částice jehlicovité ostře ohraničené útvary připomínající krystaly. Makroskopicky připomínal materiál heterogenně krystalovaný dvojchroman draselný včetně typického hnědočerveného zabarvení. Stabilita materiálu při skladování za podmínek uvedených v příkladu 6 byla konstantní po dobu 6 měsíců.
B. K pomalu míchané suspenzi pri laboratorní teplotě byl přidán glutardialdehyd ve stejné koncentraci jako ve variantě A a dále bylo postupováno při vzájemné vazbě buněk technikou pomalého míchání reakční směsi jak je uvedeno v příkladu 9 včetně způsobu ošetření vzniklých částic po vazbě.
Bylo získáno 2,75 g v. hm. navzájem vázaných kvasinek s L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktam hydrolázovou aktivitou; specifická aktivita materiálu činila 1,8 μηιοίύ L-lysinu/hod/mg v. hm. Distribuce velikosti částic se pohybovala v rozmezí od 15 do 900 um a k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 5minutové stání. Mikroskopicky posuzováno tvořily částice nepravidelné útvary s nepravidelnými okraji. Makroskopicky materiál tvořil amorfní vatovité útvary. Stabilita materiálu při skladování za podmínek uvedených v příkladu 6 byla konstatní po dobu 6 měsíců.
Příklad 11
500 g vlhké hmoty (pasty) čerstvých nativních buněk Alcaligenes metalcaligenes obsahujících enzym L-aspartát amoniak lyázu bylo suspendováno v 0,05 M fosfátovém pufru na celkový objem' 2 litry; vznikla homogenní suspenze o pH 7,1 obsahující 0,25 g v. hm. nativních buněk/ml. Spe- i cifická aktivita nativních buněk činila 0,75 μηιοίύ ’ * kys. L-asparagové/min/mg v. hm. (37 °C) pH: j 8,5. : ‘
Kovalentní zesítění vnitrobuněčného obsahu jednotlivých buněk bylo provedeno podle příkladu
1. Permeabilizace zesítěných buněk byla provedena podle příkladu 2 s tím rozdílem, že teplota míchané suspenze během permeabilizace činila 40 °C. Tepelné ošetření buněk bylo provedeno rovněž podle příkladu 2. Vzájemná vazba buněk byla provedena technikou mrazení způsobem uvedeným v příkladu 6; způsob ošetření vázaných buněk po jejich vazbě je rovněž uveden v příkladu
6.
Bylo získáno 198 g vlhké hmoty vzájemně vázaných buněk s L-aspartát amoniak lyázovou aktivitou; specifická aktivita materiálu, činila 0,5 μηιοί kys. L-asparagové/min/mg v. hm. Distribuce velikosti částic se pohybovala v rozmezí 75 až 300 μιη a k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 3 minutové stání. Mikroskopicky posuzováno materiál tvořil neohraničené útvary s nepravidelnými okraji. Makroskopicky materiál tvořil světlehnědé šupiny slídovitého charakteru. Stabilita materiálu při skla209265 dování za podmínek uvedených v příkladu 6 byla konstantní po dobu 1 měsíce.
Příklad 12
750 g vlhké hmoty (pasty) čerstvých nativních buněk Corynebaeterium glutamicum obsahujících enzym aspartát amoniak lyázu bylo suspendováno v 0,05 M fosfátovém pufru na celkový objem 3 litry; homogenní suspenze obsahovala 0,25 g v. hm. nativních buněk/ml a jejich specifická aktivita byla 1 μηιοί kys. asparagové/min/mg v. hm. (37 °C) pH 8,5.
Kovalentní zesítění vnitrobuněčného obsahu jednotlivých buněk bylo provedeno podle příkladu 1; jejich permeabilizace byla provedena stejně jak je uvedeno v příkladu 2 pouze s tím rozdílem, že namísto Slovafolu 909 byl použit pri permeabilizaci Slovafol 910 ve stejné koncentraci za jinak stejných podmínek. Tepelné ošetření buněk bylo provedeno rovněž podle příkladu 2. Vzájemná vazba buněk byla provedena technikou mrazení reakční směsi způsobem uvedeným v příkladu 6 včetně způsobu ošetření materiálu po vazbě.
Bylo získáno 312 g v. hm. vzájemně vázaných buněk s L-aspartát amoniak lyázovou aktivitou; specifická aktivita materiálu činila 0,63 μηιοί kys. L-asparagové/min/mg v. hm. Distribuce velikosti částic se pohybovala v rozmezí 50 až 250 μιη a k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 10 minutové stání. Mikroskopicky posuzováno materiál tvořil neohraničené útvary s nepravidelnými okraji. Makroskopicky materiál tvořil béžové šupiny. Stabilita materiálu při skladování za podmínek uvedených v příkladu 6 byla konstantní po dobu 3 měsíců.
Příklad 13
Z vlhké pasty čerstvých nativních buněk Escherichia coli obsahujících enzym aspartát amoniak lyázu o specifické aktivitě 0,35 pmol kys. L-asparagové/min/mg v. hm. nat. buněk (37 °C) pH 8,5 bylo připraveno 500 ml homogenní vodné suspenze o koncentraci buněk 0,25 g v. hm./ml; pH suspenze bylo upraveno za míchání 20%ním roztokem NaOH na hodnotu 7,0.
Kovalentní zesítění vnitrobuněčného obsahu bylo provedeno podle příkladu 1 včetně způsobu jejich permeabilizace. Tepelné ošetření buněk po permeabilizaci bylo provedeno podle příkladu 2. 150 ml homogenní vodné suspenze obsahující 0,3 g v. hm./ml popsaným způsobem ošetřených buněk bylo použito k přípravě navzájem vázaných buněk technikou odstřeďování způsobem popsaným v příkladu 1 včetně způsobu jejich ošetření po vazbě. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.
| Rel. odstředivá síla (G) | i 100 | 4500 | 10 200 28 595 | 1* |
| Velikost částic (μιη) | 25—150 | 50—320 | 75—400 75—425 | 1—2 |
| Rychlost sed. částic (min při 1 G) | 12 | 6,5 | 1 1 | kvant, nesed. |
| Objem částic po sed. (ml) | 10 7,5 4 4 — | |
| Spec. aktivita (/imol kys. L-asp./ min/mg v. hm. váz. b. | 0,2 0,13 0,09 0,09 | 0,28 |
| Mikroskopický obraz | neohr. útvary s nepravidel. okraji | jednotí. buňky |
| Makroskopický vzhled | amorfní světle hnědé částice | buněčná suspenze |
* Stání reakční směsi při teplotě 0 °C po dobu 3 hodin při 1 G, poté odstředění, promytí a suspendace sedimentu ve vodě.
Příklad 14
Z vlhké pasty čerstvých nativních buněk Mycobacterium sp. obsahující enzym dekarboxylázu L-asparagóvé kyseliny o specifické aktivitě 7,1 jednotek/gram v. hm. (1 jednotka účinnosti je takové množství enzymu, které uvolní 100 μΐ CO2 z kyseliny L-asparagové za 5 minut při teplotě 30 °C a pH 5,5) bylo připraveno 100 ml homogenní vodné suspenze o koncentraci nativních buněk 0,3 g v. hm./ml; pH suspenze bylo za míchání upraveno 20%ním roztokem NaOH na hodnotu 7,0.
Kovalentní zesítění vnitrobuněčného obsahu jednotlivých buněk bylo provedeno podle příkladu
1. Permeabilizace zesítěných buněk byla provedena podlé příkladu 2 s těmi rozdílý, že koncentrace zesítěných buněk v míchané suspenzi činila 0,1 g v. hm./ml, pH suspenze bylo 6,1, namísto Slovafolu 909 byl použit Slovafol 910 ve stejné koncentraci a namísto 1 M NaCl byl použit chloroform o aktuální koncentraci 5 obj. %, teplota suspenze byla 35 °C a doba trvání permeabilizace 1 hodinu. Další tepelné ošetření po permeabilizaci zesítěných buněk nebylo prováděno. Promyté, zesítěné a permeabilizované buňky byly vázány navzájem technikou mrazení postupem uvedeným v příkladu 5 s tím rozdílem, že koncentrace buněk v reakční směsi činila 0,1 g v. hm./ml. Ošetření vázaných buněk po jejich vzájemné reakci bylo provedeno podle příkladu 4.
Bylo. získáno 12,1 g v. hm. vzájemně vázaných buněk s dekarboxylázovou aktivitolTkyseliny L-asparagové o specifické aktivitě 0,2 j/g v. hm. materiálu. Distribuce velikosti částic se pohybovala v rozmezí 150 až 1000 pm; částice špatně samovolně sedimentovaly, daly se však dobře filtrovat a odsávat. Makroskopicky posuzováno tvořily částice amorfní šedožluté vločky se špatně smočivým povrchem. Stabilita materiálu při skladování za podmínek uvedených v příkladu 6 byla konstantní po dobu 1 měsíce.
Přiklad 15
Z vlhké pasty čerstvých nativních buněk Bacterium cadaveris obsahujících enzym dekarboxylázu L-lysinu o specifické aktivitě 16,4 jednotek/g v. hm. (1 jednotka účinnosti je takové množství enzymu, které uvolní 100 μΐ CO2 z L-lysinu při teplotě 30 °C a pH 5,5) bylo připraveno 100 ml homogenní vodné suspenze o pH 7,0 a koncentraci i nativních buněk 0,25 g v. hm./ml.
Kovalentní zesítění vnitrobuněčného obsahu jednotlivých buněk bylo provedeno podle příkladu
1. Permeabilizace zesítěných buněk podle příkladu 2 s těmi rozdíly, že koncentrace buněk v permeabilizované suspenzi činila 0,1 g v. hm./ml, pH suspenze bylo 6,3 a namísto Slovafolu 909 byl použit Slovafol 910 o stejné koncentraci, přičemž teplota během permeabilizace byla 35 °C. Dále bylo postupováno podle odkazu uvedeného v předchozím příkladu (příklad 14).
Bylo získáno 9,35 g v. hm. vzájemně vázaných buněk s dekarboxylázovou aktivitou L-lysinu o specifické aktivitě 0,67 j/g v. hm. materiálu. Distribuce velikosti částic se pohybovala v rozmezí 75 až 300 μπι á k jejich kvantitativní sédimentaci vedlo 4 minutové stání. Mikroskopicky posuzováno byly částice tvořeny šupinatými destičkami s nepravidelnými okraji. Makroskopicky posuzováno připomínaly částice jemnou pryskyřici světle hnědého zbarvení. Stabilita materiálu při skladování za podmínek uvedených v příkladu 6 byla konstantní po dobu 1 měsíce sledování v jednotýdeních intervalech.
Příklad 16
300 g vlhké hmoty (pasty) čerstvých nativních buněk Escherichia coli obsahujících éhzym L-asparagin amidohydrolázu bylo suspendováno v pitné vodě na celkový objem 1 litr. Homogenní suspenze obsahovala 0,3 g v. hm. nativních buněk/ ml a jejich specifická aktivita byla 0,09 μπιοί kys. L-asparagové/min/mg v. hm. (37 °C) pH 5,0.
Kovalentní zesítění vnitrobuněčného obsahu jednotlivých buněk bylo provedeno podle příkladu 1 a bylo získáno 394 g vlhké hmoty zesítěných, promytých buněk o specifické aktivitě 0,015 pmol kys. L-asparagové/min/mg v. hm. Permeabilizace suspenze obsahující 0,25 g v. hm. zesítěných buněk/ml byla provedena v přítomnosti pouze 1 M NaCl, pH suspenze bylo 6,0 a suspenze byla , třepána v 500 ml varných baňkách se třemi vlisy ί (zarážkami) na rotačním třepacím stroji o počtu i otáček 260/min při teplotě 30 °C po dobu 3 hodin. Po permeabilizaci byly buňky promyty zředěním pitnou vodou na desetinásobek objemu suspenze | a odstředěny (5000 G/30 minut). Z 250 g v. hm.
zesítěných buněk bylo získáno 181,5 g v. hm.
: zesítěnýchy -permeabilizovaných a premytých buněk Q specifické aktivitě 0,029 pmol kys. L-asparagové/min/mg v. hm. Tepelné ošetření buněk po i permeabilizaci bylo provedeno podle příkladu 2, vzájemná vazba buněk technikou mrazeni podle příkladu 6 a ošetření buněk po vzájemné vazbě podle příkladu 4.
Bylo získáno 1Ó2 g v. hm. vzájemně vázaných buněk s L-asparagin amidohydrolázovou aktivitou; specifická aktivita materiálu byla 0,039 μπιοί. ' kys. L-asparagové/min/mg. Distribuce velikosti částic se pohybovala v rozmezí 75 až 750 pm a k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo stání 8 minut. Mikroskopicky posuzováno tvořil materiál neohraničené útvary s nepravidelnými okraji. Makroskopicky tvořil materiál šupiny světle hnědé barvy. Stabilita materiálu při skladování za podmínek uvedených v příkladu 6 byla konstantní po dobu 3 měsíců.
Příklad 17
150 g vlhké hmoty (pasty) čerstvých nativních buněk Erwinia aeroidea obsahujících enzym L-asparagin amidohydrolázu bylo suspendováno v pitné vodě na celkový objem 500 ml; homogenní suspenze obsahovala 0,3 g v. hm. nativních buněk/ ml o specifické aktivitě 0,15 pmol kys. L-asparagové/min/mg v. hm. (37 °C) pH 5,0. pH suspenze bylo upraveno 20% ním roztokem NaOH na hodnotu 7,0.
Dále bylo postupováno podle příkladu 16; bylo získáno 100 g v. hm. zesítěných, permeabilizovaných a tepelně ošetřených buněk, jejichž specifická aktivita byla 0,12 gmol kys. L-asparagové/min/mg v. hm. Při vzájemné vazbě buněk technikou filtračního tlaku bylo dále postupováno podle příkladu 2 s tím rozdílem, že reakční doba činila 2 hodiny.
Popsaným způsobem vznikla pevná hnědá hmota o celkové hmotnosti 75 g ve tvaru nepravidelné desky. Získaná hmota byla rozřezána na nepravidelné menší kousky a pomocí masového strojku rozemleta; vznikl křehký granulovaný materiál, který byl suspendován v 250 mg acetonu vychlazeného na —20 °C a po dobu 3 minut intenzívně míchán. Poté byl materiál ihned ostře vakuově odsát přes terylenovou plachetku a na plachetce ještě cca 20 minut odsáván. Poté byl suspendován ve 250 ml demineralizované vody a ponechán přes noc botnat při 10 °C. Poté byl materiál dobře odsát a zvážen.
Bylo získáno 63 g v. hm. navzájem vázaných buněk s L-asparagin amidohydrolázovou aktivitou o specifické aktivitě 0,05 μπιοί kys. L-asparagové/ min/mg v. hm. Distribuce velikosti částic se pohybovala v rozmezí hodnot 550 až 1650 pm a k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 1 minutové stání. Makroskopicky posuzováno tvořily částice hnědé amorfní granule. Stabilita materiálu při skladování za podmínek uvedených v příkladu 6 byla konstantní po dobu 6 měsíců.
Příklad 18
150 g vlhké hmoty čerstvých nativních buněk Aspergillus niger obsahujících enzym glukózooxidázu o specifické aktivitě 0,105 pmol H2O2/min/ mg v. hm. nativních buněk bylo suspendováno v 1 litru pitné vody; suspenze obsahovala 0,15 g v. hm./ml., pil suspenze bylo za míchání upraveno 20%ním roztokem NaOH na hodnotu 7,0.
Kovalentní zesítění vnitrobuněčného obsahu jednotlivých buněk bylo provedeno podle příkladu 1 a bylo získáno 125 g v. hm. zesítěných buněk o specifické aktivitě 0,08 μπιοί H2O2/min/mg v. hm. Pěrmeabilizace zesítěných a promytých buněk byla prováděná ve vodné suspenzi obsahující 0,05 g v. hm. zesítěných buněk/ml v baňkách se třemi vlisy postupem uvedeným v příkladu 16. Bylo získáno 107 g v. hm. zesítěných a permeabilizovaných buněk o specifické aktivitě 0,1 μπιοί H2O2/min/mg v. hm. Tepelné ošetření buněk po permeabilizaci nebylo prováděno. Vzájemná vazba buněk byla provedena technikou mrazení podle příkladu 6 s tím rozdílem, že koncentrace zesítěných a permeabilizovaných buněk v reakční směsi byla 0,08 g v. hm./ml. Ošetření materiálu po vazbě bylo provedeno rovněž podle příkladu 6.
Bylo získáno 62 g vlhké hmoty vzájemně vázai ných buněk s giukózooxidázovou aktivitou; specii fická aktivita materiálů činila 0,095 μπιοί H2O2/ ; min/mg v. hm. Distribuce velikosti částic se pohy bovala v rozmezí hodnot 100 až 1000 gm a k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 12 minutové stání. ' Makroskopicky posuzováno tvořil materiál tmavě šedé amorfní pelety. Stabilita materiálu při skladování za podmínek uvedených v příkladu 6 byla konstantní po dobu 3 měsíců. Materiál byl vystaven testování mechanické a enzymově stability postupem uvedeným v příkladu 6 za podmínek uvedených v popisu vynálezu; po 288 hodinách (12 dní) nepřetržitého třepání vodné suspenze vázaných buněk činila specifická aktivita 70 % aktivity původní.
Příklad 19
150 g vlhké hmoty (pasty) čerstvých nativních buněk Streptomyces phaeochromogenes s glukóí zoizomerázovou aktivitou bylo, suspendováno ; v 1 litru 0,05 M fosfátového pufru pH 7,0.
Koncentrace nativních buněk v homogenní sus! penzi činila 0,15 g v. hm/ml a jejich specifická ! aktivita byla 0,021 μπιοί fruktózy/min/mg v. hm.
(60 °<C) pH 6,85.
Kovalentní zesítění vnitrobuněčného obsahu jednotlivých buněk včetně způsobu jejich separace a promytí bylo provedeno podle příkladu 1. Bylo získáno 119 g v. hm. zesítěných a promytých buněk o specifické aktivitě 0,012 gmol fruktózy/min/mg v. hm. Permeabilizace zesítěných buněk byla provedena podle příkladu 6 s tím rozdílem, že koncentrace zesítěných buněk v suspenzi činila 0,08 g v. hm./ml a teplota suspenze během 3hodinové permeabilizace činila 60 °C. Další tepelné ošetření zesítěných buněk po jejich permeabilizaci nebylo prováděno. Vzájemná vazba buněk byla provedena technikou mrazení postupem uvedeným v příkladu 5 s tím rozdílem, že koncentrace buněk v reakční směsi činila 0,12 g v. hm./níl. Ošetření materiálu po vazbě bylo provedeno rovněž podle příkladu 5.
Bylo získáno 71g vzájemně vázaných buněk s glukózoizomerázovou aktivitou; specifická aktivita materiálu činila 0,01 μιηοΐ fruktózy/min/njg v. hm. Distribuce velikosti částic se pohybovala v rozmezí hodnot 200 až 1300 pm a k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 4minutové stání. Mikroskopicky posuzováno tvořily částice nepravidelné destičky s ohraničenými okraji. Makroskopicky tvořil materiál světle hnědé šupiny. Stabilita materiálu při skladování za podmínek uvedených v příkladu 6 byla konstantní po dobu 6 měsíců.
f
Příklad 20
Nativní buňky E. coli o specifické aktivitě penicilinacylázy 7,0 pmol 6-APK/hod./mg vlhké hmoty byly žesítěny a permeabilizovány jak je uvedeno v příkladu 1 s tím rozdílem, že zesítěné buňky měly aktivitu 5,8 pmol 6-APK/hod./mg vlhké hmoty a že permeabilizace byla prováděna se suspenzí zesítěných buněk 0,5 g vlhké hmoty/ml pri koncentracích butylacetátu 5 % objem/objem a Slovafolu 909 1 % objem/objem v průběhu 4hodinového nepřetržitého míchání pri 25 °C (500 ot./min.), takže specifická aktivita permeabilizovaných buněk činila 8,0 pmol 6-APK/hod./mg vlhké hmoty.
Z popsaným způsobem permeahilizovaných buněk bylá připravena vodná suspense 50 g/100 ml, jejíž pH bylo upraveno na hodnotu 7,6. Poté bylo k suspensi přidáno 5 ml 10%ního vodného roztoku Sedipury CL-930 a po 5 minutách stání 4 ml 25%ního vodného roztoku glutardialdehydu. Směs byla intenzivně promíchána, naplněna do injekční stříhačky opatřené jehlou o vnitřním průměru 1,6 mm a vytlačována na hliníkový tác do formy válcovitých dlouhých útvarů. Po 2hodinovém sušení na vzduchu při teplotě místnosti byly asi 2/3 materiálu 3 x dekantovány vodou a pak ještě 30 minut bobtnány ve vodě, aby se vyplavily nezreagované složky, a asi polovina tohoto množství byla po odsátí ponechána schnout na vzduchu pri teplotě, místnosti 24 hodin, načež byl materiál 24 hodin bobtnán ve vodě a pak odsát, (varianta a). Druhá polovina materiálu po 30minutovém bobtnání a obsátí byla intenzivně míchána 5 minut s vychlazeným acetonem, jehož teplota byla -27 °C, poté odsáta, bobtnána 24 hodin ve vodě a znovu vakuově odsáta, (varianta b). Zbylá 1/3 materiálu po počátečním 2hodinovém sušení byla dále sušena celkem 24 hodin, tedy v přítomnosti nezreagovaných reakčních složek (glutaraldehyd, Sedipur). Nato byl preparát 5 x dekantován vodou, bobtnán 24 hodin ve vodě a odsát, (varianta c).
Tmavohnědé odsáté materiály byly mechanicky upraveny do konečné formy krátkých válečků o průměru 1 mm. Specifické aktivity penicilinacylázy u jednotlivých . preparátů vykazovaly tyto hodnoty v pmol 6-APK/hod./mg vlhké hmoty:
(a) 0,80 (sušení bez reagencií) / (b) 0,75 (sušení acetonem) / (c) 0,60 (sušení s reagenciemí).
Příklad 21
Byla použita vlhká pasta zesítěných a permeabilizovaných buněk s penicilinacylázovou aktivitou 8,0 pmol 6-APK/hod./mg vlhké hmoty získaná podle příkladu 20. Z této buněčné pasty byla připravena suspenze 10 g/20 ml pomocí 51,4% ního vodného roztoku Sedipuru CL-930 ostrým mícháním. Z této suspenze byla odstředěním (10 000 G/20 minut) připravena řídká pasta, která byla pomocí injekční stříkačky bez jehly o vnitřním průměru 2 mm vytlačována do 10%ního roztoku glutardialdehydu. Proces byl doprovázen vznikem kapek, které setrvávaly chvíli na hladině vodného roztoku glutardialdehydu a pak dopadaly na podstavené síto ve formě granulí. Granule byly ponechány mořit v roztoku glutardialdehydu při laboratorní teplotě , 30 minut a potom byly na sítku prqmývány 1 hodinu pomalým prouděním vody. Odsáté granule, které byly ještě měkké, byly sušeny 24 hodin volně na vzduchu při teplotě místnosti. Po 48hodinovém bobtnání ve vodě byly tmavohnědé granule odsáty do konečné formy preparátu, jehož penicilinacýlázová aktivita činila 1,25 μπιοί 6-APK/hod./mg vlhké hmoty.
Příklad 22
600 g vlhké hmoty buněk Alcaligenes metalcaligenes obsahující asparát amoniak lyázu o specifické aktivitě 0,45 μπιοί kyseliny L-asparagové/min./ mg vlhké hmoty (pH 8,5,37 °C), bylo suspendováno v pitné vodě na celkový objem 2 litry. Takto vzniklá suspense buněk o pH 7,5 byla sítěna mícháním v přítomnosti 0,5%ního glutardialdehydu (hmota/objem) po dobu 1 hodiny pri teplotě 25 °C. Poté byla reakční směs zředěna 10 x vodou a buňky byly odděleny odstředěním. Pasta zesítěných buněk byla suspendována v 1,5 M vodném roztoku fumaranu amonného obsahujícím 1 mg/ml MgSO4.7H2O o pH 8,5 na koncentraci 300 g vlhké hmoty buněk/lt a po přidání Slovafolu 909 tak, aby jeho koncentrace v suspensi činila 0,1% byla suspense míchána 48 hodin pri 30 °C. Poté byla suspense odstředěna (6.000 G/30 min.) a po promytí 2x31 vody bylo získáno 416 g vlhké hmoty buněk o specifické aktivitě 0,35 μπιοί kys. L-asparagové/mg vlhké hmoty.
g vlhké pasty zesítěných, permeahilizovaných a aktivovaných buněk s aspartázovou aktivitou bylo suspendováno v 3%ním (hmota/objem) roztoku Sedipuru CL-930 na celkovou koncentraci 0,2 g buněk/ml. Při pH 7,0 byla suspense ponechána stát 30 minut a poté byla odstředěna (6000 g/30 minut). Získaná pasta byla vytlačena otvorem o průměru 1,6 mm do 0,5%ního vodného roztoku glutardialdehydu pH 7,0, kde byla ponechána 15 minut při teplotě místnosti. Poté byl získaný materiál promyt 2 x 50 ml vody a sušen na vzduchu pri teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Usušený materiál byl mechanicky rozdrcen na částice válcovitého tvaru o délce 1—3 mm. Po lóhodinovém bobtnání v 1,5 M vodném roztoku fumaranu amonného obsahujícího hořečnaté ionty při 29 °C bylo získáno 3,8 g pevných rychle sedimentujících Částic s dobrými hydrodynamickými vlastnostmi o aktivitě 0,05 gmol kyseliny L-aspa~ ragové/min./mg vlhké hmoty miiteriálů.
Claims (4)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZU1. Způsob výroby stabilních preparátů vzájemně vázaných buněk prokaryontních a eukaryontních mikroorganismů s enzymatickou aktivitou, zejména bakterií, kvasinek a jiných imperfektních hub, použitelných pro biotransformace, vyznačující se tím, že sé nejprve obsah jednotlivých buněk výchozího organismu zesítíresakcí s dialdehydem, s výhodou glutařdialdehyďěíťh pp této reakci se zesítěné buňky permeabilizuj ( působením fyzikálních anebo fyzikálně-chentických anebo cherfiic- ( kých faktorů, potom se néépájí reagovat ve vodj ’ ném prostředí s rozpustnou sloučeninou, obsahují^· . cí nejméně dvě primární anebo dvě sekundární ; aminové skupiny, s výhodou s polyethyleňimine^n ' nebo hexamethylendiaminem, a s diáldehydem, s výhodou s glutardialdehydem, vzniklévzájeinně vázané buňky se po oddělení proníyjí védou a popřípadě mechanicky zpevňují. přechodnou parciální dehydratací působením organických s vodou mísitelných rozpouštědel, s výhodou acetonu nebo jeho směsí s vodou, při teplotě 10 až —30°C. *
- 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se permeabilizace zesftěnýcb buněk provádí mícháním buněčné suspenze ve vodném prostředí při teplotách od 0 do 70 °C, pří hodnotě pH 4,0 až 9. 0, v přítomností tenzidu anebo organického s vodou mísitelného anebo neutišitelného rozpouštědla, zejména butýíacetátu, chloroformu nebo dimethylsulfoxidu, popřípadě za současné nebo následné změny iontové síly suspenze,
- 3. Zpj&sobpoijlebpďtt^Wímačujícísetím.žese reakce zesítěných st penňeabilizovaných buněk se sloučeninou rozpustnou ve vodě, obsahující nejméně dvě prímátnf. anebo dvě sekundární aminoskupiny a s dialdehydem provádí při teplotách pod teplotou tání reakční směsi.
- 4. Způsob podle bodu 3, vyznačující se tím, že se reakce provádí při teplotě 0 až 30 °C, při relativní odstředivé síle 1 až 50 000 G nebo při filtračním tlaku od 0 do 50 650 kPa.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS514579A CS209265B1 (cs) | 1979-07-23 | 1979-07-23 | Způsob výroby stabilních preparátů vzájemně vázaných buněk prokaiyontních a eukaryontních mikroorganismů s enzymovou aktivitou. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS514579A CS209265B1 (cs) | 1979-07-23 | 1979-07-23 | Způsob výroby stabilních preparátů vzájemně vázaných buněk prokaiyontních a eukaryontních mikroorganismů s enzymovou aktivitou. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS209265B1 true CS209265B1 (cs) | 1981-11-30 |
Family
ID=5395781
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS514579A CS209265B1 (cs) | 1979-07-23 | 1979-07-23 | Způsob výroby stabilních preparátů vzájemně vázaných buněk prokaiyontních a eukaryontních mikroorganismů s enzymovou aktivitou. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS209265B1 (cs) |
-
1979
- 1979-07-23 CS CS514579A patent/CS209265B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1050454A (en) | Shaped product containing glucose isomerase and method of producing said product | |
| Homaei | Enzyme immobilization and its application in the food industry | |
| Akertek et al. | Characterization of immobilized catalases and their application in pasteurization of milk with H2O2 | |
| WO1989000195A1 (en) | Process for immobilization of biological material by cross-linking with polyazetidine | |
| US4950596A (en) | Stabilization of intracellular enzymes | |
| US4996150A (en) | Biocatalyst immobilization in a gel of anionic polysaccharide and cationic polymer | |
| JPS6222599B2 (cs) | ||
| KR910002854B1 (ko) | 효소의 고정방법 | |
| US4276381A (en) | Preparation of immobilized enzymes of microorganisms | |
| Illanes et al. | Heterogeneous enzyme kinetics | |
| Iyengar et al. | Urease bound to chitin with glutaraldehyde | |
| Bryjak | Storage stabilization of enzyme activity by poly (ethyleneimine) | |
| CS209265B1 (cs) | Způsob výroby stabilních preparátů vzájemně vázaných buněk prokaiyontních a eukaryontních mikroorganismů s enzymovou aktivitou. | |
| JPH0325159B2 (cs) | ||
| US4675292A (en) | Stabilization of glucose isomerase | |
| Cheng et al. | Effect of PEG-mediated pore forming on Ca-alginate immobilization of nitrilase-producing bacteria Pseudomonas putida XY4 | |
| CA1267618A (en) | Stabilization of intracellular enzymes | |
| JPS596885A (ja) | 不溶性生体触媒の製法 | |
| CS203607B1 (en) | Process for preparing bonded cells with activity of penicilinacylase | |
| Rose et al. | Production of isomalt | |
| JPS5974984A (ja) | 固定化酵素もしくは固定化微生物の製造方法 | |
| CA1266246A (en) | Composition and method for immobilizing cells and enzymes in a carrier matrix | |
| CS231656B1 (cs) | Enzymové katalyzátory pro biotransformace a způsob jejich výroby | |
| Aranaz et al. | Synthesis of p-hydroxyphenylglicine by cell extract from Agrobaterium radiobacter encapsulated in alginate capsules | |
| US4184919A (en) | Method of gelling microbial mycelia |