JPS63501474A - 細胞を培養するための微小担体を製造するための方法及び該方法によって製造された微小担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞を培養するための微小担体を製造するための方法及び該方法によって製造さ れた微小担体 発明の分野 本発明は、微生物産業及びよ！！７％足には、細胞を培養するための微小担体を 製造するための方法及びこの方法によって製造された微小担体に関する。

従来の技術 細胞の大規模な培養の分野において、世界で現在得られた広範な研究及び実質的 な実験は、微小担体上での表面依存性細胞の偽懸濁培養の方法の利点及び有望な 特性を示す。その方法は、栄養培地中に懸濁された小さな粒子−微小担体上に細 胞が固定され、広げられ、そして増殖されることをもたらす。

微小担体上で次の細胞全増殖することが現在可能である：グリーンキヌデルの腎 臓の細胞、−久培養及び二次培養：鶏の胚細胞、−次培養及び二次培養及び同様 のもの。

界面活性剤の存在中、トルエン−クロロホルム混合液中においてゼラチン溶液の 懸濁液を激しく攪拌し、懸濁されたゼラチンの球状粒子を得、そしてそれヲ１０ ０４１の目の大きさｏａｉｔ−通してスクリーンすること金含んで成る、細砲ヲ 培養するための微小担体を製造するための方法が当業界で知られている。アセト ンにより洗浄し、そして１００μｍよりも小さなサイズのゼラチンの個々の粒子 を蒸発乾燥せしめた後、それらを膨潤するために水に懸濁し、そして次にグルタ ルアルデヒドによシ処理し、その後それらを、１００趨の目の大きさの篩を通し て再びスクリーンする。このようにして分離された粒子を懸濁し、そしてこれら の粒子の消毒のためにオートクレーブにかける。その得られたサンプルをまず、 　２５Ｑｇｎの目の大きさの篩を通してスクリーンし、そして次にその分離され た粒子を１００μｍの目の大きさの篩を通してスクリーンし、そして再びオート クレーブにかける（４．３．８２’に出願されたＰＣＴ出願Ｗ８２１００６６０ ｆ：参照のこと）。

この方法を実施することの複雑な特徴は、特別に装備された反応器中にゼラチン の溶液の懸濁全行ない、そして複雑な組成物の反応混合物（三成分混合物）を使 用することが必要である事実に関連される。

前記の他に、従来技術の方法は、得られた生成物の連続的多段処理、危険且つ毒 性の溶媒の使用及び相当な量の主要試薬（グルタルアルデヒド）の使用を含んで 成る。

非極性有機溶媒からなる混合物中におけるゼラチンの溶液を、激しく攪拌しなが ら懸濁することを含んで成る〔この懸濁過程の間、架橋剤（ジアルデヒド）が導 入される〕、細胞を培養するための微小担体を製造するための方法がまた当業界 に知られている。その得られた球状粒子（微小担体）を、篩を通してスクリーン し、有機溶媒によシ洗浄し、次に界面活性剤の存在中温水によシ洗浄する。その 後、このようにして得られた微小担体は、さらに開発及び貯蔵のために並びに変 色を避けるためにその生成物を安定化するために、形成されたシッフ塩基の還元 のための還元剤、たとえば過酸化水素の１０チ溶液により処理される。

さらに洗浄した後、１００〜２５０鋼のサイズの粒子を分離する（　１９８５年 ６月１５日に公告されたＵＳＳＲ発明者の証明書番号１１６１５４Ｂを参照のこ と）。

この方法は、懸濁のために特別に装備された反応器の使用及び多成分組成物の反 応媒体の使用の必要性によるその実施の複雑な特徴を示す。

この従来技術の方法を実施することにおいて、得られた微小担体から分散媒會洗 い流すことが困難である・ さらに、既知の方法は、球型の微小担体を製造する。この型は細胞を培養する段 階においては最適ではない。なぜならばそれは、微小担体の表面に細胞の付着を 妨げるからである。

発明の開示 本発明は、作業の改良、微小担体の製造のための単純化法及び細胞の効果的な増 殖を確保するその改良された特性による方法に向けられる。

本発明の目的は、次の方法によって達成される。

すなわち、架橋剤によシ処理されたゼラチンから粒子を造形し、そしてその目的 とする生成物の安定化を含んで成る、細胞を培養するための微小担体を製造する ための方法であって、前記ゼラチン粒子の造形を、架橋剤によるゼラチン溶液の 処理、次に異形の粒子へのその得られたゼラチンブロック−コポリマーの崩壊及 びその上で細胞の最適増殖を確保するサイズの粒子の分離によってもたらし、又 はそのゼラチン粒子の造形を、異形の粒子への乾燥ゼラチンの崩壊、その上で細 胞の最適増殖を確保するサイズの粒子の分離、続いて架橋剤によるそれらの処理 によってもたらし；その安定化の前、該粒子の造形後、タンノｆり質分解酵素に よりそれらを処理し、平滑面の前記粒子を得ること’ｆｉ−特徴とする方法によ ってである。

不発明の方法は、純度に関して改良された品質の微小担体、すなわちその得られ た微小担体において、その懸濁培地の不純物が存在しない（その存在は、以前は 増殖細胞に対して毒性効果を産生じたン微小担体全得ることを可能にした。不発 明はまた、多くの段階の回避によシ相当に簡牟に式する。さらに、複雑な懸濁装 置を用いる必要性が碌い。

本発明によれば、架橋剤としてジアルデヒド又はホルムアルデヒドを用いること が好ましい。

微小担体の品質及び貯蔵におけるそれらの安定性の増大を改良するためには、架 橋剤としてジアルデヒドの使用において、＊発明に従って、造形された粒子の安 定化をジアルデヒドによるその反復処理及び続いて還元剤による該粒子の処理に よってもたらすことが好ましい。

本発明に従えば、還元剤として、アルカリ金属の硼化水素又は過酸化水素を用い ることが好ましい。

本発明の態様は、架橋剤としてホルムアルデヒドを用いる場合、造形された粒子 の安定化を、ホルムアルデヒドによるその反復処理によってもたらし、従って、 目的とする生成物の製造をより安価にし、そしてその高い品質の特性全保持する ことを可能にすることにある。

本発明に従えば、タンパク質分解酵素として、トリゾシン又はコラゲナーゼを使 用することが好ましい。

本発明はまた、７５〜３５０趨の大きさ及び１．０３〜１．１５９７ｅｘ３の密 度を有する異形のゼラチン！ロックーコ４リマーの粒子を含んで成る本発明の方 法によって製造された、細胞を培養するための微小担体に関する。

本発明の微小担体は、細胞の固定化、広がり及び増殖のために十分適切な異形の 平滑面を有し；さらにこれらの微小担体は透明であ）、それは細胞の培養の間、 制御を促進する。

さらに本発明の目的及び利点は、細胞を培養するための微小担体を製造し、そし て細胞を培養するための微小担体を得るための方法の次の詳細な説明から一層十 分に明らかになるであろう。

まず、ゼラチンからの粒子の造形が行なわれる。

乾燥状態のゼラチンを異形の粒子に崩壊し、その上で細胞の最適増殖を確保する サイズの粒子を分離する。次に、このようにして得られたゼラチン粒子を。

たとえば好ましくはホルムアルデヒド又はジアルデヒド、たとえばグルタルアル デヒド、グリオキサール及び同様のものである架橋剤による６埋にかける。

架橋剤による処理の結果として、ゼラチンプロックーコポリマ−（微小担体に機 械的強度、耐化学物質及び耐熱性を付与する］が形成される。

出発生成物として、ぜラチン水溶液、氷酢酸及びタンパク質のための他の溶媒中 、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドの溶液が使用され得る。

ゼラチン水溶液を使用することが好ましい。

粒子を造形するために、ゼラチン溶液を、架橋剤により処理し、次にその上で細 胞の最適な増殖を確保する大きさの異形粒子にその形成されたゼラチンブロック −コポリマーを崩壊する。

架橋剤としてホルムアルデヒドの使用は、ゼラチン分子の架橋がホルムアルデヒ ドの１つの分子とゼラチン中のりシンのε−アミノ基との相互反応によりそして もう１つの遊離アミノ基との続く反応によるヒドロキシメチル誘導体の形成によ りもたらされることにある。従って、ゼラチンの２分子の架橋は、ホルムアルデ ヒドの１つの分子によって生成されるメチレン基によってもたらされ、そしてこ れは目的とする生成物の透明度及びその安定性を確保する。

ジアルデヒドが架橋剤として使用される場合、ジアルデヒドのそれぞれのアルデ ヒド基は、シップ塩基を与える。得られたＮａＣＨの結合の安定化及び無色の生 成物の製造のために、その得られたブロック−コポリマーが還元剤により処理さ れる。

異形のゼラチンプロツク−コポリマーの造形粒子は、細胞の接着、広がシ及び増 殖のために適切でない、不均一の表面を有する。このために、その粒子に平滑面 を付与するために、トリゾシン、コラゲナーゼ及び同様のものによって例示され 得るタンパク質分解酵素によりそれらを処理する。

粒子の洗浄後、それらを安定化せしめる。ジアルデヒドを架橋剤として使用する 場合、その安定化は、ジアルデヒドによるその粒子の反復処理、及び還元剤によ る続く処理によってもたらされる。還元剤として、＝Ｃ＝Ｎ−結合及びアルデヒ ド基を還元する物質、たとえばアルカリ金属の硼化水素、過酸化水素及び同様の ものが使用される。

ホルムアルデヒドが架橋剤として使用される場合、ゼラチンブロック−コポリマ ーの粒子の安定化は、ホルムアルデヒドによシくり返しそれらを処理することに よってもたらされる。

その得られた微小担体は、異形の及び１．０３〜Ｌ１５　ｆ／　／ａｍ”の密度 で７５〜３５０ｍの大きさのゼラチンブロック−コポリマーからの機械的、化学 的及び熱安定性粒子を含有する。

本発明の微小担体は、培養される細胞の表面との効果的な生ｖＪ特異性相互反応 を確保する。その得られた微小担体及びそれらの透明度のために特有な屈折率の ために、細胞増殖の間、便利な制御を確保することが可能である。微小担体の平 滑な異形は、細胞をそれらの表面で十分接着せしめ、そしてその上で効果的に増 殖することを可能にする。その微小担体は、従来の培養培地によって分解されず 、そして実験室条件下及び商業的規模の両者で細胞を増殖するために使用され得 る。

既知方法によって得られた微小担体に比べると、不発明の方法によって製造され た微小担体は、一層高い純度を有する。なぜならけ、従来技術の方法において使 用される懸濁培地の不純物（油、炭化水素ンが、細胞に対して後で毒性効果を与 える微小担体に存在しないからである。本発明の方法によって製造された微小担 体の品質の改良はまた、その方法が微小担体の粒子サイズのより高い均一性を確 保する（粒子の９８％が１００〜２５０　ｆｉｎの太きである〕事実によ〕達成 される。既知方法によって製造された微小担体はより低い均一性を有する（粒子 の７５〜８０％が１００〜２５０μｍの太さである）。

さらに、不発明の方法は、分散、繰返し洗浄の段階（従来技術の方法におけるよ りな）の除去によりその方法を単純にし、セしてより単純な方法の装置の使用を 可能にする。

本発明をよシ理解するために、細胞を培養するための微小担体を製造するための 方法及びその得られた微小担体の試験全例示するいくつかの特定の例が下記に与 えられている。

例１ ５０℃の温度で製造されたゼラチンの２５チ水溶液４００１１ｔｔ−１呈温で激 しく攪拌しながらグリオキサールの２５チ水溶液１５０ｄと共に混合する。

その得られたゼラチンブロック−コポリマーを、２５０趨の直径の目の篩を通す 、その得られた粒子（２５０角よりも大きくない直径を有する）を、連α的に攪 拌しながら室温でトリプシンの溶液ｏ、５ノ当り前記ゼラチンブロックーコポｙ ｆｆ−の粒子５５０ｇの割合で、ＰＨ＝７．６での０．１５Ｍリン酸緩衝溶液中 におけるトリプシンの０．２５チ溶液により処理する。その後、そのゼラチンブ ロック−コポリマーｆ　ＮａＣＡの０−１５Ｍ溶液によシ洗浄し、トリプシン及 びそのゼラチンブロック−コポリマーの酵素分解の可溶性生成物を除去する。そ の洗浄された粒子ｔ、グリオキサールの２５％溶液１００−に添加し、そして室 温で１５分間、その中に保持する。次に、そのグリオキサールの溶液ｉ、１００ μｍの直径の目の篩によりｒ過することによりて除去し、その粒子を過酸化水素 の３チ水溶液１！中に懸濁し、そして３０分間維持し、その後その得られた微小 担体をＮａＣ１の０．１５　Ｍ溶液によｉ洗浄する。

ＮａＣ１の０．１５　Ｍ溶液中に懸濁された微小担体を、１２０℃の温度で１５ 分間、オートクレーブで殺菌り、、２００〜２５０印の異形粒子サイズ及び１． ０７１／ｃ、の密度を有する微小担体ｓｏｏ、ｐを得る。

このようにして得られた微小担体を、グリーンキヌデルの腎臓の表面依存性細胞 を増殖することに試験した。

その培養は、５％のウシ血清を有するイーグル栄養培地１５０−を有する２５０ ｍ攪拌フラスコ中でもたらされる。微小担体の濃度は栄養培地の一当〕８×ｌθ 個の粒子であった。この培養の結果は下記の表に示される。

例２ ５０℃の温度で製造されたゼラチンの３５チ水溶液２００ｄｉ、激しく攪拌しな から室温でグルタルアルデヒドの２５チ水溶液１００ｔｊと共に混合する。

その得られたゼラチンブロック−；ポリマーを、２００μｍの直径の目を有する 篩を通す、このようにして得られた粒子（２００ＪＩａｓよりも小さな直径を有 する）′ｆ：、連続して攪拌しながら、３７±１℃の温度でコラゲナーゼの溶液 ２３〇−当タゼラチンプｑツクーコｆリマーの粒子２７０ｇの割合で取られた０ 、１５ＭＩＪン酸緩衝溶液中コラゲナーゼのｏ、５チ溶液により処理する。久に その粒子ｔ−ＮａＣｔの０．１５Ｍ溶液によフ洗浄する。その洗浄された粒子を 連続的に、グルタルアルデヒドの２５％溶液１３〇−により室温で、次に反応し なかったグルタルアルデヒドの除去のためにＮａＣ１の０．１５Ｍ溶液によシ、 及び還元剤−硼化水素すＦリウムの２チ溶液０．５ノによシ宜温で、次に洗浄液 体の中性声値まで水によシ洗浄する。その後、その得られた微小担体を１０〜１ ５分間、ＮａＣＡの０．１５Ｍ溶液０．５ノ中に再懸濁し、その後ＮａＣＬの等 張溶液の新鮮な部分によシ洗浄し、そして１５分間１２０℃の温度でオートクレ ーブによシ殺菌し、１５０〜２００趨の異形粒子サイズ及び１．０５１１／ａｓ ｓの密度を有する微小担体２５０ｇを得る。

このようにして得られた微小担体を、前記例１に記載したのと類似する方法で試 験した。その試験結果は下記の表に示されている。

例３ 微小担体を前記例２に記載されているようにして製造する。出発溶液として、２ ０チゼラチン溶液、タンパク質分解酵素としてキモトリプシンの０．７５チ溶液 、還元剤として過酸化水素の３％溶液を使用する。１５０〜２００−の異形粒子 サイズ及び１、０６．９／ｌｓｍ”の密度を有する微小担体２５０ｇが得られる 。

この得られた微小担体を、前記例１に記載の方法に類似する方法で試験した。そ の試験結果は下記の表に示されている。

例４ ゼラチンブロック−コポリマーの粒子上側１に記載しているようにして製造する 。その得られたゼラチンコポリマーの粒子を、連続して攪拌しながら２５℃の温 度でｐＨ＝７．６の０．１５　Ｍリン酸緩衝溶液中トリ・グシンの０．２５％溶 液０．７５１により処理する。次にその粒子を例１に記載された方法に類似する 方法により処理し、２００〜２５０μｍの異形粒子サイズ及び１．０６　ｆｌ　 １０ｎ”の密度を有する微小担体４７５ｇを得る。

この得られた微小担体を、例１に記載されているようにして試験した。その得ら れた結果は、下記の表に示されている。

例５ ゼラチンブロック−コポリマーの粒子を１例１に記載された方法に従って製造す る。その得られた粒子を、連続して攪拌しながら２０℃の温度で６．４の−の０ ．０６Ｍリン酸緩衝液中キモトリプシンの０．７５チ溶液Ｌ２５ノによシ処理す る。次に、その粒子を、例１０方法に類似する方法によシ処理し、２００〜２５ ０、ｍの異形粒子サイズ及び１．０８　ｆ／／ｍ’の密度を有する微小担体５０ ０ｇ′ｔ−得る。その得られた微小担体を前記例１におけるようにして試験した 。

その試験の結果は下記の表に示される。

例６ 篩を通しての粉砕ゼラチンのスクリーニングによ〕製造された７５〜９０趨の乾 燥粒子サイズを有する乾燥ゼラチン２００．１−、水に湿潤した後、ホルムアル デヒドの４０チ溶液５００−によＦ）１０分間処理する。過剰のホルムアルデヒ ドを水によシ洗い流し、そしてその得られたゼラチンブロック−コポリマーの粒 子を、連続して攪拌しながら室温でトリプシン溶液０．５７当り粒子５５０ｇの 割合で取られた。ＰＨ＝７．６の０．１５Ｍリン酸緩衝溶液中トリプシン０．２ ５％溶液によシ処理する。その後、その粒子をＮａＣＡの０．１５　Ｍ溶液によ り洗浄し、そしてホルムアルデヒドの４０チ溶液５００ゴによシ１０分間処理す る。その得られた粒子を炉取し、　ＮａＣ２の０．１５Ｍ溶液により洗浄する。

ＮａＣｔの０．１５　Ｍ溶液中に懸濁された粒子１１２０℃で１５分間オートク レーブにかけることによって殺菌する。このようにして得られた、１６０〜２０ ０趨の異形粒子サイズ及び１１５９　／ｌｘｔ’の密度を有する微小担体５５０ ＩＩヲ得る。その得られた微小担体を例１に記載された方法に類似する方法によ 〕試験する。その試験結果は次の表に示されている。

例７ 粉砕ゼラチンのエアージェットによるスクリーニングによって製造された、８〜 １００μｍの乾燥粒子サイズを有る乾燥ゼラチン２００９ｆ、ホルムアルデヒド の２０％溶液５００ｇＩｔによシ処理する。次にその方法を例１に記載されたよ うにして行なったが、しかしタンパク質分解酵素として、キモトリプシンの０． ２５％溶液を使用し、そしてその粒子の安定化を、ホルムアミドの２０チ溶液に よってもたらす。このようにして得られた、１８０〜２５０μｍの異形粒子サイ ズ及びｘ−ｏ２ｇ／α３の密度を有する微小担体５９０ｇ１得る。このようにし て得られた微小担体を例１の方法に類似する方法で試験する。

その試験結果は下記の表に示されている。

例８ 粉砕ゼラチンのスクリーニングにより製造された、７０〜９０趨の乾燥粒子サイ ズの乾燥ゼラチン２００ｇ’ｔ、ホルムアルデヒドの３０％溶液５００ｄによ９ １０分間処理する。過剰のホルムアルデヒドを水によシ洗い流し、そしてその得 られたゼラチンブロック−コポリマーの粒子を、連続して攪拌しながら室温でト リプシンの溶液０．５ノ当シ粒子５５０Ｉの割合で取られた。ｐｉ（＝７．６の ０．１５Ｍリン酸緩衝液中トリプシンの０．５％溶液によシ処理する。その後、 その粒子ｆ　ＮａＣＬの０．１５　Ｍ溶液によシ洗浄し、そしてホルムアルデヒ ドの３０チ溶液５００ｄにより処理する。その得られた微小担体をν取し、Ｎａ Ｃ６の０．１５Ｍ溶液により洗浄する。　ＮａＣｔの（Ｌ１５Ｍ溶液中に懸濁さ れた微小担体全、１２０℃の温度で１５分間、オートクレーブにかけることに殺 菌し、１６０〜２００趨の異形粒子サイズ及び１．０７９７ｅｘ”の密度の微小 担体ｓｉｏｇｖ得る。その得られた微小担体を例１に記載しているようにして試 験した。その試験結果は下記の表に示されている。

例９ ５０℃の温度で製造されたゼラチンの２５％水溶液４００ｓ＋１−１激しく攪拌 しながらホルムアルデヒドの３５％水溶液１００−と共に混合する。その得られ たゼラチンブロック−コポリマーを％２００句の直径の目金有する篩を通す、そ の得られ九粒子（２００μｍよりも大きくない直径を有する）を、連続して攪拌 しながら室温で７．６の−の０．１５Ｍリン酸緩衝液中トリトリフの０．２５％ 溶液によ〕処理する。その後、その粒子をＮａＣＺの０．１５Ｍ溶液により洗浄 し、トリプシンを除去する。その洗浄された粒子を、ホルムアルデヒドの３５ｔ ｓ溶液１０〇−中に添加し、そして室温で維持する０次に、そのホルムアルデヒ ドの溶液を濾過によって除去し、そしてその得られた微小担体を塩化ナトリウム の０１５Ｍ溶液によ）洗浄する。ＮａＣ１の０．１５Ｍ溶液中に懸濁された微小 担体を、１２０℃の温度で１５分間オートクレーブにかけることによって殺菌す る。

１５０〜２００　ｔｒｍ　（Ｄ異形粒子サイズ及び１．０９ｇ／１３の密度を有 する微小担体５００ｇを得る。このようにして得られた微小担体を前記例１に記 載されているようにして試験する。その試験結果は下記の表に示されている。

例１０ 粉砕ゼラチンのスクリーニングによって製造された４０〜６０趨の乾燥粒子サイ ズの乾燥ゼラチン２００ｇを、水に湿潤した後、グルタルアルデヒドの２５％溶 液５００−によシ処理する。過剰のグルタルアルデヒドを水により洗浄し、そし てその得られたゼラチンブロック−コポリマーの粒子を、連続して攪拌しながら 室温で−＝７．６の０．１５Ｍリン酸緩衝液中トリグシンの０．２５チ溶液によ ）処理する。

その後、その粒子を脱イオン水により洗浄し、トリプシン及びゼラチンの酵素分 解の生成物を除去する。

その洗浄された粒子をグルタルアルデヒドの２５％溶液１０〇−中に添加し、そ して室温で保持する。

次にそのグルタルアルデヒドの溶液を除去し、そしてその粒子を水により洗浄す る。その粒子をハイドロサルファイドの１％溶・液１！中に懸濁し、そして３０ 分間保持し、次にＮａＣ２の０．１５Ｍ溶液によりその得られた微小担体を洗浄 する。　ＮａＣ１の０．１５Ｍ溶液中に懸濁された微小担体を、１２０℃で１５ 分間オートクレーブにかけることによって殺菌する。

このようにして、８０〜１２０μｍの異形粒子及び１０７　Ｅ／ｃｍｓＯ密度’ に有密度機小担体５００９１）Ｅ’４られる。このようにして製造された微小担 体金側１に記載されている方法に従って試験する。その試験結果は下記の表に示 される。

鶏の胚の１次細胞を、前記例２に記載されているようにして製造された微小担体 上で増殖した。約５．０００　ｅｓｓ２の培養面積全確保する微小担体の密集残 留物１８−全、ハンクス塩溶液５〇−中に懸濁する。

１０分後、そのハンクス塩溶液をデカントし、そしてその微小担体を５％のウシ 血清、０．２５％のラクタルプミン加水分解生成物、０．１％のガラクトース、 ２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液及び抗生物質を含む栄養培地１９９の５０ｗｔ中に 再懸濁する。その得られた懸濁液を、懸濁攪拌器（スピナー）を備えた２５〇− フラスコ中に移す。微小担体の懸濁液を９日目の鶏の胚の１次細胞５〇−中に添 加しくその細胞を上記担成物の培地中に懸濁する）、そしてその栄養培地をその フラスコに添加し、体積ｔ−１００１１ｔにする。

細胞の接種濃度は０−５　ｄｎ　、の細胞／ｄであり微小担体の濃度は、約５０ ｅｓ２／−の培養面積を確保する。

その培養は３７℃の温度で行なわれる。

戎 例１〜１０において製造された微小担体の試験の結果 例の微小　細胞の接種　増殖細胞の数、細胞数１　２Ｘ１０５　１０．４Ｘ１０ ’　５．２２　ｄｉｔｔｏ　９．６Ｘ１０’　４．８３　ｄｌｔｔｏ　６．２Ｘ １０’　３．１４　０．１５Ｘ１０　Ｌ５Ｘ１０’　１０５　ｄｉｔｔｏ　１． ５Ｘ１０’　１０６　２Ｘ１０’　８．６Ｘ１０’　４．３７　ｄｉｔｔｏ　７ ．９Ｘ１０’　４．０８　ｄｉｔｔｏ　９．４Ｘ１０５４．７９　ｄｌｔｔｅ　 ８．ｌＸ１０’　４．０１０　２Ｘ１０５　８．２Ｘ１０’　４．１微小孔体の 悉濁液の穏やかな攪拌下：初日の間−１Ｑｒ、ｐ、ｍの速度で、２日目及び３日 目の間−２０７＠　１）　＊Ｔ１１　＠その後−５０〜６０　ｒ−ｐｅｔａ　＠ 培養の２日目から、その培地の一部を毎日変える：２２日目び３日目−培地の体 積の５０％、その後−培地の体積の７０チ。微小担体の粒子上での培養の始まり の後、５〜６日で、鶏の胚の１次細胞のデカントされた培養物が形成される。培 養期間の最後（６日目）での培養密度は、（５，８±０．３　）　ｄｎの細胞／ −であり、すなわち鶏の胚の１次細胞の数は、６日間にわたって１１倍増加され る。微小担体上で増殖された数の計算は、次の方法に従ってもたらされる。培養 の完結の後、サンプル１０−を取る（その微小担体は十分に予備懸濁される）、 サンプル中の微小担体の沈殿の後、上清液をデカントし、そして微小担体上の培 養物を、０．１５　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液により数度洗浄する。

例１２ グリーンキヌデルの腎臓の２次細胞を、前記例２において製造された微小担体上 で増殖した。

２Ｘ１０５個の細胞／１１１ｇの濃度におけるグリーンキヌデルの腎臓の２次細 胞を、密集残留物（１０〇−の培地、従って約１５ｃＨ１２／−の培養面積を確 保する）５．５−の濃度で使用される微小担体の懸濁液中に導入する。次の組成 物の栄養培地を使用する：１０チのウシ血清、０．２５％のラクタル！シン加水 分解生成物、０．１％のガラクトース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液及び抗生物 質を含むイーグルの最大培地。１４？スピナー中に、栄養培地中、微小担体及び 細胞の懸濁液３５０−を充填する。その培養は、その懸濁液の穏やかな攪拌下で 、すなわち初日の間１０　ｒ、ｐ、ｍ、　、　２及び３日目の間２０　ｒ、ｐ、 ｎａｍ及びその後、５０〜６０　ｒ、ｐ、ｍ、下で３７℃の温度てもたらされる 。培養し始めた後、７２及び１２０時間後、培地の一部、すなわちそれぞれ３０ ％及び’ＩＯ％’ｋ、新しい培地と変換する。微小担体の実質的にすべての粒子 上での培養の６日後、細胞の密集培養物亦観察される。この時までにその細胞濃 度は、３．８　ｄｎ。

細胞／−ぐらい高い。

例１３ 細胞の長期培養のための試験を、前記例２におけるようにして製造された微小担 体上で行なった。

グリーンキヌデルの腎臓の２次細胞を例１２に記載したようにして増殖する。集 密培養物の形成の後、あらかじめシリコン化された内部壁を有する０、５ノロー ラーざトル中に微小担体を移す、それぞれのがトル中に、増殖された培養物を有 する微小担体の懸濁液１７５ゴを導入する。その培養は、前記例１２に記載され たのと同じ組成物の培地〔但し、減じられた血清濃度（３チ）〕中において、３ ７℃で、１０　ｒ、ｐ、ｍ、で行なわれる。１週間に２度、培地の５０チを、新 しい培地と取り換える。１週間ごとに細胞の数を、例１１に記載した方法によっ て計数し、そして微小担体上での培養物の採取されたサンプルをマイクロスキャ ンする。その観察は、９週間にわたって（観察期間）、細胞は透明の１１であり 、はうきシした境界及び典型的な形を保持し、そして微小担体から剥離しないこ とを示す、全観察期間、細胞の数は３．６±０．３６ｄｎ、の細胞／−のレベル で維持される。

再移植系の細胞を、正常及び低められた濃度の血清を有する培地中において、例 １２において製造された微小担体上で増殖した。集密残留＊（培地の１００−１ 面積１５０２７ｄ）５．５−の濃度で取られた微小担体上で、４６４７系の細胞 （健康な成熟したグリーンキヌデルの腎臓から得られた）を増殖する。４６４７ 系の細胞の接種濃度は１５Ｘ１０　個の細胞／ｄである０例１２において記載さ れたのと同じ組成物の栄養培地が使用されたが、しかし１つの場合、その培地は １０％の血？ｌ１ｔ−含み、そしてもう１つの場合、ｉ＊のウシ血清を含む。再 考において、ピルビン酸ナトリウムを培地に添加し、１〇−の濃度にし、そして メチルセルロースを添加し、０．３％の最終濃度にする。比較するために、細胞 の同じ培養物を０．１ノ容量のガラス平底フラスコの表面上で増殖する；そのフ ラスコにおける培養物の細胞の接種濃度は微小担体上での培養物におけるとも同 じあり、すなわちｌ０ＸＩＯ’個の細胞／１：ｍ１３である。正常な及び低めら れた濃度の血清全盲する培地における従来の方法（ガラ表面及び微小担体上で） での細胞の培養に基づいて（すべての他の条件は等しい）、１０％の血清を含む 栄養培地の使用によりガラス表面上で増殖される細胞の数は、微小担体上で増殖 される細胞の数の８０．２チであり、セして１チの血清を含む栄養培地の使用に よシガラス表面上で増殖される細胞の数はその４２．２％である。

例１５ 二倍体系の細胞金、例１において製造された微小担体上で増殖せしめた。

ヒト胎児の組織から産成されたＭ−２１系の二倍体細胞を、例１２において記載 したのと類似する方法で微小担体上で増殖せしめ：この場合の細胞の接種濃度は ３×１０　個の細胞／ｇＩｔである。増殖の４日後、細胞の数は１．８　ｍｎ、 の細胞／ｗｔであり、すなわちそれは９６時間にわたって６倍に増加し、そして 微小担体の粒子の主要部分を、デカントされた細胞の層により被覆する。

例１６ 本発明の微小担体上で増殖された細胞の収集を行なった。

鶏の胚の１次細胞を、前記例１１において記載したのと同じ方法で増殖する。培 養の後、サングル１０ｄｆｆｉ取シ（微小担体の懸濁による予備試験の後）、そ して細胞の数を例１におけるようにして計算する。

その細胞数の計数は、それらの濃度が５．７　ｄｎ、細胞／−であることを示す 。栄養培地を除するために洗浄した後、その微小担体の残る部分に、０．２５％ のトリグシン及び０．０２％のエチレンジアミン四酢酸を含む０．１５Ｍリン酸 緩衝液５Ｑｄ中に再懸濁する。

５分後、その上清液体を、注意してデカントし、細胞を有する微小担体を室温で ５分間、分散溶液の残る量の中でインキュベートする。その後、その微小担体の 懸濁液−ｉｉ、０．５％のラグタルプミン加水分解生成物を含むリン酸緩衝溶液 に添加し、そしてそのフラスコを数置、振盪する。微小担体から分離された細胞 を計数する。その細胞の数は５．２５１１Ｉｔｍ、の細胞／−又は細胞の核の数 の約９２％である。

本発明は、ウィルスワクチン及び種々の生物学的活性の物質、たとえはインター フェロン、ホル七ン、酵素及び特定の適用のための他の生成物の高活性ｙ４製物 の製造における医薬及び家畜病治療に有用である。

手続補正書（方式） 昭和６３年３月２ｇ日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示　〃−♂１４ξくン２３ＰＣＴ／ＳＵ８６１０　ＯＯ８３ ２、発明の名称 細胞を培養するための微小担体を製造するための方法及び該方法によって製造さ れた微小担体３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ナウチノーブロイズボドストベンノエオビエディネニエ°“ビオラ−”　 （外１名）４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）　明細書の翻訳文 （２）請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 （１）明細書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（２、特許請求の範囲の翻訳文 の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）明細書の翻訳文　１通 （２）請求の範囲の翻訳文　１通

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．架橋剤により処理されたゼラチンから粒子を造形し、そしてその目的とする 生成物の安定化を含んで成る、細胞を培養するための微小担体を製造するための 方法であって、前記ゼラチン粒子の造形を、架橋剤によるゼラチン溶液の処理、 次に異形の粒子へのその得られたゼラチンブロックーコポリマーの崩壊及びその 上で細胞の最適増殖を確保するサイズの粒子の分離によってもたらし、又はその ゼラチン粒子の造形を、異形の粒子への乾燥ゼラチンの崩壊、その上で細胞の最 適増殖を確保するサイズの粒子の分離、続いて架橋剤によるそれらの処理によっ てもたらし；モの安定化の前、該粒子の造形の後、タンパク質分解酵素によりそ れらを処理し、平滑面の前記粒子を得ることを特徴とする方法。
2. ２．前記架橋剤としてジアルデヒド又はホルムアルデヒドを使用することを特徴 とする請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．架橋剤としてジアルデヒドの使用において、前記造形された粒子の安定化を 、ジアルデヒドによるその反復処理及び続いて還元剤による前記粒子の処理によ ってもたらすことを特徴とする請求の範囲第１及び第２項記載の方法。
4. ４．還元剤として、アルカリ金属の硼化水素又は過酸化水素を用いることを特徴 とする請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．架橋剤としてホルムアルデヒドの使用において、前記造形された粒子の安定 化を、ホルムアルデヒドによるその反復処理によってもたらすことを特徴とする 請求の範囲第１又は第２項記載の方法。
6. ６．前記タンパク質分解酵素として、トリプシン又はコラグナーゼを用いること を特徴とする請求の範囲第１〜４項のいずれか１項記載の方法。
7. ７．請求の範囲第１〜６項の方法によって製造された、細胞を培養するための微 小担体であって、異形で７５〜３５０ｕｍの粒子サイズ及び１．０３〜１．１５ ｇ／ｃｍ３の密度を有するゼラチンブロックーコポリマーからの粒子を含んで成 る微小担体。