DE2834067A1 - Verfahren zur herstellung von traegern fuer zellkulturen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von traegern fuer zellkulturen

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DE2834067A1 DE19782834067 DE2834067A DE2834067A1 DE 2834067 A1 DE2834067 A1 DE 2834067A1 DE 19782834067 DE19782834067 DE 19782834067 DE 2834067 A DE2834067 A DE 2834067A DE 2834067 A1 DE2834067 A1 DE 2834067A1
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carriers
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Description

VON KREtSLER SCHONWALD MSYcR ElSHOLD FUES VONKREISLER KELLER SELTlNG
2$3A067
PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler + 1973 Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln
■ Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden
Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln ' Dipf.-Chem. Carola Keller, Köln
Dipl.-Ing. G. Selling, Köln
5 KÖLN 1
DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF
2. August 1978 AvK/Ax
Institut Pasteur, 28 Rue du Docteur Roux
Paris, Frankreich
Verfahren zur Herstellung von Trägern für Zellkulturen
ι.- u i Rufnummer 909 8 0 9/0771
10 41
Telefon: (02 21) 234541 -4 ■ Telex: 883 2307 dopa d Telegramm: Oompatenl KoIn
Die Erfindung betrifft Zellkulturen, insbesondere die Verwendung von hitzehärtbaren Kunststoffen für die Verbesserung der zum Zellwachstum verwendeten Träger.
Zellkulturen werden bekanntlich im allgemeinen entweder in Einfachschichten auf Trägern in Gegenwart von flüssigen Nährmedien oder in Suspension in einem flüssigen Nährmedium oder in Gegenwart eines halbfesten Nährmediums (Agarose) durchgeführt.
Als geeignete Träger für das Zellwachstum dienen vorallem neutrales Glas oder Kunststoffe, die im allgemeinen auf Polystyrol basieren und einer besonderen Behandlung, durch die ihnen die Eignung für das Zellwachstum verliehen wird, unterworfen werden. Diese Kunststoffe sind für den einmaligen Gebrauch bestimmt und werden durch eine physikalische Behandlung unter Ausschluß von Hitze sterilisiert. In neuerer Zeit wurde mit der Verwendung von Mikroträgern auf Basis von Glas, Polysacchariden ("Sephadex") oder Kunststoffen für Zellkulturen begonnen.
Die Träger für Zellkulturen müssen so beschaffen sein, daß die Zellen leicht an ihnen haften. Sie dürfen für die Zellen weder giftig sein noch ihr Wachstum hemmen. Ferner müssen sie leichte Beobachtungen unter dem Mikroskop ermöglichen.
Versuche mit Kugeln aus Glas oder Polystyrol als Mikroträger wurden durchgeführt. Diese Mikroträger sind jedoch für die Durchführung von Kulturen im großtechnischen Maßstab unbefriedigend oder nur unter bestimmten
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Bedingungen befriedigend. In diesem Zusammenhang wird auf die Veröffentlichung von A.L. Van Wezel "Microcarrier Cultures of Animal Cells" in "Tissue Culture Methods and Application", herausgegeben von Paul F. Kruse jr. und M.K.Patterson jr., Academic Press New York und London 1973, verwiesen. Beispielsweise wird festgestellt, daß die Zellen an den Kunststoffkugeln, z»B. Kugeln aus Polystyrol oder "Rilsan", die einer besonderen Behandlung unterworfen worden sind, nicht genügend fest haften. Ferner wird angegeben, daß Versuche mit Kugeln aus dem Produkt der Handelsbezeichnung "Spherosil" durchgeführt worden sind. Diese Kugeln scheinen angesichts ihrer verhältnismäßig hohen Dichte im Kulturmedium für Kulturen im Großmaßstab ungeeignet zu sein.
Ferner wird festgestellt, daß die verschiedenen Produkttypen, die unter der Handelsbezeichnung "DEAE-Sephadex" bekannt sind, nicht alle die gleichen Eigenschaften als Träger für Zellkulturen aufweisen.
Zur Verbesserung der Eigenschaften der Kugeln aus "DEAE-Sephadex A 50" wurde bereits vorgeschlagen, sie mit Nitrozellulose zu überziehen (siehe die vorstehend genannte Arbeit von A.L. Van Wezel).
Es wurde nun für die Behandlung der Träger für Zellkulturen ein Weg gefunden, der ihre Verwendung unter ver— schiedenen Arbeitsbedingungen, insbesondere ihre Verwendung für das Einsetzen, die Züchtung und die TryDsinierung von Zellkulturen, insbesondere von Kulturen von menschlichen oder tierischen diploiden Zellen ermöglicht. Die Methode gemäß der Erfindung besteht darin, daß man auf Grundträger einen hitzehärtbaren Kunststoff unter den nachstehend ausführlich beschriebenen Bedingungen aufbringt.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Herstellung von Trägern für Zellkulturen nach einem Verfahren, das
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dadurch gekennzeichnet ist, daß man auf Grundträger eine Lösung eines hitzehärtbaren Kunststoffs aufbringt und die beschichteten Träger anschließend der Einwirkung von Wärme unter Bedingungen aussetzt, unter denen der hitzehärtbare Kunststoff aushärtet und der in dieser Weise beschichtete Träger sterilisiert wird.
Die Erfindung umfaßt ferner die aus einem Grundträger und einem hitzegehärteten Überzug bestehenden Träger für Zellkulturen.
Als "Grundträger" werden hier ajLle Träger bezeichnet, die zur Zeit auf dem in Frage kommenden Gebiet verwendet werden und auf Glas oder Polysacchariden basieren. Diese Träger können eine ebene oder kugelförmige Oberfläche aufweisen.
Als Beispiele solcher Träger sind Petrischalen, Roux-Schalen, Kugeln, insbesondere Kugeln aus Produkten der Handelsbezeichnung "DEAE-Sephadex" und alle anderen Glaskolben oder Materialien, die für Zellkulturen verwendet werden, zu nennen.
Die für die Zwecke der Erfindung geeigneten hitzehärtbaren Kunststoffe dürfen nicht giftig für die Zel.len_ sein. Sie müssen vorzugsweise transparent sein, um Beobachtungen unter dem Mikroskop zu ermöglichen. Ferner müssen sie so beschaffen sein, daß die Zellen leicht und fest an den beschichteten Trägern haften. Bei der Aufbringung auf Mikroträger müssen diese Kunststoffe einen Film um jeden Mikroträger bilden, ohne Aggregate zu bilden. Ferner müssen diese Kunststoffe der abschließenden Behandlung im Autoklaven in der Flüssigphase (Sterilisation) widerstehen.
Als Beispiele hitzehärtbarer Kunststoffe, die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, sind insbesondere die Produkte der Reaktion eines Aldehyds mit^olyvinylalko-
einem
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hol, z.B. Produkte der Reaktion von Formaldehyd oder
einem
Butyraldehyd mit/Polyvinylalkohol zu nennen. Als Beispiele hitzehärtbarer Kunststoffe, die für die Zwecke der Erfindung bevorzugt werden, sind die Produkte der Handelsbezeichnung "Rhovinal B" und "Rhovinal F" (Hersteller Rhone Poulenc Polymeres) zu nennen.
Die unter der Handelsbezeichnung "Rhovinal B" bekannten Produkte sind Polymerisate von Butyraldehyd und Polyvinylalkohol, die durch Umsetzung von Butyraldehyd mit Polyvinylalkohol.11 hergestellt werden. Von diesen Produkten wird das Produkt "Rhovinal B:10/20" besonders bevorzugt. In den vorstehenden Bezeichnungen bedeutet die erste Zahl die Viskosität einer 5%igen Lösung des Produkts in 95%igem Äthylalkohol bei 200C in Millipoiseuille und die zweite Zahl den Anteil der Polyvinyl— alkoholgruppen im Molekül in Gew.-%.
Die unter der Handelsbezeichnung "Rhovinal F" bekannten Produkte sind Formal-Polyvinylalkohol-Polymerisate, die
einem .
durch Reaktion von Formol mit/Polyvinylalkohol erhalten werden.
Die hitzehärtbaren Kunststoffe werden beim Verfahren gemäß der Erfindung in Form von Lösungen in geeigneten Lösungsmitteln verwendet. Geeignet sind Lösungsmittel, die die genannten Kunststoffe lösen und vorzugsweise flüchtig sind. Wenn nicht flüchtige Lösungsmittel verwendet werden, ist intensives Waschen erforderlich, um jede Spur von Lösungsmitteln, die für die Zellen giftig sein wurden, zu entfernen. Vorzugsweise werden Chloroform, Methanol oder Gemische von Chloroform und Methanol verwendet.
Die beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten Lösungen von hitzehärtbaren Kunststoffen enthalten den hitzehärtbaren Kunststoff in einer genügenden Menge, um unter den Arbeitsbedingungen einen geschlossenen
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Film zu bilden, der eine optimale Zellkultur, d.h. eine Zellvermehrung während wenigstens einer Woche ermöglicht, Die Bestimmung der Konzentration der zu verwendenden Lösung ist dem Fachmann ohne weiteres möglich. Beispielsweise sind bei Verwendung des hitzehärtbaren Kunststoffs "Rhovinal B 10/20" Lösungen einer Konzentration von 0,5 bis 2%, vorzugsweise von 1%, geeignet.
Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung behandelten Mikroträger werden vor der Aufbringung der Lösung des hitzehärtbaren Kunststoffs vorzugsweise zum Beispiel mit einem isotonischen Puffer, z.B. einem Phosphatpuffer von pH 7,2, gewaschen und in den Autoklaven gegeben.
Die mit der Lösung des hitzehärtbaren Kunststoffs behandelten Träger werden anschließend einer Wärmebehandlung im Ofen oder Autoklaven bei einer Temperatur unterworfen, die genügt, um den hitzehärtbaren Kunststoff auszuhärten und den in dieser Weise beschichteten Träger zu sterilisieren. Im allgemeinen wird bei einer Temperatur zwischen etwa 1*20°C (Autoklav) und 1800C (Ofen)
gearbeitet.
Wenn die Träger kugelförmig sind und beispielsweise die Form von feinen Teilchen einer Größe von 100 bis 200 um (nach dem Quellen) haben, ist es vorteilhaft, das aus den feinen Teilchen bestehende Gel in der Lösung des hitzehärtbaren Kunststoffs bei einer Temperatur von etwa 37°C während einer solchen Zeit von beispielsweise 24 bis 48 Stunden in Suspension zu halten, daß der hitzehärtbare Kunststoff an der gesamten Oberfläche der feinen Teilchen haftet.
Nach der Wärmebehandlung im Autoklaven müssen die Träger, insbesondere die Mikroträger aus "Sephadex" in einem isotonischen Puffer gewaschen werden, um alle Lösungsmittelspuren zu entfernen. Anschließend müssen sie sterilisiert und bis zum Gebrauch aufbewahrt werden.
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Gemäß einer Variante des Verfahrens gemäß der Erfindung ist es vorteilhaft, die Träger (Kugeln und Mikroträger) nach der Wärmebehandlung mit einem isotonischen Puffer, der Ca++- oder Mg++-Ionen enthält, zu waschen und sie in den Autoklaven zu geben. Durch diese Behandlung wird die Haftfestigkeit der Zellen an den Mikroträgern verbessert.
Der hier gebrauchte Ausdruck "in den Autoklaven geben" bedeutet, daß die Träger im Autoklaven bei einer Temperatur von etwa 120°C während einer für die Sterilisierung genügenden Zeit behandelt werden. Es ist zweckmäßig, die Mikroträger vor ihrem Gebrauch in einem Nährmedium, das etwa 10% Kalbsserum enthält, zu spülen.
Bevorzugt als Träger werden gemäß der Erfindung Träger für Zellkulturen, die aus einem Grundträger beispielsweise aus Glas oder Polysacchariden in.ebener Form oder Kugelform bestehen, beispielsweise Petrischalen,Roux-Schalen oder Kugeln, die mit einem hitzegehärteten Überzug aus einem Polymerisat, das das Produkt der Reak— tion eines Aldehyds und eines Polyvinylalkohol ist,. beispielsweise aus einem Butyral-Polyvinylalkohol- oder Formal-Polyvinylalkohol-Polymerisat, versehen sind.
Die Träger gemäß der Erfindung können für die Kultivierung von menschlichen oder tierischen diploiden Zellen oder beliebigen anderen Zellen (primäres Explantat, kontinuierliche Nachkommenschaft), die sich für die Kultivierung in Einfachschichten eignen, verwendet werden. Ferner können diese Träqer für alle üblichen
(Impfens) Arbeitsschritte des Einsetzens und der Trypsinierung von Zellkulturen verwendet werden.
Die Zellen, die sich auf den Mikroträgern gemäß der Erfindung vermehren, können als Substrat für die Gewinnung von Vi re η verwendet werden. Die Gewinnung des Virus erfolgt durch Abtrennung vom Kulturmedium nach
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Entfernung der Kugeln durch Dekantieren. Das Virus kann anschließend für die Herstellung von Impfstoffen und Virus-Antigenen gereinigt werden. Die bei diesem Verfahren erhaltenen Zellkulturen können außerdem zur Gewinnung von Interferon, von Enzymen oder Hormonen oder beliebigen anderen Substanzen, die aus den Zellen stammen, dienen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele ausführlich erläutert.
Beispiel 1 Behandlung einer ebenen Oberfläche: Roux-Schalen
Ein Butyraldehyd-Polyvinylalkohol-Polymerisat "Rhovinal B 10/20" wurde in Chloroform in Konzentrationen von 0,5 bis 1% gelöst. Die Lösung des Polymerisats wurde in eine Zellkulturschale gegossen, bis die Schale gefüllt war. Der Inhalt wurde dann in eine zweite Schale und dann nacheinander in alle Schalen gegossen. Man ließ die Schalen 5 Minuten auf Stroh abtropfen und sterilisierte sie dann während einer Stunde im Ofen bei 180°C. Während der Sterilisierung wurde der an der Oberfläche der Schale haftende Film der Polymerlösung durch die Hitze gehärtet.
Beispiel 2 Behandlung einer kugelförmigen Oberfläche
Kugeln, die aus dem Polysaccharid der Handelsbezeichnung "DEAE-Sephadex A-50" bestanden und einen Durchmesser von 80 bis 100 um hatten, wurden verwendet. 10 g dieser Kugeln wurden mehrmals mit einem isotonischen Phosphatpuffer von pH 7,2 im Autoklaven gewaschen. Die Kugeln wurden in 600 ml einer Chloroformlösung des Butyraldehyd-Polyvinylalkohol-Polymerisats "Rhovinal B 10/20" (1 1 Chloroform enthielt 15 g Polymerisat) suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde eine Stunde bei 37°C
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gehalten. Der Überschuss der Chloroformlösung (untere Phase) wurde entfernt, wobei das Gel aus dem Polysaccharid "DEAE-Sephadex" (obere Phase) zurückbehalten wurde.
Das Gel wurde 24 Stunden bei 37°C und dann eine Stunde
Kugeln im Autoklaven (12O°C) gehalten, nie/wurden anschließend mehrmals während einer Zeit von 24 Stunden in einem isotonischen Phosphatpuffer von pH 7,2 gewaschen und dann in Gegenwart eines Phosphatpuffers, der Ca++- und Mg -Ionen enthielt, im Autoklaven behandelt.
Die in dieser Weise behandelten Kugeln können bis zum Gebrauch steril gehalten werden. Zum Gebrauch ist es zweckmäßig, sie einmal im Nährmedium, das 10% Kalbsserum enthält, zu spülen.
Beispiel 3
Behandlung einer kugelförmigen Oberfläche
Für diesen Versuch wurden ebenfalls Kugeln aus dem Produkt der Handelsbezeichnung "DEAE-Sephadex A-50" verwendet. Nach dem Waschen mit isotonischem Phosphatpuffer wurden 10 g des Polysaccharids "DEAE-Sephadex A-50" in 600 ml Methanol gespült. Nach 24 Stunden bei 37°C wurde der Methanolüberschuss über dem Gel entfernt. Die Kugeln wurden in 600 ml einer Lösung des Butyraldehyd-Polyvinylalkohol-Polymerisats "Rhovinal B 10/20" /suspendiert. Das verwendete Lösungsmittel bestand aus einem Gemisch von Chloroform (75%) und Methanol (25%). Nach 48 Stunden bei 37°C wurde der Überschuss der Lösung des Polymerisats entfernt und das Gel eine Stunde im Autoklaven (1200C) behandelt. Die Kugeln wurden anschließend auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise gewaschen und gespült.
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Beispiel 4
Verwendung von Roux-Schalen, die auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt wurden
In eine gemäß Beispiel 1 behandelte Roux-Schale wurden 100 ml Nährmedium (Eagle-Grundmedium oder Eagle-Minimalmedium) gegeben, das etwa 10% Kalbsserum enthielt. Das Medium wurde mit 50.000 menschlichen diploiden Zellen pro ml Nährmedium geimpft. Nach 24 Stunden hafteten die Zellen zu 100% am erfindungsgemäßen Träger. Die Kultivierung wurde dann 7 bis 8 Tage fortgesetzt, wobei eine endgültige Mindestkonzentration von 200.000
ρ
Zellen/cm Träger erhalten wurde.
Beispiel 5
Verwendung von Kugeln aus dem Polysaccharid "DEAE-"Sephacex", die auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise
behandelt wurden.
In einen mit Rührer versehenen Kolben werden ein Nährmedium (Eagle-Grundmedium oder Eagle-Minimalmedium), das etwa 10% Kalbsserum enthält, und 1 bis 2 mg/ml der auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise mit dem Butyraldehyd-Polyvinylalkohol-Polymeren behandelten Kugeln aus dem Polysaccharid "DEAE-Sephadex A-50" gegeben. Das Nährmedium wird mit 10 menschlichen diploiden Zellen pro ml Nährmedium (Zellstamm MRC 5) geimpft.
Die Zellen werden 24 Stunden bei 37°C langsam gerührt (60 UpM), wobei sie sich zu 100% an die Kugeln heften. Die Zellzüchtung wird 7 bis 8 Tage fortgesetzt (90 UpM), wobei eine Endkonzentration der Zellen von 10 Zellen/ml erhalten wird. Während der Züchtungsdauer von 7 bis 8 Tagen muß der pH-Wert konstant bei 7,2 bis 7,4 gehalten werden.
Zum Vergleich wird eine Kultivierung von diploiden Zellen unter den vorstehend genannten Bedingungen, jedoch unter Verwendung von Kugeln aus dem Polysaccharid
/0771
'•DEAE-Sephadex A 50" durchgeführt, die nicht nach dem Verfahren gemäß der Erfindung behandelt worden sind. Nach einer Kultivierungsdauer von 7 bis 8 Tagen beträgt die Endkonzentration der Zellen nur 10 Zellen/ml.

Claims (1)

  1. 2834087
    P a te η t an s ρ rii c he
    1) Verfahren zur Herstellung von Trägern für Zellkülturen, dadurch gekennzeichnet, daß man auf Grundträger eine Lösung eines hitzehärtbaren Kunststoffs aufbringt und die in dieser Weise beschichteten Träger anschließend der Einwirkung von Wärme unter Bedingungen aussetzt^ unter denen der hitzehärtbare Kunststoff au-sgeträr-te-t- und die beschichteten Träger sterilisiert werden.
    2} Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als hitzehärtbaren Kunststoff das Produkt der Reaktion eines Aldehyds mit einem Polyvinylalkohol verwendet.
    3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
    daß man als hitzehärtbaren Kunststoff ein durch Umsetzung
    einem
    von Butyraldehyd mit/Polyvinylalkohol erhaltenes Butyral-Polyvinylalkohol-Polymerisat verwendet, das als 5%ige Lösung in 95%igem Äthylalkohol bei 200C eine Viskosität von 10 Millipoiseuille hat, und 20 Gew.-% PoIyvinylalkoholgruppen enthält.
    4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Grundträger Petrischalen, Roux-Schalen oder Kugeln aus dem Polysaccharid "DEAE-Sephadex" oder Glasträger verwendet.
    5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die mit der Lösung des hitzehärtbaren Kunststoffs beschichteten Träger der Einwirkung von Wärme bei einer Temperatur zwischen 120° und 1800C aussetzt.
    G) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Träger vor dem Aufbringen der Lösung des hitzehärtbaren Kunststoffs mit einem isotonischen Puffer wäscht und sie im Autoklaven behandelt.
    909809/0771
    BAD ORIGINAL
    28340·?
    7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kugeln oder NiikrotrHger nach der Hit'anrtjehandlung mit einem isotonischen Puffer spült, der Ca - und Mg++-Ionen enthält, und im Autoklaven behandelt. "
    8) Träger für Zellkulturen, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 7.
    9) Träger für Zellkulturen, dadurch gekennzeichnet^ Äiß sie aus einem Grundträger mit ebener Oberfläche, z.B» Petrischalen oder Roux-Schalen, oder kugelförmigen Grundträgern z.B. Kügelchen, und einem darauf aufgebrachten hitzegehärteten Überzug bestehen.
    10) Träger nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der hitzegehärtete Überzug aus einem Butyral-Polyvinyialkohol-Polymerisat oder einem Formal-Polyvinylalkohol-Poiymerisat besteht.
    11) Träger nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der hitzegehärtete Überzug aus einem Butyral-Polyvinylalkohol-Polymerisat besteht, das durch Umsetzung von Butyraldehyd mit einem Polyvinylalkohol erhalten worden ist, als 5%ige Lösung in 95%igem Äthylalkohol bei 200C eine Viskosität von 10 MillipoiseuilIe hat und 20 Gew.-% Polyvinylalkoholgruppen enthält.
    909809/0 771
    BAD ORIGINAL
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